BR112014012100A2 - Composição de enzima que é capaz de hidrolisar oligopeptídeos do glúten resistentes àclivagem enzimática compreendendo endopeptidase da família s8/s53, seu processo de produção, ácido nucleico, cepa actinoallomurus, endopeptidase da família s8/s53, formulação farmacêutica e complemento alimentício, bem como uso da referida composição no tratamento e prevenção de distúrbios associados à intolerância ao glúten e método de degradação de oligopeptídeos - Google Patents

Abstract

composição de enzima que é capaz de hidrolisar oligopeptídeos do glúten resistentes à clivagem enzimática compreendendo endopeptidase da família s8/s53, seu processo de produção, ácido nucleico, cepa actinoallomurus, endopeptidase da família s8/s53, formulação farmacêutica e complemento alimentício, bem como uso da referida composição no tratamento e prevenção de distúrbios associados à intolerância ao glúten e método de degradação de oligopeptídeos. a presente invenção refere-se a composição de enzima capaz de hidrolisar oligopeptídeos do glúten resistentes à clivagem por enzimas gástricas e pancreáticas e cuja presença no lúmen intestinal resulta em efeitos tóxicos, a qual compreende endopeptidase da família s8/s53 ativa em ph entre 3 e 8, seu processo de produção, ácido nucleico, cepa actinoallomurus , formulação farmacêutica e complemento alimentício, bem como uso da referida composição no tratamento e prevenção de psilose celíaca, dermatitis herpetiformis e outros distúrbios associado à intolerância ao glúten e método de degradação dos referidos oligopeptídeos do glúten.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM- POSIÇÃO DE ENZIMA QUE É CAPAZ DE HIDROLISAR OLI- GOPEPTÍDEOS DO GLÚTEN RESISTENTES À CLIVAGEM ENZI-

MÁTICA COMPREENDENDO ENDOPEPTIDASE DA FAMÍLIA S8/S53, SEU PROCESSO DE PRODUÇÃO, ÁCIDO NUCLEICO, CE- PA ACTINOALLOMURUS, ENDOPEPTIDASE DA FAMÍLIA S8/S53, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA E COMPLEMENTO ALIMENTÍ- CIO, BEM COMO USO DA REFERIDA COMPOSIÇÃO NO TRATA- MENTO E PREVENÇÃO DE DISTÚRBIOS ASSOCIADOS À INTO- LERÂNCIA AO GLÚTEN E MÉTODO DE DEGRADAÇÃO DE OLI- GOPEPTÍDEOS".

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a uma nova família de endo- peptidases que tem propriedades catalíticas únicas que a dão capaz de degradar polipeptídios grandes, incluir aquele rico na prolina. À presente invenção adicionalmente refere-se a métodos para produzir a composição de enzima bem como a composição farmacêutica e um complemento alimentício contendo a composição de enzima e o seu uso na degradação de polipeptídios. Antecedente da Invenção

[002] Doença celíaca (CD) é um distúrbio de trato gastrointestinal crônico em que ingestão de glúten, presente em alimentos feitos do trigo, o centeio, cevada e as suas variedades de relação cruzada, con- duz ao dano da pequena mucosa intestinal por um mecanismo autoi- mune em indivíduos geneticamente suscetíveis (Green P.H.R., Cellier C. "Celiac Disease" N. Engl. J. Med., 2007,357,1731-1743; Kagnoff M.F. "Celiac disease: pathogenesis of a model immunogenetic di- sease" J. Clin. Invest., 2007, 117, 41-9). Mecanismos através do qual o glúten induz os seus efeitos patogenéticos foram explicados nos últi- mos anos. Tanto os mecanismos de imunidade inatos como adaptá-

1a/52 veis são envoltos e são responsáveis pelo dano final na mucosa.

[003] O glúten consiste de gliadinas e gluteninas, as frações inso- lúveis em água e sal de proteínas armazenadas presentes em grãos de cereal. Uma rede de glúten é criada pela interação entre as duas proteínas quando farinha e água são-misturada durante a preparação da massa de farinha.

[004] Uma vez ingerido, o glúten vai através digestão parcial por gástrico e pancreático e enzimas proteolíticas de bordas ciliadas que resulta em muitos peptídeos do comprimento diferente (poucos a mais de 30 aminoácidos) que são resistentes a digestão nova devido ao alto teor de resíduos de prolina como muitas proteases são incapazes de clivar ligações de peptídeo localizadas nas terminações N ou Cda pro- lina (Hausch F., Shan L., Santiago N.A., Gray G.M., Khosla C. "Intesti- nal digestive resistance of immunodominant gliadin peptides". Am.

J.

Physiol.

Gastrointest.

Liver Physiol., 2002, 283, 996-1003; Shan L., Molberg O., Parrot |., Hausch F., Filiz F., Gray G.M,., Sollid L.M., Khos- la C." Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue" Science, 2002, 297, 2275-2279). A falta de enzimas de clivagem específicas para a prolina não é uma deficiência de enzima específica em pacien- tes celíacos, como sugeridos no passado, mas é própria do aparelho digestivo de mamíferos que não se desenvolveu para consumir proteí- nas com tão alto teor de prolina na sua dieta.

Os peptídeos do glúten não digerido podem passar a barreira epitelial através mecanismos não ainda claramente explicados, embora uma passagem paracelular mediada por zonulina e um transcelular caminho, via transcitose e re- trotranscitose, tenham sido recentemente propostos (Drago S., El As- mar R., Di Pierro M., Grazia Clemente M., Tripathi A., Sapone A., Tha- kar M., lacono G., Carroccio A., D'Agate C., Não T., Zampini L., Catas- si C., Fasano A. "Gliadin, zonulin and gut permeability: Effects on celi- ac and non-celiac intestinal mucosa and intestinal cell lines" Scand.

J.

Gastroenterol., 2006, 41, 408-19; Schumann M,, Richter J.F., Wedell |, Moos V., Zzimmermann-Kordmann M., Schneider T., Daum S., Zeitz M., Fromm M., Schulzke J.D." Mechanisms of epithelial translocation of the alpha(2)-gliadin-33mer in coeliac sprue" Gut, 2008, 57, 747-754; Matysiak-Budnik T., Moura 1.C., Arcos-Fajardo M., Lebreton C,, Ménard S., Candalh C., Ben-Khalifa K., Dugave C., Tamouza H., van Niel G., Bouhnik Y., Lamarque D., Chaussade S., Malamut G., Cellier C., Cerf-Bensussan N., Monteiro R.C., Heyman M. "Secretory IgA me-

diates retrotranscytosis of intact gliadin peptides via the transferrin re- ceptor in celiac disease" J. Exp. Med., 2008, 205, 143-154).

[005] Uma vez na lamina propria (LM), a desamidação da gluta- mina a resíduos de glutamato pelo transglutaminase de tecido (tTG, o autoantígeno na CD) reforça a sua apresentação a células T CD4+ DQ2 ou DO8 (Molberg O., McAdam S., Lundin K.E., Kristiansen C., Arentz-Hansen H., Kett K., Sollid L.M. "T cells from celiac disease lesi- ons recognize gliadin epitopes deamidated in situ by endogenous tis- sue transglutaminase" Eur. J. Immunol., 2001,31, 1317-23) para a pro- dução de uma resposta pró-inflamatória com interferon-gama (IFN-y) como principal efetor de citocina. Também se mostrou que vários pep- tídeos do glúten causam danos de mucosa independentemente de um reconhecimento específico por linfócitos T CD4+, mas induzimento de uma resposta imunológica inata por regulando a expressão de IL-15, ciclo-oxygenase-2 e os marcadores de ativaçãa CD25 e CD83 em cé- lulas mononucleares LM: entre eles, os melhores caracterizados são peptídeos p31-43/49 do a1 - gliadinas (PGQQQPFPPQQPY/PQPQPF) (Ciccocioppo R., Di Sabatino A., Corazza G.R. "The immune recogni- tion of gluten in coeliac disease" Clin. Exp. Immunol., 2005, 140, 408- 16).

[006] Prevê-se que a CD afete aproximadamente 1% tanto da população européia como de norte-americana, com um estudo de ta- xas de aumento de exposição de Finlândia (1:47) em pessoas mais velhas (Vilppula A., Kaukinen K., Luostarinen L., Krekelã |., Patrikainen H., Válvula R., Mâáki M., Collin P. "Increasing prevalence and high inci- dence of celiac disease in elderly people: a population-based study" BMC Gastroenterol., 2009, 29, 9-49). Entretanto, muitos estudos indi- cam que a CD é difundida em todo o mundo com valores de prevalên- cia semelhantes (Barada K,, Bitar A., Mokadem M.A., Hashash J.G., Green P. "Celiac disease in Middle Eastern and North African coun-

tries: a new burden?" World J. Gastroenterol., 2010, 16, 1449-57; Dalgic B., Sari S., Basturk B., Ensari A., Egritas O., Bukulmez A., Baris Z., Grupo de estudos Celíaco turco "Prevalence of celiac disease in healthy Turkish school children" Am. J. Gastroenterol., 2011.106, 1512-7; Makharia G.K., Verma A.K., Amarchand R., Bhatnagar S., Das P., Goswami A., Bhatia V., Ahuja V., Datta Gupta S., Anand K. "Preva- lence of celiac disease in the northern part of India: a community based study" J. Gastroenterol. Hepatol., 2011, 26, 894-900; Wang X.Q,, Liu W,., Xu C.D., Mei H., Gao Y., Peng H.M., luan L., Xu J.J. "Celiac dis- ease in children with diarrhea in 4 cities in China" J. Pediatr. Gastroen- terol. Nutr., 2011, 53,368-70).

[007] Nenhuma terapia está disponível atualmente e a única re- mediação à doença é uma dieta sem glúten estrita, ao longo da vida necessário para prevenir não só o dano de mucosa específico da CD e consequentes distúrbios relacionados à má absorção (como anemia deficiente pelo ferro ou osteoporose) mas também outras doenças au- toimunes que se associaram com a CD, como diabete do tipo 1 e tire- oidite autoimune, ou complicações mais pesadas como linfomas de célula T associados com enteropatia.

[008] A eliminação total do glúten (o limiar de entrada de glúten seguro é geralmente indicado em 50 mg/dia, embora 10 mg/dia seja considerado mais seguro) mantém a CD na remissão em todos exceto uma pequena percentagem de pacientes (2-5%) que sofrem de uma forma sem resposta. Tal dieta é, entretanto, fortemente exigente para pacientes, que são restringidos nas suas atividades comuns e sofrem do isolamento social. O uso do glúten como o aditivo em processos de alimento é comum e é a causa principal de ignorar a ingestão do glú- ten, produza esta dieta realmente difícil de manter.

[009] Por estas razões seria fortemente ba -vindo por pacientes de CD qualquer alternativa que lhes permite assumir na sua dieta diá-

ria quantidades pelo menos mínimas de glúten.

[0010] O uso de enzimas proteolíticas exógenas para desintoxica- ção de glúten é uma das estratégias mais prometedoras do tratamento da CD. Os caminhos diferentes da aplicação podem explorar estas en- zimas potencial: tratamento de glúten contendo farinhas, antes ou du- rante a fermentação de massa de farinha, assim indo através a produ- ção de "novo alimento", bem como consumo de acompanhador de glú- ten e enzimas proteolíticas adequadas, assim indo como "complemen- to alimentício", de mesmo modo ao uso de lactase de intolerância de lactose. Necessariamente, solicita-se que propriedades de enzima di- ferentes concordem os objetivos diferentes.

[0011] A aproximação enzimática do tratamento da CD é baseada na manifestação por et al Shan. (Science, 2002) da capacidade de en- zimas microbianas de clivar peptídeos do glúten em resíduos especifi- cos e retirar o tóxico/imunotóxica sequências de peptídeo específicas. Especialmente, eles mostraram que um exógeno endoprotease espe- cífico de prolil derivado de Flavobacterium meningosepticum (de - PEP) resultou útil em digestão de peptídeos de gliadina. A adição de um PEP in vitro na presença de extratos da fronteira da membrana ci- liada (BBM) ou durante a aspersão in vivo do rato que o intestino del- gado causou a uma degradação rápida do imunodominante peptídeo 33-mer ("33-mer") e uma perda da sua capacidade de estimular célu- las Tes específicas para a gliadina (Hausch et a/., 2002).

[0012] Outras enzimas da mesma família (a CE. 3.4.21.26) de ou- tras cepas bacterianas (isto é Sphingomonas capsulata e Myxococcus xanthus) foram avaliados para este objetivo pelos mesmos autores (Shan L., Marti T., Sollid L.M., Gray G.M., Khosla C. "Comparative bio- chemical analysis of three bacterial proly! endopeptidases: implications for coeliac sprue" Biochem. J., 2004,383,311-318). Globalmente, estes estudos mostraram diferenças substanciais entre as três enzimas em relação a comprimento da cadeia e especificidade de subsítio e con- firmaram o potencial da terapia de enzima oral, embora as preocupa- ções crescentes quanto à sua eficácia possível in-vivo, devido a restri- ções em especificidade de substratos, pH da atividade (a ótima ativi- dade em pH quase neutro em vez do pH ácido como tinha de atuar no estômago), o longo tempo necessário para concluir digestão de peptí- deos tóxicos e resistência à degradação pela pepsina. Uma combina- ção de duas enzimas com atividade gástrica e especificidade de subs- trato complementar foi depois sugerida (Gass J., Bethune M.T., Siegel M., Spencer A., Khosla C." Combination enzyme therapy for gastric digestion of dietary gluten in patients with celiac sprue" Gastroentero- logy, 2007, 133, 472-480): PEP de S. capsulata associado a EP-B2, a isoforma 2 de endoprotease B específica para a glutamina de Hor- deum vulgare, um derivado de protease da cisteína de sementes de cevada de germinação que é ativado em pH ácido e pela pepsina (Be- thune M.T., Strop P., Tang Y., Sollid L.M., Khosla C. "Heterologous ex- pression, purification, refolding, and structural-functional characteriza- tion of EP-B2, a self-activating barley cysteine endoprotease" Chem. Biol., 2006, 13, 637-47), mostrou para ser uma ferramenta terapêutica potencialmente mais potente. Outro estudo informa que um PEP deri- vado de Aspergillus niger, desdobrando a sua atividade principal con- dições sob ácidas no estômago, pode começar a degradar a gliadina antes que ele atingisse o lúmen intestinal (Stepniak D., Spaenij- Dekking L., Mitea C., Moester M., de Ru A., Baak-Pablo R. van Veelen P., Édens L., Koning F. "Highly efficient gluten degradation with a new- ly identified prolyl endoprotease: implications for celiac disease" Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 2006, 291, G621-9).

[0013] Estes achados foram citados por vários documentos de Pa- tente. Em WO2003/068170 (EP572127), os inventores afirmam que administrar uma dose eficaz do glutenase a um paciente celíaco ou paciente de dermatitis herpetiformis reduz níveis de oligopeptídeos tó- xicos de glúten, desse modo atenuando ou eliminando os efeitos pre- judiciais do glúten. Adicionalmente o suporte a esta aproximação é da- do em WO2005/107786 (EP1740197), onde as formulações farmacêu- ticas de enzimas de glutenase para uso no tratamento de celíaco ou pacientes de dermatitis herpetiformis são divulgadas.

[0014] O WOZ2005/027953 (EP16663298) descreve um tratamento com um novo endoprotease específica de prolil de Aspergillus niger (- PEP) que resultou útil em digestão de peptídeos tóxicos de glúten. WO?2005/019251 fornece o aminopeptidase de leucina (LAP) de duas espécies fúngicas diferentes, Trichophyton rubrum e Aspergillus fumi- gatus em combinação com o dipeptidil peptidase IV (DpplV). Estas en- zimas foram avaliadas para a clivagem do 33-mer sob condições neu- tras de pH já que a ótima atividade de LAPs foi prevista aproximada- mente 7,0 com uma faixa de variação da atividade entre o ph 6 e 8, assim impedindo ou limitando um esgotamento possível da gliadina no fluido gástrico.

[0015] Também se mostrou que os tripeptidias peptidases de A. fumigatus podem degradar proteínas em pH ácido (Reichard U., Le- chenne B., Asif A.R., Streit F., Grouzmann E., Jousson O., Monod M. "Sedolisins, a new class of secreted proteases from Aspergillus fumigatus with endoprotease or tripeptidyl|-peptidase activity at acidic pHs" Appl. Environ. Microb., 2006, 72, 1739-48). Em WO2011/077359 é fornecido um kit composto por uma prolil protease (AfuS28) e pelo menos uma tripeptidil protease que pertence à família de sedolisina a ser utilizada como complemento alimentício útil também para o trata- mento da CD.

[0016] É claro que o valor terapêutico de uma enzima ou composi- ção de enzima para o tratamento da CD está relacionado às enzimas a) serem resistente à degradação por outras enzimas gastrintestinais,

b) serem eficientes no ambiente onde 33-mer e os outros os peptídeos tóxicos são produzidos, e c) exporem atividades proteolíticas rápidas e elevadas na direção dos peptídeos do glúten. Estas enzimas devem ser ativas em pH ácido e devem ser capazes de acessar uma compo- sição complexa de glúten escondidos por outros componentes normais de gêneros alimentícios assados ou cozidos. Sumário da Invenção

[0017] Os Requerentes na presente invenção identificaram uma nova família de enzimas e fornecem uma enzima ou uma composição desta família de enzima que tem propriedades catalíticas únicas.

[0018] Os Requerentes identificaram um Actinoallomurus sp. como produtor desta família de enzima. As endopeptidases da invenção são produzidos pelo cultivo de Actinoallomurus em um meio de cultura a- dequado, por exemplo contendo soja. A cepa, originalmente identifica- da com o código A8 do Requerente, foi isolada de um solo italiano e depositada no dia 24 de junho de 2011, com o DSMZ,-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, (agora Leib- niz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell- kulturen GmbH), Inhoffenstarsse 7b, D-38124 Braunschweig, Alema- nha, sob o abrigo no disposto no Tratado de Budapeste. À cepa foi concedido o número de registro DSM 24988.

[0019] As endopeptidases da presente invenção são capazes de hidrolisar certos oligopeptídeos do glúten, que são resistentes à cliva- gem por enzimas gástricas e pancreáticas e cuja presença no lúmen intestinal resulta em efeitos tóxicos. O tratamento enzimático pode reti- rar tais peptídeos e os seus efeitos tóxicos; ele pode degradar a gliadi- na e assim desintoxicar o glúten sem adição de qualquer PEP. As pep- tidases da invenção têm uma ampla variação de atividades de pH e são capazes de exercer a atividade proteolítica de pH 3 a pH 8. Tal atividade será definida como atividade de glutenase.

[0020] Estas enzimas de glutenase fornecem métodos para prevenir os sintomas da psilose celíaca e/ou dermatitis herpetiformis reduzindo os níveis de oligopeptídios tóxicos de glúten em gêneros alimentícios, antes de ou depois da ingestão por um paciente. Estas enzimas podem ser u- sadas em conjunto com outras enzimas proteinases proteolíticas tais co- mo e aminopeptidases para produzir eficazmente hidrolisados de proteína usados para alimentos e bebidas, e medicamentos.

[0021] Estas enzimas são secretadas por cepas de Actinollomurus diferentes cultivando-as em meios adequados e a sua atividade pode ser avaliada utilizando tanto substratos cromogênicos como análise zimográ- fica.

[0022] Além disso, as enzimas da invenção podem ser produzidas em células hospedeiras introduzindo uma codificação de ácidos nucleicos para essas enzimas, cultivando as células em um meio de cultura sob condições adequadas para produzir e recuperar as enzimas. Descrição dos Desenhos

[0023] Figura 1: Árvore filogenética inferida das sequências de glutenases da invenção e a sedolisina ou proteases de kumamolisina.

[0024] As sequências de proteína foram alinhadas com o programa CLUSTALW e a árvore de probabilidade máxima com valores de inicializa- ção foi calculada utilizando software de MEGAS. Actinoallomurus sp. as en- dopeptidases estão no negrito. SedE foi utilizado como grupo externo. A ár- vore foi depois visualizada com o software MEGAS5. Os valores de inicializa- ção iguais ou mais elevadas do que 50% são indicados em nodos. A barra de escala indica o número de substituições de aminoácido por sítio.

[0025] SedE = sedolisina E de A. fumigatus Af293 (EAL86850); SedB = sedolisina B de Aspergillus fumigatus Af293 (CAE17674); TP- Pa = tripeptidil peptidase A de A. oryzae RIB40(BAC56232); SedD = sedolisina D de A. fumigatus Af293 (CAE17675); SedC = sedolisina C de A. fumigatus Af293 (CAE46473); SedA = sedolisina um de A. fumi- gatus Af293 (CAES1075); KumaA = Kumamolisina como de Alicicloba- cillus sendaiensis (Q8GB88); KumaB = Kumamolisina de Bacillus sp. MN-32 (Q8RR56); sedolisinA = sedolisina de Pseudomonas sp. 101 (P42790); sedolisinB = sedolisina-B de Xanthomonas sp. T-22 (Q60106); Endopep-são as glutenases da invenção. Os números de acesso de sequência de proteína são informados entre parênteses.

[0026] Figura 2: Perfil de atividade de endopep-140 (> 100 kDa) e endopep-40 (<100 kDa) medido no substrato fluorescente Suc- cinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC sob várias condições de pH. Fluorescência medida depois de duas horas em 37 T. Os valores de pH específicos são dados em Eixo X, percentagem da atividade relativa sobre o Eixo Y.

[0027] Figura 3: Atividade de endopeptidase de endopep-140 (> 100 kDa) e endopep40 (<100 kDa) medido no substrato fluorescen- te Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC em pH3 e pH5. Fluorescência medi- da em vários intervalos de tempo em 37C. Os tempos de incubação são dados no Eixo X, unidades de fluorescência arbitrais (rfu) no Eixo Y.

[0028] Afigura4: SDS-PAGE de 8% corada com o azul Coo- massie de glutenases recombinantes.

[0029] A expressão de proteína foi induzida com IPTG 0,2 uM em 22 durante a noite. S1 indica a cepa de E. coli transformada com pET28b-endopep-140; S3 indica a cepa de E. coli transformada com pET28b-endopep-40. Os pesos moleculares do marcador utilizado são indicados à esquerda.

[0030] Da esquerda: faixa 1 = marcador de peso molecular; faixa 2 = S1 não induzido; faixa 3 = S1 induzido, 3h colheita; faixa 4 = S1 in- duzido, colheita durante a noite (o.n.); faixa 5 = espaço em branco; fai-

xa 6 = S3 não induzido; faixa 7 = S3 induzido, 3h colheita; faixa 8 = S3 induzido, colheita o.n.

[0031] Afigura5: Esgotamento do peptídeo de gliadina 33-mer por endopep-140.

[0032] Os produtos de reação no curso de tempo foram separados por HPLC de fase reversa. A figura 5A: MS de traços, contagens de íons m/z=300-2000; a figura 5B: perfil UV 230 nm, as uyAU são micro unidades de absorbância. O perfil obtido no tempo 0,30 minutos, duas horas é comparado. Só um sinal que corresponde ao peptídeo 33-mer intacto ([M 2H] =1957) esteve presente no tempo 0. Este sinal diminuiu eficazmente com o tempo. Vários picos apareceram depois que a in- cubação de 30 minutos e a sua quantidade aumentou no tempo duas horas. Todos os íons moleculares observados são informados na Ta- bela 2. O tamanho do pico mais característico é destacado na figura.

[0033] Afigura6: Esgotamento do peptídeo de gliadina 33-mer por endopep-140 na presença de pepsina (1mg/ml).

[0034] Os produtos de reação de curso de tempo foram separados por HPLC de fase reversa. A figura 6A: MS de traços, contagens de íons m/z=300-2000; a figura 6B: perfil UV 230 nm, as uAU são micro unidades de absorbância. O perfil obtido no tempo 0,30 minutos, duas horas é comparado. Enquanto só um sinal que corresponde ao peptí- deo 33-mer intacto ([M 2H] =1957) esteve presente no tempo 0, vários picos apareceram depois que a incubação de 30 min e a sua quanti- dade aumentaram no tempo duas horas. Todos os íons moleculares observados são informados na Tabela 3. O tamanho dos picos mais característicos é destacado na figura. O sinal em ([M-H] =1068) cor- responde a um peptídeo de nove aminoácidos presentes na sequência 33-mer. O sinal 689,7 é devido à pepsina.

[0035] Afigura7: Análise de HPLC-MS. O peptídeo de gliadina 33-mer foi incubado com a pepsina. Figure7A: MS de traços; figura 7B:

perfil UV 230nm, as pyAU são micro unidades de absorbância. O perfil obtido no tempo O e duas horas é comparado. Quase nenhuma degra- dação dos 33-mer foi observada.

[0036] Afigura8: A proteólise da gliadina SDS-PAGE corada com o azul Coomassie.

[0037] Digestão de gliadina por duas glutenases diferentes em presença ou ausência de pepsina. A gliadina foi incubada duas horas em 37 C.

[0038] Da esquerda: faixa 1 = marcador de Peso molecular; faixa 2 = gliadina; faixa 3 = gliadina + endopep-40 (<100 kDa); faixa 4 = glia- dina + endopep-40 (<100 KkDa) + pepsina; a faixa 5 = reação 3 parou depois da incubação de 10 min; faixa 6 = gliadina + endopep-140 (> 100 kDa); faixa 7 = gliadina + endopep-140 (> 100 kDa) + pepsina. Breve Descrição de Tabelas

[0039] Tabela 1. As proteínas putativas purificadas de Actinoallo- murus secretome.

[0040] Tabela 2. Os peptídeos liberados por digestão 33-mer com endopep-140.

[0041] Tabela 3. Os peptídeos liberados por digestão 33-mer com endopep-40. Descrição Detalhada da Invenção

[0042] Os actinomicetos são bactérias de positivo do grama de filamentoso, principalmente conhecidas pela sua capacidade de pro- duzir metabólitos bioativos secundários. Os actinomicetos foram utili- zados como fonte de hidrolases, embora só poucos, particularmente os de alcalifílico, tenham sido por enquanto explorados para o seu po- tencial enzimático (Endo A., Murakawa S., Shimizu H., Shiraishi Y. "Purification and properties of collagenase from a Streptomyces spe- cies" J. Biochem., 1987, 102, 163-70; Sakurai Y., Inoue H., Nishii W., Takahashi T., lino Y., Yamamoto M., Takahashi K. "Purification and

Characterization of a Major Collagenase from Streptomyces parvulus" Biosci. Biotechnol. Biochem., 2009, 73, 21-28; Mehta V.J., Thumar J.T., Singh S.P., "Production of alkaline protease from an alkaliphilic actinomiceto" Bioresource Technology, 2006, 97, 1650-1654).

[0043] Além disso, a sequência de genoma completa de Streptomyces coelicolor A3 (2) predisse a presença de 60 proteases putativas secretadas e peptidases entre as 819 proteínas potencialmente secretadas (Bentley S.D., Chater K.F., Cerdeho-Tárraga A.M., Challis G.L., Thomson N.R,, James K.D., Harris D.E., Codorniz M.A., Kieser H. Harper D., Bateman A,, Brown S., Chandra G., Chen C.W,, Collins M., Cronin A., Fraser A., Goble A., Hidalgo J., Hornsby T., Howarth S., Huang C.H., Kieser T., Larke L., Murphy L., Oliver K., O'Neil S., Rabbinowitsch E., Rajandream M.A., Ruther- ford K., Rutter S., Seeger K., Saunders D., Sharp S., Squares R., Squares S., Taylor K., Warren T., Wietzorrek A., Woodward J., Barrell B.G., Parkhill J., Hopwood D.A." Complete genome sequence of the model actinomiceto Streptomyces coelicolor A3 (2)" Nature, 2002, 417, 141-7) fornecendo valor adicional de actinomicetos como fonte potencial de novas enzimas hidrolíticas. Entre os actinomicetos, as cepas acidofílicas oferecem possibili- dades mais altas de produzir enzimas com propriedades que melhor ajus- tam as exigências para serem eficazes na CD, ou seja, atividade em pH á- cido. Vários novos gêneros de actinomicetos acidofílicos (isto é Catenulispo- ra, Actinospica, Rugosimonospora, Streptacidiphilus) bem como bactérias de filamentoso com propriedades acidofílicas que pertencem a uma linha- gem bacteriana anteriormente desconhecida (isto é, Ktedonobacter) foram descritos pela primeira vez nos últimos anos (Busti E., Cavaletti L., Monciar- dini P., Schumann P., Rohde M., Sosio M., Donadio S. "Catenulispora acidi- phila gen. nov., sp. nov., a novel, mycelium-forming actinomiceto, and pro- posal of Catenulisporaceae fam. nov." Int. J. Syst. Evol. Bacteriol., 2006,

56, 1741-1746; Cavaletti L., Monciardini P., Bamonte R., Schumann P,, Rohde M,, Sosio M., Donadio S." New lineage of filamentous, spore-forming, gram-positive bacteria from soil" Appl. Env. Microbiol., 2006, 72, 4360-4369; Cavaletti L., Monciardini P., Schumann P., Rohde M., Bamonte R., Busti E., Sosio M., Donadio S. "“Actinospica acidiphila gen. nov., sp. nov. and Actinospica robiniae gen. nov., sp. nov.; proposal for Actinospicaceae fam. nov. and Catenulisporinae subordo. nov. in the order Actinomycetales" Int. J. Syst. Evol. Bacteriol., 2006, 56, 1747-1753; Monciardini P., Cavaletti L., Ranghetti A., Schumann P., Rohde M., Bamonte R., Sosio M., Mezzelani A., Donadio S. "Novel members of the family Micromonosporaceae, Rugosimonospora acidiphila gen. nov., sp. nov. and Rugosimonospora afri- cana sp. nov" Int. J. Syst. Evol. Bacteriol., 2009, 59, 2752-2758; Kim S.B., Lonsdale J., Seong C.M., Goodfellow M. "Streptacidiphilus gen. nov., aci- dophilic actinomicetos with wall chemotype | and emendation of the family Streptomycetaceae (Waksman e Henrici (1943) **) emendam. Rainey et al. 1997)" Antonie van Leewenhoek, 2003, 83, 107-116).

[0044] Actinoallomurus, como muitos outros actinomicetos, pode cultivar em um meio contendo a proteína como o único nitrogênio e fonte de carbono. Esta capacidade de crescer em um meio de proteína depende da ação sinér- gica de endo e exoproteases secretadas desde então só aminoácidos e os peptídeos curtos podem ser assimilados via transportadores de membrana. As cepas de Actinoallomurus têm o ótimo crescimento em pH ligeiramente ácido, assim sugerindo que as enzimas proteolíticas podem ser expressadas neste pH e podem ser capazes de digerir proteínas complexas em condições ácidas. No conhecimento de Requerentes nenhum outro relatório descreve a produção de proteases que atuam em pH ácido de actinomicetos.

[0045] Actinoallomurus sp. DSM 24988 foi isolado pelos Reque- rentes de um solo — italiano, guardado na coleção de cepa dos Reque-

entes, e depositado no dia 24 de junho de 2011 com o DSMZ, Deuts- che Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhof- fenstr,7b, D-38124 Braunschweig, Alemanha (agora Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), sob o abrigo no disposto no o Tratado de Budapeste. À cepa foi concedido o número de registro DSM 24988. Actinoallomurus sp. À DSM 24988 cresce em vários meios sólidos padrão (Shirling E.B., Gottlieb D." Methods of characterization of Streptomyces species" Int. J. Syst. Bacteriol., 1966, 16,313-340) acidificado em pH 5,5 com HCI. Depois de 15 dias da incubação em 28%, o micélio de substrato é convoluto, a sua cor é a formação de creme violeta com o envelheci- mento e nenhum micélio aéreo é produzido no ágar-ágar ISP2. A cor do micélio aéreo é branca quando formado em HSAS5 (Busti et al, 2006). O crescimento abundante e a produção do creme convolu- to/micélio vegetativo marrom foram observados sobre o ágar-ágar ISP3 depois de 15 dias da incubação. A produção leve de pigmentos solúveis acastanhados está presente depois de 20 dias da incubação. A cepa pode ser cultivada na temperatura entre 21 e 350, tempera- tura ótima sendo 28º em ISP2 e HSA5. Actinoallomurus sp. DSM 24988 é capaz de crescer na presença de até 2,5% NaCl (p/v); na concentração de 1% (p/v) e mais elevada a cepa não diferencia o mi- célio vegetativo violeta mas só o micélio de substrato de creme convo- luto. A cepa, semeada em placa de ágar-ágar ISP2 ajustado aos valo- res de pH desejados com HCI ou NaOH, cresce bem em pH entre 4,0 e 7,0, com um condição favorável pH 5,5. O creme convoluto abun- dante de micélio vegetativo é observado quando cultivado ISP9 sobre ácido acrescentado com o glúten. Nenhum micélio aéreo e pigmentos solúveis são produzidos.

[0046] A investigação proteômica das proteínas de Actinoallomu- rus secretadas confirma que os conjuntos diferentes de proteases ati-

vas em pH neutro, básico ou ácido são secretados e, especialmente, vários membros da família de peptidase S8/S53.

[0047] As glutenases da invenção pertencem à peptidase ME- ROPS S8 [subfamílias S8A (subtilisina) e S8B (quequixina)] e S53 (sedolisina) família (Rawlings N.D., Barrett A.J., Bateman A. "ME- ROPS: the peptidase database" Nucleic Acids Res., 2010,38, D227- D233).

[0048] O glúten é um componente protéico de trigo, cevada, cen- teio e espécies relacionadas, únicas na sua capacidade de fornecer a elasticidade e outras características desejadas à massa de farinha e muitos outros alimentos. As proteínas de glúten são ricas em resíduos de glutamina (35%) e prolina (15%), uma característica que é especi- almente notável entre epítopos de glúten que são reconhecidos por células T específicas para a doença. Os componentes tóxicos princi- pais do glúten de trigo são gliadinas, uma família de prolina - e gluta- mina - proteínas ricas que contêm vários epítopos estimuladores de célula T. A sua degradação parcial no trato gastrointestinal por pepsi- na, tripsina, a quimiotripsina leva à formação de vários peptídeos tóxi- cos diferentes dos peptídeos p31-49 e dos seus derivados p31-43 da fração a1-gliadina, e p56-88 (33-mer) da fração a2 são o melhor carac- terizado. O 33-mer é um fragmento de peptídeo de 33 resíduos obtidos também por digestão enzimática in-vitro que mimetiza a fisiológica gastrintestinal (Shan et a/. 2002), cuja sequência de aminoácido é L- QLQOPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPOPF (SEQ ID Nº: 6. É o peptídeo imunoestimulador mais forte já que ele transporta múltiplas cópias de três epítopos que são imunogênicos em pacientes com a doença celíaca; ele é assim responsável por uma resposta imunotóxi- ca forte (Qiao S.W., Bergseng E., Molberg O., Xia J., Fleckenstein B., Khosla C., Sollid M.L." Antigen Presentation to Celiac Lesion-Derived T Cells of a 33-mer Gliadin Peptide Naturally Formed by Gastrointestinal

Digestion" J. Immunol., 2004, 173, 1757-1762) e por isso é utilizado como um modelo da desintoxicação de glúten. O peptídeo 33-mer é um substrato excelente da enzima transglutaminase 2 (TG2) dos pep- tídeos desamidatos da gliadina na lamina propria, aumentando a sua afinidade às moléculas do antígeno de leucócito humano (HLA) DQ2 ou DOQ8 e assim melhorando a resposta imunológica de mucosa medi- ada na célula T que leva às consequências clínicas. O transporte in- testinal dos 33-mer intactos através da camada de eritrócito pode ser devido a uma sobreexpressão do receptor de transferrina na CD e/ou a uma permeabilidade de mucosa melhorada. De qualquer maneira, os peptídeos podem evitar a degradação pelo caminho de endossoma- |ysosomal ácido e podem atingir a borda da serosa inalterada. A de- gradação do peptídeo de gliadina 33-mer em peptídeos contendo me- nos que nove resíduos não resultam em nenhuma toxicidade do glú- ten.

[0049] Já que o trato gastrointestinal não possui o equipamento enzimático para clivar eficientemente os derivados dos peptídeos do glúten ricos em prolina, que determinam em pacientes com a doença celíaca uma resposta intestinal imune anormal, o uso de proteases o- ralmente ativas para degradar peptídeos de gliadina tóxicos antes que eles atinjam a mucosa pode ser considerado como um tratamento al- ternativo à dieta.

[0050] Os requerentes identificaram uma nova subfamília de prote- Ínas que exibem uma atividade proteolítica em direção a peptídeos, tal como peptídeos ricos em prolina, em pH ácido, que corresponde ao pH do fluido gástrico, e encontraram que esta composição de enzima é também capaz de degradar o peptídeo de gliadina 33-mer. Com base em propriedades estruturais, obtidas pela análise de bioinformática, os Requerentes mostraram que esta nova subfamília pertence a peptida- ses S8/S53 (subtilisina quequixina sedolisina) e pode ser agrupada em um novo subgrupo diferente da sedolisina já conhecida ou kumamoli- sina que pertencem à família S53 (Figura 1).

[0051] Os requerentes desenvolveram uma determinada composi- ção destes endopeptidases. Esta composição compreende pelo me- nos um das endoproteases da família de peptidases S8/S53 (subtilisi- na quequixina sedolisina) produzida por Actinoallomurus que digere polipeptídio de cadeia completa e degrada um fragmento da gliadina conhecida por ser resistente à ação de protease. Portanto pelo menos uma endoprotease pode ser utilizada para o tratamento de doença ce- líaca ou qualquer doença do processo digestivo tal como por má absorção. Além disso, como a enzima é resistente à pepsina, uma combinação destas duas atividades proteolíticas pode resultar na de- gradação mais extensa de polipeptídios e proteínas tal como a gliadi- na. Os requerentes descobriram que 33-mer é degradado a peptídeos de seis aminoácidos (Tabela 2 e 3). Embora as enzimas da invenção estejam ativas sozinhas, a adição para eles de uma ou mais peptida- ses que estão atuando sobre a prolina peptídeos ricos os prolil- endoproteases tais como e/ou os x-prolil-dipeptidil aminopeptidases e/ou os prolil-aminopeptidases podem resultar em uma ação mais rá- pida.

[0052] A família de proteína S8/S53 da presente invenção sozinha ou opcionalmente em combinação com outras proteases pode ser útil na indústria de alimento, tal como, mas não limitada a, para degradar substratos amargos, tratamento de carnes, indústria de sabão, ou de- gradar prions, vírus, e contaminantes tóxicos ou proteínas em peptí- deos curtos e/ou aminoácidos livres.

[0053] Assim, a presente invenção fornece uma composição de enzima, compreendendo pelo menos uma endopeptidase S8/S53 ativa em pH entre 3 e 8 (inclusive), selecionada do grupo consistindo em:

[0054] Os endopep-140 compreendendo a SEQ ID Nº: 1, um fragmento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocorre naturalmente do mesmo, ou sequência que tem pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade,

[0055] Os endopep-40 compreendendo a SEQ ID Nº: 2, um frag- mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou sequência que tem pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade,

[0056] Os endopep-120 compreendendo a SEQ ID Nº: 3, um fragmento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocorre naturalmente do mesmo, ou sequência que tem pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade,

[0057] Os endopep-60 compreendendo a SEQ ID Nº: 4, um frag- mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou sequência que tem pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade

[0058] Os endopep-41 compreendendo a SEQ ID Nº: 5, um frag- mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou sequência que tem pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade.

[0059] O termo "peptidase(s) da invenção", "protease(s) da inven- ção", ou "endopeptidase(s) da invenção" tal como utilizado aqui, identi- fica uma ou mais das endopeptidases definidas acima.

[0060] A presente invenção também inclui um derivado de endo- peptidase do qualquer uma das sequências indicadas acima onde qualquer dos aminoácidos possa ser modificados nos resíduos corres- pondentes mostrados nas SEQ ID Nº“: 1, 2, 3, 4 ou 5 ainda manuten- ção da sua atividade biológica e funções fisiológicas, ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo. O objetivo da presente invenção inclui também a variante de qualquer peptidase contendo substituições, eli- minações, modificações de cadeia lateral e/ou inserções em certas posições dentro da sequência de aminoácido da sequência de amino- ácido nativa que preserva a atividade biológica e a função fisiológica da dita sequência de aminoácido de natural. Os exemplos de substitui- ções são bem conhecidas dos versados na técnica e indicados, por exemplo, na WO2011/077359.

[0061] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a protea- ses isoladas da invenção, e fragmentos biologicamente ativos das mesmas (ou derivados, porções, análogos ou homólogos das mes- mas). O fragmento biologicamente ativo se refere a regiões das prote- ases da invenção, que são necessárias para atividades de protease específicas.

[0062] Em uma modalidade adicional, a protease da invenção é uma protease que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, mais preferi- velmente pelo menos 70%, mesmo mais preferivelmente 80%, ainda mais preferivelmente 90% e bem mais preferivelmente 95% de identi- dade com a sequência de aminoácido compreendendo as SEQ ID Nº“: 1, 2, 3, 4 ou 5 e conserva a atividade das proteases compreendendo as SEQ IDN: 1,2,3,4 ou 5.

[0063] O termo "identidade" e "homologia" quando mencionado um nucleotídio ou a sequência de aminoácido são utilizados de modo tro- cável aqui e refere ao grau ao qual, dois polinecleotídeos ou as se- quências de polipeptídio são idênticos ou homólogos em uma base de resíduo por resíduo por cima de uma determinada região da compara- ção. O alinhamento e a identidade de por cento ou a homologia podem ser determinados utilizando programa adequado qualquer conhecido na técnica, por exemplo, os descritos em Current Protocols in Molecu- lar Biology (Ausubel F.M. et al., "Commercially Available Software", Current Protocols in Molecular Biology, 1987, o Suplemento 30, a Se- ção 7,7.18, a Tabela 7,7. 1). Os programas preferidos incluem o pro-

grama de GCG Pileup, FASTA (Pearson R. e Lipman D. J. "Improved Tools for Biological Sequence Analysis" Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 1988, 85, 2444-2448), e BLAST (Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. "Basic local alignment search tool" J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410).

[0064] A invenção também fornece proteases da invenção opera- cionalmente fundidas a outros polipeptídios que são chamados proteí- nas quiméricas ou marcadas pelos versados na técnica. O polipeptídio pode ser fundido à terminação N e/ou terminação C da protease da invenção. As proteínas de fusão marcadas diferentes podem ser feitas pelos versados na técnica e produzidos por técnicas padrão de DNA recombinante ou as técnicas convencionais incluindo sintetizadores automatizados de DNA. Tais proteínas de fusão podem facilitar a puri- ficação da protease recombinante da invenção ou a sua expressão na substância secretada em células hospedeiras. Estas técnicas são bem conhecidas dos versados na técnica.

[0065] Os Requerentes mostraram que os peptídeos grandes tal o peptídeo de gliadina 33-mer podem ser degradados em pH ácido pelas endopeptidases. O endopep-140 secretado atua clivando a cadeia de polipeptídio em vários pontos que geram pequenos peptídeos diferen- tes de seis aminoácidos (Tabela 2, Figura 5). Essa endopeptidase mostra uma preferência de sítios possuindo tirosina ou leucina ou feni- lalanina na posição P1 e prolina na posição P2 e P1'. Aumentar a quantidade da endopeptidase e/ou o tempo da incubação conduz para finalizar a degradação do polipeptídio 33-mer. De acordo com os pe- sos moleculares detectados, parece que os resíduos de glutamina são transformados a resíduos glutâmicos que assim sugerem o envolvi- mento de uma atividade de amidotransferase. As endopeptidases da composição de enzima da invenção podem operar na presença da pepsina de mamífero (Tabela 2, Figura 6).

[0066] As mesmas análises foram realizadas com endopep-40 e os resultados obtidos, mostrados na Tabela 3, indicam que esta glute- nase se comporta de mesmo modo.

[0067] O endopep-140 contém um domínio estrutural com a alta homologia a outras endopeptidases da invenção. Por exemplo, o ali- nhamento de BLAST dá a Identidade = 223/370 (60%), Positivos = 261/370 (71%) entre endopep-140 e endopep-40 ou Identidade = 227/431 (53%), Positivos = 273/431 (63%) entre endopep-140 e endo- pep-41. Os resultados semelhantes são obtidos pelo alinhamento de BLAST entre endopep40 e endopep-41, com a Identidade = 230/419 (55%), Positivos = 278/419 (66%). Os positivos são resíduos de ami- noácido que são idênticos ou muito semelhantes um a outro nas suas características fisicoquímicas como determinadas com a matriz BLO- SUM6?2.

[0068] As endopeptidases da composição de enzima da invenção podem ser produzidas pelo cultivar uma cepa de Actinoallomurus que ocorre naturalmente ou uma mutante da mesma que é capaz de pro- duzir pelo menos uma endopeptidase S8/S53 acima definida ou uma célula hospedeira obtida por técnicas recombinantes de DNA.

[0069] O termo "recombinante", quando utilizado com referência a uma célula, indica que a célula duplica um ácido nucleico heterólogo, ou expressa um peptídeo ou proteína codificada por um ácido nucleico heterólogo. Os genes não encontrados dentro da forma nativa (não- recombinante) da célula ou encontrados na forma nativa da célula em que os genes são modificados e re-introduzidos na célula por meios artificiais e podem estar contidos em células recombinantes.

[0070] A pessoa versada na técnica reconhecerá que estas células podem ser organismos transgênicos unicelulares ou multicelulares.

[0071] A invenção também inclui métodos baseados no cultivo de células que contêm um ácido nucleico endógeno à célula que foi modi-

ficada sem retirar o ácido nucleico da célula; tais modificações incluem os obtidos por substituição genética, mutação específica para o sítio, e técnicas relacionadas, por exemplo pelo tratamento com agentes mu- tagênicos ou com radiações ionizantes.

[0072] O termo "variante alélica" indica qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo local cro- mossômico. A variação alélica surge naturalmente através a mutação, e pode resultar no polimorfismo fenotípico dentro de populações. As mutações genéticas não podem ser silenciosas (nenhuma modificação no polipeptídio codificado) ou podem codificar polipeptídios que alte- ram as sequências de aminoácido. O termo variante alélica se refere também a uma proteína codificada por uma variante alélica de um ge- ne.

[0073] Assim, a presente invenção fornece um método para pro- duzir a composição de enzima da invenção que compreende:

[0074] cultivar uma cepa de Actinoallomurus que ocorre natural- mente e capaz de produzir pelo menos uma endopeptidase S8/S53 acima definida e recuperar a endopeptidase(s) da batelada de cultivo; ou

[0075] cultivo de um derivado de cepa de Actinoallomurus de uma cepa de Actinoallomurus que ocorre naturalmente capaz de produzir pelo menos uma endopeptidase S8/S53 acima definida por mutação convencional e/ou técnicas de seleção, que mantêm a capacidade de produzir pelo menos uma das endopeptidases acima definidas e recu- perar a endopeptidase(s) da batelada de cultivo; ou

[0076] uma técnica de DNA recombinante compreendendo as eta- pas de:

[0077] introduzir em uma célula hospedeira um ácido nucleico co- dificando pelo menos uma endopeptidase das selecionadas do grupo consistindo em subtilisina quequixina sedolisina da classe S8/S53:

[0078] Os endopep-140 compreendendo as SEQ ID Nº: 1, um fragmento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocorre naturalmente do mesmo, ou sequência que tem pelo menos 50%, 60%. 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade,

[0079] Os endopep-40 compreendendo as SEQ ID Nº: 2, um frag- mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou sequência que tem pelo menos 50%, 60%. 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade,

[0080] Os endopep-120 compreendendo as SEQ ID Nº: 3, um fragmento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocorre naturalmente do mesmo, ou sequência que tem pelo menos 50%, 60%. 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade,

[0081] Os endopep-60 compreendendo as SEQ ID Nº: 4, um frag- mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou sequência que tem pelo menos 50%, 60%. 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade, e e) Os endopep-41 compreendendo as SEQ ID Nº: 5, um fragmento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocorre natu- ralmente do mesmo, ou sequência que tem pelo menos 50%, 60%. 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade, 2) cultivo da célula da etapa 1) em um meio de cultura sob condições adequadas para produzir a endopeptidase(s), e

[0082] recuperação da endopeptidase(s) da batelada de cultivo.

[0083] Uma ou mais as endopeptidases da invenção podem ser produzidas na execução de um método como acima definido. Quando as endopeptidases simples são separadamente produzidas executan- do o método definido acima, a presente invenção inclui opcionalmente a etapa de combinar duas ou mais das endopeptidases obtidas para fornecer uma composição de enzima contendo uma mistura das endo- peptidases acima citadas. As ditas endopeptidases podem ser obtidas como endopeptidases isoladas. Com o termo "endopeptidase isolada", tal como utilizado aqui, é definida uma forma purificada da endopepti- dase que é substancialmente sem outras proteínas ou material celular da célula da qual a endopeptidase é derivada.

[0084] Todos os termos de ácido nucleico de DNA/RNA também mencionando as suas técnicas de manipulação relacionadas aqui usa- das são bem conhecidas dos peritos na técnica de biologia molecular e por enquanto estes termos são utilizados em toda a sua significação ampla e comum tal como informado em Maniatis T., Fritsch E.F., Sam- brook J. "Molecular cloning: a laboratory manual" Cold Spring Harbor, NY, 1982 ou Ausubel F.M. "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley & Sons, Nova lorque, NY, 1993 ou Sambrook et al., "Mo- lecular Cloning: a Laboratory Manual 2 Nº Ed.", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

[0085] Os ácidos nucleicos codificando as endopeptidases da composição de enzima da invenção são um objetivo adicional da in- venção que inclui os ácidos nucleicos cujas sequências são fornecidas aqui e definidas como as SEQ ID Nº: 7, 8, 9, 10 ou 11 ou fragmentos das mesmas. A invenção também inclui ácidos nucleicos mutantes ou variantes ou porção destes ácidos nucleicos.

[0086] Consequentemente, os ácidos nucleicos da presente inven- ção incluem uma sequência de polinecleotídeos mostrada em SEQ ID Nº: 7, 8, 9, 10 ou 11 ou uma sequência que tem pelo menos 50%, pre- ferivelmente 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mesmo mais preferivelmente 80%, ainda mais preferivelmente 90% e bem mais pre- ferivelmente pelo menos 95% de identidade com a sequência de ácido nucleico compreendendo as SEQ ID Nº: 7, 8, 9, 10 ou 11 e está codifi- cando uma sequência de aminoácido que ainda está mantendo a ativi- dade biológica e função fisiológica da dita sequência de aminoácido.

[0087] As sequências caracterizadas pela identidade ao nível de nucleotídio são indicadas aqui também como "sequências de ácido nucleico homólogas" ou variações do mesmo. As sequências de nu- cleotídio homólogas codificam aquelas sequências codificação de iso- formas de proteases da invenção. As isoformas podem ser expressa- das no mesmo organismo em consequência de, por exemplo, o en- trançamento alternativo de RNA. Alternativamente, as isoformas po- dem ser codificadas por genes diferentes.

[0088] As sequências de nucleotídio homólogas também incluem, mas não são limitadas a, variações alélicas naturalmente ocorrem e mutações das sequências de nucleotídio apresentadas aqui. As se- quências de ácido nucleico homólogas incluem aquelas sequências de ácido nucleico que codificam substituições de aminoácido conservati- vas em SEQ ID Nº: 1,2, 3,4 ou 5.

[0089] Na invenção, as sequências de nucleotídio homólogas po- dem incluir sequências de nucleotídio codificando uma protease da invenção de outras espécies que pertencem a Actinoallomurus bem como de gêneros Actinoallomurus diferente, tal como, por exemplo, Catenulispora, Actinospica, Ktedonobacter, Streptomyces, Streptacidi- bphilus, Micromonospora, Rugosimonospora.

[0090] Requerentes determinaram pela análise de BLAST que os genomas de Catenulispora, Ktedonobacter, Streptomyces contêm ge- nes que codificam para proteínas a homologia tendo mais do que de 50% com a protease correspondente da invenção; por exemplo, as proteínas putativas com números de acesso ACU72534 e ACU72320 de Catenulispora acidiphila têm a Identidade = 261/400 (65%), Positi- vos = 295/400 (74%) com SEQ ID NO endopep-40:2 e Identidade = 705/1342 (53%), Positivos = 878/1342 (65%) com SEQ ID NO endo- pep-140:1 respectivamente, ou proteína putativa com o número de a- cesso EFH81837 de Ktedonobacter racemifer tem a Identidade = 244/402 (61%), Positivos = 299/402 (74%) com SEQ ID Nº endopep-

40:2, ou Streptomyces sp. a sequência de proteína de e14 com o nú- mero de acesso EFF91270 tem a Identidade = 230/371 (62%), Positi- vos = 274/371 (74%) com SEQ ID Nº endopep-40:2, também. A endo- peptidase homóloga que codifica os genes pode estar presentes em cepas que pertencem ao filogeneticamente de gêneros relacionado ao acima mencionado cujas sequências genômicas não estão disponíveis por bancos de dados públicos.

[0091] Um "fragmento biologicamente ativo" da endoprotease da invenção pode ser preparado isolando um fragmento de ácido nucleico das SEQ ID Nº“: 7, 8, 9, 10 ou 11, que codifica uma endoprotease com a mesma atividade biológica das endoproteases da invenção, expres- sando a porção codificada da endoprotease (por exemplo, segundo a expressão recombinante in vitro) e avaliação da atividade do fragmen- to codificado da endoprotease. A invenção adicionalmente abrange moléculas de ácido nucleico que se diferenciam das sequências de ácido nucleico mostradas em SEQ ID Nº“: 7, 8, 9, 10 ou 11 devido à degeneração do código genético e assim codificam as mesmas prote- ases que são codificadas pelas sequências de ácido nucleico mostra- das em SEQ ID Nº: 7, 8, 9, 10 ou 11.

[0092] As técnicas de manipulação genética e a expressão de pro- teína são conhecidas aos versados na técnica e podem ser encontra- das também em Kriegler M. "Gene Transfer and Expression: A Labora- tory Manual" Stockton Press, NY, 1990.

[0093] Os requerentes indicaram com o termo "atividade biológica" ou "atividade funcional" a função natural ou normal das proteases da invenção, por exemplo, a capacidade de degradar outras proteínas. Os resíduos de aminoácido que são conservados entre as proteases da invenção são preditos para ser particularmente não-acessíveis à alte- ração. Os aminoácidos para os quais as substituições conservativas podem ser feitas são bem conhecido dentro da técnica. Como todas as pessoas versadas na técnica reconhecem, cada códon em um ácido nucleico (à parte do AUG, que é ordinariamente o único códon da me- tionina) pode ser modificado para produzir uma molécula funcional- mente idêntica por técnicas padrão. Além disso, as substituições indi- viduais, eliminações ou adições que se alteram, acrescentam ou elimi- nam um aminoácido único ou uma pequena percentagem de aminoá- cidos (tipicamente menor do que 5%, mais tipicamente menor do que 1%) em uma sequência codificada são "mutações conservativas" onde as alterações resultam na substituição de um aminoácido com um a- minoácido quimicamente semelhante.

[0094] Outro aspecto da invenção pertence a moléculas de ácido nucleico codificando as proteases da invenção que contêm modifica- ções em resíduos de aminoácido que não são essenciais para a ativi- dade. Tais proteases da invenção diferenciam-se na sequência de a- minoácido das SEQ ID Nº: 1, 2, 3, 4 ou 5, ainda conserva a atividade biológica. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico isolada compreende uma sequência de nucleotídio codificando uma protease, em que a protease compreende uma sequência de aminoácido com a identidade pelo menos aproximadamente de 50% às sequências de aminoácido das SEQ ID Nº“: 1, 2, 3,4 ou 5.

[0095] O termo "ácido nucleico isolado" ou "sequência isolada de polinucleotídio", tal como utilizado aqui, identifica uma molécula de á- cido nucleico que é separada de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes na célula da qual o ácido nucleico é derivado e é substancialmente sem outro material celular ou material de meio de cultura quando a molécula de ácido nucleico de dita é obtida de uns microrganismos naturalmente ocorrem, um derivado de microrganismo disto, ou microrganismos obtidos por técnicas recombinantes.

[0096] Uma molécula de ácido nucleico isolada codificando uma endoprotease da invenção homóloga à proteína das SEQ ID Nº: 1, 2,

3, 4 ou 5, pode ser criado introduzindo uma ou mais substituições de nucleotídio, adições ou eliminações na sequência de ácido nucleico das SEQ ID Nº“: 7, 8, 9, 10 ou 11, de tal modo que uma ou mais as substituições de aminoácido, as adições ou as eliminações são intro- duzidas na protease codificado. As mutações podem ser introduzidas em SEQ ID Nº“: 7, 8, 9, 10 ou 11, por técnicas padrão, mutagênese dirigido para o sítio tal como, mutagênese mediado por PCR e rearran- jo de DNA. Alternativamente, as mutações podem ser introduzidas a- leatoriamente ao longo de tudo ou parte de uma sequência de codifi- cação da protease da invenção, tal como pelo mutagênese de satura- ção, e os mutantes resultantes podem ser avaliados para a atividade biológica da protease da invenção para identificar mutantes que con- servam a atividade.

[0097] A composição de enzima de glutenase de acordo com a presente invenção também pode ser utilizada na forma imobilizada e utilizada, por exemplo, para o tratamento de alimentos líquidos. A composição de enzima da invenção também pode ser utilizada no fruto e indústria de cerveja de limpeza de equipamento e manutenção. Por exemplo, um glúten permite-se que o alimento contendo líquido flua ao longo de uma matriz permeável para o glúten no qual a composição de enzima da invenção é incorporada. O glúten é extraído do alimento e digerido pela ação das enzimas. A composição de enzima da invenção também pode contribuir para a energia disponível do alimento. Por e- xemplo, uma prolina parcialmente ou indigerível - compreendendo pro- teína é totalmente ou parcialmente degradada pela composição de en- zima da invenção, a disponibilidade resultando em um alimento mais digerível para humano ou animal. Desse modo, a taxa de crescimento e/ou razão de conversão de alimento (isto é, o peso do alimento ingerido em relação a ganho de peso) do humano ou do animal é me- lhorado.

Métodos de Produção das Endopeptidases e a sua Caraterização

[0098] A presente invenção também se refere a métodos para produ- Zzir as enzimas da presente invenção compreendendo cultivando (a) uma cepa, que na sua forma de tipo selvagem, ou (b) uma forma derivada dis- to por técnicas de mutação comuns, por exemplo, pelo tratamento com agentes mutagênicos ou com radiações ionizantes, ou (c) uma célula hospedeira que é capaz de produzir o polipeptídio da invenção, e recupe- rar o dito polipeptídio da batelada de cultivo. Nos métodos de produção da presente invenção, os meios do cultivo de célula são diferentemente selecionados entre os conhecidos na técnica pela produção de proteína de acordo com o cultivo de cepas de tipo selvagens, derivado de cepas disto, ou células hospedeiras recombinantes. O cultivo realiza-se em um meio nutritivo adequado compreendendo carbono e fontes de nitrogênio e sais inorgânicos, utilizando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou po- dem estar preparadas composições publicadas de acordo com (por exemplo, nos catálogos da Coleção de Cultura de Tipo Americana). Por exemplo, o meio contendo soja mais tem tendência de permitir a produ- ção de enzimas da invenção por microrganismos de tipo selvagens.

[0099] As células podem ser cultivadas pelo cultivo de frasco de sacu- didela, fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fer- mentação contínua, em batelada, em batelada alimentada ou no estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais executados em um meio adequado e sob condições que permitem o polipeptídio ser expres- sado e/ou isolado. Se o polipeptídio for secretado no meio nutritivo, o poli- peptídio pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídio não for secretado, pode ser recuperado de lisados de célula. Várias atividades proteolíticas são produzidas e o cultivo é suspenso quando a produção da endopeptidase atingiu um máximo. Depois da realização do cultivo, o meio de cultura é filtrado de separar corpos microbianos, e o filtrado é processado do modo habitual da coleção da endopeptidase por vários procedimentos em combinação, ultrafiltração tal como, a concentração sob reduziu a pressão, salgadura fora, precipitação por solvente orgâ- nico, diálise, filtração de gel, cromatografia adsorvente, cromatografia de troca iônica, electro-focagem, e congelar a vácuo. Os procedimen- tos adequados devem ser selecionados considerando as propriedades físicas e químicas desejadas de endopeptidases.

[00100] Um exemplo representativo da produção de endopeptida- ses da presente invenção cultivando o tipo selvagem cepa de Actinoal- lomurus é fornecido no Exemplo 1 daqui por diante. A endopeptida- se(s) da invenção pode ser purificada ao grau desejado da pureza que pode depender do uso desejado e da atividade específica da endopep- tidase(s). Expressão Heteróloga em Células Hospedeiras

[00101] As células recombinantes e os microrganismos podem ser utilizados para produzir as endopeptidases da presente invenção. A célula hospedeira pode ser qualquer das células hospedeiras familia- res para a pessoa versada na técnica, incluir células procarióticas, cé- lulas eucarióticas, células de mamífero, células de inseto, células fún- gicas, células de levedura e/ou células de planta. A seleção de um hospedeiro adequado é dentro das capacidades da pessoa versada na técnica.

[00102] Os microrganismos úteis são células bacterianas bactérias de positivo de grama tais como inclusive, mas não limitados a, uma célula de Bacillus (por exemplo, Bacillus subtilis, Bacillus cereus) ou uma célula de Streptomyces, ou as células das bactérias de ácido láti- co, ou bactérias gram negativas tal como E. coli e Pseudomonas. As células de produção preferidas incluem aquelas de organismos conhe-

cidos por serem geralmente considerados como seguros, tais como o Lactobacillus procariótico, Pyrococcus, Bacillus, Streptomyces, e o As- pergillus eucariótico. As células mais preferidas incluem aquelas que já são usadas na preparação de gêneros alimentícios, tal como Lactoba- cillus spp. e/ou Aspergillus oryzae.

[00103] A produção extracelular das enzimas pode ser obtida de microrganismos tal como Aspergillus oryzae, Lactobacillus casei, Kluy- veromyces lactis ou Streptomyces lividans.

[00104] A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacteria- na pode ser, por exemplo, feita pela transformação de protoplasto (por exemplo, Chang S., Cohen S.N. "High frequency transformation of Bacil- lus subtilis protoplasts by plasmid DNA" Mol. Gen. Genet., 1979, 168, 111-115), utilizando células competentes (por exemplo, Dubnau D., Da- vidoff-Abelson R. "Fate of transforming DNA following uptake by compe- tent Bacillus subtilis. |. Formation and properties of the donor-recipient complex" J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221), eletroporação (por exemplo, Shigekawa, K., Dower W. J. "Electroporation of eukaryotes and prokary- otes: a general approach to the introduction of macromolecules into cells" Biotechniques, 1988, 6, 742-751) ou conjugação (por exemplo, Koehler T.M., Thorne C.B. "Bacillus subtilis (natto) plasmid pl S20 mediates in- terspecies plasmid transfer" J. Bacteriol., 1987, 169, 5771-5278).

[00105] Os organismos multicelulares úteis a serem utilizados como células hospedeiras são, por exemplo, plantas, partes de planta, se- mentes ou células de planta. Os organismos multicelulares produzem preferidos são, por exemplo, colheitas de alimento transgênicas, grãos tais como, ou verduras, tomate tal como, que contêm os ácidos nuclei- cos codificando as proteases da invenção.

[00106] Um exemplo representativo da produção de endopeptida- ses da presente invenção em células hospedeiras recombinantes é dado no Exemplo 2 daqui por diante.

Formulações Farmacêuticas

[00107] Os reagentes de endopeptidase da presente invenção po- dem ser administrados sozinhos ou incluídos em diversas formula- ções. Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com a sua via desejada da administração, que é preferi- velmente a administração oral. Por exemplo, já que alguns endopepti- dases da composição de enzima da invenção são secretados, uma preparação bruta obtida do meio de cultura de células de Actinoallo- murus ou outros microrganismos recombinantes unicelulares úteis bactérias de positivo de grama tais como inclusive, mas não limitaram a, uma célula de Bacillus, célula de Streptomyces, as células de bacté- rias de ácido lático, bactérias de gram negative E. coli tal como, podem ser administradas oralmente. As bactérias de ácido lático incluem, mas não são limitadas a, as espécies dos gêneros Lactococcus, Lactobacil- lus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, e Enterococcus. Alter- nativamente, a composição de enzima da invenção pode ser adminis- trada oralmente depois da purificação.

[00108] Tais formulações podem estar preparadas com os ingredi- entes adequados gerar uma preparação na forma líquida, por exemplo na forma de uma solução, emulsão, ou em forma sólida, pastilhas tais como, cápsulas, ou semissólido. A formulação da composição de en- zima pode ser administrada de diversos modos inclusive os particu- larmente adequados para misturar-se com gêneros alimentícios. Os componentes de enzima podem ser ativos antes de ou durante a in- gestão, e podem ser tratados, por exemplo, por uma encapsulação adequada, para controlar a cronometragem da atividade.

[00109] Para preparar uma composição farmacêutica adequada das endopeptidases da presente invenção o método qualquer da estabili- zação do material químico ou biológico conhecido na técnica, compre- endendo os baseados em irradiação ou modulação de temperatura ou as suas combinações, pode ser utilizado.

[00110] Para tratar a doença celíaca, as composições farmacêuti- cas empregadas são preferivelmente formuladas para liberar a sua atividade no fluido gástrico. Este tipo de formulações fornecerá a ativi- dade ótima no lugar certo, por exemplo, o lançamento das endoprote- ases da invenção no estômago.

[00111] —Alternativamente um microrganismo, tal como uma cultura bacteriana ou cultura de levedura, capaz de produzir os reagentes ati- vos pode ser administrado a um paciente. Tal cultura pode ser mista com preparações de alimento ou formulada, por exemplo, como uma cápsula entérica.

[00112] A presente invenção adicionalmente fornece um comple- mento alimentício compreendem a composição de enzima da presente invenção. O termo "complemento alimentício" no contexto da presente invenção é o aditivo de alimento intercambiável com os termos, um suplemento dietético e o suplemento nutricional.

[00113] O complemento alimentício da invenção pode ser formula- do, preparado, fornecido e dispensado tal como descrito em outros do- cumentos anteriores quanto ao campo da presente invenção (WO2011/077359, WO 2003/068170, WO2005107786) que fornecem métodos para tratar e/ou prevenir uma síndrome associada com uma doença humana, disse doença que é selecionada do grupo compreen- dendo doença celíaca, dermatitis herpetiformis, tratado digestivo má absorção, uma reação alérgica, uma deficiência de enzima, uma infec- ção fúngica, doença de Crohn, micoses e psilose.

[00114] Como um exemplo, o complemento alimentício da invenção pode ser uma enzima granulada produto revestido ou não revestido que pode ser prontamente misto com componentes de alimento, alter- nativamente, os complementos alimentícios da invenção podem formar um componente de uma premistura. Alternativamente, os complemen-

tos alimentícios da invenção podem ser um líquido estabilizado, pasta fluida aquosa ou baseada no óleo. A composição de enzima da inven- ção pode ser fornecida pela expressão as enzimas diretamente em colheitas de alimento transgênicas (como, por exemplo, plantas trans- gênicas, sementes e assim por diante), grãos tais como, cereais, mi- lho, feijão de soja, colza, lupino.

[00115] A composição farmacêutica ou o complemento alimentício da invenção podem ser fornecidos antes de refeições, imediatamente antes de refeições, com refeições ou imediatamente depois de refei- ções, para que as endoproteases da composição de enzima da pre- sente invenção sejam liberadas ou ativadas no lúmen gastrintestinal superior onde as endoproteases podem completar enzimas gástricas e pancreáticas para desintoxicar o glúten ingerido e prevenir peptídeos perigosos passar a camada de eritrócitos.

[00116] A composição de enzima da presente invenção tem aplica- ções numerosas na indústria de processamento de alimentos, particu- larmente eles podem ser utilizados na produção de complementos ali- mentícios tais como descrito nos documentos anteriores acima men- cionados.

[00117] Desta descrição resulta evidente que um objetivo adicional da presente invenção consiste no fornecimento de um método de de- gradação de oligopeptídeos do glúten que são resistentes à clivagem por enzimas gástricas e pancreáticas e cuja presença no lúmen interno resulta em efeitos tóxicos que compreende o contato dos ditos oligo- peptídeos do glúten com uma composição de enzima ou pelo menos uma endopeptidase isolada da presente invenção. Especialmente, um aspecto do método de dita consiste no tratamento ou a prevenção da psilose celíaca, dermatitis herpetiformis e/ou outro distúrbio qualquer associado com a intolerância ao glúten que com- preende a administração a um paciente que esteja necessitando do mesmo de uma quantidade eficaz de uma composição de enzima ou de pelo menos uma endopeptidase isolada da presente invenção, pre- ferivelmente, incorporado em uma formulação farmacêutica, comple- mento alimentício, bebida ou bebida. Exemplos Exemplo 1: Identificação e caraterização de endopeptidases de Actinoallomurus sp. DSM 24988 Cultivo de Cepa e Produção de Proteína

[00118] A cepa de Actinoallomurus utilizada de acordo com a pre- sente invenção deriva da coleção de cepa de Requerentes.

[00119] — Actinoallomurus sp. DSM 24988 foi mantida no meio de á- gar-ágar ISP2 (Shirling e Gottlieb, 1966) acidificado em pH 5,5 com HCI. O teor microbiano de uma placa foi raspado e inoculado em um frasco Erlenmeyer de 50 ml contendo 15 ml do meio AF5 que é com- posto de: (g/I) dextrose 20, extrato de levedura 2, farelo de soja 8, Na- CI 1 e MES 10. O meio foi preparado em água destilada e pH ajustado a 5,5 antes de esterilização em 121 por 20 min. O frasco inoculado foi cultivado em 28T, em um agitador rotativo que gira a 200 rpm. De- pois de incubação de 5-6 dias, 5% da cultura foram inoculados em uma segunda série de frascos Erlenmeyeres de 500 ml contendo 100 ml do mesmo meio de fermentação. A produção de proteína foi reali- zada em frascos incubados durante 15 dias em 28€T em um agitador rotativo que gira a 200 rpm. A produção da proteína foi controlada pelo bioensaio tal como descrito abaixo.

[00120] Várias atividades proteolíticas são produzidas e o cultivo é suspenso quando a produção de endopeptidases, seguidos dos ensai- os descritos abaixo, atingiu um máximo. A fermentação foi colhida de- pois de 15 dias e o caldo foi centrifugado em 4000 rpm durante 15 mi- nutos. O meio de cultura foi filtrado de separar corpos microbianos, e o filtrado foi processado. Os procedimentos adequados foram seleciona-

dos considerando as propriedades físicas e químicas desejadas de endopeptidases. Determinação de Atividades Proteolíticas

[00121] As atividades de enzima foram medidas em pH diferente no tampão acetato (acetato de amônio - AMAC, concentração de final de 50 mM, pH 4,0 a 8,0; 20mM ácido acético, pH3,0) em 37 TC em um vo- lume total de 0,2 ml.

[00122] A atividade enzimática da endopeptidase foi determinada medindo a hidrólise de Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC (Amino-Metil- Cumarina) como substrato (Bachem AG, Hauptstrasse 144, 4416 Bu- bendorf, a Suíça).

[00123] As soluções de estoque de substrato foram preparadas na concentração de 10 mM e guardadas a -20C. O substr ato foi prepara- do de 10-20 ul de solução de metanol de 60% contendo 2mM Succinil- Ala-Ala-Pro-Phe-AMC e solução de tampão acetato de 50-150 ul. À mistura reacional conteve uma concentração do substrato de 0,2 mM e a preparação de enzima (entre 10-40 ul ou 1,0 ug por ensaio) no tam- pão acetato de 200 ul por valores de pH diferentes.

[00124] Ao substrato, que tinha sido anteriormente aquecido a 37*C durante 10 minutos, 10-40 ul da solução de enzima foi acrescentado, e a reação foi realizada em 37T até duas horas. O AM C liberado foi medido com um leitor de microplaca Fusion (Perkin Elmer Italia SpA, Monza, Italia) em um comprimento de onda de excitação de 360nm e um comprimento de onda de emissão de 460nm.

[00125] Como controle, o substrato foi incubado sem enzima. A atividade enzimática para liberar 1 mmol de AMC em 1 minuto é de- finida como 1 Unidade. Purificação de Endopeptidase

[00126] O micélio foi separado do meio de cultura pela filtração de papel (Miracloth de Calbiochem, USA). Depois disso, 200 ml do sobre-

nadante foram centrifugados durante 10 minutos em 5000 rpm para retirar o entulho, depois o sobrenadante foi adicionalmente centrifuga- do em 10000 rpm de 20 min em 4 para retirar a fração não solúvel. As proteínas foram precipitadas do sobrenadante pelo etanol (1:4 v/v) ou saturação de 20-75% de sulfato de amônio. O granulado foi resus- penso e dializado, na ocorrência concentrada utilizando um Centricon mais -70 com um 5 kDa cut-off (Millipore, Bedford, Mass., USA). À presença de proteases capazes de hidrolisar Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe- AMC foi destacada quando testado em pH5. As alíquotas da suspen- são de proteína depois da diálise foram fervidas para ser submetidas à análise de MS-shotgun. O procedimento fervente é necessário para evitar digestão de auto. Pelo menos 5 proteínas que pertencem aa protease de família S8/S53 foram detectadas.

[00127] As proteínas resuspensas foram cromatografadas na resina de troca iônica Amberlite IRA900 (Alfa Aesar GmbH, o Karlsruhe, a 76185 Alemanha) ou celulose de DE-52 (Whatman Intra. Ltd, Maidsto- ne Inglaterra) ou outra matriz; as frações obtidas foram testadas para a hidrólise Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC e as frações ativas juntadas submetidas a 1D-SDS-PAGE e análise zimográfica.

[00128] As proteínas foram adiconalmente fracionadas pela filtração de exclusão de tamanho no cut-off de peso molecular 300 kDa, 100 kDa, 50kDa,30 kDa, 10 kDa (Nanosep Pall, Michigan. USA, Vivaspin Sartorius GmbH 37070 Goettingen, Alemanha). A sua atividade foi tes- tada tal como descrito. As frações ativas com o peso molecular dife- rente foram obtidas. As alíquotas destas frações foram fervidas e ana- lisadas por MS-shotgun.

[00129] As proteínas foram separadas por eletroforese em 10% homogêneos ou gel do disco 4-15% ou gel de poliacrilamida para qualquer kD (Bio-Rad, Hércules, 9640, CA, USA) depois corando com o R-250 azul Brilhante Coomassie (Bio-Rad) ou de prata (SIGMA-

Aldrich, USA) ou por corando de atividade de enzima (zimografia) rea- lizada incubando o gel em 37 (TC com 50-100 uM do sub strato fluores- cente Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC em pH desejado.

[00130] Duas endopeptidases que pertencem à família S8/S53 fo- ram purificados até que a análise eletroforética mostrasse a presença de uma banda única como detectado tanto por coloração por sal de prata como por zimografia.

[00131] A primeira endopeptidase foi obtida depois da filtração de peso molecular: foi conservada em um cut-off > 100 kDa. A análise de shotgun-MS da parte alíquota fervida correspondente revelou a presen- ça de endopep-140, SEQ ID Nº: 1 (Tabela 1A), com um peso molecular de 142449.4 e uma pl teórica de 5,18; os traços de duas outras proteí- nas foram detectados. Esta fração de proteína resultou ativa na varie- dade de pH 4 para 8 com uma condição favorável de pH 5 (Figura 2). Quando testado em pH 3 a enzima mostra 95% da sua atividade em pH depois de 30 minutos da incubação em 37 (Figura 3). Esta fração de proteína resultou mais eficiente em digestão 33-mer do que na hidró- lise do Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC como mostrado no exemplo 3.

[00132] A segunda glutenase, indicada como endopep40, SEQ ID Nº: 2, foi contida na fração de proteína de cut-off <100kDa (Tabela 1B) com um peso molecular de 39908.4 e uma pl teórica de 5.94. Esta pro- teína resultou ativa na variedade de pH 4 para 6 com uma condição favorável de pH 5. Quando testado em pH 3 a enzima mostra 85% da sua atividade em pH 5 depois de 30 minutos da incubação em 37C (Figura 3). A banda fluorescente destacada pela zimografia mostra um peso molecular de aproximadamente 40KkDa. A proteína ativa eluída da banda de gel ou o tamanho molecular correspondente retentado de cut-off foram caracterizados para a atividade enzimática. A análise de shotgun-MS revelou a presença de outras proteínas; os sinais que in- dicam a presença de sequências endopep-140 podem ser devido a polipeptídios menores (<100 kDa) formados pela sua degradação. Outras três endopeptidases (indicadas como endopep-120, SEQ ID Nº: 3, endopep-60, SEQ ID Nº: 4, endopep-41, SEQ ID Nº: 5) não foram purificadas à homogeneidade. A sua presença foi detectada por MS- shotgun no secretoma e nas frações ativas das primeiras etapas de purificação. A análise de MS-shotgun permitiu a identificação da sua sequência de aminoácido, aqui informou. Os requerentes denomina- ram as proteínas de acordo com o seu peso molecular inferido. Deste modo, o endopep-120 tem um peso molecular de 112012.8 e uma pl teórica de 6,75, o endopep-60 tem um peso molecular de 59646,0 e uma pl teórica de 6,02, o endopep-41 tem um peso molecular de

41646. 1 e uma pl teórica de 5.22. Análise de MS de Proteína: experimentos de shotgun MS.

[00133] Hoje, as metodologias de proteômico têm a importância primária de biomarcador dirigido pela descoberta ou estudos de cara- terização de proteína.

[00134] A aproximação de proteômico clássica é baseada no eletro- forese de gel d-dimensional (2DG), onde as manchas de proteína do interesse são isoladas e identificadas pela espectrometria de massa (MS). O 2DG a aproximação tem uma relativamente alta resolução, que é limitada entretanto pela dificuldade no detectando de certas classes de proteínas. Estes incluem proteínas de membrana devido à sua solubilidade baixa no tampão de eletroforese de gel, proteínas com um qualquer baixo (<10 kDa) ou alto (> 200 kDa) peso molecular, bem como aqueles ponto isoelétrico com um extremo (pl <4 ou> 9). Uma limitação adicional desta aproximação reside na dificuldade na análise de proteínas menor representadas e no fato que é tedioso e demorado.

[00135] Estes problemas são resolvidos utilizando uma nova meto- dologia proteômica baseada na cromatografia capilar bi-dimensional ligada à espectrometria de massa de tandem (2DC-MS/MS), também denominado MudPIT (Tecnologia de Identificação de Proteína Multidi- mensional) (Washburn, M.P., Wolters D., Yates J.R. 3o "Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identificati- on technology" Nat. Biotechnol., 2001, 19, 242-7). Ela envolve a gera- ção de peptídeos de digestão enzimática de uma mistura de proteína complexa, a sua separação por meio de duas colunas micro-HPLC e análise direta de picos eluídos pelo MS/MS. 2DC-MS/MS troca iônica de associações com separação de fase reversa de misturas de peptí- deo obtidas de digestão direta (ou pre-fracionada) de proteínas totais. Especialmente, as misturas de peptídeo são primeiro separadas por meio da cromatografia de troca iônica (coluna SCX, 5 um, 0,3 ID x150 mm) utilizando de sete etapas da concentração de cloreto de amônio crescente (O a 1000 mM). Cada etapa de sal é diretamente carregada sobre a coluna de fase reversa (C1g, 0.180 ID x 100 mm) e separada com um gradiente de acetonitrila: eluente A, 0,1% de ácido fórmico em água; eluente B, 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila. Os peptídeos eluídos da coluna C,; são analisados diretamente com um espectrô- metro de massa de armadilha de fon; o limite da detecção é aproxima- damente 10 fmol ou menor. Os espectros são adquiridos no modo po- sitivo (tipicamente na faixa de 400-1600 m/z) utilização de exclusão dinâmica da análise de MS/MS. As proteases diferentes são usadas para digerir o extrato de proteína de amostras (tripsina, pepsina ou proteinase K).

[00136] A identificação das proteínas correspondentes é depois ob- tida através uma pesquisa de banco de dados automatizada com o software adequado, tal como o algoritmo SEQUEST (Eng, J. K., Mc- Kormack, A. L., Yates, J. R. "An Approach to Correlate Tandem Mass Spectra Data of Peptides with Amino Aminoacid Sequences in a Prote- in Database" J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1994, 5, 976-984) para ma-

nejo de dados de espectros de massa. Os espectros de massa expe- rimentais produzidos são correlacionados a sequências de peptídeo obtidas pela comparação com os espectros de massa teóricos no ban- co de dados de proteína carregado do NCBI (www.ncbi.nIm.nih.gov) ou outros sites da web. Critérios de Identificação de Proteína

[00137] As identificações de peptídeo foram aceitas se eles podem ser estabelecidos em uma probabilidade maior do que 90,0% como especificado pelo algoritmo de Peptide Prophet (Keller A., Nesvizhskii A.l., Kolker E., Aebersold R. "Empirical statistical model to estimate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and database search" Anal. Chem., 2002, 15, 5383-92). As identificações de proteína foram aceitas se elas podem ser estabelecidas em maior do que a probabilidade de 95,0% e contiveram pelo menos um peptídeo identifi- cado. Como a identidade de não mais de 50% foi encontrada com os bancos de dados públicos de proteína, o genoma de Actinoallomurus foi sequenciado e traduzido para 6 fases de leitura possíveis. O ali- nhamento subsequente por BLAST dos peptídeos detectados contra as proteínas putativas do Actinoallomurus identificou as proteínas ho- mólogas conhecidas.

[00138] Um total de 94 proteínas foi putativamente identificado no secretoma de Actinoallomurus. As enzimas constituíram uma fração significante delas, 17 enzimas proteolíticas foram detectadas, e as gli- cosidases, lipases, fosfatases ácidas e diesterases também foram en- contradas. Nenhuma função pode ser verificada pela análise de BLAST para 25 sequências.

[00139] Entreas proteases, cinco proteínas que pertencem à famí- lia de peptidase S8/S53 puderam ser detectadas, duas das quais esti- veram entre as proteínas mais representadas.

[00140] As mesmas análises foram realizadas sobre todas as eta-

pas de purificação subsequentes até que só poucas sequências fos- sem detectadas.

[00141] Os dados obtidos pela análise de MS das frações ativas fervidas mostraram poucas sequências de proteína embora uma ban- da única estivesse presente no gel de SDS-PAGE corado por sais de prata. Como mostrado na Tabela 1, endopep-140 (SEQ ID Nº: 1) e en- dopep-40 (SEQ ID Nº: 2) foram detectadas como as proteínas respon- sáveis de duas atividades descritas. A presença de endopep-140 na amostra identificada como <100 kDa é possivelmente devido à degra- dação parcial da proteína em polipeptídios menores.

[00142] A análise de in silico indicou que tanto a endopep-140 como a endopep-40 são proteínas glicadas contendo um peptídeo de sinal que leva a substância secretada que sugere que elas podem ser pro- duzidas como pre-proenzimas.

[00143] A análise de in silico agrupou todos os cinco endopeps na família S8/S53 e indicou que todos são proteínas glicadas. A alta ho- mologia foi encontrada entre endopep-140, endopep40 e endopep-41 (SEQ ID Nº: 5) permitindo o agrupamento em um subgrupo tal como mostrado pela árvore filogenética da Fig.1. Uma sequência de peptí- deo de sinal foi detectada também para endopep-60 (SEQ ID Nº: 4), enquanto ela estava ausente nas endopep-120 (SEQ ID Nº: 3) e endo- pep-41.

[00144] A árvore filogenética mostrada na Figura 1 destacou a novi- dade dessas glutenases S8/S53, que não se agrupam com kumamolisi- na nem sedolisina nem com as enzimas de tripeptidil peptidase (sedA a sedD) divulgadas na WO 2011/077359, que pertencem à família S53.

[00145] A novidade destas enzimas foi adicionalmente apoiada pela especificidade de substrato, como mostrada no Exemplo 3. O padrão de degradação dos 33-mer obtido por digestão com o endopep-140 ou endopep-40 mostrou uma atividade endo-proteolítica.

Exemplo 2: produção de endopeptidase em células hospedeiras recombi- nantes

2.1 Cepas e Plasmídios.

[00146] — Actinoallomurus sp. DSM 24988 foi utilizado neste estudo. To- dos os experimentos de subclonagem de plasmídio foram executados em E. coli DHIOB (Invitrogen, Carlsbad, CA) utilização do plasmídio pTZ57R/T (Fermentas, UAB, a Lituânia).

[00147] — Escherichia coli BL21 (DE3) Star (Novagen Italia, Podenzano, PC) foi utilizada para produzir peptidases heterólogas (recombinantes).

2.2 Produção de Protease Recombinante.

[00148] As proteases de Actinoallomurus recombinantes foram produ- zidas e purificadas de Escherichia coli BL21 (DE3) Star utilizada como o sistema de expressão.

[00149] Para construir cepas de E.coli que produzem Endopep-140 e as sequências de nucleotídio Endopep-40 dos genes foram amplificados utilizando o seguinte conjunto de iniciadores:

[00150] Fendopep-140 5-AAMAAAGCTTCAGCTACAGGTGTGGTCGG-3' SEQ ID Nº: 12

[00151] Rendopep-140 5-AAAAAAACATATGCCCGATCTTCCCACCC-3' SEQ ID Nº: 13

[00152] Fendopep-40 5'-AMAAAGCTTCAGAAGGCTCCGGTGECC-3' SEQ ID Nº: 14

[00153] Rendopep-40 5-AMAAAAACATATGTCACGACGCGTGACCG-3'SEQ ID Nº: 15

[00154] Os produtos PCR foram clonados no vetor pTZ57R/T e se- quenciados antes da clonagem no vetor de expressão para verificar que nenhuma mutação tinha sido introduzida durante as amplificações PCR.

[00155] Depois os genes de endopep foram clonados nos sítios Ndel- Hindlll do plasmídio pET28b (Novagen) e transformados no BL21 de hospedeiro de expressão (DE3) Star.

[00156] As células transformadas foram cultivadas em culturas de 50 ml de meios LB contendo 30u/ml da canamicina em 37C até que OD600 0,6-1 fosse atingido. A expressão de glutenases foi induzida com a adição de 0,2 uM isopropyl B-D-thiogalactoside (Sigma) e as culturas foram adicionalmente incubadas em 22 durante a noite. Como mostrado na Figura 4, as bandas de proteína que correspondem ao peso molecular desejado de endopep-140 e endopep-40 foram ob- tidas.

2.3 Purificação de Endopeptidases Heterologamente Produzidas.

[00157] As células expressando as endopeptidases recombinantes foram centrifugados em 5000 g durante 20 minutos. O granulado foi resuspenso em 8 ml da solução de buffers (20 fosfato de sódio de mM 500 mM NaCl, pH 7,8), depois a lisosima 1 mg/ml foi acrescentada pa- ra lisar as células completamente.

[00158] As proteínas marcadas com His foram purificadas de extra- tos brutos de célula imobilizadas por cromatografia de afinidade por Ni?” que usa o Sistema de Purificação NiI-NTA (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As alíquotas de cinco microlitros de frações eluídas foram migradas através um SDS-PAGE e coradas com azul-coomassie ou coloração por sal de prata para verificar a presença e o grau de pureza das endopeptidases expressadas. A figura 4 mos- tra os níveis de expressão obtidos para endopep-140 e endopep-40 depois da indução em comparação com a cepa de controle não- induzida.

[00159] A atividade enzimática dos extratos totais obtidos de cepas de E. coli transformadas com pET28b vazio e pe T28b-endopep-140 ou pET28b-endopep-40 respectivamente foi testada com Succinil-Ala-Ala- Pro-Phe-AMC como um substrato. A atividade enzimática foi detectada nos extratos de cepas de pET28b-endopeps enquanto nenhuma ativi- dade foi mostrada pelo controle negativo.

Exemplo 3: Atividade Biológica de Endopeptidase.

3. Degradação de peptídeo tóxico 33-mer de gliadina em pH ácido.

[00160] Uma solução do peptídeo imunotóxico 33-mer da gliadina (50 uM) foi incubada em 37ºC durante até duas horas na presença de 44UU de endopep-140 ou 2UU endopep-40 em presença ou ausência de Img/ml de pepsina. A reação foi realizada em ácido acético 20mMM pH 3, volume total de 300 ul. A reação foi controlada em tempos dife- rentes de O a 120 min (tO, t3, t15, t30, t60 e min t120) em 37 CT. O de- saparecimento do peptídeo 33-mer e o surgimento de produtos de de- gradação foram controlados pela análise de HPLC-MS. as alíquotas de 50 ul foram tomadas e a atividade de enzima foi parada com 50 ul H2O: CH3;CN 50:50 (+ 0,1% de ácido fórmico). As amostras foram submetidas ao HPLC-MS, analisado no espectrômetro de massa LTQ- XL (Thermo Fisher Scientific, San Jose, California, USA). Os perfis de HPLC-MS obtidos com endopep-140, endopep-140 e pepsina, pepsina sozinha são informados nas figuras 5, 6, 7 respectivamente. O desa- parecimento do peptídeo 33-mer foi evidente depois de duas horas de incubação.

[00161] Todos os peptídeos detectados depois da incubação do peptídeo 33-mer com 41U de endopep-140 ou 2UuU de endopep-40 são informados nas tabelas 2 e 3, respectivamente.

[00162] Depois de incubação de duas horas, o pico mais intenso observado tem uma posição de carga igual a 1 e corresponde a [MH] * de 748,4, indicando a presença de pequenos peptídeos. Este sinal é também primeiro a aparecer. Com base na sequência 33-mer, quatro (1-6, 8-13, 15-20, 22-27) peptídeos correspondem a esta massa mole- cular, todos sendo compostos de 6 resíduos. De acordo com a análise de MS dos resíduos 33-mer, glutâmicos digeridos em vez de resíduos de glutamina estão presentes na sequência de peptídeo hidrolisado, assim sugerindo uma desamidação do substrato.

[00163] A análisemostrou que depois de 2 horas da incubação dos 33-mer com pepsina quase nenhuma hidrólise foi observada (Figura 7 e Tabelas 2 e 3) de acordo com dados de literatura.

[00164] Aumentar a quantidade de endopep-140 até 8uU ou de en- dopep-40 a 9uU resultou no completo desaparecimento do 33-mer de- pois 2h em pH 3 (não mostrado).

[00165] Mesmo na presença da pepsina o mesmo padrão da de- gradação é observado embora a quantidade do peptídeo intacto de- pois 2h seja mais alta do que na sua ausência, sugerindo que as en- dopeptidases não são destruídas pela pepsina.

3.2 Análise de HPLC/MS

[00166] A análisede HPLC foi realizada utilizando o espectrômetro de massa de armadilha de íon. Bombas LTQ-XL ou Advantage ligada à Accela ou Surveyor (Thermofisher Scientific, San Jose, CA, USA) foram usadas na caraterização dos hidrolisados enzimáticos de proteí- na produzidos pela mistura de enzimas. Os peptídeos foram separa- dos utilizando uma Thermofisher Scientific Hypersil ouro ou uma colu- na de simetria C18 (Waters, Milford, Mass., USA) em combinação com um gradiente de 0,1% de ácido fórmico em água Milli Q (Millipore, Bedford, Mass., USA) (Solução A) e 0,1% de ácido fórmico em aceto- nitrila (Solução B) para eluição. O gradiente começou em 95% da So- lução A e aumentou a 60% da Solução B. A informação detalhada so- bre os peptídeos individuais foi obtida utilizando o "algoritmo de MS/MS" dependente de varredura, que é um algoritmo característico do espectrômetro de massa de armadilha de um íon. A análise do e- xame total foi seguida da análise de exame de ruído na determinação do estado de carga do (on mais intenso na faixa de variação de massa total de teste. 33-mer (M=3910) foi utilizado para adaptar para a ótima sensibilidade no modo de MS e para a ótima fragmentação no modo MS/MS, executando a infusão constante de 60 ug/ml, espécies resul-

tantes principalmente duplamente e triplamente carregadas no modo de MS, e uma ótima energia de choque de aproximadamente 35% no modo MS/MS. Exemplo 4: Atividade Biológica da Endopeptidase

4.1 Degradação de Gliadina e Mistura de Hidrolisado de Glúten

[00167] Devido a uma característica estrutural específica, os prolil- oligopeptidases não podem digerir peptídeos grandes, normalmente mais longos do que 30 aminoácidos. Também, a protease do tripeptidil sedolisina não pode hidrolisar a gliadina sem adição de prolil protease. Esta limitação é uma desvantagem óbvia de uma enzima, que estão destinados para hidrolisar tanto rapidamente e como eficientemente quanto possível todos os peptídeos com potencial tóxico ricos em pro- lina.

[00168] Endopep-140 e endopep-40 de Actinoallomurus foram in- cubados com gliadinas para verificar se as endoproteases de Actinoal- lomurus são capazes de digerir as proteínas inteiras. Os produtos de hidrólise formados foram analisados por SDS-PAGE.

[00169] “Uma solução de gliadina foi preparada dissolvendo gliadina em pó (Sigma G3375) em etanol 70% a 70º a uma conc entração de mg/ml (20 uM). As moléculas de gliadina intactas consistem de uma mistura de proteína de 40-55 kDa. A gliadina foi incubada em 37º com 10 ul (SuU) das endoproteases de Actinollomurus em ácido acéti- co 20 mM pH 3 em um volume final de 0,3 ml. As reações foram reali- zadas em um Thermomixer (Eppendorf AG, o Hamburgo, Alemanha) tanto na ausência como na presença da pepsina em 1mg/ml (Figura 8). As reações foram controladas em tempos diferentes intervalo, as amostras de 30 ul foram retiradas da mistura de incubação no tempo O minuto, 30 minutos, uma e duas horas e mantiveram em 4€ até SDS- PAGE. Todos os materiais utilizados para SDS-PAGE e corar foram comprados de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hércules, CA, U-

SA). As amostras foram preparadas utilizando tampão de mostra de acordo com produz instruções e separado em kd qualquer Bis-Tris gels que usa sistema de tampão de SDS de acordo com produz instru- ções. Corar foi executado utilizando Coomassie R250 ou prata.

[00170] Como pode ser visto na Figura 8, a gliadina é clivada pelas endopeptidases de derivado de Actinollomurus em pequenos peptí- deos para concluir quase digestão durante duas horas. O decaimento do produto pode ser visto pela redução na intensidade da banda no gel de SDS. Este experimento também mostra que a pepsina não afeta a eficácia de digestão. Tabela 1. As proteínas putativas purificadas do secretoma do Actinoal- lomurus.

[00171] —Actinoallomurus purificou frações foram filtrados em 100 peso molecular kDa cut-off e submeteram-se à análise de MS-shotgun. Os peptídeos identificados foram alinhados contra proteínas inferidas pela tradução de genoma de Actinoallomurus (Protein Id: o código in- terno da sequência de proteína putativa) e a análise de in silico subse- quente por BLAST evidenciou nas proteínas conhecidas homólogas (número de acesso de BLAST: código de sequência; anotação de BLAST: nome de proteína; n.r.: nenhum resultado). Os números de espectros combinados dão uma medida semiquantitativa de quantida- des de proteína, indicadas como frequência (F médio).

[00172] A:dados obtidos de fração > 100 kDa; B: dados obtidos de fração <100 kDa.

A BLAST número de FF Id da Proteína BLAST observação regstro Médio Seq 48773 YP 003835151.1 |Peptidase S8/S53 5. | Endopep-140 Seq 100531 dbj|BAJ32040.1 lipase putativa Re o am NC Em

B BLAST número dejBLAST observa-|F Id da Proteína regstro ção Médio Seg 44766 — |zP 069219711 proteina secretada [4014 DA Seq 72108 YP 003114375.1 Peptidase S8/S53 |/30,25 Endopep-40 Seq 48773 YP 003835151.1 Peptidase S8/S53 ens | Endopep-140 AA os Po Tabela 2. Os peptídeos liberados por digestão 33-mer com endopep-

140.

[00174] Todos os pesos moleculares detectados por HPLC-MS de- pois de digestão de peptídeo de gliadina 33-mer (50 uM) com 4 uU endopep-140 na presença e ausência de pepsina (1 mg/ml). O contro- le é obtido incubando o 33-mer com a pepsina sozinha. Incubação em 37T, 20mM ácido acético, pH3. Nn 5 10 15 20 25 30

LALQPFPQPOLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPOQPEF

Tempo . Sinal de mas- Sequência deduzida de incu- Situação carga sa de peptídeo bação 1306,27; . . 100% To 3 [M-3H";2[M-2H] | 1-33 . 1956,64 residual 1088,73 1 [MHY 25-33 Fo fas Em T3o 748,45 1 [MHY 1-6; 8-13; 15-20; 22-27 Fo 1306,27; . . 50% re- 3 [M-3H" ; 2 [M-2H] 1956,64 sidual 1088,73 1 [IMHY 25-33 NO To * Ga 7 E 1-6; 8-13; 15-20; 22-2 es mr [essa pepsina [MH Ns 1306,27; " + 70% re- 3 [M-3H" ; 2 [M-2H] 1956,64 sidual 1088,73 1 [MHY 25-33 Fo vas [mm + Pico mais 748,45 1 [MH] 1-6; 8-13; 15-20; 22-27 || t Intenso

T ” 1068,24 7 IMAT 16-24 Fo 7 1306,27; » . 20% re- 3 [M-3H" ; 2 [M-2H] ' 1956,64 sidual 1088,8 1 [MH] 25-33 FF Ts Tm Fm 748,45 1-6; 8-13; 15-20; 22-27 Fo Tm * osso 7 e 16-24 pepsina 119% NET 2a po 527 1 IA mo 1306,27; + . 45% re- 3 [M-3H" ; 2 [M-2H] í 1956,64 sidual Controle | 1306,27; . : 95% re- 3 [M-3H";2[M-2H] | 1-33 À Tn 1956,64 sidual

Tabela 3. Os peptídeos liberados por digestão 33-mer com endopep-

40.

[00175] Todos os pesos moleculares detectados por HPLC-MS de- pois de digestão de peptídeo de gliadina 33-mer (50 uM) com 2 uU endopep-40 na presença e ausência de pepsina (1 mg/ml) em interva- los de tempo diferentes. O controle é obtido incubando o 33-mer com a pepsina sozinha. Incubação em 37 T, 20mM ácido acético, pH3. N 5 10 15 20 25 30

LQLQPFPQPOLPYPQPQLPYPQPQLPYPAQPAQPF Tempo de Sinal de massa Situação da carga Sequência deduzida de incubação peptídeo E aee Temer e mesas | so e o no e e ag so en | | [ser mera fm means | E RR a fes — me ss | rs eram mo sas | Lo [es mw as — | SI es mm q Ta es Tm eee | | [ser mera mamas | E RR a [es a as Ta eras e are mamae jim nes |

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Claims (32)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição de enzima que é capaz de hidrolisar oli- gopeptídeos do glúten que são resistentes à clivagem por enzimas gástricas e pancreáticas e cuja presença no lúmen intestinal resulta em efeitos tóxicos, a referida composição caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma endopeptidase da família S8/S53 ativa em pH entre 3 e 8 selecionada do grupo consistindo em: a) endopep-140 compreendendo a SEQ ID Nº: 1, um frag- mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou uma sequência possuindo pelo menos 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade, b) endopep-40 compreendendo a SEQ ID Nº: 2, um frag- mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou uma sequência possuindo pelo menos 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade, c) endopep-120 compreendendo a SEQ ID Nº: 3, um frag- mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou uma sequência possuindo pelo menos 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade, d) endopep-60 compreendendo a SEQ ID Nº: 4, um frag- mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou uma sequência possuindo pelo menos 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade, e e) endopep-41 compreendendo a SEQ ID Nº: 5, um frag- mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou uma sequência possuindo pelo menos 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade.

2. Composição de enzima de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a endopeptidase é selecionada do gru- po consistindo em:

a) endopep-140 compreendendo a SEQ ID Nº: 1 ou uma sequência possuindo pelo menos 95% de identidade, b) endopep-40 compreendendo a SEQ ID Nº: 2 ou uma se- quência possuindo pelo menos 95% de identidade, c) endopep-120 compreendendo a SEQ ID Nº: 3 ou uma sequência possuindo pelo menos 95% de identidade, d) endopep-60 compreendendo a SEQ ID Nº: 4 ou uma se- quência possuindo pelo menos 95% de identidade, e e) endopep-41 compreendendo a SEQ ID Nº: 5 ou uma se- quência possuindo pelo menos 95% de identidade.

3. Composição de enzima de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a endopeptidase é selecionada do grupo consistindo em: a) endopep-140 compreendendo a SEQ ID Nº: 1 ou uma sequência possuindo pelo menos 95% de identidade, e b) endopep-40 compreendendo a SEQ ID Nº: 2 ou uma se- quência possuindo pelo menos 95% de identidade.

4. Composição de enzima de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a(s) endopep- tidase(s) é/são obtida(s) de uma cepa de Actinoallomurus.

5. Composição de enzima de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que as endopeptidase(s) é/são obtida(s) do Actinoallomurus sp. DSM24988.

6. Composição de enzima de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais enzima(s) diferente(s) proteolítica(s) selecionada(s) de prolil-endoproteases, —x-prolil-dipeptidil aminopeptidases e prolil- aminopeptidases.

7. Composição de enzima de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a endopepti-

dase está operacionalmente fusionada a outro polipeptídeo para for- mar proteínas quiméricas ou aproveitadas.

8. Endopeptidase isolada da família S8/S53 ativa em pH entre 3 e 8, como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é selecionada de: a) endopep-140 compreendendo a SEQ ID Nº: 1 ou uma sequência possuindo pelo menos 95% de identidade, b) endopep-40 compreendendo a SEQ ID Nº: 2 ou uma se- quência possuindo pelo menos 95% de identidade, c) endopep-120 compreendendo a SEQ ID Nº: 3 ou uma sequência possuindo pelo menos 95% de identidade, d) endopep-60 compreendendo a SEQ ID Nº: 4 ou uma se- quência possuindo pelo menos 95% de identidade, e e) endopep-41 compreendendo a SEQ ID Nº: 5 ou uma se- quência possuindo pelo menos 95% de identidade.

9. Endopeptidase isolada da família S8/S53 de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que é selecionada de a) endopep-140 compreendendo a SEQ ID Nº: 1 ou uma sequência possuindo pelo menos 95% de identidade, e b) endopep-40 compreendendo a SEQ ID Nº: 2 ou uma se- quência possuindo pelo menos 95% de identidade.

10. Composição de enzima de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou endopeptidase isolada da família S8/S53 de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que é para uso como um medicamento para o tratamento ou prevenção da psilose celíaca, dermatitis herpetiformis e/ou qualquer outro distúrbio associado à intolerância ao glúten.

11. Uso de uma composição de enzima, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou de pelo menos uma endo- peptidase isolada da família S8/S53, como definida na reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que é para produzir hidrolisados de proteína utilizados para alimento e bebidas.

12. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende, como o ingrediente proteolítico ativo, uma composi- ção de enzima, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou pelo menos uma endopeptidase isolada da família S8/S53, como definida na reivindicação 8 ou 9.

13. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 12, caracterizada pelo fato de que é uma formulação farmacêutica oral.

14. Complemento alimentício, caracterizado pelo fato de que compreende, como o ingrediente proteolítico ativo, uma composi- ção de enzima, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou pelo menos uma endopeptidase isolada da família S8/S53, como definida na reivindicação 8 ou 9.

15. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que codifica pelo menos uma endopeptidase, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, que compreende pelo menos uma se- quência de polinucleotídeos selecionada das SEQ ID Nº“: 7, 8,9, 10 e 11, ou pelo menos uma sequência de polinucleotídeos possuindo pelo menos 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID N“:7, 8,9, 10 e 11.

16. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma se- quência de polinucleotídeos possuindo pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID Nº“: 7, 8, 9, 10 e 11.

17. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação ou 16, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência de polinucleotídeos selecionada das SEQ IDN“:7 e 8.

18. Processo para produzir uma composição de enzima,

como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que com- preende:

A) cultivar uma cepa de Actinoallomurus que ocorre natu- ralmente capaz de produzir pelo menos uma endopeptidase da família S8/S53, como definida na reivindicação 1, em um meio de cultura sob condições adequadas para produzir a composição de enzima e recu- perar a composição de enzima da batelada de cultivo, ou

B) cultivar uma cepa de Actinoallomurus derivada por mu- tação convencional e/ou procedimentos de seleção de uma cepa que ocorre naturalmente, tal como definido em A), que mantém a capaci- dade de produzir pelo menos uma endopeptidase da família S8/S53, como definida na reivindicação 1, em um meio de cultura sob condi- ções adequadas para produzir a composição de enzima e recuperar a composição de enzima da batelada de cultivo, ou

C) introduzir em uma célula hospedeira um ácido nucleico codificando pelo menos uma endopeptidase da família S8/S53, como definida na reivindicação 1, selecionada do grupo consistindo em:

a) endopep-140 compreendendo a SEQ ID Nº: 1, um frag- mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou uma sequência possuindo pelo menos 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade,

b) endopep-40 compreendendo a SEQ ID Nº: 2, um frag- mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou uma sequência possuindo pelo menos 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade,

c) endopep-120 compreendendo a SEQ ID Nº: 3, um frag- mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou uma sequência possuindo pelo menos 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade,

d) endopep-60 compreendendo a SEQ ID Nº: 4, um frag-

mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou uma sequência possuindo pelo menos 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade, e e) endopep-41 compreendendo a SEQ ID Nº: 5, um frag- mento biologicamente ativo do mesmo, uma variante alélica que ocor- re naturalmente do mesmo, ou uma sequência possuindo pelo menos 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade, cultivar a célula em um meio de cultura sob condições ade- quadas para produzir a(s) endopeptidase(s) e recuperar a endopepti- dase da batelada de cultivo.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, item A) ou B), caracterizado pelo fato de que a cepa de Actinoallomurus é substi- tuída por uma cepa pertencendo ao gênero Catenulispora, Kte- donobacter ou Streptomyces capaz de produzir pelo menos uma en- dopeptidase, como definida na reivindicação 1.

20. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracteri- zado pelo fato de que a cepa de Actinoallomurus é a Actinoallomurus sp. DSM 24988.

21. Processo de acordo com a reivindicação 18, item OC), caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende pelo me- nos uma das sequências de polinucleotídeos identificadas, como defi- nidas na reivindicação 15 ou 16.

22. Processo de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que o ácido nucleico compreende pelo menos uma das sequências de polinucleotídeos SEQ ID Nº“: 7 e 8 ou pelo menos uma das sequências de polinucleotídeos possuindo pelo menos 95% de identidade a qualquer uma das SEQ IDN“:7 e 8.

23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 18, item C), 21 e 22, caracterizado pelo fato de que a célula hos- pedeira é um microrganismo selecionado de Bacillus, Streptomyces,

Lactobacillus, Pyrococcus, Pseudomonas e Escherichia coli.

24. Processo de acordo com a reivindicação 23, caracteri- zado pelo fato de que a célula hospedeira é Escherichia coli BL21 (DE3) Star.

25. Cepa, caracterizada pelo fato de que é Actinoallomurus DSM 24988.

26. Método de degradação de oligopeptídeos do glúten que são resistentes à clivagem por enzimas gástricas e pancreáticas e cuja presença no lúmen interno resulta em efeitos tóxicos, caracterizado pelo fato de que compreende o contato dos ditos oligopeptídeos do glúten com uma composição de enzima, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou pelo menos uma endopeptidase iso- lada, como definida na reivindicação 8 ou 9.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracteriza- do pelo fato de que é para o tratamento ou prevenção da psilose celía- ca, dermatitis herpetiformis e/ou outro distúrbio qualquer associado à intolerância ao glúten que compreende a administração a um paciente que esteja necessitando do mesmo de uma quantidade eficaz de uma composição de enzima, como definida em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 7, ou pelo menos uma endopeptidase isolada, como defini- da na reivindicação 8 ou 9.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracteriza- do pelo fato de que a composição de enzima ou a endopeptidase iso- lada é incorporada em uma formulação farmacêutica, um complemen- to alimentício, ou uma bebida.

29. Uso da composição de enzima, como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 7, ou de pelo menos uma endopepti- dase isolada, como definida na reivindicação 8 ou 9, caracterizado pe- lo fato de que é para hidrolisar oligopeptídeos do glúten que são resis- tentes à clivagem por enzimas gástricas e pancreáticas e cuja presen-

ça no lúmen interno resulta em efeitos tóxicos na produção de com- plementos alimentícios.

30. Uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a composição de enzima ou a endopeptidase isolada está na forma imobilizada.

31. Uso de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento de produtos alimentícios líquidos.

32. Uso da composição de enzima, como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 7, ou da endopeptidase isolada da família S8/S53, como definida na reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tra- tamento ou prevenção da psilose celíaca, dermatitis herpetiformis e/ou qualquer outro distúrbio associado à intolerância ao glúten.

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