EA006825B1

EA006825B1 - Способы получения биологически активных молекул

Info

Publication number: EA006825B1
Application number: EA200101078A
Authority: EA
Inventors: Менахем Рубинштейн; Бианлинг Лиу; Даниэла Новик; Пьер Грабэр
Original assignee: Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко.Лтд.
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2000-04-13
Publication date: 2006-04-28
Also published as: WO2000061768A3; WO2000061768A2; EE200100530A; KR20020007365A; KR100682185B1; UA73940C2; EP1169460B1; NO20014966D0; IL145842A0; BR0009782A; EA200101078A1; ES2259287T3; ATE326536T1; EE05591B1; NO329525B1; JP2002541813A; DE60028022T2; AR023468A1; NO20014966L; CA2368994C

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу получения биологически активных молекул из их биологически неактивных предшественников посредством мутации их нативных участков расщепления с образованием участка, расщепляемого обычной протеазой, и расщеплением мутированной молекулы с получением биологически активной молекулы.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение, главным образом, относится к получению биологически активных молекул, которые существуют в виде неактивных предшественников и ίη νίνο расщепляются протеазами с получением зрелых биологически активных молекул.

Конкретнее, изобретение относится к получению каспаз и цитокинов, которые продуцируются ίη νίνο из соответствующих предшественников саморасщеплением, расщеплением другими каспазами или расщеплением, например, протеазой каспазой-1, также известной как интерлейкин-1-превращающий фермент (1СЕ). Примерами цитокинов, продуцирующихся подобным образом, служат интерлейкин-ΐβ и интерлейкин-18.

Предпосылки изобретения

Каспазы представляют собой семейство цистеиновых протеаз, которые расщепляют свои белкимишени за остатком Акр. Из одиннадцати описанных каспаз каспаза-1 и, возможно, каспазы -4, -5 и -11, как предполагается, в первую очередь, вовлечены в процессинг провоспалительных цитокинов, тогда как другие играют решающую роль в инициации и исполнении апоптоза, или запрограммированной клеточной гибели. Каспазы имеют несколько общих черт, в том числе то, что они синтезируются в виде каталитически неактивных зимогенов, активирующихся, главным образом, расщеплением после специфических внутренних остатков Акр, присутствующих в междоменных линкерах, а также способность расщеплять свои субстраты после остатков Акр. В результате, некоторые зрелые активные каспазы, в особенности, полученные из каспаз с длинным продоменом, могут процессировать и активировать самих себя и другие неактивные зимогены каспаз. Основываясь на первичной структуре, проапоптотические каспазы можно разделить на два класса: класс I, включающий каспазы -2, -8, -9 и -10, которые содержат длинный Ν-концевой продомен, и класс II, включающий каспазы -3, -6 и -7 с коротким или отсутствующим продоменом. Эксперименты по расщеплению ίη νίίτο говорят о том, что каспазы II класса требуют для своего протеолитического процессинга наличия активированных каспаз I класса (12).

Другая классификация каспаз разделяет их по специфичности участка расщепления (13). Здесь каспазы I группы содержат консенсусный участок АЕНЭ (каспазы -1, -4 и -5), каспазы II группы - консенсусный участок ЭехЭ (каспазы -2, -3 и -7), а каспазы III группы - консенсусный участок (!УЕ)ЕхЭ (каспазы -6, -8 и -9). Оптимальным участком для каспазы-8 является ЙЕТЭ (14).

Интерлейкин-18 (I И-18), первоначально описанный как интерферон-γ (ШЫ^)-индуцирующий фактор, представляет собой недавно охарактеризованный цитокин, имеющий общие структурные черты с семейством белков ГЬ-1 (1-4). ^-18 первоначально был выделен и впоследствии клонирован из печени мышей, получавших обработанные теплом РторюпоЬас1етшт аспек (Р.аспек), с последующим введением липополисахарида (ЪР8) (2, 5). Также недавно описано клонирование человеческого ^-18 (3).

Как и ^-12. ^-18 продуцируется активированными макрофагами, такими как купферовские клетки печени и другие немигрирующие макрофаги (3). ^-18 является ранним индуктором ответа ТЫ, костимулирует продукцию ΣΕΝ-γ, как и ΤΝΕ-γ, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и ^-2 (6). В дополнение, он усиливает пролиферацию Т-клеток, вызванную антителами против СИ3, и повышает клеточную цитотоксичность, обусловленную естественными киллерами, путем увеличения экспрессии Еак-лиганда (6, 7).

В отличие от большинства других цитокинов, демонстрирующих структуру, свернутую в четыре спирали, ^-18 и ΤΗ-1β имеют β-складчатую листовую структуру (7). Подобно ΤΗ-1β, ^-18 синтезируется в виде биологически неактивного предшественника (ргоГЬДЗ), лишенного сигнального пептида (3). Предшественники ΤΗ-1β и ^-18 расщепляются каспазой-1 (ГС-1 β-превращающий фермент или ГСЕ), которая расщепляет после остатка аспарагиновой кислоты в позиции Р1. Образованные зрелые цитокины легко высвобождаются из клетки (8, 9). Исследования на мышах, дефицитных в отношении каспазы-1, продемонстрировали важную роль зрелого ^-18 как индуктора ΞΕΝ-γ и ответов ТЫ. Инъекция таким мышам Р.аспек и ЬР8 приводила к низким уровням циркулирующего ΖΕΝ-γ по сравнению с мышами дикого типа (8, 9). Инъекция ^-18 восстанавливала ЬРЗ-индуцированный уровень ΕΕΝ-γ у мышей, дефицитных по каспазе-1 (9), что служит дальнейшим подтверждением представления о том, что каспаза-1 вовлечена в продукцию активного ^-18. Другие каспазы, особенно те, что расщепляют внутриклеточные белки, ассоциированные с апоптозом, были по крайней мере в 100 раз менее активны, чем каспаза-1 (9). Подобные исследования с [Ε-18-дефицитными мышами выявили его роль в активности ΝΚ-клеток и индукции цитокинов (10).

Рекомбинантный ΤΗ-1β и мышиный ^-18, экспрессированный в Е. сой, могут быть подвергнуты рефолдингу с получением полностью активных цитокинов. Попытки экспрессировать зрелую форму человеческого ^-18 в Е. сой или в других хозяевах не привели к получению полностью активного цитокина. По причине его потенциального терапевтического использования, например, при злокачественных новообразованиях или в любых условиях, когда желательна индукция продукции интерферона-γ, возникает потребность в создании эффективной системы экспрессии для продукции зрелого, биологически активного человеческого !Е-18.

- 1 006825

Сущность изобретения

Настоящее изобретение позволяет получать молекулы, которые в процессе их формирования в природе продуцируются в форме биологически неактивного предшественника и становятся активными после расщепления их предшественника. Последнее не может быть легко осуществлено ίη νίίτο.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу продукции биологически активной молекулы из ее биологически неактивного предшественника мутацией ее нативного участка расщепления с получением участка, чувствительного к расщеплению обычной протеазой, и расщеплением мутантной молекулы с получением биологически активной молекулы.

Биологически активная молекула представляет собой цитокин, предпочтительно выбранный из 1Ь1β и Ш-18.

В данных цитокинах предпочтительным нативным участком расщепления является участок расщепления каспазой-1.

Обычная протеаза, привлеченная для расщепления, может быть выбрана из тромбина, энтерокиназы, субтилизина, гененазы (депепаке™; №\ν Епд1ап6 Вю1аЬ§, Встсг1у МА, И8А), протеазы человеческого риновируса 3С и протеазы фактора Ха. Когда для расщепления привлекается каспаза, предпочитают каспазу-8.

Применяемый в предпочтительном осуществлении настоящего изобретения способ включает трансфекцию клеток-хозяев вектором, содержащим ДНК, кодирующую неактивный предшественник биологически активной молекулы, мутированный в его участке расщепления каспазой-1 с образованием участка, расщепляемого протеазой, культивирование трансфицированных клеток-хозяев, экспрессирующих указанный предшественник, и выделение биологически активной молекулы после обработки протеазой, причем указанная биологически активная молекула представляет собой цитокин.

Необязательно способ может быть усовершенствован тем, что осуществляют слияние кДНК в рамку считывания после последовательности, кодирующей глутатион-8-трансферазу (С8Т), и экспрессированные молекулы слияния перед обработкой протеазой задерживают на гранулах глутатион-агарозы.

Настоящее изобретение также описывает кДНК, кодирующую неактивный предшественник биологически активной молекулы, мутированный в нативном участке его расщепления каспазой-1 с образованием участка, расщепляемого протеазой, которую необязательно подвергают слиянию с последовательностью, кодирующей С8Т. Указанная биологически активная молекула представляет собой цитокин, выбранный из 1Ь-1 β и 1Б-18.

Согласно настоящему изобретению может быть также осуществлен способ получения и/или очистки рекомбинантного гибридного полипептида или белка слияния. Точнее, фрагмент ДНК, кодирующий молекулу белка, подлежит слиянию с фрагментом ДНК, кодирующим связывающий белок с использованием в качестве линкерной последовательности ДНК, кодирующей пептидную последовательность, которая распознается и разрезается каспазой. ДНК слияния включают в состав вектора клонирования, который используется для трансформации подходящих клеток. После экспрессии гибридный полипептид очищают посредством контакта с лигандом или субстратом, к которому обладает специфической аффинностью связывающий белок, например аффинной хроматографией.

В предпочтительном осуществлении данного способа связывающим белком служит С8Т, а участок расщепления представляет собой участок расщепления каспазы-8.

Изобретение также относится к биологически активным молекулам, полученным вышеописанным способом.

Экспрессия зрелого 1Ь-18 в Е. сой ведет к возникновению белка, лишенного биологической активности. Дальнейшие попытки провести правильный рефолдинг полипептидного остова 1Б-18, экспрессированного в Е. со11, были безуспешными. Человеческий 1Ь-18 и человеческий 1Б-1 β экспрессируются ίη νΐνο как их предшественники рго1Ь-18 и рго1Б-1 β, которые расщепляются каспазой-1 с получением биологически активных зрелых 1Ь-18 и ΣΠ-1β, соответственно. Однако каспаза-1 коммерчески недоступна. Настоящее изобретение относится к простому способу получения биологически активных молекул в Е. со11, в частности цитокина и, более конкретно, человеческого 1Ь-18. С этой целью конструировали кДНК, кодирующую человеческий рго1Ь-18, в котором участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка расщепления коммерчески доступным белком, например фактором Ха. Для упрощения манипуляций мутантную кДНК рго1Ь-18 подвергали слиянию с последовательностью, кодирующей глутатион-8-трансферазу (С8Т). Полученный белок слияния С8Т-рго1Ь-18, содержащий участок расщепления фактором Ха, экспрессировали в Е. сой и связывали на гранулах глутатион-агарозы. Зрелый человеческий 1Ь-18, проявляющий высокую биологическую активность, освобождали с гранул обработкой фактором Ха.

Сходным образом в последовательности ДНК, кодирующей человеческий 1Ь-1 β, участок расщепления каспазой-1 мутировали с образованием участка расщепления фактором Ха. Для упрощения манипуляций мутантную кДНК рюШ-^ подвергали слиянию в рамку считывания с последовательностью, кодирующей глутатион-8-трансферазу (С8Т). Полученный белок слияния С8Т-рго1Ь-1 β, содержащий уча- 2 006825 сток расщепления фактором Ха, экспрессировали в Е. со11 и связывали на гранулах глутатион-агарозы. Зрелый человеческий 1Ь-1 β освобождали с гранул обработкой фактором Ха.

Когда для расщепления применяли каспазу-8, выполняли сходную процедуру, с той разницей, что участок расщепления каспазой-1 человеческого 1Ь-18 или человеческого ΣΠ-1β мутировали с образованием участка расщепления каспазой-8. Впоследствии, слияние с последовательностью, кодирующей ОБТ, и дальнейшие стадии процедуры проводили, как описано выше.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 проиллюстрировано клонирование кДНК, кодирующей мутантный человеческий рго1Ь-18 (рго1Ь-18_1ЕОК). Эту кДНК клонировали в три стадии РСК с использованием метода перекрывающихся праймеров. Дорожки представляют собой: М, маркеры размеров ДНК, отмеченные с левой стороны; 1, ДНК длиной в 498 нп, полученная в первой РСК; 2, ДНК длиной в 551 нп, полученная во второй РСК; 3, ДНК длиной в 600 нп, полученная в третьей РСК и кодирующая человеческий рго1Ь-18_1ЕОК.

На фиг. 2 показана структура экспрессирующей плазмиды р6ЕХ-рго-1Ь-181_ЕОК. (а) Фланкирующие нуклеотидные последовательности ВатН Ι/ЕсоК I фрагмента кДНК длиной в 600 нп, кодирующего человеческий рго1Ь-18_1ЕОК. Сайты рестрикции ВатН I и ЕсоК I, а также участок связывания фактора Ха показаны скобками. Незакрашенной стрелкой отмечен участок расщепления фактором Ха. (Ь) Схематическое представление рСЕХ-2ТК. Также показаны сайты рестрикции. Закрашенной стрелкой обозначен участок лигирования ВатН Ι/ЕсоК I во вставке.

На фиг. 3 показан БЭБ-РАСЕ грубых белковых экстрактов Е. со11, экспрессирующей белок слияния СЗТ-рго[Е-18ц,_;;|<. Дорожки представляют собой: 1 клетки, трансформированные исходной плазмидой рСЕХ-2ТК без индукции; 2 клетки, трансформированные исходной плазмидой рСЕХ-2ТК и индуцированные 0,1 мМ изопропилтиогалактозида (ЕРТО). Ожидаемая полоса (26 кДа) глутатионтио-редуктазы (ОБТ) обозначена стрелкой слева. Дорожкам 3-7 соответствуют клетки, трансформированные плазмидой рОЕХ-ргоГЕ-^шж и неиндуцированные (дорожка 3) или индуцированные ГРТО в течение обозначенного времени. Полоса (43 кДа), помеченная стрелкой справа, соответствует размеру белка слияния ОБТ-рюШНа фиг. 4 показан БЭБ-РАСЕ (10% акриламид) белка слияния ОБТ-р^оI^-18_IЕОК после очистки на глутатион-агарозе. Супернатант обработанных ультразвуком бактерий (см. фиг. 3, дорожку 7) подвергали аффинной очистке на глутатион-агарозе. Дорожки представляют собой: 1 маркеры молекулярной массы (отмеченные в кДа с левой стороны); 2 аффинно очищенный ОБТ-р^оI^-18_IЕОК. Гель окрашивали кумасси голубым.

На фиг. 5 показан БЭБ-РАСЕ (12% акриламид) очищенного человеческого ^-18. Белок слияния ОБТ-рюШ-Щ^ж задерживали на гранулах глутатион-агарозы и инкубировали с фактором Ха в качестве протеазы в соотношении с субстратом 1:50 (мас./мас.); супернатант анализировали через 6 ч. Дорожка 1, маркеры молекулярной массы, помеченной в кДа с левой стороны; дорожка 2. Человеческий ^-18 в супернатанте от гранул глутатион-агарозы. Гель окрашивали кумасси голубым.

На фиг. 6 показано исследование биологической активности человеческого ^-18. Человеческий ΣΕ18 в обозначенных дозах добавляли к культурам не прилипающих к пластику мышиных спленоцитов (5х10⁶ клеток/лунка) в присутствии конканавалина А (0,125 мкг/мл) и полимиксина В (1 мкг/мл). Супернатант исследовали на предмет наличия интерферона-гамма посредством ЕБЕБА. Уровень интерферонагамма, индуцированный ЕЕ-18 (100 нг/мл) в отсутствии Соп А, составлял 160 пг/мл.

На фиг. 7 показана в схематичной форме процедура очистки ЫЕ-18 с использованием каспазы-8.

На фиг. 8 показана последовательность ОБТ-рго-ЫЕ-18_ЕЕТС. Рамкой отмечен участок расщепления каспазой-8. Подчеркнутая последовательность представляет зрелый ЫЕ-18.

На фиг. 9 показан окрашенный кумасси голубым БЭБ-РАСЕ (10% акриламидный гель), отражающий очистку белка слияния ОБТ-рго-ЫЕ-18_ЬЕТд на глутатион-агарозе. Супернатант разрушенных клеток рекомбинантной Е. со11 ΣΜ109, экспрессирующей ОБТ-рго-ЫЕ-18_ЬЕТЕ, аффинно очищали на глутатионагарозе и обрабатывали каспазой-8 на твердой фазе. Супернатант, полученный после обработки, концентрировали и разделяли по размерам молекул на Бирегбех-75. Дорожки представляют собой: 1 маркеры молекулярной массы (обозначена в кДа с левой стороны); 2 супернатант разрушенных клеток; 3 аффинно очищенный ОБТ-рго-ЫЕ-18_ЪЕТЕ; 4 глутатион-агарозная смола после твердофазной обработки каспазой-8 в течение 4 ч; 5 концентрированный результат обработки каспазой-8 в течение 4 ч; 6 фракция чистого ЫЕ-18 с Бирегбех-75.

Подробное описание изобретения

Согласно настоящему изобретению получена кДНК, кодирующая человеческий ргоЕЕ-18, в котором участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка фактора Ха. Можно использовать другие мутации с образованием участков, подходящих для других протеаз.

Примеры возможных участков расщепления и подходящих протеаз включают

Ееи-Уа1-Рго-Агд-О1у-Бег (БЕО Ю N0:1), последовательность, расщепляемую между аминокислотами Агд и О1у протеазой тромбином;

- 3 006825

11е-61и-61у-Лгд- (ΞΕΟ ΙΌ N0:2), последовательность, расщепляемую после остатка Агд протеазой фактором Ха;

Акр-Акр-Акр-Ьук- (ΞΕΟ ΙΌ NО:3), последовательность, расщепляемую после остатка Ьу§ протеазой энтерокиназой;

Ηίδ-Туг- (ΞΕΟ ΙΌ NО:4), последовательность, расщепляемую после остатка Туг протеазой субтилизином в его варианте Оеиеиаке™ (№\ν Епд1аиб Вю1аЬ§);

Тут-Ηίδ- (ΞΕΟ ΙΌ NО:5), последовательность, расщепляемую после остатка Туг протеазой субтилизином в его варианте Оеиеиаке™ (№\ν Ει^Ειπά Вю1аЬ§);

Ееи-61и-Уа1-Ееи-Рйе-61п-О1у-Рго (ΞΕΟ ΙΌ N0:6), последовательность, расщепляемую после остатка 01и протеазой человеческого риновируса 3С.

Подобным образом, получена кДНК, кодирующая человеческий ρτοΙΕ-1β, в котором участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка фактора Ха. Можно использовать другие мутации с образованием участков, подходящих для других протеаз.

Пе-01и-61у-Агд- (ΞΕΟ ΙΌ N0:2), последовательность, расщепляемую после остатка Агд протеазой фактором Ха;

Λφ-Λφ-Λφ-Ενδ- (ΞΕΟ ΙΌ N0:3), последовательность, расщепляемую после остатка Ьу§ протеазой энтерокиназой;

Ееи-61и-Уа1-Ееи-Рйе-61и-61у-Рго (ΞΕΟ ΙΌ N0:6), последовательность, расщепляемую после остатка 01и протеазой человеческого риновируса 3С.

Выбор мутации зависит от следующих параметров: участок расщепления, образованный мутацией, должен быть очень специфичным, чтобы избежать нежелательного расщепления в других участках полипептидного остова ρτοΙΕ-18 или ρτοΙΌ-Ιβ; протеаза должна проявлять высокий уровень специфичности в отношении сконструированного участка расщепления; протеаза должна быть легко доступна, например, из коммерческих источников; и мутация не должна вызывать большие изменения во вторичной или третичной структуре ρτοΙΕ-18 или ρτοΙΌ-Ιβ. Использование фактора Ха, энтерокиназы или субтилизина является предпочтительным перед другими протеазами, поскольку полученные в результате ΙΌ-18 или ΙΌ-1β не имеют мутированных аминокислот. Использование фактора Ха наиболее предпочтительно, поскольку оно требует наиболее консервативных мутаций, таким образом понижая риск изменения вторичной или третичной структуры ρτοΙΕ-18 или ρτοΙΕ-1β и риск того, что расщепление не будет иметь место. Использование фактора Ха или энтерокиназы является предпочтительным перед другими протеазами, поскольку полученные в результате ΙΌ-18 или ΙΗ-1 β не имеют мутированных аминокислот.

Для того чтобы сконструировать кДНК, кодирующую человеческий мутантный ρτοΙΕ-18 (ρτοΙΕ18_ΙΕσκ), в котором участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка расщепления фактором Ха, в кДНК человеческого ρτοΙΕ-18 вводили следующие мутации: Ό33Ι; Ξ35Ο и И36К. Эти мутации составили последовательность ΙΕΟΚ, распознаваемую фактором Ха.

Вектор, экспрессирующий человеческий ρτοΙΌ-18_ΙΕΟΚ, конструировали следующим образом. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) здорового донора стимулировали бактериальным липополисахаридом (ΕΕΞ). Из клеток выделяли общую РНК. РНК подвергали обратной транскрипции и полученную ДНК использовали в качестве шаблона в полимеразной цепной реакции (РСК). Мутацию вводили в последовательность с использованием перекрывающихся праймеров в три стадии РСК (фиг. 1). Полученный продукт РСК длиной в 600 нп, кодирующий мутантный человеческий ρτοΙΕ-18, клонировали в клонирующий вектор ТА (ρΟΕΜ-Т еаку, Ргошеда) и последовательность его ДНК подтверждали ДНК-секвенированием. Полученную плазмиду ρ6ΕΜ-Τ-ρτοΙΌ-18_ΙΕΟΚ расщепляли ΕοοΚ Ι и ВатН Ι и фрагмент длиной 600 нп, кодирующий человеческий ρτοΙΕ-18_ΙΕΟΚ, субклонировали в прокариотическом экспрессирующем векторе ρΟΕΧ-2ΤΚ, содержащем последовательность гена ΟΞΤ (Рйаттас1а). Полученный экспрессирующий вектор, содержащий последовательность гена человеческого ρτοΙΌ-18_ΙΕΟΚ, подвергали слиянию в рамку считывания к 3'-концу гена ΟΞΤ (фиг. 2).

Затем проводили экспрессию и очистку ΟΞΤ-ρτοΙΕ-18_ΙΕΟΚ. Свежую единичную колонию Ε. той 1Μ109, трансформированную плазмидой ρΟΕΜ-Τ-ρτοΙΕ-18_ΙΕΟΚ, выращивали при встряхивании при 37°С до достижения оптической плотности 0,6 при 600 нм. Затем экспрессию белка индуцировали изопропилтиогалактозидом (ΙΕΤΟ) и культивировали далее при 37°С в течение 3 ч. С помощью Ξ^Ξ-РА^Ε общего бактериального белка была выявлена индукция белка массой 43 кДа, по размерам соответствующего 6ΞΤ-ρτοΙΕ-18_ΙΕΟΚ (фиг. 3). Все последующие стадии выделения 6ΞΤ-ρτοΙΕ-18_ΙΕΟΚ проводили при 4°С. Бактерии собирали центрифугированием, ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере φΒΞ), содержащем ингибиторы протеаз. Бактерии лизировали обработкой ультразвуком, добавляли Τιί^ Χ-100 до конечной концентрации 1% и смешивали очищенный лизат с гранулами глутатион-агарозы (Рйаттааа). Гранулы отмывали и анализировали их аликвоту с помощью Ξ^Ξ-РА^Ε. При этом была обнаружена единственная полоса на 43 кДа, соответствующая белку слияния 6ΞΤ-ρτοΙΕ-18_ΙΕΟΚ (фиг. 4). Гранулы затем обрабатывали фактором Ха и собирали супернатант. Ξ^Ξ-РА6Ε супернатанта характеризовался большой полосой примерно на 18 кДа, что согласовывалось с ожидаемой массой зрелого человеческого

- 4 006825

1Ь-18. Кроме того, наблюдалась дополнительная, более слабая полоса на 19,5 кДа (фиг. 5). Анализ белковой последовательности полос на 18 и 19,5 кДа в обоих случаях показал наличие ожидаемой Ν-концевой последовательности зрелого человеческого 1Ь-18. Полоса на 43 кДа, соответствующая белку слияния 68Т-рго1Ь-18_1ЕОК, еще присутствовала на 8Э8-РА6Е гранул глутатион-агарозы после их обработки протеазой, что отражало неполное расщепления (не показано).

Рекомбинантный человеческий 1Ь-18 тестировали в отношении биологической активности на мышиных спленоцитах на основании их способности индуцировать экспрессию интерферона-гамма. Инкубация не связанных с поверхностью мышиных спленоцитов только с человеческим 1Ь-18 выявила малую продукцию ΙΕΝ-гамма, что наводило на мысль о необходимости костимулятора. Только Соп Α при 0,125 мкг/мл не вызывал индукции ΙΕΝ-γ на значимом уровне. Когда не связанные с поверхностью спленоциты инкубировали с Соп А и ГБ-18, полученным согласно настоящему изобретению, достигали индукции ΙΕΝ-γ, зависимой от дозы (фиг. 6).

Для того чтобы сконструировать кДНК, кодирующую человеческий мутантный рго1Ь-1в (ргоГЬ1β_Εσκ), в котором участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка расщепления фактором Ха, в кДНК человеческого рго1Ь-1в вводят следующие мутации: Υ113Ι, У1146, Н115К и Ό116Κ. Эти мутации составляют последовательность ГЕОК, распознаваемую фактором Ха.

Чтобы сконструировать вектор, экспрессирующий человеческий ргоГБЧвшок, осуществляют следующие стадии. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) здорового донора стимулируют бактериальным липополисахаридом (ЬР8). Из клеток выделяют общую РНК. РНК подвергают обратной транскрипции и полученную ДНК используют в качестве шаблона в полимеразной цепной реакции (РСК) с праймерами, соответствующими кодирующей последовательности человеческого ΙΕ-1β. Полученный продукт РСК клонируют в клонирующий вектор ТА, например «р6ЕМ-Т еаку» от Рготеда, и затем подвергают сайт-специфическому мутагенезу подходящими олигонуклеотидами. Последовательность полученного вектора подтверждают ДНК-секвенированием. Полученную плазмиду рОЕМ-Т-ргоГЬ^1βΙΕΟΚ расщепляют надлежащими ферментами рестрикции и фрагмент длиной примерно 820 нп, кодирующий человеческий рго!К-1 βι_Ε^_κ. субклонируют в прокариотическом экспрессирующем векторе р6ЕХ-2ТК, содержащем последовательность гена 68Т (Рйагтас1а). Полученный экспрессирующий вектор содержит последовательность гена человеческого подвергнутого слиянию в рамку считывания с З'-концом гена 68Т.

Экспрессию и очистку СЗТ-ргоШ-Ц/ык проводят сходным образом. Свежую единичную колонию Е. сой 1М109, трансформированную плазмидой р6ΕМ-Т-р^оI^-1β_IΕ^К, выращивают при встряхивании при 37°С до достижения оптической плотности 0,6 при 600 нм. Затем экспрессию белка индуцируют изопропилтиогалактозидом (ГРТО) и культивируют далее при 37°С в течение 3 ч. С помощью 8Э8-РА6Е общего бактериального белка выявляют индукцию белка массой ~52 кДа по размерам соответствующего 68^131^^1/1,11,. Все последующие стадии выделения 68Т-р^оI^-1β_IΕ^К проводят при 4°С. Бактерии собирают центрифугированием, ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере (РВ8), содержащем ингибиторы протеаз. Бактерии лизируют обработкой ультразвуком, добавляют Тгйоп Х-100 до конечной концентрации 1% и смешивают очищенный лизат с гранулами глутатион-агарозы (Рйагтас1а). Гранулы отмывают и анализируют их аликвоту с помощью 8Э8-РА6Е на присутствие белка слияния 68Т-рго!Е1βΕσ_Κ массой ~52 кДа. Затем гранулы обрабатывают фактором Ха и собирают супернатант, содержащий зрелый человеческий ΙΕ-1β.

В другом осуществлении настоящего изобретения экспрессию и очистку полипептида проводят посредством продукции белка слияния, содержащего участок расщепления каспазой. Плазмиду, экспрессирующую связывающий пептид в слиянии с интересующим белком, можно мутировать так, что участок расщепления каспазой будет введен в позиции, удобной для очистки активного полипептида.

Участки распознавания каспазы составляют 4 аминокислоты, последней из которых является аспарагиновая кислота. В целом, каспазы проявляют более высокую и отличную от обычно используемых протеаз специфичность участков расщепления и имеют значительные преимущества перед ранее описанными протеазами, будучи удобными для расщепления пептидов слияния. Пример процедуры очистки приведен на фиг. 7.

Предпочтительные участки расщепления для каждой каспазы описаны в литературе (Апп. Кеу. Вюсйет., 1999, 68:383-424). Все они обычно содержат остаток Акр в позиции Р1.

Описанную выше плазмиду рОЕМ-Т-ргоГЕЖщж модифицировали с получением другого мутантного человеческого ргоГЕ-18 (ргоШЖьщ-д, см. фиг. 8), в котором участок расщепления фактором Ха мутируют с образованием участка расщепления каспазой-8. Это позволяет использовать для расщепления каспазу-8.

Другим преимуществом использования каспазы является ее высокая эффективность в отношении выхода и времени расщепления. Было обнаружено, что при сравнении количества белка ΙΕ-18, полученного от рОЕМ-Т-ргоГЬ-^шдк и рОЕМ-Т-ргоШ-^шд, количество фермента и время, необходимые для получения 1 мг ЫЬ-18, уменьшаются. Процедура приводит к продукции белка с ожидаемым размером (фиг. 9) и биологической активностью.

- 5 006825

Каспаза-8 не является единственной применимой каспазой, и, в зависимости от наличия или отсутствия участка расщепления специфической каспазой в интересующем в плане очистки белке или от любых других критериев, можно использовать мутации, соответствующие участкам расщепления любой другой каспазой.

Каспазу можно отделить от интересующего белка с использованием стандартных способов очистки, таких как, например, гель-фильтрация или ионообменная хроматография.

В заключение, описанный здесь способ позволяет получать из Е. сой очищенные, биологически активные человеческие белки, такие как 1Ь-18 и ΙΕ-1β. Оказывается, что для правильного фолдинга этих цитокинов требуется их экспрессия вначале в форме предшественников и затем расщепление до их зрелой формы.

Человеческий 1Б-18 в этом отношении отличается от мышиного 1Б-18, который может экспрессироваться в бактериальных клетках в виде зрелого, биологически активного цитокина.

Теперь изобретение будет проиллюстрировано следующими, не ограничивающими его, примерами. Пример 1. Конструирование плазмиды, кодирующей человеческий рго1Ь-18 с участком фактора Ха. РМВС получали из периферической крови здорового добровольца разделением на градиенте плотности Е1со11-Рас|ие РЬи8 (Рйагташа). Затем РМВС дважды отмывали ледяным РВ8, содержащим 2% ЕВ8, и ресуспендировали до 2,5х10⁶ клеток/мл в среде КРМ1-1640, дополненной фетальной бычьей сывороткой (ЕВ8), 2 мМ Ь-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина (КРМ1-10). Культуру стимулировали ЬР8 (1 мкг/мл, 3 ч, 37°С). Общую РНК экстрагировали из клеток с помощью ТйРиге™ Ιδοίαΐίοη Кеадеи! (Воейпидег Маиийет) согласно инструкции производителя.

кДНК рго1Ь-18_1ЕОК конструировали путем трехстадийной РСК с использование метода перекрывающихся праймеров. Различные праймеры создавали на основе кДНК человеческого рго1Ь-18 (ОеиВаик ассеккюи ио. Ό49950, (3)).

Для первой РСК прямым праймером являлся следующий:

5'-ЛЛСЛТС6ЛЛ66ТС6ТТЛСТТТ66СЛЛ6СТТ6ЛЛТС-3' (8ЕО ГО N0:7), а обратным праймером был 5'-С6С6ЛЛТТССТЛ6ТСТТС6ТТТТ6ЛЛСЛ6Т-3' (8ЕО ГО N0:8). Сайт Есо ΚΙ входил в состав обратного праймера. Шаблоном служила подвергнутая обратной транскрипции общая клеточная РНК, выделенная из РВМС, стимулированных ЬР8. Условия термоцикла были следующими: 10 циклов (94°С, 30 с; 55°С, 30 с и 68°С, 2 мин), после чего следовали 25 циклов (94°С, 30 с; 55°С, 30 с и 68°С, 125 с/цикл). Полученный продукт РСК длиной 498 нп амплифицировали на следующей стадии РСК, используя перекрывающийся прямой праймер

5'-Т66СЛЛТ6ЛЛЛТТТЛТТ6ЛСЛЛТЛС6СТТТЛСТТТЛТЛ6СТ6ЛЛ6ЛТ6ЛТ6ЛЛЛЛСЛТС6Л Л66ТС6ТТЛСТТТ6-3' (8Е0 ГО N0:9) и тот же, что на предыдущей стадии, обратный праймер. Условия термоцикла были следующими: 30 циклов (94°С, 30 с; 56°С, 30 с и 72°С, 1 мин). Полученный продукт длиной 551 нп амплифицировали на третьей стадии РСК, используя перекрывающийся прямой праймер 5'-С6Т66ЛТССЛТ66СТСТ6ЛЛССЛ6ТЛ6ЛЛ6ЛСЛЛТТ6СЛТСЛЛСТТТ6Т66СЛЛТ6ЛЛЛТТ ТЛТТ6ЛС-3' (8Е0 ГО N0:10) и тот же, что на предыдущей стадии, обратный праймер. В состав прямого праймера входил сайт ВатН I. Условия термоцикла были теми же, что и на предыдущей стадии. Полученный продукт РСК длиной 0,6 тыс.нп (фиг. 1) очищали посредством набора Нфй Риге™ для очистки продуктов РСК (Воейпидег Маиийет) и лигировали в состав вектора рОЕМ-Т Еаку с получением плазмиды рОЕМ-рго1Ь-18_1ЕОК. Продуктами лигирования трансформировали компетентные клетки ДМ109 (Рготеда Согрогайои). На всем протяжении работы использовали стандартные протоколы клонирования (11).

Плазмиду рОЕМ-рго1Ь-18_1ЕОК проверяли на наличие правильной вставки путем обработки ферментами рестрикции и ДНК-секвенирования. Плазмиду обрабатывали ВатН I и ЕсоК I. Полученную ВатН Ι/ЕсоК I ДНК, кодирующую человеческий рго1Ь-18_1ЕОК, подвергали электрофорезу в 1,0% агарозе и выделяли из геля полосу, соответствующую 0,6 тыс.нп, посредством 01Ас.|шск Ое1 Ех1гасйои Кй (ПМСЕН Оегтаиу). Эту ДНК лигировали в состав экспрессирующего вектора рОЕХ-2ТК (Рйагтааа), который был линеаризован с помощью ВатН I и ЕсоК I. Полученной рекомбинантной плазмидой рОЕХ-ргоШ18_1ЕОК (фиг. 2) трансформировали штамм Е. сой 1М109 и подтверждали последовательность полученного вектора обработкой ферментами рестрикции и ДНК-секвенированием.

Пример 2. Экспрессия и очистка белка слияния СЗТ-ргоШ-Щщок.

мл инкубировавшейся в течение ночи культуры из свежей единичной колонии Е. сой ДМ109, трансформированной плазмидой рСЕХ-рго^-18^,^. растворяли в 450 мл среды ЬВ, содержащей 100 Ед/мл ампициллина и выращивали при встряхивании при 37°С до достижения оптической плотности при 600 нм, равной 0,6. Затем экспрессию белка индуцировали добавлением ГРТО до конечной концентрации 0,1 мМ и дальнейшим культивированием в течение 3 ч при 37°С. Бактерии осаждали путем центрифугирования (5000хд, 5 мин, 4°С) и быстро ресуспендировали в 1:100 от первоначального объема ледяного фосфатно-солевого буфера (РВ8; 150 мМ №С1, 16 мМ №₂НР0₄, 4 мМ NаН₂Р0₄, рН 7,3), содержащего ингибиторы протеаз (лейпептин 1 мкг/мл, пепстатин А 1 мкг/мл, апротинин 2 мкг/мл, РМ8Е 0,2 мМ и ЕЭТА 5 мМ). Клетки лизировали на льду мягкой обработкой ультразвуком (4 импульсами по 15 с). Добавляли Тгйои Х-100 до конечной концентрации 1% и смесь держали на льду в течение 5 мин. Очищенный от осадка лизат (14000хд, 15 мин, 4°С) смешивали с 50% суспензией гранул глутатион-агарозы (2 мл,

- 6 006825

Рйагтааа) и инкубировали смесь при мягком встряхивании при 4°С в течение 3 ч. Гранулы осаждали центрифугированием (500хд, 5 мин), дважды отмывали 10 объемами буфера для лизиса (1% Ттйоп Х-100 в РВ8), дважды - 10 объемами 20 мМ трис-НС1, рН 8,0, 150 мМ ЫаС1 и дважды - 10 объемами 20 мМ трис-НС1, рН 8,0, 150 мМ ЫаС1, 2,0 мМ СаС1₂ (буфер расщепления) . Все стадии выполняли при 4°С.

Пример 3. Расщепление белка слияния и очистка зрелого человеческого 1Ь-18.

Гранулы глутатион-агарозы со связанным белком слияния С§Т-рто1Ь-18_1ЕЖ инкубировали (6 ч, 23°С) с фактором Ха (№\ν Епд1апЛ В1о1аЬ§) в 1 мл буфера расщепления, используя протеазу в соотношении к субстрату 1:50 (мас./мас.), при постоянном перемешивании на ротаторе. На этой стадии освобождается зрелый человеческий 1Ь-18. Гранулы осаждали центрифугированием при 500хд в течение 5 мин при 4°С и отмывали 5 раз 2 мл ледяного РВ8. Супернатант и все объемы отмывки объединяли, очищали от осадка центрифугированием (14000хд, 15 мин, 4°С) и концентрировали путем ультрафильтрации (Сеп1псоп-10, Ат1соп). Аликвоты белка, так же как и гранулы до и после обработки, подвергали электрофорезу в 0,1% ЗЭЗ-12% полиакриламидном геле с последующей окраской кумасси голубым. При электрофорезе супернатанта получили большую полосу примерно на 18 кДа, что согласовывалось с ожидаемой массой зрелого человеческого 1Ь-18. Кроме того, наблюдалась малая полоса на 19,5 кДа (фиг. 5). При анализе Ν-концевой последовательности белка из двух полос получили последовательность ΥΕΟΚ....., что согласовывалось с таковой зрелого человеческого 1Ь-18. Очищенный белок стерилизовали, пропуская через фильтр 0,2 мкм, и хранили при -70°С.

Пример 4. Исследование биологической активности человеческого 1Ь-18.

Активность человеческого 1Ь-18 выявляли, как описано в (2). В кратком изложении, селезенки нормальных мышей линии С3Н/Не1 выделяли, измельчали и помещали в буфер Джея (Сеу ЬиГГег: 0,144 М ΝΗ·|Ο в 0,017 М трис-НС1, рН 7,2) для разрушения эритроцитов. Лейкоциты дважды отмывали РРМ1-5 и затем ресуспендировали в КРМЫ0. Для получения не прилипающих к пластику клеток клеточные суспензии инкубировали (60 мин, 37°С) в 100 мм пластиковых чашках (Вес1оп Оюкшкоп ЫЛ., ϋΚ). Не сорбировавшиеся клетки аккуратно отбирали, центрифугировали и ресуспендировали в КРМ1-10. Жизнеспособные клетки подсчитывали при помощи исключающего мертвые клетки теста - окраски трипановым синим - и концентрацию клеток доводили до 5х10⁶ клеток/мл. При помощи этой процедуры избавлялись от большей части неспецифических эстераза-положительных клеток. Суспензию не прилипающих к пластику клеток (0,15 мл) помещали в 96-луночный плоскодонный культуральный планшет для микротитрования (ΝϋΝίΕΟΝ™, Дания). 1Ь-18 в различных концентрациях, полимиксин (1 мкг/мл) и Соп А (0,125 мкг/мл) добавляли в лунки в 50 мкл КРМ1-10. Планшеты инкубировали в течение 24 или 48 ч при 37°С в 5% СО₂. После инкубации супернатанты собирали и определяли титры мышиного ΙΕΝ-γ посредством ЕЫ8А. При инкубации не прилипающих к пластику мышиных клеток селезенки только с человеческим Ш-18 выявляли малую продукцию ΙΕΝ-γ, что указывало на необходимость костимуляции. Добавления одного Соп А в концентрации 0,125 мкг/мл не индуцировало значительного уровня ΙΕΝ-γ. Когда не прилипающие спленоциты инкубировали с Соп А и человеческим Ш-18, полученным в настоящем изобретении, получали зависимую от дозы индукцию ΙΕΝ-γ (фиг. 6).

Пример 5. Конструирование плазмиды, кодирующей человеческий рто1Ь-1 β с участком фактора Ха.

РМВС получали из периферической крови здорового добровольца разделением на градиенте плотности Е1со11-Рас.]ие РЬИЗ (Рйаттааа). Затем РМВС дважды отмывали ледяным РВ8, содержащим 2% ЕВ8, и ресуспендировали до 2,5х10⁶ клеток/мл в среде КРМ1-1640, дополненной фетальной бычьей сывороткой (ЕВ8), 2 мМ Ь-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина (КРМ1-10). Культуру стимулировали ЬР8 (1 мкг/мл, 3 ч, 37°С). Общую РНК экстрагировали из клеток с помощью ТпРше™ 1§о1айоп Кеадеп! (Воейппдет Маппйе1т). 1 мг общей РНК использовали для КТ-РСК с помощью однопробирочного теста Тйап для КТ-РСК (Воейппдет Маппйе1т) согласно инструкции производителя.

кДНК рто1Ь-1 β клонировали путем РСК со смысловым и обратным праймерами, созданными на основе кДНК человеческого рто1Ь-1 β (СепВапк ассекыоп по. М15330). Смысловой праймер соответствовал нуклеотидам 87-107 последовательности М15330, предшествующим участку расщепления ВатН I. Обратный праймер соответствовал нуклеотидам 896-876 последовательности М15330, предшествующим участку ЕсоК I. Шаблоном служила подвергнутая обратной транскрипции общая клеточная РНК, выделенная из РВМС, стимулированных ЬР8. Условия термоцикла были следующими: 10 циклов (94°С, 30 с; 55°С, 30 с и 68°С, 2 мин), после чего следовали 25 циклов (94°С, 30 с; 55°С, 30 с и 68°С, 125 с/цикл).

Полученный продукт РСК длиной 830 нп очищали посредством набора Н1дй Рите™ для очистки продуктов РСК (Воейппдет Маппйенп) и лигировали в состав вектора рСЕМ-Т Еаку с получением плазмиды рСЕМ-ртоШ-ф. Плазмиду подвергали сайт-специфическому мутагенезу с применением олигонуклеотида АСАТСССАТААССАСССТАТТСААССССССССАССТСТАССА (5Ш ΙΌ ΝΟ:11), соответствующего нуклеотидам 405-452 мРНК человеческого ΙΕ-1β и несущего мутации Υ113Ι, У114Е, Н115С и Ό116Κ.

Полученную плазмиду рСЕМ-рюШ-фи^ из единичной колонии проверяли на наличие правильной вставки путем обработки ферментами рестрикции и ДНК-секвенирования. Плазмиду обрабатывали ВатН Ι и ЕсоК Ι. Полученную ВатН Ι/ЕсоК Ι ДНК, кодирующую человеческий ргсйИ β_Ι№Κ, подвергали

- 7 006825 электрофорезу в 1,0% агарозе и выделяли из геля полосу, соответствующую 0,82 тыс.нп, посредством О1Лс.|шск Се1 Ех1гасйоп Κίΐ (ΌΙΆ6ΕΝ, Сегтапу). Эту ДНК лигировали в состав экспрессирующего вектора рСЕХ-2ТК (Рйагтааа), который был линеаризован с помощью ВатН I и ЕсоЕ I. Полученной рекомбинантной плазмидой рСЕХ-рго1Ь-1в_1Еок трансформировали штамм Е. сой 1М109 и подтверждали последовательность полученного вектора обработкой ферментами рестрикции и ДНК-секвенированием.

Пример 6. Экспрессия и очистка белка слияния СЗТ-рго+Ч мл инкубировавшейся в течение ночи культуры из свежей единичной колонии Е. сой 1М109, трансформированной плазмидой рСЕХ-рго1Ь-1 р_1Еок, растворяли в 450 мл среды ЬВ, содержащей 100 Ед/мл ампициллина, и выращивали при встряхивании при 37°С до достижения оптической плотности при 600 нм, равной 0,6. Затем экспрессию белка индуцировали добавлением 1РТС до конечной концентрации 0,1 мМ и дальнейшим культивированием в течение 3 ч при 37°С. Бактерии осаждали путем центрифугирования (5000хд, 5 мин, 4°С) и быстро ресуспендировали в 1:100 от первоначального объема ледяного фосфатносолевого буфера (РВ8; 150 мМ №С1, 16 мМ №₂НРО₄, 4 мМ ΝαΗ₂ΡΟ₄, рН 7,3), содержащего ингибиторы протеаз (лейпептин 1 мкг/мл, пепстатин А 1 мкг/мл, апротинин 2 мкг/мл, РМ8Г 0,2 мМ и ЕЭТЛ 5 мМ). Клетки лизировали на льду мягкой обработкой ультразвуком (4 импульсами по 15 с). Добавляли Тгйоп Х-100 до конечной концентрации 1% и смесь держали на льду в течение 5 мин. Очищенный от осадка лизат (14000хд, 15 мин, 4°С) смешивали с 50% суспензией гранул глутатион-агарозы (2 мл, Рйагтааа) и инкубировали смесь при мягком встряхивании при 4°С в течение 3 ч. Гранулы осаждали центрифугированием (500хд, 5 мин), дважды отмывали 10 объемами буфера для лизиса (1% Тгйоп Х-100 в РВ8), дважды - 10 объемами 20 мМ трис-НС1, рН 8,0, 150 мМ №1С1 и дважды - 10 объемами 20 мМ трис-НС1, рН 8,0, 150 мМ №С1, 2,0 мМ СаС1₂ (буфер расщепления). Все стадии выполняли при 4°С.

Пример 7. Расщепление белка слияния и очистка зрелого человеческого ΙΕ-1β.

Гранулы глутатион-агарозы со связанным белком слияния О8Т-рго1Е-1в_1ЕОЕ инкубировали (6 ч, 23°С) с фактором Ха (Νο\ν Епд1апб Вю1аЬ§) в 1 мл буфера расщепления, используя протеазу в соотношении к субстрату 1:50 (мас./мас.), при постоянном перемешивании на ротаторе. На этой стадии освобождается зрелый человеческий ΙΕ-1β. Гранулы осаждали центрифугированием при 500хд в течение 5 мин при 4°С и отмывали 5 раз 2 мл ледяного РВ8. Супернатант и все объемы отмывки объединяли, очищали от осадка центрифугированием (14000хд, 15 мин, 4°С) и концентрировали путем ультрафильтрации (Сеп1псоп-10, Ат1соп). Аликвоты белка, так же как и гранулы до и после обработки, подвергали электрофорезу в 0,1% 8Э8-12% полиакриламидном геле с последующей окраской кумасси голубым. При электрофорезе супернатанта получили большую полосу примерно на 17 кДа, что согласовывалось с ожидаемой массой зрелого человеческого ΙΕ-1β. Очищенный белок стерилизовали, пропуская через фильтр 0,2 мкм, и хранили при -70°С.

Пример 8. Конструирование плазмиды кодирующей человеческий рго1Ь-18 с участком расщепления каспазой-8.

Рекомбинантную плазмиду рОЕХ-рго-1Ь-18_1ЕЖ из примера 1 модифицировали вставкой амплифицированного путем РСЕ фрагмента ДНК с участком расщепления каспазой-8 (ЬЕТО). В кратком изложении, рСЕХ-рго-1Г-18ц,_;;|< обрабатывали ферментами рестрикции ВАМ Н1 в позиции 951 и Нтб III в позиции 1074, отрезая порцию ДНК, содержащую Рго-домен, участок расщепления фактором Ха ВЕСЕ) и три аминокислоты от Ν-конца ЫЬ-18.

Ту же плазмиду использовали как шаблон для амплификации в РСЕ путем введения мутированного участка ЙЕТЭ в состав располагающегося ниже праймера а!дсААС СТТ ССС ААА СТА СТС СОТ ТТС САС СТТ ТТС АТС АТС ТТС АСС ТАТ АА (8ЕО Ю ΝΟ:12). Фрагмент РСЕ очищали с использованием набора для «получения высокоочищенного продукта» (Ыдй риге ргобис! рипйсайоп; Воейгшдег Маппйе1т), после чего сходным образом нарезали посредством ВАМ Ш и Ншб III с получением вставки длиной 123 нп. Открытый вектор и вставку разделяли на агарозном геле и экстрагировали с использованием коммерческого набора «1е1 8огЬ» (Сепотеб). Лигирование проводили в течение ночи, используя лигазу Т4 (Νον Епд1апб Вю1аЬ§, Веуег1у МА, США), и трансформировали продуктами лигирования компетентные клетки Е. сой ЭН5а. Выделяли и субкультивировали несколько колоний и получали препараты М1шргер посредством набора «01адеп». Чтобы секвенировать существенную часть рекомбинантной плазмиды, все препараты Мш1ргер подвергали амплификации путем РСЕ (Регкш Е1тег Сепе Атр- Лтр|Тас.| ΩΝΛ ро1утегахе). Окончательную трансформацию проводили на компетентных бактериях Е. сой 1М109, следуя способу Т88 (Сйипд, С.Т. е! а1. (1989) Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 86, 2172-2175).

Пример 9. Экспрессия и очистка белка слияния С8Т-рго[к-18|._ЕТи.

Используя плазмиду, сконструированную согласно приведенному выше примеру 8, экспрессию белка СЗТ-ргоГЕ-Щькгд проводили в флаконах при встряхивании и 5-литровых ферментерах, по существу, так же, как описано выше в примере 2.

Пример 10. Расщепление белка слияния с использованием каспазы-8 и очистка зрелого человеческого +-18.

Гранулы глутатион-агарозы со связанным белком слияния СБТ-рюШ-Щ^^ инкубировали (6 ч, 23°С) с каспазой-8 (са1Ыосйет) в 1 мл буфера расщепления (описанном в примере 6), используя соотно

- 8 006825 шение протеаза:субстрат 1:1200 (мас./мас.), при постоянном перемешивании на ротаторе или роллере. Гранулы осаждали центрифугированием при 500хд в течение 5 мин при 4°С и отмывали 5 раз 2 мл ледяного РВ8. Супернатант и все объемы отмывки объединяли, очищали от осадка центрифугированием (14000хд, 15 мин, 4°С) и концентрировали путем ультрафильтрации (Сеп1псоп-10, Ат1соп). Концентрированную после обработки смесь разделяли по размерам молекул на 8ирегдех-75 (РЫаттааа), чтобы отделить ЫЬ-18 (18 кДа) от высокомолекулярных продуктов расщепления и оставшегося протеолитического фермента (гетеродимер каспазы-8, 29 кДа, и гетеротетрамеры, 58 кДа).

В различных фракциях 8ирегдех-75 анализировали ферментную активность каспазы-8 с использованием набора для анализа каспазы-8 и флуорогенного субстрата Ас-ШТО-АМС (ВЮМОЬ), и эта активность наблюдалась в фракциях, соответствующих молекулярной массе 55 кДа (соответствующих гетеротетрамеру каспазы-8); так было показано, что каспаза-8 очень хорошо отделилась от фракций, содержащих ЫЬ-18 (18 кДа).

Фракции после гель-фильтрации, содержащие высокоочищенный ЫЬ-18 массой 18 кДа, объединяли, концентрировали на Сеп1псоп-10 (Аткоп), в конце стерилизовали, пропуская через 0,22 мкм фильтр, и хранили при -80°С.

Аликвоты белка, так же как и гранулы до и после обработки, подвергали электрофорезу в 0,1% 8Ό8-12% полиакриламидном геле с последующей окраской кумасси голубым (фиг. 9). При электрофорезе фракции супернатанта наблюдали полосу на 18 кДа, что согласовывалось с ожидаемой массой зрелого человеческого 1Ь-18. Анализ фракции гранул показал, что не происходит полного расщепления, поскольку на гранулах остался связанный белок-предшественник. Более того, во фракции гранул осталось некоторое количество расщепленного 1Ь-18.

Пример 11. Исследование биологической активности человеческого 1Ь-18, полученного путем расщепления каспазой-8.

Активность человеческого ГЬ-18 оценивали, как описано (10). В кратком изложении, клетки КС-1 культивировали в ИМЕМ, содержащей 20% РВ8. Для анализа 1Ь-18 клетки КС-1 ресуспендировали в концентрации 1,2х10⁶ клеток/мл (250 мкл/лунку, 48-луночный планшет) и стимулировали тТИРа (1пподепейск) вместе с ЫЬ-18 в различных концентрациях (несколько разведений, начиная с 80 нг/мл). Планшет инкубировали в течение 24 ч при 37°С в 5% СО₂. После инкубации супернатанты собирали и определяли содержание мышиного ΙΡΝ-γ посредством ЕЫ8А (гес. ЫРИ-у и анти-ЫРИ-у от В & Ό 8ук1етк).

Человеческий 1Ь-18 индуцировал зависимую от дозы продукцию ΙΡΝ-γ с активностью, идентичной таковой у ЫЬ-18, полученного путем конструирования участка расщепления фактором Ха.

Ссылки

1. Иакатига, К., Окатига, Н., Иада1а, К., Котаки, Т., апд Татига, Т. (1993) 1пГес1. 1ттип. 61, 64-70.

2. Окатига, Н., Ткикш, Н., Котаки. Т., Уикидо. М., Накига, А., Татто1о, Т., Топдое, К., Окига, Т., Иикада, Υ., Найоп, К., Акйа, К., ИатЬа, М., ТапаЬе, Р., КопкЫ, К., Рикида, 8., апд Кипто1о, М. (1995) ИаЫге 378, 88-91.

3. ИкЫо, 8., ИатЬа, М., Окига, Т., Найоп, К., Иикада, Υ., Акйа, К., ТапаЬе, Р., КоткЫ, К., М1са11еГ, М., РнЩ, М., Топдое, К., ТаттоЫ, Т., Рикида, 8., 1кеда, М., Окатига, Н., апд Кипто1о, М. (1996) 1. 1ттипо1. 156, 4274-4279.

4. Вахап, 1.Р., Т1тапк, 1.С., апд Каке1еш, В.А. (1996) ИаЫге 379, 591.

5. Окатига, Н., Иада1а, К., Котаки, Т., Татто1о, Т., Иика1а, Υ., ТапаЬе, Р., Акйа, К., Топдое, К., Окига, Т., Рикида, 8., апд Кшгто1о, М. (1995) 1пГес1. 1ттип. 63, 3966-3972.

6. М1са11еГ, М.Ь, ОЫкик1, Т., КоЫпо, К., ТапаЬе, Р., ИкЫо, 8., ИатЬа, М., Ташто1о, Т., Топдое, К., РнЩ, М., 1кеда, М., Рикида, 8., апд КшгтоЫ, М. (1996) Еиг. 1. 1ттипо1. 26, 1647-1651.

7. Ткикш, Н., ИакапкЫ, К., Макни К., Н1дакЫпо, К., Окатига, Н., М1уаха^а, Υ., апд Капеда, К. (1996) 1. 1ттипо1. 157, 3967-3973.

8. СЫауиг, Т., Вапецее, 8., Нидишп, М., ВиЙет, Ό., Негход, Ь., Сайет, А., фи1п(а1, Ь., 8еки1, Ь., Та1ап1ап, В., Ракктд, М., ХУопд, V., Катеп, В., Тгасеу, Ό., апд Айеп, Н. (1997) ИаЫге 386, 619-623.

9. Си, Υ., Кшда, К, Ткикш, Н., Ки, С., Нк1ао, К., Р1еттд, М.А., НауакЫ, Ν., ШдакЫпо, К., Окатига, Н., ИакапкЫ, К., Кипто1о, М., Ташто1о, Т., Р1ауе11, В.А., 8а1о, V., Нагдшд, М.ХХ'., ЬМпдк1оп, Ό.Ι., апд 8и, М.8. (1997) 8с1епсе 275, 206-209.

10. Такеда, К., Ткикш, Н., ΥокЫтоΐо, Т., АдасЫ, О., ΥокЫда, Ν., КкЫто1о, Т., Окатига, Н., ИакашкЫ, К., апд Ак1га, 8. (1998) 1ттипйу 8, 383-390.

11. 8атЬгоок, 1., РпксЫ, Е.Р., апд Машайк, Т. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота1оту Мапиа1., 2пд едп. Ед., Со1д 8рппд НагЬог ЬаЬота1опек, Со1д 8рппд НагЬог, ΝΥ.

12. Щ11а, Р., КаиГтапп, 8.Н., апд ЕаткЫач, XV.С. (1997) Сакракек апд сакраке шЫЬйотк Тгепдк ВюсЫет. 8с1. 22 388-393.

13. И1сЫо1коп, Ό.ν., ТЫотпЬепу, И.А., (1997) Сакракек: К111ег рто!еакек. Тгепдк ВюсЫет. 8с1 22 299-306.

14. Сагаа-СаВо, М., Ре1еткоп, Е.Р., Вакрег, И.М., Vа^11аπсоий, 1.Р., 2атЬош, В., МсЫо1коп, Ό.ν., ТЫотпЬепу, И.А., (1999) РипПсаОоп апд са!а1уйс рторетйек оГ Ыитап сакраке Гатйу тетЬегк. Се11 ЬеаЫ

- 9 006825 ϋΐίϊβΓ. 6; (4) 362-369. Κοηίδΐιί, К., ТапаЬе, Г., ТатдисЫ, М., УатаисЫ, Н., Таттсбо, Т., 1кес1а, М., Огйа, К., Киптсбо, М. (1997) А δίιηρίε апс! δεηδίΐίνε Ьюаззау £ог 1Ье άεΐεοΐίοη о£ Иитап т£ег1еикт-18/ткг£егоп-у тбистд £ас!ог изтд Иитап туе1отопосуйс КО-1 се11з, 1.1ттипо1. Μεΐΐιοάδ 209 187-191.

Список последовательностей <110> НиЫп5ке1п, Мепасйет

Ыи, В1ап1ипд

КоУ1ск, 0ап1е1а

ОтпагеНо, СЬаг1ез

СгаЬег, Ртегге

Уеба Кезеагсй апб ϋβνβίοριηβηΐ: Со. ΙΛά.

<120> Получение биологически активных молекул <130> Продукция 1Л-18 <14 0>

<14 1>

<150> 129427 <151> 1999-04-13 <160> 14 <170> РаБепМп Уег. 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: транслированная с синтетического олигонуклеотида <400> 1

Леи Уа1 Рго Агд С1у Зег

5 <210> 2

- 10006825 <211> 4 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: рованная с синтетического олигонуклеотида <400> 2

Не С1п С1у Агд <210> 3 <211> 4 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность трансли<220>

<223> Описание искусственной последовательности: рованная с синтетического олигонуклеотида <400> 3

Азр Азр Азр Ьуз трансли<210> 4 <211> 2 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

рованная с синтетического олигонуклеотида трансли<400> 4

ΗΪ3 Туг <210> 5 <211> 2 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: транслированная с синтетического олигонуклеотида <400> 5

Туг ΗΪ5

<210>	6
<211>	8
<212>	РКТ
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>

Описание искусственной последовательности: трансли-

рованная с синтетического олигонуклеотида <400> 6

Ьеи С1и Уа1 Ьеи РЬе 01п С1у Рго <210> 7 <211> 35 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 7 аасаЬсдаад дЬсдЬЕасЕЬ ЬддсаадсЕЬ дааЬс <210> 8

-12006825

<211>	30
<212>	ДНК
<213>	Ното зартепз
<4 00>	8
сдсдааЪЪсс	ЪадСсЕСсдИ ЪЪТдаасадС 30
<210>	9
<211>	75
<212>	ДНК
<213>	Ното зархепз
<4 00>	9

сддсаасдаа асссассдас ааСасдсгСС ассссасадс Идаада^даС даааасаСсд 60

ааддссдССа	ссссд 75
<210>	10
<211>	69
<212>	ДНК
<213>	Ното зархепз
<4 00>	10
сдСддаСсса сссассдас	^ддсСдсЬда ассад+адаа дасааТСдса СсаасЪС+дС ддсааЬдааа 60 69
<210>	11
<211>	42
<212>	ДНК
<213>	Ното заргепз
<4 00>	11
асаСдддаСа	асдаддсИаЪ Сдааддссдд дсасс£д£ас да 42
<210>	12
<211>	54
<212>	ДНК
<213>	Ното зархепз

- 13 006825

<4 00>	12
акдсаадскк	дссааадкад ксддккксса ддкккксакс акскксадск акаа 54
<210>	13
<211>	582
<212>	днк
<213>	Ното зархепз

<400> 13 акддскдскд аассадкада адасааккдс аксааскккд кддсаакдаа акккаккдас60 аасасдсссс аскккакадс кдаадакдак даааасскдд ааассдаска скккддсаад120 сссдаакска ааккаксадк сакаадааак ккдаакдасс аадккскскк саккдассаа180 ддаааксддс скскакккда адакакдаск даккскдаск дкададакаа кдсассссдд240 ассакаккка ккакаадкак дкакааадак адссадсска даддкакддс кдкааскакс300 кскдкдаадк дкдадаааак кксааскскс ксскдкдада асааааккак кксскккаад360 дааакдаакс сксскдакаа саксааддак асааааадкд асаксакакк сккксадада420 адсдссссад дасакдакаа каадакдсаа кккдаакскк саксакасда аддакасккк480 скадсккдкд ааааададад адассккккк ааасксаккк кдаааааада ддакдааккд540 ддддакадак скакаакдкк саскдкксаа аасдаадаск ад582

<210>	14
<211>	193
<212>	РКТ
<213>	Ното
<4 00>	14

заргепз

Мек

А1а

С1и

Рго

Уа1

С1и

Азр

Азп

Суз

11е

Азп

РЬе

Уа1

А1а

Мек

1

5

10

15

Ьуз

РИе

11е

Азр

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

РЪе

11е

А1а

С1и

Азр

С1и

Азп

20

25

30

Ьеи

С1и

ТЪг

Азр

Туг

РЬе

С1у

Ьуз

Ьеи

С1и

Зег

Ьуз

Ьеи

Зег

Уа1

11е

35

40

45

Агд

Азп

Ьеи

Азп

Азр

С1п

νβΐ

Ьеи

РНе

11е

Азр

С1п

С1у

Азп

Агд

Рго

50

55

60

Ьеи

РЪе

С1и

Азр

Мек

Ткг

Азр

Зег

Азр

Суэ

Агд

Азр

Азп

А1а

Рго

Агд

65

70

75

80

Ткг

Не

РЪе

11е

Зег

Мек

Туг

Ьуз

Азр

Зег

С1п

Рго

Агд

С1у

Мек

85

90

95

-14006825

А1а Уа1

ТЬг

Не 100

Зег

νβΐ

Ьуз

Суз

С1и Ьуз 105

11е Зег

ТЬг

Ьеи 110

Зег

Суз

С1и

Азп

Ьуз

11е

Зег

РЬе

Ьуз

С1и

Ме£

Азп

Рго

Азр

Азп

Пе

115

120

125

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

11е

Не

РЬе

С1п

Агд

Зег

Ла1

Рго

С1у

130

135

140

ΗΪ5

Азр

Азп

Ьуз

МеЪ

С1п

РЬе

С1и

Зег

Туг

С1и

С1у

Туг

РЬе

145

150

155

160

Ьеи

А1а

Суз

С1и

Ьуз

С1и

Агд

Азр

Ьеи

РЬе

Ьуз

Ьеи

Не

Ьеи

Ьуз

165

170

175

С1и

Азр

С1и

Ьеи

С1у

Азр

Агд

Зег

Не

Мер

РЬе

ТЬг

Уа1

С1п

Азп

С1и

180

185

190

Азр

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения биологически активной молекулы из ее биологически неактивного предшественника, включающий обеспечение мутирования его нативного участка расщепления каспазой-1 с образованием участка, расщепляемого протеазой, и расщепление мутированной молекулы с получением биологически активной молекулы, причем указанная биологически активная молекула представляет собой цитокин.
2. Способ по п.1, где цитокин выбран из 1Б- 1β и 1Б-18.
3. Способ по любому из предшествующих пунктов, где протеаза выбрана из тромбина, энтерокиназы, субтилизина, гененазы (депепазе™), протеазы человеческого риновируса ЗС, протеазы фактора Ха и каспазы, предпочтительно каспазы-8.
4. кДНК, кодирующая предшественник биологически активной молекулы, мутированный в нативном участке его расщепления каспазой-1 с образованием участка, расщепляемого протеазой, необязательно подвергнутый слиянию с последовательностью, кодирующей О8Т, причем указанная биологически активная молекула представляет собой цитокин, выбранный из 1Ь-1 β и 1Б-18.
5. Способ получения биологически активной молекулы, включающий трансфекцию клеток-хозяев вектором, содержащим кДНК, кодирующую неактивный предшественник биологически активной молекулы, мутированный в нативном участке его расщепления каспазой-1 с образованием участка, расщепляемого протеазой, культивирование трансфицированных клеток-хозяев и выделение биологически активной молекулы после обработки протеазой, причем указанная биологически активная молекула представляет собой цитокин.
6. Способ по и. 5, где кДНК подвергают слиянию в рамке считывания с последовательностью, кодирующей глутатион-8-трансфсразу (О8Т), и экспрессированную молекулу слияния задерживают на гранулах глутатион-агарозы перед обработкой протеазой.