CN1353761A - 生物活性分子的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明生物活性分子是从无生物活性的前体产生,通过其天然切割位点突变为能为蛋白酶切割的位点、并切割该突变分子而产生生物活性分子。

Description

生物活性分子的制备
技术领域
本发明总的涉及产生以无活性前体存在的生物活性分子及其在体内被蛋白酶切割而成的成熟的生物活性分子。
更具体说，本发明涉及产生天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)和细胞因子，即从其相对应的前体通过体内自身切割、其他天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的切割或诸如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(也称为白介素1转化酶ICE)等蛋白酶的切割，产生天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶和细胞因子。以这种方式产生的细胞因子的例子是白介素-1β(IL-1β)和白介素-18(IL-18)。
背景技术
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶是一个丝氨酸蛋白酶家族，它们能在天冬氨酸(ASP)残基之后切割其靶蛋白质。已公布的11种已知天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶中，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1，可能还有天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-4，-5和-11似乎主要参与促炎症细胞因子的加工，而其他天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶在引发和导致细胞凋亡或细胞程序死亡中起着关键性作用。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶具有几个共同特征：即它们合成时为无催化活性的酶原，一般通过结构域之间连接处中存在的特定内部ASP残基之后的切割而被激活，并能够在ASP残基之后切割其底物。结果，某些成熟的活性天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，特别是衍生自长的有前结构域的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，可以加工和激活其自身以及其他无活性的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶原。根据一级结构，可将促细胞凋亡的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶分成二类：I类包括天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2、-8、-9和-10，含有长的氨基末端前结构域；II类如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3、-6和-7，具有短的或没有前结构域。体外切割实验提示，II类天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的蛋白水解加工需要活化的I类天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(12)。
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的另一种分类法是根据切割位点的特异性分类(13)。I组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶具有共有序列WEHD(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1，-4和-5)；II组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶共有序列为DExD(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2，-3和-7)，第III组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶共有序列为(IVL)ExD(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-6，-8和-9)，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8最适位点是LETD(14)。
白介素18(IL-18)，起初称为β-干扰素(IFN-β)诱导因子，是最近得到鉴定的一种细胞因子，具有与蛋白质IL-1家族相同的结构特征(1-4)，已从用热灭活的痤疮丙酸杆菌(P.acnes)处理、然后用脂多糖(LPS)处理的小鼠肝脏初步纯化，并随后克隆了IL-18(2、5)。最近也报道了人IL-18的克隆(3)。
像IL-12一样，IL-18由活化的巨噬细胞，如肝枯否细胞和其他驻留巨噬细胞产生(3)。IL-18是Th1应答反应的一种早期诱导剂，协同刺激产生IFN-
Figure A0080805700041
以及TNF-β、粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子和IL-2(6)。此外，它能促进抗CD3诱导的T细胞增殖和通过增强Fas配体的表达提高自然杀伤细胞的细胞毒性(6、7)。
不像具有四螺旋束状结构的大多数其他细胞因子，IL-18和IL-1β具有的都是β折叠片层结构门(7)。与IL-1β相似，IL-18合成时也为无生物活性的前体(前IL-18)，缺乏信号肽(3)。IL-1β和IL-18前体经天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(IL-1β转化酶，或ICE)切割，切割发生在P1部位天冬氨酸之后。产生的成熟细胞因子易于从细胞释放(8、9)。用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1缺陷小鼠作的研究证明了成熟IL-18的重要作用是作为IFN-β和Th1应答反应的诱导剂。给这种小鼠注射P.acnes和LPS导致循环IFN-β水平比野生型小鼠为低侣(8、9)。给天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1缺陷小鼠注射IL-18恢复了其LPS诱导的IFN-
Figure A0080805700042
水平(9)。这进一步支持了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1参与了激活IL-18产生的观点。其他天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，特别是切割与细胞凋亡相关的胞内蛋白质的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，其活性比天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1至少低100倍(9)。用IL-18缺陷小鼠作的类似研究揭示了它在NK细胞活化和细胞因子诱导中的作用(10)。
大肠杆菌表达的重组IL-1β和小鼠IL-18可以重折叠产生活性完全的细胞因子。但尝试在大肠杆菌或其他宿主中表达成熟形式的人IL-18未能产生活性完全的细胞因子。由于其在恶性肿瘤或需要诱导产生β干扰素的病情下的潜在治疗用途，需要建立一种有效的表达系统来产生成熟的有生物活性的人IL-18。
发明概述本发明使得以无生物活性前体形式天然加工形成的分子经切割该前体后成为活性的分子。这在体外不是能容易进行的。
本发明提供一种从无生物活性的前体产生生物活性分子的方法，该方法是使该分子的天然切割位点突变为对常用蛋白酶切割敏感的位点、并切割该突变分子而产生生物活性分子。
优选的该生物活性分子是天冬氨酸物异性半胱氨酸蛋白酶可细胞因子，更优选的是IL-1β和IL-18。
在这些细胞因子中，优选的天然切割位点是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1的切割位点。
用于切割的常用蛋白酶可以选自凝血酶、肠激酶、枯草杆菌蛋白酶、基因酶TM(genenaseTM，New England Biolabs，Beverly MA，USA)、人鼻病毒3C蛋白酶和因子Xa蛋白酶。当用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶切割时，优选天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8。
在本发明一个较佳实施方式中，该方法包括用含有编码生物活性分子前体(其切割位点已突变)的cDNA的载体转染宿生，培养转染的宿主，表达该前体，以及用蛋白酶处理后分离该生物活性分子。
可任选地可以下述方法进行分离，即将cDNA按照读框融合于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)编码序列，并将表达的融合分子在用蛋白酶处理前捕俘于谷胱甘肽琼脂糖珠上。
本发明还提供编码生物活性分子的突变前体的cDNA，其可任选地融合于GST编码序列。
在本发明的一个实施方式中提供一种产生和/或纯化重组杂交多肽或融合蛋白的方法。更具体说，将编码某蛋白分子的DNA片段融合于编码结合性蛋白的DNA片段。可用被天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶能识别和切割的编码肽序列的DNA。作为连接序列，将融合的DNA插入克隆用载体，用其转化适合的宿主。表达后，通过使该杂交肽与配体或底物(该结合性蛋白对此配体或底物具有特异性亲和力)接触而纯化，即通过亲和层析而纯化。
在本发明的一个较佳实施方式中，该结合性蛋白是GST，切割位点是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8的切割位点。
本发明还涉及用上述方法制备的生物活性分子。
在大肠杆菌中表达成熟的IL-18导致产生缺乏生物活性的蛋白质。正确重折叠大肠杆菌中表达的IL-18多肽骨架的尝试迄今未成功。人IL-18和人IL-1β在体内分别表达为前IL-18(pro IL-18)和前IL-1β(pro IL-1β)前体，须经天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1切割产生生物活性的成熟IL-18和IL-1β。然而天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1不能购到商品。本发明提供一种简单方法以在大肠杆菌中生产生物活性分子，特别是细胞因子，更具体是人IL-18。为此目的，构建了编码人pro IL-18的cDNA，将其中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1切割位点突变成商品化蛋白酶(如因子Xa)的切割位点。为了便于制备，将该突变的pro IL-18 cDNA融合于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)编码序列，使产生的具有因子Xa切割位点的GST-proIL-18融合蛋白在大肠杆菌中表达，并捕获在谷胱甘肽琼脂糖珠上，通过用因子Xa切割从珠上释放出具有高度生物活性的成熟人IL-18。
类似地，将编码人IL-1β天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1切割位点的DNA序列突变为因子Xa的切割位点。为便于制备，将突变的pro IL-1β cDNA按照读框融合于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)编码序列，使产生的具有因子Xa切割位点的GST-pro IL-1β融合蛋白在大肠杆菌中表达并捕获在谷胱甘肽琼脂糖珠上。通过用因子Xa切割从珠上释放出成熟的人IL-1β。
当采用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8进行切割时，实施类似程序。不同点在于将人IL-18或人IL-1β的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1切割位点突变成天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8切割位点。然后，与GST编码序列融合，并进行如下所述的后续方法步骤。
附图简要说明
图1描述编码人前IL-18突变体(pro IL-18IEGR)cDNA的克隆。以采用重叠的引物的三步PCR法克隆该cDNA。泳道如下：左侧泳道M为DNA分子量标记。第1泳道为首次PCR产生的498bp DNA。第2泳道为第二次PCR产生的551bp DAN。第3泳道为第三次PCR产生的600bp DNA，其编码人前IL-18IEGR。
图2显示表达质粒pGEX-pro IL-18IEGR的结构。(a)编码人proIL-18IEGR的600bp Bam HI/EcoRI cDNA的侧接核酸序列。用括号示出了BamHI和EcoR I的限制性酶切位点以及因子Xa的靶位点。空心箭头表示因子Xa的切割位点。(b)pGEX-2TK的示意图，也显示出限制酶切位点。实心箭头表示插入的BamHI/EcoRI连接部位。
图3显示大肠杆菌表达GST-前IL-18IEGR融合蛋白的粗提取物的SDS-PAGE。泳道如下：第1泳道为未经诱导的用亲代质粒pGEX-2TK转化的细胞。第2泳道，用亲代质粒pGE X-2 TK转化并用0.1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的细胞。左侧箭头表示预期的26KD谷胱甘肽巯基还原酶(GST)条带。泳道3-7显示用质粒pGEX-pro IL-18IEGR转化的、用或不用(泳道3)IPTG诱导所示时间的细胞。右侧箭头表示43KD条带相应于GST-pro IL-18IEGR融合蛋白的大小。
图4显示经谷胱甘肽琼脂糖纯化后GST-pro IL-18IEGR融合蛋白的SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)。将细菌超声处理后的上清液(见图3泳道7)在谷胱甘肽琼脂糖上亲和纯化。泳道如下：第1泳道，分子量标记(左侧，以KD表示)；第2泳道，亲和纯化的GST-pro IL-18IEGR。凝胶用考马斯兰染色。
图5显示纯化的人IL-18的SDS-PAGE(12％丙烯酰胺)。将GST-pro IL-18IEGR融合蛋白捕获在谷胱甘肽琼脂糖珠上并与因子Xa共温育(蛋白酶与底物之比为1∶50 W/W)。6小时后分析上清液。左侧泳道1为分子量标记，以KD表示。泳道2，谷胱甘肽琼脂糖珠上清液中的人IL-18。凝胶用考马斯兰染色。
图6显示人IL-18的生物试验。将人IL-18以所示剂量加入到存在有0.125ìg/ml伴刀豆球蛋白A(ConA)和1μg/ml多粘菌素B的不粘附塑料的小鼠脾细胞培养物(5×106细胞/孔)中，用ELISA检测上清液中的小鼠γ-干扰素。在缺乏ConA时IL-18(100μg/ml)诱导的γ干扰素水平为160pg/ml。
图7以框图形式显示了用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8纯化人IL-18的基本程序。
图8显示GST-pro人IL-18LETD的序列。方框表示天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8切割位点。带下划线序列是成熟的人IL-18。
图9显示谷胱甘肽琼脂糖上纯化GST-pro IL-18LETD融合蛋白的考马斯兰染色SDS-PAGE(10％丙烯酰胺凝胶)。将表达GST-pro IL-18LETD的重组大肠杆菌JM109的细胞裂解上清液在谷胱甘肽琼脂糖上进行亲和纯化，并用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8进行固相消化。浓缩消化后的上清液，加到Superdex-75柱上进行分子大小层析。泳道如下：泳道1，分子量标记(左侧，以KD表示)；泳道2，细胞裂解上清液。泳道3，亲和纯化的GST-pro IL-18LETD；泳道4，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8固相消化4小时后的谷胱甘肽琼脂糖树脂；泳道5，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8消化4小时后的浓缩物；泳道6，纯化人IL-18的Superdex-75合并物。
发明详述
根据本发明制备了编码人pro IL-18的cDNA，其中，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1切割位点突变为因子Xa的位点。可采用能产生适合于其他蛋白酶的切割位点的其他突变。
可能的切割位点和合适的蛋白酶的例子包括：
Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO：1)，为凝血酶在精氨酸(Arg)和甘氨酸(Gly)之间切割的序列。
Ile-Glu-Gly-Arg-(SEQ ID NO：2)，为蛋白酶因子Xa在精氨酸残基后切割的序列。
Asp-Asp-Asp-Lys-(SEQ ID NO：3)，为肠激酶在赖氨酸(Lys)残基后切割的序列。
His-Tyr-(SEQ ID NO：4)，为枯草杆菌蛋白酶或其变体GenenaseTM(NewEngland Biolabs)在色氨酸(Tyr)残基后切割的序列。
Tyr-His(SEQ ID NO：5)，为枯草蛋杆菌白酶或其变体GenenaseTM(NewEngland Biolabs)在色氨酸残基(Tyr)后切割的序列。
Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO：6)，为人鼻病毒3C蛋白酶在谷氨酰胺(Gln)残基后切割的序列。
类似地制备了编码人proIL-1β(其中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1的切割位点突变为因子Xa的位点)的cDNA。可采用能产生适合于其他蛋白酶的切割位点的其他突变。
可能的切割位点和合适的蛋白酶的例子包括：
Ile-Glu-Gly-Arg-(SEQ ID NO：2)，为蛋白酶因子Xa在Arg残基后切割的序列
Asp-Asp-Asp-Lys-(SEQ ID NO：3)，为肠激酶在Lys残基后切割的序列
Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO：6)，为人鼻病毒3C蛋白酶在Gln残基后切割的序列
突变的选择取决于以下参数：突变所产生的切割位点必须非常特异，以避免在pro IL-18或pro IL-1β的多肽骨架中其他部位发生不需要的切割；蛋白酶对基因工程改造的切割位点必须显示高度特异性；蛋白酶必须是易于得到的，即可从商业渠道得到；优选突变应不会在pro IL-18或pro IL-1β的二级或三结构中导入一主要改变。与其他蛋白酶相比，优选使用因子Xa或肠激酶或枯草蛋白酶，因为它们产生的IL-18或IL-1β无突变氨基酸。使用Xa因子则最佳，因为它要求最保守突变，因而减少了引起pro IL-18或pro IL-1β二级或三级结构改变的风险和不发生切割的风险。采用因子Xa或肠激酶较其他蛋白酶为佳，因为产生的IL-18或IL-1β不含有突变氨基酸。
为了构建编码其中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1的切割位点突变为因子Xa的切割位点的人pro IL-18突变体(pro IL-18IEGR)的cDNA，将以下突变：L33I，S35G和D36R导入人pro IL-18 cDNA中。这些突变产生了因子Xa识别序列IEGR。
按以下方式构建了表达人pro IL-18IEGR的载体，用细菌脂多糖(LPS)刺激健康供体的外周血单核细胞(PBMC)，从这些细胞中抽提到总RNA。逆转录该RNA，产生的cDNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板。用重叠的引物以三步PCR将突变导入该序列中(图1)。将产生的编码突变的人pro IL-18的600bp PCR产物克隆入TA克隆载体(pGEM-T，Promega)中，并用DNA序列分析验证其DNA序列。用EcoRI和BamHI切割产生的pGEM-T-pro IL-18IEGR质粒，将编码人pro IL-18IEGR的600bp片段亚克隆入含有GST基因序列的原核表达载体pGEX-2TK(Pharmacia)中。产生的表达载体含有按照读框融合于GST基因3’末端的人pro IL-18IEGR基因序列。
然后进行GST-pro IL-18IEGR的表达和纯化。将用质粒pGEX-pro IL-18IEGR转化的大肠杆菌JM109的单个新鲜菌落37℃摇动培养直到密度达到0.6 OD600。然后以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达并于37℃再培养3小时。细菌总蛋白质的SDS-PAGE揭示诱导产生了43KD蛋白质，其大小对应于GST-pro IL-18IEGR(图3)。分离GST-proIL-18IEGR的所有下游步骤在4℃进行。离心收集细菌，重悬于含有蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液(PBS)中。超声裂解细菌，加入TritonX-100至最终浓度为1％，将澄清的裂解液与谷胱甘肽琼脂糖珠(Pharmacia)混合。洗涤珠并取一份作SDS-PAGE分析，发现有一条对应于GST-proIL-18IEGR融合蛋白的43KD条带(图4)。用因子Xa消化该珠，收集上清液。该上清液的SDS-PAGE产生了大约18KD的一主条带，与成熟的人IL-18预期分子量相符。此外，还可见19.5KD的较弱条带(图5)。该18KD和19.5KD条带的蛋白质序列分析表明二者都具有成熟的人IL-18的预期N末端序列。消化后在谷胱甘肽琼脂糖珠中仍存在对应于GST-proIL-18IEGR融合蛋白的43KD条带，表明切割不完全(未显示)。
根据诱导γ-干扰素表达的能力，在小鼠脾细胞中测试了该重组人IL-18的生物活性。将小鼠不粘附脾细胞与人IL-18单独培育显示几乎无IFN-γ产生，提示需要协同刺激。单用0.125μg/ml的ConA不能诱导明显水平的IFN-γ。当不粘附脾细胞与ConA和本发明的IL-18一起培育时，获得了IFN-γ的剂量依赖性诱导(图6)。
为了构建编码其中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1切割位点突变为因子Xa切割位点的人proIL-1β突变体(proIL-1βIEGR)的cDNA，将以下突变：Y113I，V114E，H115G和D116R导入人proIL-1βcDNA中。这些突变产生了因子Xa识别的序列IEGR。
采取以下步骤以构建表达人proIL-1βIEGR的载体。用细菌脂多糖(LPS)刺激健康供体外周血单核细胞(PBMC)，从这些细胞中抽提得到总RNA。逆转录该RNA，产生的cDNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板，采用相应于人proIL-1β编码序列的引物。将产生的PCR产物克隆入TA克隆载体(如pGEM-T，Promega)中，并用合适的寡核苷酸进行定点诱变。用序列分析验证所得编码突变的人proIL-1β的载体的序列。用合适的限制酶切割产生的pGEM-T-proIL-1βIEGR质粒，将编码人proIL-1βIEGR的～820bp片段亚克隆入原核表达载体pGEX-2TK(Pharmacia)中。产生的表达载体含有按照读框融合于GST基因3’末端的人proIL-1βIEGR基因序列。
以类似方法进行GST-proIL-1βIEGR的表达和纯化。将用质粒pGEX-proIL-1βIEGR转化的大肠杆菌JM109的单个新鲜菌落37℃摇动培养直到密度达到0.6OD600。然后以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达，并于37℃再培养3小时。细菌总蛋白质的SDS-PAGE揭示诱导产生了-52KD蛋白质，其大小对应于GST-proIL-1βIEGR。分离GST-proIL-1βIEGR的所有下游步骤在4℃进行。离心收集细菌，重悬于含有蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液(PBS)中。超声波裂解细菌，加入Triton X-100至最终浓度为1％，将澄清的裂解液与谷胱甘肽琼脂糖珠(Pharmacia)混合，洗涤珠并取一份作SDS-PAGE，分析是否存在～52KD的GST-IL-1β融合蛋白。用因子Xa消化该珠，收集含成熟人IL-1β的上清液。
本发明另一实施方式中，通过产生含有天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶切割位点的融合蛋白获得多肽的表达和纯化。表达融合于某感兴趣蛋白的结合肽的质粒可进行突变以将天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶切割位点引入便于活性多肽纯化的位置。
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶识别位点由4个氨基酸组成，最后一个是天冬氨酸。与常用蛋白酶相比，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶通常对切割位点显示较高和不同的特异性，这赋予了超过先前所述用于切割融合肽的蛋白酶的明显优越性。纯化方法例示于图7。
文献中描述了对每种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的优选切割位点(AnnRev.Bioch 1999)，它们在P1位置都含有共同的ASP残基。
修饰上述质粒pGEX-proIL-18IEGR得到不同的人proIL-18突变体(proIL-18LETD，见图8)其中因子Xa切割位点被突变成天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8切割位点。这样可用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8来切割。
使用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的另一优点是其在消化产量和消化时间上效率高。如表1所示，当比较从pGEX-proIL-18IEGR和pGEX-proIL-18LETD获得的IL-18蛋白时，获得1mg人IL-18所需的酶量和时间减少。该方法导致产生具有预计大小(图9)和生物活性的蛋白质。
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8不是唯一的合适酶，根据待纯化的感兴趣蛋白质中是否存在天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶特异性切割位点或其他标准，可采用对应于任何其他天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的切割位点的突变。
从感兴趣的蛋白质中除去天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶可采用标准的纯化方法，如凝胶过滤或离子交换层析。
结论是，本文所述方法提供了从大肠杆菌纯化有生物活性的人蛋白质，如IL-18和IL-1β。看来，这些细胞因子的正确折叠要求先表达为前体，再经切割成为其成熟形式。
人IL-18不同于小鼠IL-18，后者可在宿主细胞中表达为成熟的有生物活性的细胞因子。
现在将通过以下非限制性实施例描述本发明。
实施例1编码含有因子Xa(切割)位点的人proIL-18的质粒的构建
用Ficoll-Paque PLUS(Pharmacia)密度梯度分离法从健康志愿者外周血获得PBMC。用含2％FBS的冰冷PBS洗涤PBMC二次，重悬在添加有胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100U/ml链霉素的PRMI-1640(PRMI-10)培养液中，2.5×106细胞/ml。用LPS(1μg/ml)刺激培养细胞，37℃，3小时。用Tri PureTM分离试剂(Boehringer Mannheim)抽提细胞的总RNA。按生产商说明书，采用Titan one tube RT-PCR试剂盒(Boehringer Mannheim)取1微克总RNA用于RT-PCR。
采用重叠的引物经三步PCR法构建了ProIL-18IEGR。根据人的proIL-18cDNA(GenBank登录号D49950(3))设计出不同引物。
第一步PCR的正向引物为：5’-AACATCGAAGGTCGTTACTTTGGCAAGCTTGAATC-3’(SEQ ID NO：7)，反向引物为5’-CGCGAATTCCTAGTCTTCGTTTTGAACAGT-3’(SEQ 10NO：8)。该反向引物中包含有一EcoRI位点。模板是分离自LPS刺激的PBMC的逆转录细胞总RNA。热循环条件是：94℃  30秒，55℃30秒和68℃2分钟，10轮。然后94℃30秒，55℃30秒和68℃125秒，25轮。产生的498bpPCR产物在第二步PCR中扩增采用重叠的正向引物5’-TGGCAATGAAATTTATTGACAATACGCTTTACTTTATAGCTGAAGATGATGAAAACATCGAAGGTCGTTACTTTG-3’(SEQ ID NO：9)和上一步骤的反向引物。热循环条件是：94℃30秒，56℃30秒和72℃1分钟，30轮。产生的551bp产物在第三步中扩增采用重叠的正向引物5’-CGTGGATCCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAGACAATTGCATCAACTTTGTGGCAATGAAATTTATTGAC-3’(SEQ ID NO：10)，和前面步骤的反向引物。该正向引物中含有一BamHI位点。热循环条件与上一步相同。产生的0.6kbPCR产物(图1)用“High PureTM PCR产物纯化试剂盒”(Boehringer Mannheim)纯化并连接于pGEMT Easy载体，产生质粒pGEM-proIL-18IEGR。将连接产物转化入JM109感受态细胞(Promega Corporation)。整个过程中采用标准克隆方案(11)。
经限制酶消化和DNA测序验证了单个菌落的质粒pGEM-proIL18IEGR中是否存在正确的插入片段。用BamHI和EcoRI消化该质粒，产生的编码人proIL-18IEGR的BamHI/EcoRI DNA用1.0％琼脂糖电泳分辨，用QIAquick Gel Extraction试剂盒(DIAGEN，Germany)分离得到0.6kb条带。将此DNA连接于已用BamHI和EcoRI线性化的pGEX-2TK表达质粒(Pharmacia)。将得到的重组质粒pGEX-proIL-18IEGR(图2)转化入大肠杆菌JM109株，以限制酶消化和核酸测序证实所得到的载体。
实施例2 GST-proIL-18IEGR融合蛋白的表达和纯化
将用质粒pGEX-proIL-18IEGR转化的大肠杆菌JM109的新鲜单个菌落的50ml过夜培养物稀释于450ml含100U/ml氨苄青霉素的LB培养液中37℃振摇培养，直到密度达到0.6 OD600。加入IPTG至最终浓度0.1mM诱导蛋白质表达，并于37℃再培养3小时。离心(5,000xg，5分钟，4℃)收集细菌并快速重悬于1∶100起始体积的冰冷磷酸盐缓冲液(PBS，150mM NaCl，16mM Na2HPO4，4mM NaH2PO4，pH7.3)中，其中含有蛋白酶抑制剂(亮抑酶肽Lìg/ml，抑胃酶肽A1μg/ml，抑蛋白酶肽2μg/ml，PMSF 0.2mM和EDTA 5mM)。在冰上用温和超声波(4×15秒冲击)裂解细胞。加入Triton X-100至最终浓度1％，将混合物保持在冰上5分钟，将以14,000xg 15分钟4℃澄清的裂解液与谷胱甘肽琼脂糖珠悬液(2ml，Pharmacia)，混合，4℃中等振摇培育该混合物3小时。离心(500xg，5分钟)沉降亲和珠，用10倍体积裂解缓冲液(1％Triton X-100，以PBS配制)洗二次，用10倍体积20mM Tris-HCl(pH 8.0)洗二次，用10倍体积20mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl洗二次，用10倍体积20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl，20mMCaCl2(切割缓冲液)洗二次。所有步骤在4℃进行。
实施例3切割融合蛋白和纯化成熟的人IL-18
将结合有GST-proIL-18IEGR融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖珠与因子Xa(NewEngland Biolabs)在1ml裂解缓冲液中一起培育(23℃，6小时)。所用蛋白酶与底物之比为1∶50(W/W)。在转动轮台上持续混合。此步骤释放出成熟的人IL-18。4℃500xg离心5分钟，沉降珠子，用2ml冰冷PBS洗5次。将上清液和所有洗涤液合并。于4℃14,000xg离心15分钟澄清并超滤(Centricon-10，Amicon)浓缩。以0.1％SDS-12％聚丙烯酰胺凝胶电泳随后作考马斯兰染色，分辨消化前后的蛋白质和亲和珠等份。上清液中获得的主条带大约18KD，与成熟的人IL-18预计分子量相符，也可看见19.5KD小条带(图5)。此二条带的N末端蛋白质序列分析得到序列YFGK......，与成熟人IL-18相一致。将该纯化的蛋白质通过0.2μ滤膜除菌，并贮存于-70℃。
实施例4人IL-18的生物实验
按文献所述方法(2)，评估了人IL-18的活性。简言之，切取正常C3H/HeJ小鼠脾脏，研碎，使接触Gey缓冲液(0.144M NH4Cl，以0.017M Tris-HCl，pH7.2配)以破裂红细胞。用RPMI-5洗涤白细胞二次，重悬于RPMI-10中。为了制备不粘附塑料的细胞，将细胞悬液在100mm塑料平板(Becton Dickinson Ltd.UK)上37℃培育60分钟。非粘附细胞轻度聚集，离心，并重悬于RPMI-10中。用台盼兰染料排除试验计数活细胞，将细胞浓度调至5×106细胞/ml，该方法去除了大多数非特异性脂酶阳性的细胞。将不粘附塑料板的细胞悬液(0.15ml)接种于96孔平底微量滴定培养板(NUNCLONTM，Denmark)中，将50μl含不同浓度IL-18、多粘菌素(1μg/ml)和ConA(0.125μg/m)的RPMI-10液加到各孔中。37℃5％CO2培育微滴板24或48小时。培育后，收集上清液用ELISA测定小鼠IFN-γ滴度。小鼠不粘附睥细胞与单独人IL-18培育显示几乎无IFN-γ产生，提示需要协同刺激。单独0.125μg/ml Con A不能诱导明显水平的IFN-γ。当不粘附睥细胞与ConA和本发明人IL-18一起培育时，获得了IFN-γ的剂量依赖性诱导(图6)。
实施例5编码含有因子Xa(切割)位点的人proIL-1β质粒的构建
通过Ficoll-Paque PLUS(Pharmacia)密度梯度分离法获得健康志愿者外周血的PBMC。用含有2％FBS的冰冷PBS洗PBMC二次，重悬在添加有胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酸胺，100U/mL青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640(RPMI-10)培养液中，2.5×106细胞/ml。用LPS(1μg/ml)刺激培养细胞37℃3小时。用TriPureTM分离试剂(Boehringer Mannheim)抽提细胞的总RNA。按生产商说明书采用Titan one tube RT-PCR试剂盒(Boehringer Mannheim)取1微克总RNA用于RT-PCR。
用根据人proIL-1β cDNA(Genbank登录号M15330)设计的有义和反向引物作PCR克隆proIL-β cDNA。有义引物对应于序列M15330的核苷酸87-107，前面有一BamHI切割位点。反向引物对应于序列M15330的核苷酸896-876，前面有一EcoRI位点。模板是分离自LPS-刺激的PBMC的逆转录的细胞总RNA。循环条件是：94℃30秒，55℃30秒和68℃2分钟，10轮。然后94℃30秒，55℃30秒和68℃125秒，25轮。用“High PureTM PCR产物纯化试剂盒”(Boehringer Mannheim)纯化产生的830bp产物，将其连接到pGEM-T Easy载体中产生质粒pGEM-proIL-1β。采用对应于人IL-1β的mRNA核苷酸405-452的并含有Y113I，V114E，H115G和D116R突变的寡核苷酸ACATGGGATAACGAGGCTATTGAAGGCCGGGCACCTGTACGA(SEQ ID NO：11)对该质粒进行定点诱变。
经限制性酶消化和DNA测序验证了单个菌落的质粒pGEM-proIL-1βIEGR中是否存在正确的插入片段。用BamHI和EcoRI消化该质粒，产生的编码人proIL-1βIEGR的BamHI/EcoRI DNA用1.0％琼脂糖电泳分辨，用QIAquick Gel Extraction试剂盒(DIAGEN，Germany)从凝胶分离得到0.82kb条带。将此DNA连接于已用BamHI和EcoRI线性化的pGEX-2TK表达质粒(Pharmacia)。将得到的重组质粒pGEX-proIL-1βIEGR)转化入大肠杆菌JM109株，以限制性酶消化和核酸测序证实所得到的载体。
实施例6 GST-proIL-1βIEGR融合蛋白的表达和纯化
将用质粒pGEX-proIL-1βIEGR转化的大肠杆菌JM109的新鲜单个菌落的50ml过夜培养物稀释于450ml含100U/ml氨苄青霉素的LB培养液中37℃振摇培养，直到密度达到0.6 OD600。加入IPTG至最终浓度0.1mM诱导蛋白质表达并37℃再培养3小时。离心(5,000xg，5分钟4℃)收集细菌并快速重悬于1∶100起始体积的冰冷磷酸盐缓冲液(PBS，150mM NaCl，16mM Na2HPO4，4mM NaH2PO4，pH7.3)中，其中含有蛋白酶抑制剂(亮抑酶肽1ìg/ml，抑胃酶肽A1μg/ml，抑蛋白酶肽2μg/ml，PMSF 0.2mM和EDTA 5mM)。在冰上用温和超声波(4×15秒冲击)裂解细胞。加入Triton X-100至最终浓度1％，将混合物保持在冰上5分钟，将14,000xg15分钟4℃澄清的裂解液与谷胱甘肽琼脂糖珠悬液(2ml，Pharmacia)，混合，4℃中等振摇培育该混合物3小时。离心(500xg，5分钟)沉降亲和珠，用10倍体积裂解缓冲液(1％Triton X-100，以PBS配制)洗二次，用10倍体积20mM Tris-HCl(pH 8.0)洗二次，用10倍体积20mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl洗二次，用10倍体积20mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl，20mM CaCl2(切割缓冲液)洗二次。所有步骤在4℃进行。
实施例7切割融合蛋白和纯化成熟的人IL-1β
将结合有GST-proIL-18IEGR融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖珠与因子Xa(NewEngland Biolabs)在1ml裂解缓冲液中一起培育(23℃，6小时)。所用蛋白酶与底物之比为1∶50(W/W)。在转动轮台上持续混合。此步骤释放出成熟的人IL-1β。4℃500xg离心5分钟，沉降珠子，用2ml冰冷PBS洗5次。将上清液和所有洗涤液合并。于4℃14,000xg离心15分钟澄清并超滤(Centricon-10，Amicon)浓缩。以0.1％SDS-12％聚丙烯酰胺凝胶电泳随后作考马斯兰染色，分辨消化前后的蛋白质和亲和珠等份。上清液中获得的主条带大约17KD，与成熟的人IL-1β预计分子量相符。将该纯化的蛋白质通过0.2μ滤膜除菌，并贮存于-70℃。
实施例8编码含有天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8切割位点的人proIL-18质粒的构建
通过插入含天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8切割位点(LETD)的PCR扩增DNA片段对实施例1的重组质粒pGEX-proIL-18IEGR进行了修饰。简言之，用限制性酶BamHI在第951位和限制性酶Hind III在第1074位消化pGEX-proIL-18IEGR。从人IL-18的N末端切下含前体结构域、因子Xa切割位点(IEGR)和三个氨基酸的DNA部分。
采用同一质粒作为PCR扩增的模板，将突变的位点LETD导入下游引物：atgcAAGCTTGCCAAAGTAGTCGGTTTCCAGGTTTTCATCATCTTCAGCTATAA(SEQ ID NO：12)。用“高纯产物纯化”试剂盒(Boehringer.Mannheim)纯化该PCR片段。然后用BAM HI和Hind III作类似切割，产生123bp的插入片段。将切开的载体和插入片段在琼脂糖凝胶上分离并用商品试剂盒“Jet Sorb(Genomed)”抽提。用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly MA，USA)连接过夜并将连接产物转化入大肠杆菌DH52感受态细胞中。分离得到几个菌落，将其传代培养并用(Qiagen)试剂盒制成小量制备物。对所有小量制备物进行PCR扩增(Perkin ElmerGene Amp-AmpliTag DNA聚合酶)以测定该重组质粒其本部分的序列。按TSS法(Chung.CT等人1989.Proc Natl Acad Sci USA 86：2172-2175)在感受态大肠杆菌JM109中进行最终转化。
实施例9 GST-proIL-18LETD融合蛋白的表达和纯化
基本上如实施例2所述，采用实施例8构建的质粒，在摇瓶和5升发酵罐中进行GST-pro-LETD-人IL-18蛋白的表达。
实施例10用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8切割融合蛋白和纯化成熟的人IL-18
将结合有GST-pro-IL-18LETD融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖珠与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8(Calbiochem)在裂解缓冲液(如实施例6所述)中一起23℃培育4小时。所用蛋白酶与底物之比为1∶1200(W/W)。在转动轮或滚动台上持续混合。4℃500xg离心5分钟，沉降珠子，用2ml冰冷PBS洗5次。将上清液和所有洗涤液合，并14,000xg 4℃15分钟超滤(Centricon-10，Amicon)浓缩。将浓缩的消化液在Superdex-75(Pharmacia)上进行分子大小层析以便将人IL-18(18KDa)与较高分子量的切割产物和残留的蛋白水解酶(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8的异源双体，29KDa和异源四聚体，58KDa)相分离。
用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8试验试剂盒和AC-IETD-AMC荧光原性底物(BIOMOL)测定了不同Superdex-75组分中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8的酶活性。在相应于分子量55KD的组分(相应于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8异源四聚体)中观察到此酶活性。因此表明含人IL-18(17KD)的组分已良好分离。
合并18KD的高纯人IL-18凝胶过滤组分，在Centricon-10(Amincon)上浓缩，最后0.22μm滤膜除菌，-80℃保存。
以0.1％SDS-12％聚丙烯酰胺凝胶电泳随后作考马斯兰染色(图9)，分辨消化前后的蛋白质和亲和珠等份。上清液中观察到的主条带18KD，与成熟的人IL-18预计分子量相符。亲和珠组分的分析显示切割不完全，因为前体蛋白仍结合在珠上。因此，一些切下的IL-18蛋白仍留在珠组分中。
实施例11天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8切割产生的人IL-18的生物试验
如文献(10)所述评价了人IL-18的活性。简言之，将KG-1细胞维持培养在含20％FBS的DMEM液中。IL-18试验时，将KG-1细胞配成1.2×106细胞/ml的悬液，48孔板上，每孔中加250微升，用小鼠TNF-β(Innogenetics)和不同浓度的人IL-18(从80ng/ml起始的系列稀释液)一起刺激KG-1细胞。该板在5％CO2中37℃培育24小时，然后收集上清液，用ELISA(R & D Systems的重组人IFN-γ和抗人IFN-γ)测定小鼠IFN-γ含量。
人IL-18诱导了IFN-γ的剂量依赖性产生，其活性与从因子Xa切割位点构建物获得的人IL-8活性相同。
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刘卞灵(Liu，Bianling)
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        20                  25                  30Leu Glu Thr Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile
    35                  40                  45Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro
50                  55                  60Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg65                  70                  75                  80Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met
            85                  90                  95Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys
        100                 105                 110Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile
    115                 120                 125Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly
130                 135                 140His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe145                 150                 155                 160Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys
            165                 170                 175Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu
        180                 185                 190Asp

Claims (11)

1.一种从无生物活性的前体产生生物活性分子的方法，其特征在于，该方法包括将该分子的天然切割位点突变为能被蛋白酶切割的位点，并切割该突变分子以产生生物活性分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物活性分子是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶或细胞因子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述细胞因子选自IL-1β和IL-18。
4.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中，所述天然切割位点是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1的切割位点。
5.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中，所述蛋白酶选自凝血酶，肠激酶，枯草杆菌蛋白酶，基因酶TM，人鼻病毒3C蛋白酶，因子Xa蛋白酶和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，优选天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8。
6.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中，还包括：用一载体转染宿主细胞，该载体含有编码其切割位点已突变的生物活性分子前体的cDNA，并培养转染的宿主细胞和分离经蛋白酶处理后的生物活性分子。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述cDNA按照读框融合于GST编码序列，而且，表达的融合分子捕获在谷胱甘肽琼脂糖珠上然后用所述蛋白酶处理。
8.一种编码生物活性分子的突变前体的cDNA，其中，所述cDNA可任选地融合于GST编码序列。
9.根据权利要求8所述的cDNA，其中，所述生物活性分子是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶或细胞因子。
10.根据权利要求8所述的cDNA，其中，所述细胞因子选自IL-1β和IL-18。
11.根据上述权利要求任一项所述方法制备的生物活性分子。
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