JPH10327872A - Ｂｃｌ−２相互作用蛋白遺伝子ｂｉｓ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】特に遺伝子診断並びに新しい治療法の開発に利
用できる新規なヒト遺伝子を提供。 【解決手段】配列番号：１で示されるアミノ酸配列の全
部又は一部をコードする塩基配列を含むヒト遺伝子ｂｉ
ｓを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞死が関与する
各種の疾患乃至病態の診断、予防及び治療の指針として
有用な遺伝子、より詳しくは、細胞死の防止にＢｃｌ−
２と共同作用する新規なＢｃｌ−２相互作用蛋白をコー
ドする遺伝子に関する。

【０００２】更に本発明は、かかる遺伝子によってコー
ドされる新規な蛋白質及びその特異抗体に関する。

【０００３】

【従来の技術】アポトーシス（apoptosis）は、厳格な
遺伝的コントロールを受けている、系統発生的に保存さ
れた細胞自殺機構であり、形態発生、組織ホメオスタシ
スの維持及び危険かつ望まない細胞の除去等を含む各種
の生物学的事象に重要な役割を果たしている〔Science,
267: 1456-1462 (1995)〕。

【０００４】アポトーシスは、このように種々の生命現
象にかかわっているため、多くの研究分野で基礎科学の
面から興味を持たれているが、最近、癌や神経疾患をは
じめとした種々の疾患にも深く関与していることが知ら
れるようになり、これら疾患の解明やその治療及び予防
等の観点から殊に注目をあびてきている。

【０００５】しかして、細胞死のシグナル伝達の全体像
を把握すべく研究が進められており、抗アポトーシス性
Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白の果たす役割を含めて、アポ
トーシスの分子機構が次第に明らかにされてきている。

【０００６】種々の刺激により誘導されるアポトーシス
シグナルは、最終的にはカスペース（caspase）カスケ
ードを伴う共通のマシナリーに集中する〔Cell, 82: 34
9-352(1995)〕が、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミ
リー蛋白は、カスペースカスケードの活性化につながる
シグナル導入経路をブロックすることにより、これらの
細胞死を防止する〔Oncogene, 12: 2251-2257 (199
6)〕。この作用は、(1)ＡＩＦのようなアポトーシス誘
発性のミトコンドリア因子の膜電位低下（Δψ）依存性
放出の防止〔J. Exp. Med., 184: 1-11 (1996)〕、(2)
Δψ非依存性のアポトーシス誘発性チトクロームＣの放
出防止〔Science, 275: 1129-1132 (1997)；同, 275: 1
132-1136 (1997)〕及び(3)プロカスペース（procaspase
s）の隔離〔Science, 275: 1122-1126 (1997)〕を含む
多機構を介するものと考えられている。

【０００７】上記Ｂｃｌ−２ファミリーは、３つの異な
ったサブファミリーからなっている。第１は、ＢＨ１、
２、３及び４の４つの領域中に相同性を持つ抗アポトー
シス性Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗを含
む。第２は、ＢＨ１、２及び３の領域中にＢｃｌ−２と
の相同性を持つプロアポトーシス性Ｂａｘ及びＢａｋを
含む。第３は、ＢＨ３の領域中にのみＢｃｌ−２との相
同性を持つプロアポトーシス性Ｂｉｋ及びＢｉｄを含ん
でいる。このファミリー蛋白にきわだつ特徴は、ヘテロ
ダイマーの形成能であり、該ヘテロダイマー形成は、い
ずれが拮抗体であるかは不明であるが、相手側の生化学
的活性を制御するものとされている〔Cell, 74: 609-61
9 (1993)〕。

【０００８】また、上記ファミリーのメンバーではない
が、Ｂｃｌ−２と協力して細胞の抗アポトーシス活性を
増強する能力を有する、Ｂａｇ−１〔Cell, 80: 279-28
4 (1995)〕やＲａｆ−１〔Cell, 87: 629-638 (1996)〕
等の各種Ｂｃｌ−２結合蛋白が同定されているが、それ
らのＢｃｌ−２活性の増強におけるメカニズムは未知の
ままである。

【０００９】かかる細胞死のシグナル伝達の全体像の把
握及びそれにより得られる情報は、細胞死の分子機構の
解明に極めて重要であり、これは、基礎科学研究の分野
はもとより、細胞死が絡んだ各種疾患の解明やその新し
い処置法等の開発の面からも斯界で望まれているところ
である。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｂｃｌ−２
の抗アポトーシス活性の生化学的基礎と制御メカニズム
を明らかにすることにより、斯界で要望される前記所望
の情報を提供することを目的とする。

【００１１】上記目的より、本発明者は、Ｂｃｌ−２に
結合してその活性をモジュレートする蛋白を更に同定す
べく研究を重ねた結果、Ｂｃｌ−２と共同作用して細胞
死を防止する新規なＢｃｌ−２相互作用蛋白をコードす
る特定遺伝子の単離同定に成功し、本発明を完成するに
至った。

【００１２】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明によれば、
以下の（ａ）及び（ｂ）のいずれかの蛋白質をコードす
る塩基配列を含むＢｃｌ−２相互作用蛋白遺伝子、特に
ヒト遺伝子である当該遺伝子が提供される。

【００１３】（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配
列からなる蛋白質、（ｂ）配列番号：１で示されるアミ
ノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又
は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｂｃｌ−２との結
合活性を有する蛋白質。

【００１４】更に、本発明によれば、上記の遺伝子によ
ってコードされるＢｃｌ−２相互作用蛋白質及びこれに
結合性を有する特異抗体が提供される。

【００１５】また、本発明によれば、以下の（ａ）及び
（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＢｃｌ−
２相互作用蛋白遺伝子、特にヒト遺伝子である当該遺伝
子が提供される。

【００１６】（ａ）配列番号：２で示される塩基配列の
全部又は一部を含むポリヌクレオチド、（ｂ）配列番
号：２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド。

【００１７】更に、本発明によれば、遺伝子検出用の特
異プローブ又は特異プライマーとして使用されるＤＮＡ
断片である上記遺伝子が提供される。

【００１８】以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチ
ド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biologi
calNomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (198
4)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作
成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野に
おける慣用記号に従うものとする。

【００１９】

【発明の実施の形態】本発明遺伝子の一具体例として
は、後述する実施例に示される「ｂｉｓ」と名付けられ
たクローンの有するＤＮＡ配列から演繹されるものを挙
げることができ、その塩基配列は配列番号：２に示され
るとおりである。

【００２０】該遺伝子ｂｉｓ（Bcl-2-interacting deat
h suppresser）は、配列番号：１に示される新規なＢｃ
ｌ−２相互作用蛋白（Ｂｉｓ）をコードするヒトｃＤＮ
Ａであり、該Ｂｉｓ蛋白は、Ｂｃｌ−２と協力して機能
する、細胞の抗アポトーシス活性の新規なモジュレータ
ーであると考えられる。

【００２１】Ｂｉｓ蛋白は、前記Ｂｃｌ−２ファミリー
蛋白及び他の既知蛋白とは顕著な配列相同性を示さず、
これは、後記する試験例によって代表されるＢｃｌ−２
とのインビトロ結合活性を有することにおいて、更に
は、抗アポトーシス性蛋白Ｂｃｌ−ｘＬやプロアポトー
シス性蛋白Ｂａｘとは結合性を示さないことによって特
徴付けられる。

【００２２】Ｂｉｓ蛋白は、それ自身抗アポトーシス活
性を有しており、殊にＢｃｌ−２と共同作用してＢａｘ
誘導アポトーシス及びＦａｓ仲介アポトーシスを強力に
防止する。従って、Ｂｉｓ蛋白は、Ｂｃｌ−２に結合し
てこれとの共同作用により細胞死を防止することによ
り、アポトーシスの精巧な制御を担うモジュレーターと
して、細胞死の分子機構に重要な役割を果たしているも
のと考えられる。

【００２３】しかして、Ｂｉｓ蛋白の欠損或は低下した
レベル又はかかる機能異常等は、例えば、細胞死を伴う
各種疾患等、異常な或は病的なアポトーシスの亢進に起
因する各種の疾患や病態に深く関与しているものと考え
られ、本発明にかかるｂｉｓ遺伝子及びその遺伝子産物
の提供は、これら疾患乃至病態の解明、把握及びその診
断、予防及び治療等の処置等に極めて有用な情報乃至手
段を与えるものである。

【００２４】例えば、本発明遺伝子を利用する或はその
発現を目的とする遺伝子治療や本発明遺伝子産物の生体
への投与は、上記アポトーシスの亢進に起因する各種の
疾患や病態、例えば、アルツハイマー氏病やパーキンソ
ン氏病等の各種神経疾患、心筋症等の各種心臓疾患、筋
ジストロフィー及び糖尿病等の細胞死を伴う各種疾患の
予防及び治療に有用であると考えられる。

【００２５】また、本発明遺伝子は、上記疾患の処置に
利用される本発明遺伝子の発現を誘導する新規薬剤を開
発する上でも好適に利用されるものである。

【００２６】更に、個体或は組織における本発明遺伝子
の発現又はその産物の発現の検出や、該遺伝子の変異
（欠失や点変異）又は発現異常の検出等は、上記疾患の
解明や診断上において好適に利用されよう。

【００２７】本発明遺伝子は、具体的には配列番号：１
で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩
基配列を含む遺伝子又は配列番号：２で示される塩基配
列の全部或は一部を含むポリヌクレオチドからなる遺伝
子として例示されるが、特にこれらに限定されることな
く、例えば、上記特定のアミノ酸配列において一定の改
変を有する遺伝子や上記特定の塩基配列と一定の相同性
を有する遺伝子であることができる。

【００２８】即ち、本発明遺伝子には、配列番号１に示
されるアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠
失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質を
コードする塩基配列を含む遺伝子もまた包含される。こ
こで、「アミノ酸の欠失、置換又は付加」の程度及びそ
れらの位置等は、改変された蛋白質が、配列番号：１で
示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同様の機能を有
する同効物であれば特に制限されない。具体的には、Ｂ
ｃｌ−２とのインビトロ結合活性或はＢｃｌ−２と細胞
死防止に共同して作用する活性を保持するものが挙げら
れる。

【００２９】尚、これらアミノ酸配列の改変（変異）等
は、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾等に
より生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本
発明の具体例遺伝子）に基づいて人為的に改変すること
もできる。本発明は、このような改変・変異の原因及び
手段等を問わず、上記特性を有する全ての改変遺伝子を
包含するものである。

【００３０】上記の人為的手段としては、例えばサイト
スペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzym
ology, 154: 350, 367-382 (1987)；同 100: 468 (198
3)；Nucleic Acids Res., 12: 9441 (1984)；続生化学
実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105
(1986)〕等の遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル
法やリン酸アミダイト法等の化学合成手段〔J. Am. Che
m. Soc., 89: 4801 (1967)；同91: 3350 (1969)；Scien
ce, 150: 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22:1859 (1
981)；同24: 245 (1983)〕及びそれらの組合せ方法等が
例示できる。

【００３１】本発明遺伝子のひとつの態様としては、配
列番号：２で示される塩基配列の全部或は一部を含むポ
リヌクレオチドからなる遺伝子を例示できるが、この塩
基配列は、上記アミノ酸配列（配列番号：１）の各アミ
ノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例でもあり、本発
明遺伝子はこれらに限らず、各アミノ酸残基に対して任
意のコドンを組合せ選択した塩基配列を有することも勿
論可能である。該コドンの選択は、常法に従うことがで
き、例えば利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮する
ことができる〔Ncleic Acids Res., 9: 43 (1981)〕。

【００３２】また、本発明遺伝子は、例えば配列番号２
の具体例で示されるように、一本鎖ＤＮＡの塩基配列と
して表示されるが、本発明はかかる塩基配列に相補的な
塩基配列からなるポリヌクレオオチドやこれらの両者を
含むコンポーネントも当然に包含するものであり、ま
た、ｃＤＮＡ等のＤＮＡに限定されることもない。

【００３３】更に、本発明の遺伝子は、前記のとおり、
配列番号：２に示される塩基配列の全部又は一部を含む
ポリヌクレオチドからなるものに限定されず、当該塩基
配配列と一定の相同性を有する塩基配列からなるものも
包含するものである。かかる遺伝子としては、少なくと
も、下記に掲げるようなストリンジェントな条件下で、
配列番号：２で示される塩基配列からなるＤＮＡとハイ
ブリダイズし、一定の条件下での洗浄してもこれより脱
離しないものが挙げられる。

【００３４】即ち、配列番号：２の塩基配列を有するＤ
ＮＡと、６×ＳＳＣ中６５℃一夜の条件下或は５０％ホ
ルムアミドを含む４×ＳＳＣ中３７℃一夜の条件下にお
いてハイブリダイズし、２×ＳＳＣ中６５℃での３０分
間の洗浄条件下においても該ＤＮＡから脱離しない塩基
配列を有する遺伝子が例示される。ここで、ＳＳＣは、
標準食塩−クエン酸緩衝液である（standard saline ci
trate; 1×SSC = 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrat
e）。

【００３５】本発明の遺伝子は、その具体例についての
配列情報に基づいて、一般的な遺伝子工学的手法により
容易に製造・取得することができる〔Molecular Clonin
g 2dEd, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生
化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化
学会編（1986）等参照〕。

【００３６】具体的には、本発明遺伝子が発現される適
当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調
製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当
なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択すること
により実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 7
8: 6613 (1981)；Science, 222: 778 (1983)等〕。

【００３７】上記において、ｃＤＮＡの起源としては、
本発明遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由
来する培養細胞等が例示され、これらからの全ＲＮＡの
分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのク
ローニング等はいずれも常法に従い実施できる。尚、ｃ
ＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明におい
てはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテッ
ク社（Clontech Lab.Inc.）より市販の各種ｃＤＮＡラ
イブラリー等を用いることもできる。

【００３８】本発明遺伝子をｃＤＮＡライブラリーから
スクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方
法に従うことができる。具体的には、例えばｃＤＮＡに
より産生される蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スク
リーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する
方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを
用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイ
ブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を例示でき
る。

【００３９】ここで用いられるプローブとしては、本発
明遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成
されたＤＮＡ等が一般的に例示できるが、勿論既に取得
された本発明遺伝子そのものやその断片等も良好に利用
できる。

【００４０】また、上記特異抗体に代えてＢｃｌ−２蛋
白を利用した、蛋白質相互作用クローニング法（protei
n interaction cloning procedure）によることもで
き、更に、本発明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定し
たセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーをス
クリーニング用プローブとして用いることもできる。

【００４１】本発明遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法
〔Science, 230: 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ
増幅法も好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全
長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、レース法
（ＲＡＣＥ：Rapid amplification of cDNA ends；実験
医学、12(6): 35 (1994))、殊に５’−レース（５’−
ＲＡＣＥ）法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8: 899
8 (1988)〕等の採用が好適である。かかるＰＣＲ法の採
用に際して使用されるプライマーは、既に本発明によっ
て明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適
宜設定でき、これは常法に従い合成できる。

【００４２】尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離
精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル
電気泳動法等によればよい。

【００４３】上記で得られる本発明遺伝子或は各種ＤＮ
Ａ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Ac
ad. Sci., USA., 74: 5463 (1977)〕やマキサム−ギル
バート法〔Method in Enzymology, 65: 499 (1980)〕等
に従って、また簡便には市販のシークエンスキット等を
用いて、その塩基配列を決定することができる。

【００４４】本発明遺伝子の利用によれば、一般の遺伝
子工学的手法を用いることにより、該遺伝子産物である
Ｂｃｌ−２相互作用蛋白を容易に大量に安定して製造す
ることができる。

【００４５】即ち、本発明は、本発明にかかるＢｃｌ−
２相互作用蛋白遺伝子を含有するベクター（発現ベクタ
ー）及び該ベクターによって形質転換された宿主細胞並
びに該宿主細胞を培養することによりＢｃｌ−２相互作
用蛋白を製造する方法をも提供するものである。

【００４６】該製造方法は、通常の遺伝子組換え技術
〔Science, 224: 1431 (1984); Biochem. Biophys. Re
s. Comm., 130: 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA.,80: 5990 (1983)及び前記引用文献等参照〕に従
うことにより実施できる。

【００４７】上記宿主細胞としては、原核生物及び真核
生物のいずれも用いることができ、例えば原核生物の宿
主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いられ
るものが広く挙げられるが、好適には大腸菌、とりわけ
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株に含
まれるものが例示できる。また、真核生物の宿主細胞に
は、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、
例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cell, 23: 175 (1
981)〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞及びそのジ
ヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA., 77:4216 (1980)〕等が、後者としては、サッ
カロミセス属酵母細胞等が好適に用いられているが、こ
れらに限定される訳ではない。

【００４８】脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベク
ターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の
上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部
位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有する
ものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有し
ていてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的に
は、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳ
Ｖ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕等が例
示できる。また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベク
ターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝
子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc. Na
tl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕等を例示でき
る。

【００４９】原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主
細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中
に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプ
ロモーター及びＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）
塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例え
ばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適利用でき
る。上記ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２及びそ
の改良ベクターがよく用いられるが、これらに限定され
ず各種のベクターを利用することができる。プロモータ
ーとしても特に限定なく、例えばトリプトファン(trp)
プロモーター、lpp プロモーター、lac プロモーター、
PL/PR プロモーター等をいずれも好適に使用できる。

【００５０】尚、本発明遺伝子の発現ベクターとして
は、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用でき、
該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させ
るためのｐＧＥＸ（Promega 社）等を例示できる。

【００５１】上記所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）
の宿主細胞への導入方法・形質転換法にも特に制限はな
く、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質
転換体も、常法に従い培養することができ、該培養によ
り本発明遺伝子によりコードされる目的のＢｃｌ−２相
互作用蛋白が発現・産生され、形質転換体の細胞内、細
胞外若しくは細胞膜上に蓄積若しくは分泌される。

【００５２】上記培養に用いられる培地としては、採用
した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択
利用でき、その培養も宿主細胞の生育に適した条件下で
実施できる。

【００５３】かくして得られる組換え蛋白（Ｂｃｌ−２
相互作用蛋白）は、所望により、その物理的性質、化学
的性質等を利用した各種の分離操作従って分離、精製す
ることができる〔「生化学データブックII」、1175-125
9頁、第１版第１刷、1980年6月23日株式会社東京化学同
人発行；Biochemistry, 25(25): 8274 (1986); Eur.J.
Biochem., 163: 313 (1987) 等参照〕。該方法として
は、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱剤に
よる処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超
音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル
濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマ
トグラフィー、透析法、これらの組合せ等が挙げられ、
特に好ましい上記方法としては、本発明のＢｃｌ−２相
互作用蛋白の特異抗体を結合させたカラムを利用するア
フィニティクロマトグラフィーを例示できる。

【００５４】しかして、本発明は、例えば上記の如くし
て得られる、新規なＢｃｌ−２相互作用蛋白自体をも提
供するものである。該蛋白は、Ｂｃｌ−２との結合活性
を有することにより特徴付けられ、前記のとおり医薬分
野において殊に有用である。

【００５５】また、このＢｃｌ−２相互作用蛋白は、該
蛋白の特異抗体を作成する為の免疫抗原としても利用で
きる。こで抗原として用いられるコンポーネントは、例
えば上記遺伝子工学的手法に従って大量に産生された蛋
白或はそのフラグメントであることができ、これら抗原
を利用することにより、所望の抗血清（ポリクローナル
抗体）及びモノクローナル抗体を収得することができ
る。該抗体の製造方法自体は、当業者によく理解されて
いるところであり、本発明においてもこれら常法に従う
ことができる〔続生化学実験講座「免疫生化学研究
法」、日本生化学会編（1986）等参照〕。

【００５６】例えば、抗血清の取得に際して利用される
免疫動物としては、ウサギ、モルモット、ラット、マウ
スやニワトリ等の通常動物を任意に選択でき、上記抗原
を使用する免疫方法や採血等もまた常法に従い実施でき
る。

【００５７】また、モノクローナル抗体の取得も、常法
に従い、上記免疫抗原で免疫した動物の形質細胞（免疫
細胞）と形質細胞腫細胞との融合細胞を作成し、これよ
り所望抗体を産生するクローンを選択し、該クローンの
培養により実施することができる。免疫動物は、一般に
細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮し
て選択され、通常マウスやラット等が有利に用いられて
いる。免疫は、上記抗血清の場合と同様であり、所望に
より通常のアジュバント等と併用して行なうこともでき
る。 尚、融合に使用される形質細胞腫細胞としても、
特に限定なく、例えばｐ３（p3/x63-Ag8）〔Nature, 25
6: 495-497 (1975)〕、ｐ３−Ｕ１〔Current Topics in
Microbiology and Immunology, 81: 1-7 (1978)〕、Ｎ
Ｓ−１〔Eur. J. Immunol., 6: 511-519 (1976)〕、Ｍ
ＰＣ−１１〔Cell, 8: 405-415 (1976)〕、ＳＰ２／０
〔Nature, 276: 269-271 (1978)〕等、ラットにおける
Ｒ２１０〔Nature, 277: 131-133 (1979)〕等及びそれ
らに由来する細胞等の各種の骨髄腫細胞をいずれも使用
できる。

【００５８】上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合
は、通常の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）やセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下に
公知の方法に準じて行なうことができ、所望のハイブリ
ドーマの分離もまた同様に行ない得る〔Meth. in Enzym
ol., 73: 3 (1981)；上記続生化学実験講座等〕。

【００５９】また、目的とする抗体産生株の検索及び単
一クローン化も常法により実施され、例えば抗体産生株
の検索は、上記の本発明抗原を利用したＥＬＩＳＡ法
〔Meth. in Enzymol., 70: 419-439 (1980)〕、プラー
ク法、スポット法、凝集反応法、オクテロニー（Ouchte
rlony）法、ラジオイムノアッセイ等の一般に抗体の検
出に用いられている種々の方法に従い実施することがで
きる。

【００６０】かくして得られるハイブリドーマからの本
発明抗体の採取は、該ハイブリドーマを常法により培養
してその培養上清として得る、また、ハイブリドーマを
これと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させその腹
水として得る方法等により実施される。前者の方法は、
高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗
体の大量生産に適している。このようにして得られる抗
体は、更に塩析、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラ
フイー等の通常の手段により精製することができる。

【００６１】かくして得られる抗体は、本発明のＢｃｌ
−２相互作用蛋白に結合性を有することによって特徴付
けられ、これは、前述したＢｃｌ−２相互作用蛋白の精
製及びその免疫学的手法による測定乃至識別等に有利に
利用できる。

【００６２】本発明は、かかる新規な抗体をも提供する
ものである。

【００６３】また、本発明によって明らかにされた本発
明遺伝子の配列情報を基にすれば、例えば該遺伝子の一
部又は全部の塩基配列を利用することにより、個体もし
くは各種組織における本発明遺伝子の発現の検出を行な
うことができる。

【００６４】かかる検出は常法に従って行うことがで
き、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse transcribed-Polyme
rase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplif
ication of RNA. In PCR Protocol, A Guide to method
s and applications, AcademicPress, Inc., SanDiego,
21-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅やノーザンブロット
解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab.
(1989)〕、in situ ＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Res.,
21: 3159-3166 (1993)〕や in situ ハイブリダイゼー
ション等の細胞レベルでのそれら測定、ＮＡＳＢＡ法
〔Nucleic acid sequence-based amplification, Natur
e, 350: 91-92 (1991)〕及びその他の各種方法によりい
ずれも良好に実施し得る。

【００６５】尚、ＲＴ−ＰＣＲ法を採用する場合におい
て、用いられるプライマーは、本発明遺伝子のみを特異
的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り何等限定
されず、本発明の遺伝情報に基いてその配列を適宜設定
することができる。通常、これは２０〜３０ヌクレオチ
ド程度の部分配列を有するものとすることができる。

【００６６】このように、本発明は、本発明にかかるＢ
ｃｌ−２相互作用蛋白遺伝子の検出用の特異プライマー
及び／又は特異プローブとして使用されるＤＮＡ断片を
も提供するものである。

【００６７】

【発明の効果】本発明によれば、アポトーシス制御を担
うモジュレーターであり細胞死の防止にＢｃｌ−２と共
同作用する新規なＢｃｌ−２相互作用蛋白、同蛋白をコ
ードする新規遺伝子及び同蛋白の特異抗体が提供され
る。これらの利用により、アポトーシスの分子機構の解
明並びにこれが関与する各種の疾患や病態の解明やその
診断、予防及び治療等に有用な技術が提供される。

【００６８】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、実
施例を挙げる。

【００６９】

【実施例１】 （１）ｂｉｓｃＤＮＡの単離 Ｂｃｌ−２に結合性を有する蛋白をコードするｃＤＮＡ
を同定するため、マニアティス等の方法〔Maniatis, F.
et al., (1982), Molecular Cloning: A Laboratory M
anual (Cold Spring Harbor, New York)〕に従い、組換
えヒトＢｃｌ−２蛋白を用いてヒトｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングした。

【００７０】スクリーニングは、ｂｃｌ−２バキュロウ
イルス感染Ｓｆ９細胞の溶菌液を使用し、陽性ファージ
クローンは、抗ヒトＢｃｌ−２モノクローナル抗体を用
いて同定した。

【００７１】即ち、ヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリー／
λｇｔ１１（Clontech社）を大腸菌Ｙ１０９０上に３７
℃でまき、４２℃で３時間インキュベートした。ファー
ジプレートに、１０ｍＭ ＩＰＴＧ（isopropyl thiogal
actoside）に浸したニトロセルロースフィルターを３７
℃で３時間載せ、該フィルターを、０．０５％ツイーン
２０（Tween 20）を含むＴＢＳ溶液（10mM Tris-HCl, p
H 8.0 / 150mM NaCl）で洗浄後、６Ｍグアニジン−塩酸
のＨＢＢ溶液（20mM Hepes, pH 7.5 / 5mM MgCl₂ / 1mM
KCl / 5mM DTT）での１０分間の処理を２回、次いで、
３Ｍグアニジン−塩酸のＨＢＢ溶液での５分の処理を３
回行なった。

【００７２】フィルターを、２０ｍｌのＴＢＳ溶液で希
釈したＲＩＰＡ溶液（1% NP40 / 0.1% SDS / 150mM NaC
l / 50mM Tris-HCl, pH 7.5 / 10μM APMSF / 0.1 u/ml
aprotinin / 5μg/ml leupeptin）中で、２×１０⁷の
ｂｃｌ−２バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞〔Anal. Bi
ochem., 205: 70-76 (1992)〕より調製した透明溶菌液
の２ｍｌと、０℃で一夜インキュベーションした。フィ
ルターを、洗浄後、抗ヒトＢｃｌ−２モノクローナル抗
体〔Ame. J. Pathology, 137: 225-232 (1990)〕と、次
いでアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ
抗体（Promega社）とインキュベートした。

【００７３】かくして、１３７７ｂｐの同一のＤＮＡ配
列を有する所望の２つの陽性クローンが特定された。こ
のｃＤＮＡを標識プローブとして同一ライブラリーをス
クリーニングすることにより、ほぼ全長サイズである２
２６４ｂｐのｃＤＮＡ（ｂｉｓ）を単離した。

【００７４】尚、標識プローブ（³²Ｐ標識ｃＤＮＡプロ
ーブ）は、上記１３７７ｂｐｃＤＮＡを常法に従い標識
することにより調製した〔上記マニアティス等の文
献〕。

【００７５】かくして得た本発明ｃＤＮＡ（ｂｉｓ）の
塩基配列は、配列番号：２に示されるとおりであり、５
０９アミノ酸残基からなるその予想蛋白（Ｂｉｓ）のア
ミノ酸配列は、配列番号：１に示されるとおりである。

【００７６】尚、配列解析の結果、先に得たクローン
は、全長サイズｃＤＮＡクローンの３’部分に相当して
いる（配列番号：２における８８８番目より少なくとも
そのＢｉｓ蛋白コード領域のＣ端までを含む）ことを確
認した。

【００７７】配列番号：１に示されるアミノ酸配列は、
相同性検索（DDBJ FASTA）により、どのような既知蛋白
にも又機能的モチーフにも相同性を有していないことが
確認された。

【００７８】（２）Ｂｉｓ発現プラスミドの調製と発現 (1) グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）融合蛋白発現ベクターｐＧＥＸ（Promega社）のＥ
ｃｏＲＩサイトに、前記１３７７ｂｐのｂｉｓｃＤＮＡ
をサブクローングした。該プラスミドＤＮＡを大腸菌に
導入し、ＩＰＴＧで融合遺伝子発現を誘導してＧＳＴ−
Ｂｉｓ融合蛋白を発現させた。集菌した大腸菌を、Ｌバ
ッファー（50 mM Tric-HCl, pH 7.5 / 2.5% サッカロー
ス、0.5% NP40, 5mM MgCl₂）に懸濁し、超音波処理によ
り細胞を破砕した。遠心後、ＧＳＴのグルタチオンへの
結合能を利用し、上清をグルタチオンアガロースビーズ
とインキュベートして（４℃、１時間）ＧＳＴ−Ｂｉｓ
融合蛋白を精製した。

【００７９】(2) 前記の全長ｂｉｓｃＤＮＡを、β−
アクチンプロモーターとサイトメガロウイルス由来のエ
ンハンサーを有するベクターｐＣＡＧＧＳ〔Gene, 108:
193-199 (1991)〕のＥｃｏＲＩサイトにサブクローン
化することにより，Ｂｉｓ発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ
−ｂｉｓを得た。

【００８０】１０％ＦＢＳ、０．２ｍＭ Ｌ−グルタミ
ン、５０単位／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌスト
レプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地で維持したＣＯ
Ｓ−７細胞に、電気穿孔（220V, 960μF）にて、各５μ
ｇのｐＣＡＧＧＳ−ｂｉｓ及びｐＣＡＧＧＳ（ベクタ
ー）で１０⁷細胞当たりトータル１０μｇＤＮＡ導入
し、細胞を４８時間培養して一過的発現を行った。

【００８１】（３）Ｂｉｓ蛋白抗体の作成 上記で得たＧＳＴ−Ｂｉｓ融合蛋白を、ウサギに、数週
間おきに皮下注射による３度の投与を行ない、抗体価の
上昇を確認後、血液を採取し、血清を分離した。該血清
より、常法に従い、ＧＳＴ−Ｂｉｓ融合蛋白のアフィニ
ティクロマト法により所望抗体を精製した〔E. Harlon
& D. Lane, Antibodies; A LaboratoryManual, Cold Sp
ring Harbor Lab. (1988)〕。

【００８２】かくして得た抗ヒトＢｉｓ蛋白抗体は、ヒ
トＢｉｓ蛋白を認識し、見かけ上の分子量が６０ｋＤの
マウスＢｉｓと交叉反応性を示した。

【００８３】（４）組織におけるＢｉｓの発現 組織におけるｂｉｓ／Ｂｉｓの特異的発現プロファイル
を調べるため、各種のマウス組織を用いたノーザンブロ
ット分析及びウエスタンブロット分析を行った。

【００８４】ノーザンブロット分析において、各種の成
熟マウス組織からの全ＲＮＡは常法に従い単離した〔前
記マニアティス等の文献〕。ポリ(Ａ⁺)ＲＮＡは、オリ
ゴ(dT)カラムクロマトグラフィーで精製し、１０μｇの
ＲＮＡをアガロースゲルにてサイズ分画した。

【００８５】ノーザンブロットは、前記した³²Ｐ標識ｂ
ｉｓｃＤＮＡプローブと常法に従いハイブリダイズさせ
た。

【００８６】ウエスタンブロット分析において、成熟マ
ウスからの各種器官及び胎児は、これを溶解液（50mM T
ris-HCl, pH 7.5 / 150mM NaCl / 0.1% SDS / 1% NP40
/ 0.1% sodium deoxycholate / 10μM p-amidinophenyl
methanesulfonyl fluoride hydrochloride / 0.1 μ/ml
aprotinin / 5μg/ml leupeptin / 10mM sodium dipho
sphate decahydrate / 10mM NaF / 4mM EDTA / 2mM Na₃
VO₄）にてホモジナイズし、その４０μｇを１０％ポリ
アクリルアミド／ＳＤＳゲルにてサイズ分画し、メンブ
ラン（Immobilon polyvinyliden difluoride membrane:
Millipore社）にブロットした。

【００８７】マウスＢｉｓの存在は、前記抗ヒトＢｉｓ
蛋白抗体、パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ウサ
ギＩｇＧ抗体（Promega社）及び化学発光増強試薬（enh
anced chemiluminescence mixture detection reagent:
Amersham社）を用いて検出した。

【００８８】結果を図１（上記ノーザンブロット分析の
結果）及び図２（上記ウエスタンブロット分析の結果）
に示す。尚、各図における供試組織は次の通りである。

【００８９】・heart 心臓 ・kidney 腎臓 ・spleen 脾臓 ・uterus 子宮 ・intestine 腸 ・thymus 胸腺 ・brain 脳 ・lung 肺 ・liver 肝臓 ・muscle 筋 ・Ｅ^10.5 妊娠１０．５日の胎児胚 ・Ｅ^14.5 妊娠１４．５日の胎児胚（head：頭、body：
体） ・Ｅ^18.5 妊娠１８．５日の胎児胚（head：頭、body：
体） 図１に示すように、ｂｉｓ遺伝子は、各種の成熟マウス
組織において２．３ｋｂの単一サイズのｍＲＮＡ（図中
→にて表示）として発現されており、最も高い発現が心
臓において認められた。

【００９０】同様に、ウエスタンブロット分析により、
各種の成熟マウス組織におけるＢｉｓの普遍的な発現
（心臓における最も高い発現）が認められた（図２）。
尚、Ｂｉｓは、妊娠１０．５日の初期からマウス胚に認
められ、その量は、誕生に向けて増加していた。

【００９１】（５）ＢｉｓとＢｃｌ−２との相互作用
（インビトロ結合活性） Ｂｉｓ蛋白とＢｃｌ−２との結合性を評価した。

【００９２】即ち、前記（２）−(1)で得たＧＳＴ−Ｂ
ｉｓ融合蛋白を結合したグルタチオンビーズを、ＷＥ緩
衝液（20mM Tris-HCl, pH 7.5 / 2mM MgCl₂ / 1mM DT
T）で３回洗いビーズに非特異的に結合した蛋白を除
き、ヒトｂｃｌ−２遺伝子を導入してＢｃｌ−２蛋白を
発現するようにしたマウス細胞株〔Oncogene, 7: 869-8
76(1992)〕の細胞破砕液と４℃で２時間インキュベート
した。

【００９３】ビーズをＲＩＰＡ溶液にて３回洗った後、
ビーズに結合している蛋白をサンプル緩衝液（40mM Tri
s-HCl, pH 6.8 / 2% SDS / 5% β-mercaptoethanol / 5
% glycerol / 0.002% BPB）で溶出し、これをポリアク
リルアミド-ＳＤＳゲル電気泳動にかけた。ウエスタン
ブロット法により、ゲル内の蛋白をＰＶＤＦフィルター
に電気的に移し、フィルター上のＢｃｌ−２蛋白を前記
抗ヒトＢｃｌ−２モノクローナル抗体により検出した。

【００９４】該ウエスタンブロットの結果を図３に示
す。

【００９５】同図における各レーンは次のとおりであ
る。

【００９６】レーン１：ＧＳＴ−Ｂｉｓ融合蛋白を用い
た上記試験例。

【００９７】レーン２：ＧＳＴ蛋白を使用した陰性コン
トロール。

【００９８】レーン３：グルタチオンアガロースビーズ
使用による陰性コントロール。

【００９９】レーン４：上記ＭＴ２細胞破砕液（ヒトＢ
ｃｌ−２蛋白）を使用した陽性コントロール。

【０１００】同図より、ＧＳＴ−Ｂｉｓ融合蛋白を用い
たレーン１にのみＢｃｌ−２蛋白が検出され、ＧＳＴ及
びグルタチオンアガロースビーズの場合（レーン２及び
３）ではシグナルが認められないことから、Ｂｉｓ蛋白
はＢｃｌ−２蛋白に対する結合能を有するものと結論で
きる。

【０１０１】（６）細胞死防止におけるＢｉｓとＢｃｌ
−２間の共同作用 Ｂｉｓが、Ｂｃｌ−２の抗アポトーシス活性をモデュレ
ートする活性を有するか否かを、微細注入（microinjec
tion）のシステムにより試験した〔Genes to Cells, 2:
55-64 (1997)〕。

【０１０２】即ち、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０
培地でガラス性カバースリップに播いたＨｅＬａ細胞
に、ライカシステム（Leica microinjection system: L
eica社）により、前記（２）−(2)で得たＢｉｓ発現プ
ラスミドｐＣＡＧＧＳ−ｂｉｓ及び下記所定のＤＮＡ
（ＰＢＳ溶液）を核内微細注入した。

【０１０３】尚、ヒトＢｃｌ−２発現プラスミドｐＣＡ
ＧＧＳ−ｈｂｃｌ−２、ヒトＢｃｌ−ｘＬ発現プラスミ
ドｐＣＡＧＧＳ−ｈｂｃｌ−ｘＬ及びマウスＢａｘ発現
プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ｍｂａｘは、前記（２）−
(2)と同様にして、全蛋白コード領域を含むヒトｂｃｌ
−２ｃＤＮＡ〔B4cDNA; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,8
3: 5214-5218 (1986)〕、同ヒトｂｃｌ−ｘＬｃＤＮＡ
〔Cell, 74: 597-608 (1993)〕及び同マウスｂａｘｃＤ
ＮＡ〔Cell, 74: 609-619 (1993)〕を用いて製造した。

【０１０４】ＨｅＬａ細胞に注入した全ＤＮＡ濃度は、
ベクターＤＮＡ（pCAGGS）で２００ｎｇ／μｌに調整
し、５．８ｍｇ／ｍｌのローダミンイソチオシアネート
（RITC）標識ＢＳＡ〔J. Biol. Chem., 269: 24542-245
45 (1994)〕を常に共注入することにより、注入した細
胞を特定した。

【０１０５】細胞死は、マウスＢａｘ発現プラスミドｐ
ＣＡＧＧＳ−ｍｂａｘの２０ｎｇ／μｌを同時に微細注
入して３時間インキュベーションすることにより又は１
μｇ／ｍｌの拮抗性抗Ｆａｓモノクローナル抗体ＣＨ１
１（ＭＢＬ社）で４時間細胞を処理することにより誘導
した。

【０１０６】所定の時間経過後に、細胞を１０％フォル
マリン溶液／２０分で固定化し、ヘキスト３３３４２
（Hoechst 33342: Calbiochem社）／５分にて染色し、
４８０ｎｍ励起（RITC用）及び３６０ｎｍ励起（Hoechs
t 33342用）にて蛍光顕微鏡（Olympus BX-50）下に分析
した。アポトーシス細胞は、凝縮したクロマチン及び／
又はヘキスト３３３４２で染色される断片化した核によ
り特定した〔Cancer Res., 56: 2161-2166 (1996)〕。

【０１０７】結果を、表１及び表２並びに図４に示す。

【０１０８】

【表１】

【０１０９】

【表２】 表１は、Ｂａｘ誘導アポトーシスに対する、ＢｉｓとＢ
ｃｌ−２による相乗的防止作用を示すものであり、導入
した各ＤＮＡとその濃度、ＤＮＡ導入された全細胞数に
対するアポトーシス細胞の比（Ａ／Ｔ）及びその割合
（％）が示されている。

【０１１０】表２は、Ｆａｓ仲介アポトーシスに対する
同上作用を示すものであり、表１に準じて示されてい
る。尚、同試験において、Ｈｅｌａ細胞のインキュベー
ション時間はＤＮＡ注入後２時間である。

【０１１１】図４は、上記Ｂａｘ誘導アポトーシスにお
ける、Ｂｉｓ及びＢｃｌ−２による相乗的細胞死防止を
示す図面代用写真（蛍光顕微鏡写真）であり、同図上段
（RITC）及び下段（Hoechst 33342）のパネルは同一視
野の顕微鏡写真である。

【０１１２】尚、同図における注入ＤＮＡの組み合わせ
は次のとおりであり、ＤＮＡ濃度は、ｐＣＡＧＧＳ−ｍ
ｂａｘ及びｐＣＡＧＧＳ−ｂｉｓが２０ｎｇ／ｍｌ、ｐ
ＣＡＧＧＳ−ｈｂｃｌ−２が２ｎｇ／ｍｌである。

【０１１３】ａ：pCAGGS-mbax（bax） ｂ：pCAGGS-mbax 及び pCAGGS-hbcl-2（bax/bcl-2) ｃ：pCAGGS-mbax 及び pCAGGS-bis（bax/bis） ｄ：pCAGGS-mbax, pCAGGS-bis 及び pCAGGS-hbcl-2（ba
x/bis/bcl-2） 以上試験より、以下のことが明らかである。

【０１１４】細胞死は、一緒に微細注入されたマウスｂ
ａｘ（mbax）ＤＮＡにより誘導された。大量のｈｂｉｓ
ＤＮＡの注入は、Ｂａｘ誘導細胞死に、わずかではある
が十分に顕著性ある抵抗を与えた（表１）。このこと
は、Ｂｉｓが、Ｂｃｌ−２よりは効率的ではないもの
の、抗アポトーシス活性を奏することを示している。

【０１１５】比較的低濃度におけるｈｂｉｓ及びｈｂｃ
ｌ−２ＤＮＡは、それら単独ではＢａｘ誘導細胞死に顕
著な保護を与えないが、共注入により増強された防止効
果を与えた（図３及び表１）。ＢｉｓとｈＢｃｌ−２に
よるこの効果は、Ｂｉｓと他の抗アポトーシス性ｈＢｃ
ｌ−ｘＬとでは抗アポトーシス活性が増強されなかった
ことより（表１）、相加的ではなく、相乗的であると考
えられる。

【０１１６】Ｂｉｓが、Ｂｃｌ−２と相互作用しＢｃｌ
−ｘＬには相互作用しないとすると、ＢｉｓとＢｃｌ−
２によるこの相乗的抗アポトーシス活性は、この両蛋白
の相互作用によって直接的にメディエートされているこ
とが明らかである。

【０１１７】ＢｉｓとＢｃｌ−２が、他の刺激により誘
導されるアポトーシスも共同して防止するか否かを試験
するため、拮抗的抗Ｆａｓ抗体処理によってアポトーシ
スを誘導した。表２に示すとおり、ＢｉｓとＢｃｌ−２
は共同して、Ｆａｓ仲介のアポトーシスを防止すること
が確認され、また、上記同様、大量のＢｉｓ単独による
マイナーな抗アポトーシス活性が認められた。

【０１１８】以上より、ＢｉｓとＢｃｌ−２の共同作用
は、アポトーシス一般に共通するものと考えられる。

【０１１９】（７）考察 Ｂｃｌ−２と相互及び共同作用してアポトーシスを防止
する、新規な蛋白Ｂｉｓ及びその遺伝子を単離同定し
た。

【０１２０】Ｂｃｌ−２とＢｉｓによるアポトーシスの
相乗的な防止効果は、両蛋白の相互作用によってメディ
エートされているものと考えられる（Ｂｉｓは、抗アポ
トーシス性Ｂｃｌ−ｘＬとは相互作用も共同作用もしな
い）。この相乗効果におけるＢｃｌ−２とＢｉｓの分子
間相互作用の必須の役割は、ヒトＢｉｓがニワトリＢｃ
ｌ−２とは相互作用乃至共同作用しないことを確認して
いることからも更に支持される。

【０１２１】ニワトリＢｃｌ−２は、進化上保存されて
いないループ領域を除いては、その配列が、ヒトＢｃｌ
−２のそれとほとんど同一であることより、Ｂｉｓは、
Ｂｃｌ−２のループと相互作用するものと思われる。該
ループ領域は、Ｂｃｌ−２の抗アポトーシス活性の負の
制御に関与していることが近年報告されており〔EMBO
J., 16: 968-977 (1997)〕、Ｂｉｓは、その相互作用に
よって、該ループのこの負の効果をキャンセルするもの
と考えられる。

【０１２２】また、Ｂａｇ−１及びＲａｆ等の各種蛋白
も、Ｂｃｌ−２との相互作用によりこれと共同して、細
胞の抗アポトーシス活性を増強することが報告されてお
り、これらＢｃｌ−２相互作用蛋白の各々は、各種の条
件下において生ずる異なった抗アポトーシスシグナルを
Ｂｃｌ−２に伝達するメディエーターとして働いている
ものと考えられる。

【０１２３】本発明のｂｉｓ遺伝子は、ヒト及びマウス
の各種組織に広く発現されており、殊に、Ｂｃｌ−２を
低レベルでしか発現していないが〔Nucl. Acid Res., 2
0: 4187-4192 (1992)〕長期生存細胞である心細胞にお
いて高レベルに発現されている。このことより、Ｂｉｓ
は、心臓においてわずかに存在しているＢｃｌ−２の抗
アポトーシス活性を増強するように機能しているものと
考えられる。

【０１２４】従って、心細胞の死を伴う心疾患の一部
は、Ｂｉｓ蛋白の欠損又は低下したレベルに結び付いて
いる可能性が考えられる。

【０１２５】以上によれば、細胞死を伴う疾患の中に、
Ｂｉｓ発現が低下することが原因になっているものが想
定され、それら疾患における当該遺伝子発現や蛋白発現
のレベルの検出、当該遺伝子の欠損或は変異を伴う遺伝
性疾患におけるそれら異常の検出、また当該遺伝子を利
用する遺伝子治療の適用等は、前記した種々の医療分野
上において極めて有用である。

【０１２６】

【配列表】

(1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Ostuka Pharmaceutical Co., Ltd. (ii) TITLE OF INVENTION: Ｂｃｌ−２相互作用蛋白遺
伝子ｂｉｓ (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 2 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING REFERENCE: 1067JP (C) FILING DATE: 30-MAY-1997

【０１２７】(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 509 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: Met Ala Leu Pro Gly Arg Ala Leu Gly Cys Arg Leu Leu Gly Lys Ala 1 5 10 15 Thr Leu Cys Thr Pro Ser Ser Asp Gln Ala Thr Phe Pro Phe Leu Cys 20 25 30 Ser Met Lys Ala Leu Arg Thr Gly Arg Cys Thr Leu Ser Met Ser Ile 35 40 45 Pro Ser Leu Gly Cys Ser Asp Ser Glu Leu Arg Arg Gln Gln Arg Leu 50 55 60 Leu Arg Gly Pro Ser His Leu Cys Gly Gly Met Pro Glu Thr Thr Gln 65 70 75 80 Pro Asp Lys Gln Arg Gly Gln Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Pro 85 90 95 Pro Ala Ser His Gly Pro Glu Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ala Ser Asp 100 105 110 Cys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Leu Pro Ser Ser Gly Arg Ser 115 120 125 Ser Leu Gly Ser His Gln Leu Pro Arg Gly Tyr Ile Ser Ile Pro Val 130 135 140 Ile His Glu Gln Asn Val Thr Arg Pro Ala Ala Gln Pro Ser Phe His 145 150 155 160 Gln Ala Gln Lys Thr His Tyr Pro Ala Gln Gln Gly Glu Tyr Gln Thr 165 170 175 His Gln Pro Val Tyr His Lys Ile Gln Gly Asp Asp Trp Glu Pro Arg 180 185 190 Pro Leu Arg Ala Ala Ser Pro Phe Arg Ser Ser Val Gln Gly Ala Ser 195 200 205 Ser Arg Glu Gly Ser Pro Ala Arg Ser Ser Thr Pro Leu His Ser Pro 210 215 220 Ser Pro Ile Arg Val His Thr Val Val Asp Arg Pro Gln Gln Pro Met 225 230 235 240 Thr His Arg Glu Thr Ala Pro Val Ser Gln Pro Glu Asn Lys Pro Glu 245 250 255 Ser Lys Pro Gly Pro Val Gly Pro Glu Leu Pro Pro Gly His Ile Pro 260 265 270 Ile Gln Val Ile Arg Lys Glu Val Asp Ser Lys Pro Val Ser Gln Lys 275 280 285 Pro Pro Pro Pro Ser Glu Lys Val Glu Val Lys Val Pro Pro Ala Pro 290 295 300 Val Pro Cys Pro Pro Pro Ser Pro Gly Pro Ser Ala Val Pro Ser Ser 305 310 315 320 Pro Lys Ser Val Ala Thr Glu Glu Arg Ala Ala Leu Ser Thr Ala Pro 325 330 335 Ala Glu Ala Thr Pro Pro Lys Pro Gly Glu Ala Glu Ala Pro Pro Lys 340 345 350 His Pro Gly Val Leu Lys Val Glu Ala Ile Leu Glu Lys Val Gln Gly 355 360 365 Leu Glu Gln Ala Val Asp Asn Phe Glu Gly Lys Lys Thr Asp Lys Lys 370 375 380 Tyr Leu Met Ile Glu Glu Tyr Leu Thr Lys Glu Leu Leu Ala Leu Asp 385 390 395 400 Ser Val Asp Pro Glu Gly Arg Ala Asp Val Arg Gln Ala Arg Arg Asp 405 410 415 Gly Val Arg Lys Val Gln Thr Ile Leu Glu Lys Leu Glu Gln Lys Ala 420 425 430 Ile Asp Val Pro Gly Gln Val Gln Val Tyr Glu Leu Gln Pro Ser Asn 435 440 445 Leu Glu Ala Asp Gln Pro Leu Gln Ala Ile Met Glu Met Gly Ala Val 450 455 460 Ala Ala Asp Lys Gly Lys Lys Asn Ala Gly Asn Ala Glu Asp Pro His 465 470 475 480 Thr Glu Thr Gln Gln Pro Glu Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ser Asn Pro 485 490 495 Ser Ser Met Thr Asp Thr Pro Gly Asn Pro Ala Ala Pro 500 505

【０１２８】(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:
2: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 2264 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA(cDNA) (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 213..1739 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: GAATTCGGGC AGCATGAGCG CCGCCACCCA CTCGCCCATG ATGCAGGTGG CGTCCGGCAA 60 CGGTGACCGC GACCCTTTGC CCCCCGGATG GGAGATCAAG ATCGACCCGC AGACCGGCTG 120 GCCCTTCTTC GTGGACCACA ACAGCCGCAC CACTACGTGG AACGACCCGC GCGTGCCCTC 180 TGAGGGCCCC AAGGAGACTC CATCCTCTGC CA ATG GCC CTT CCC GGG AGG GCT 233 Met Ala Leu Pro Gly Arg Ala 1 5 CTA GGC TGC CGC CTG CTA GGG AAG GCC ACC CTG TGT ACC CCC AGC TCC 281 Leu Gly Cys Arg Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Cys Thr Pro Ser Ser 10 15 20 GAC CAG GCT ACA TTC CCA TTC CTG TGC TCC ATG AAG GCG CTG AGA ACC 329 Asp Gln Ala Thr Phe Pro Phe Leu Cys Ser Met Lys Ala Leu Arg Thr 25 30 35 GGC AGG TGC ACC CTT TCC ATG TCT ATC CCC AGC CTG GGA TGC AGC GAT 377 Gly Arg Cys Thr Leu Ser Met Ser Ile Pro Ser Leu Gly Cys Ser Asp 40 45 50 55 TCC GAA CTG AGG CGG CAG CAG CGG CTC CTC AGA GGT CCC AGT CAC CTC 425 Ser Glu Leu Arg Arg Gln Gln Arg Leu Leu Arg Gly Pro Ser His Leu 60 65 70 TGC GGG GGC ATG CCA GAA ACC ACT CAG CCA GAT AAA CAG CGT GGA CAG 473 Cys Gly Gly Met Pro Glu Thr Thr Gln Pro Asp Lys Gln Arg Gly Gln 75 80 85 GTG GCA GCG GCG GCG GCA GCC CAG CCC CCA GCC TCC CAC GGA CCT GAG 521 Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Pro Pro Ala Ser His Gly Pro Glu 90 95 100 CGG TCC CAG TCT CCA GCT GCC TCT GAC TGC TCA TCC TCA TCC TCC TCG 569 Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ala Ser Asp Cys Ser Ser Ser Ser Ser Ser 105 110 115 GCC AGC CTG CCT TCC TCC GGC AGG AGC AGC CTG GGC AGT CAC CAG CTC 617 Ala Ser Leu Pro Ser Ser Gly Arg Ser Ser Leu Gly Ser His Gln Leu 120 125 130 135 CCG CGG GGG TAC ATC TCC ATT CCG GTG ATA CAC GAG CAG AAC GTT ACC 665 Pro Arg Gly Tyr Ile Ser Ile Pro Val Ile His Glu Gln Asn Val Thr 140 145 150 CGG CCA GCA GCC CAG CCC TCC TTC CAC CAA GCC CAG AAG ACG CAC TAC 713 Arg Pro Ala Ala Gln Pro Ser Phe His Gln Ala Gln Lys Thr His Tyr 155 160 165 CCA GCG CAG CAG GGG GAG TAC CAG ACC CAC CAG CCT GTG TAC CAC AAG 761 Pro Ala Gln Gln Gly Glu Tyr Gln Thr His Gln Pro Val Tyr His Lys 170 175 180 ATC CAG GGG GAT GAC TGG GAG CCC CGG CCC CTG CGG GCG GCA TCC CCG 809 Ile Gln Gly Asp Asp Trp Glu Pro Arg Pro Leu Arg Ala Ala Ser Pro 185 190 195 TTC AGG TCA TCT GTC CAG GGT GCA TCG AGC CGG GAG GGC TCA CCA GCC 857 Phe Arg Ser Ser Val Gln Gly Ala Ser Ser Arg Glu Gly Ser Pro Ala 200 205 210 215 AGG AGC AGC ACG CCA CTC CAC TCC CCC TCG CCC ATC CGT GTG CAC ACC 905 Arg Ser Ser Thr Pro Leu His Ser Pro Ser Pro Ile Arg Val His Thr 220 225 230 GTG GTC GAC AGG CCT CAG CAG CCC ATG ACC CAT CGA GAA ACT GCA CCT 953 Val Val Asp Arg Pro Gln Gln Pro Met Thr His Arg Glu Thr Ala Pro 235 240 245 GTT TCC CAG CCT GAA AAC AAA CCA GAA AGT AAG CCA GGC CCA GTT GGA 1001 Val Ser Gln Pro Glu Asn Lys Pro Glu Ser Lys Pro Gly Pro Val Gly 250 255 260 CCA GAA CTC CCT CCT GGA CAC ATC CCA ATT CAA GTG ATC CGC AAA GAG 1049 Pro Glu Leu Pro Pro Gly His Ile Pro Ile Gln Val Ile Arg Lys Glu 265 270 275 GTG GAT TCT AAA CCT GTT TCC CAG AAG CCC CCA CCT CCC TCT GAG AAG 1097 Val Asp Ser Lys Pro Val Ser Gln Lys Pro Pro Pro Pro Ser Glu Lys 280 285 290 295 GTA GAG GTG AAA GTT CCC CCT GCT CCA GTT CCT TGT CCT CCT CCC AGC 1145 Val Glu Val Lys Val Pro Pro Ala Pro Val Pro Cys Pro Pro Pro Ser 300 305 310 CCT GGC CCT TCT GCT GTC CCC TCT TCG CCC AAG AGT GTG GCT ACA GAA 1193 Pro Gly Pro Ser Ala Val Pro Ser Ser Pro Lys Ser Val Ala Thr Glu 315 320 325 GAG AGG GCA GCC CTC AGC ACT GCC CCT GCA GAA GCT ACA CCT CCA AAA 1241 Glu Arg Ala Ala Leu Ser Thr Ala Pro Ala Glu Ala Thr Pro Pro Lys 330 335 340 CCA GGA GAA GCC GAG GCT CCC CCA AAA CAT CCA GGA GTG CTG AAA GTG 1289 Pro Gly Glu Ala Glu Ala Pro Pro Lys His Pro Gly Val Leu Lys Val 345 350 355 GAA GCC ATC CTG GAG AAG GTG CAG GGG CTG GAG CAG GCT GTA GAC AAC 1337 Glu Ala Ile Leu Glu Lys Val Gln Gly Leu Glu Gln Ala Val Asp Asn 360 365 370 375 TTT GAA GGC AAG AAG ACT GAC AAA AAG TAC CTG ATG ATC GAA GAG TAT 1385 Phe Glu Gly Lys Lys Thr Asp Lys Lys Tyr Leu Met Ile Glu Glu Tyr 380 385 390 TTG ACC AAA GAG CTG CTG GCC CTG GAT TCA GTG GAC CCC GAG GGA CGA 1433 Leu Thr Lys Glu Leu Leu Ala Leu Asp Ser Val Asp Pro Glu Gly Arg 395 400 405 GCC GAT GTG CGT CAG GCC AGG AGA GAC GGT GTC AGG AAG GTT CAG ACC 1481 Ala Asp Val Arg Gln Ala Arg Arg Asp Gly Val Arg Lys Val Gln Thr 410 415 420 ATC TTG GAA AAA CTT GAA CAG AAA GCC ATT GAT GTC CCA GGT CAA GTC 1529 Ile Leu Glu Lys Leu Glu Gln Lys Ala Ile Asp Val Pro Gly Gln Val 425 430 435 CAG GTC TAT GAA CTC CAG CCC AGC AAC CTT GAA GCA GAT CAG CCA CTG 1577 Gln Val Tyr Glu Leu Gln Pro Ser Asn Leu Glu Ala Asp Gln Pro Leu 440 445 450 455 CAG GCA ATC ATG GAG ATG GGT GCC GTG GCA GCA GAC AAG GGC AAG AAA 1625 Gln Ala Ile Met Glu Met Gly Ala Val Ala Ala Asp Lys Gly Lys Lys 460 465 470 AAT GCT GGA AAT GCA GAA GAT CCC CAC ACA GAA ACC CAG CAG CCA GAA 1673 Asn Ala Gly Asn Ala Glu Asp Pro His Thr Glu Thr Gln Gln Pro Glu 475 480 485 GCC ACA GCA GCA GCG ACT TCA AAC CCC AGC AGC ATG ACA GAC ACC CCT 1721 Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ser Asn Pro Ser Ser Met Thr Asp Thr Pro 490 495 500 GGT AAC CCA GCA GCA CCG TAGCCTCTGC CCTGTAAAAA TCAGACTCGG 1769 Gly Asn Pro Ala Ala Pro 505 AACCGATGTG TGCTTTAGGG AATTTTAAGT TGCATGCATT TCAGAGACTT TAAGTCAGTT 1829 GGTTTTTATT AGCTGCTTGG TATGCAGTAA CTTGGGTGGA GGCAAAACAC TAATAAAAGG 1889 GCTAAAAAGG AAAATGATGC TTTTCTTCTA TATTCTTACT CTGTACAAAT AAAGAAGTTG 1949 CTTGTTGTTT CAGAAGTTTA ACCCCGTTGC TTGTTCTGCA GCCCTGTCTA CTTGGCCACC 2009 CCCACCACCT GTTAGCTGTG GTTGTGCACT GTCTTTTGTA GCTCTGRACT GGAGGGGTAG 2069 ATGGGGAGTC AATTACCCAT CACATAAATA TAAAACATTT ATCAGAAATG TTGCCATTTT 2129 AATGAGATGA TTTTCTTCAT CTCATAATTA AAATACCTGA CTTTAGAGAG AGTAAAATGT 2189 GCCAGGAGCC ATAGGAATAT CTGTATGTTG GATGACTTTA ATGCTACATT TTAAAAAAAG 2249 AAAATACCCG AATTC 2264

【図面の簡単な説明】

【図１】ノーザンブロット分析により調べたマウスにお
けるＢｉｓの組織分布を示す図面代用写真である。

【図２】ウエスタンブロット分析により調べたマウスに
おけるＢｉｓの組織分布を示す図面代用写真である。

【図３】ＢｉｓとＢｃｌ−２のインビトロでの結合能を
示す図面代用写真である。

【図４】Ｂａｘ誘導アポトーシスに対するＢｉｓ及びＢ
ｃｌ−２の相乗的防止を示す図面代用写真（蛍光顕微鏡
写真）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＡＢ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ ＡＡＭ Ｓ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＰ Ｇ０１Ｎ 33/53 ＡＢＳ ＡＤＰ // Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＧＺ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の（ａ）及び（ｂ）のいずれかの蛋白
   質をコードする塩基配列を含むＢｃｌ−２相互作用蛋白
   遺伝子： （ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋
   白質、（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列にお
   いて１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加された
   アミノ酸配列からなり、Ｂｃｌ−２との結合活性を有す
   る蛋白質。
2. 【請求項２】以下の（ａ）及び（ｂ）のいずれかのポリ
   ヌクレオチドからなるＢｃｌ−２相互作用蛋白遺伝子： （ａ）配列番号：２で示される塩基配列の全部又は一部
   を含むポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号：２で示され
   る塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下
   でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】ヒト遺伝子である請求項１又は２に記載の
   遺伝子。
4. 【請求項４】Ｂｃｌ−２相互作用蛋白遺伝子検出用の特
   異プローブ又は特異プライマーとして使用されるＤＮＡ
   断片である請求項２に記載の遺伝子。
5. 【請求項５】請求項１に記載の遺伝子によってコードさ
   れるＢｃｌ−２相互作用蛋白質。
6. 【請求項６】請求項５に記載のＢｃｌ−２相互作用蛋白
   質に結合性を有する抗体。