JP5093783B2 - Hgf前駆体蛋白質改変体及びその活性型蛋白質 - Google Patents
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Description
従来動物細胞の培養にはウシ胎児血清が添加されてきたが、近年では無血清培養法も進歩しており、医薬製剤として用いられる蛋白質をCHO細胞等の動物細胞を用いて生産する場合は無血清条件で培養が行われるのが一般的である。これは、ウシ胎児血清を使用しないことにより生産コストの削減が可能なことに加え、蛋白質製剤にウシ胎児血清に由来するウイルスや異常プリオンが混入する可能性を回避することができるためである。CHO細胞等の動物細胞を用いてHGFを生産する場合にも無血清培養は可能であるが、その場合、HGFは不活性型のHGF前駆体蛋白質としてしか製造できないという問題がある。
HGFの生合成では、まず一本鎖のHGF前駆体蛋白質が合成されて細胞から分泌されるが、このHGF前駆体蛋白質は不活性な前駆体である。HGF前駆体蛋白質がHGFアクチベーター(HGFA)と呼ばれるプロテアーゼの作用によって切断を受け、二本鎖に変換されて初めてHGFは活性型となる。活性型となったHGFは、α鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーである。HGFA自体も、もとは不活性な一本鎖前駆体(以下、プロHGFAともいう。)として生合成され、通常は血漿中をプロHGFAの形で循環している。組織傷害時には血液凝固系等と連動してトロンビンの作用によりプロHGFAが切断を受け、二本鎖の活性型HGFAとなり、HGF前駆体蛋白質を活性化する。血清はすでに血液凝固系が作用した後のものなので、血清中ではHGFAが活性型として存在する。したがって、HGFをコードするDNAを組み込んだCHO細胞を血清存在下で培養すると、血清中の活性型HGFAの作用により、HGFは活性型に変換された状態で培養液中に産生される。しかし、無血清条件でCHO細胞を培養すると、HGFAが存在しないことからHGFは不活性型のHGF前駆体蛋白質としてしか産生されない。HGFAを血清の代わりにCHO細胞の培養系に添加することも考えられるが、上記のようにHGFAも不活性な一本鎖のプロHGFAとして細胞から分泌された後に血液凝固系と連動した活性化を受けて初めて活性型HGFAが生じるというカスケードが存在するため、活性型HGFAを血清非存在下で得ることにも難がある。したがって、従来の技術では血清を添加する条件でなければ活性型HGFを効率的に生産できないというのが実状である。
しかし、血清を添加せずともHGF前駆体蛋白質を活性化する方法は従来知られていなかった。
すなわち、本発明は、血清を使用せずとも活性型ヘテロダイマーへの変換が可能なHGF前駆体蛋白質改変体及びその活性型蛋白質、さらにはその製造方法を提供するものである。さらに、本発明は、活性型HGF蛋白質改変体を有効成分として含有する医薬製剤を提供する。
[1]HGFペプチド構造において、HGFのα鎖の領域又はそのα鎖のC末端からアミノ酸残基を1乃至20個欠失するポリペプチドの領域と、HGFのβ鎖の領域又はそのβ鎖のN末端からアミノ酸残基を1乃至20個欠失するポリペプチドの領域との間に、プロテアーゼ反応又は化学反応によってペプチド切断しうる少なくとも2残基のアミノ酸配列を有するペプチド鎖Xが挿入された配列を有するHGF前駆体蛋白質改変体であって、ペプチド鎖X中の少なくとも一ヶ所を切断することによって得られる蛋白質がHGFの活性を有することを特徴とするHGF前駆体蛋白質改変体、
[2]ペプチド鎖Xが、プロテアーゼ認識配列を有することを特徴とする前記[1]に記載のHGF前駆体蛋白質改変体、
[3]プロテアーゼ認識配列がGenenase Iの認識配列、エンテロキナーゼの認識配列、血液凝固第Xa因子の認識配列、トロンビンの認識配列、TEVプロテアーゼの認識配列、Rhinovirus 3Cプロテアーゼの認識配列及びFurinの認識配列から選択される少なくとも1の認識配列であることを特徴とする前記[2]に記載のHGF前駆体蛋白質改変体、
[4]プロテアーゼ認識配列がHis−Tyr又はTyr−Hisであることを特徴とする前記[2]に記載のHGF前駆体蛋白質改変体、
[5]HGFがヒト、ネコ又はイヌ由来HGFであることを特徴とする前記[1]〜[4]のいずれかに記載のHGF前駆体蛋白質改変体、
[6]HGFがヒト由来HGFであることを特徴とする前記[1]〜[4]のいずれかに記載のHGF前駆体蛋白質改変体、
[7]HGFが、
(a)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつHGFと実質的に同質の活性を有する蛋白質、又は
(c)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつHGFと実質的に同質の活性を有する蛋白質、
であることを特徴とする前記[6]に記載のHGF前駆体蛋白質改変体、
[8]α鎖が、
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列の第32位から第494位で表されるアミノ酸配列であり、β鎖が、
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列の第495位から第728位で表されるアミノ酸配列、
であるか、α鎖が、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列の第32位から第489位で表されるアミノ酸配列であり、β鎖が、
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列の第490位から第723位で表されるアミノ酸配列であることを特徴とする前記[6]に記載のHGF前駆体蛋白質改変体、
[9]前記[1]〜[8]のいずれかで示されるHGF前駆体蛋白質改変体における、ペプチド鎖X中の少なくとも一ヶ所を切断することによって得られる活性型HGF蛋白質改変体、
[10]切断がプロテアーゼ処理又は化学的処理によって行われることを特徴とする前記[9]に記載の活性型HGF蛋白質改変体、
[11]プロテアーゼがGenenase I、エンテロキナーゼ、血液凝固第Xa因子、トロンビン、TEVプロテアーゼ、Rhinovirus 3Cプロテアーゼ及びFurinから選択される少なくとも1のプロテアーゼであることを特徴とする前記[10]に記載の活性型HGF蛋白質改変体、
[12]切断が、His−Tyr又はTyr−HisのC末側で行われることを特徴とする前記[10]に記載の活性型HGF蛋白質改変体、
[13]切断がGenenase I処理によって行われることを特徴とする前記[10]又は[12]に記載の活性型HGF蛋白質改変体、
[14]切断が化学的な切断方法によって行われることを特徴とする前記[9]に記載の活性型HGF蛋白質改変体、
[15]前記[1]〜[8]のいずれかに記載のHGF前駆体蛋白質改変体を製造し、続いてあるいは同時にペプチド鎖X中の少なくとも1ヶ所を切断することによって前記HGF前駆体蛋白質改変体を活性型HGF蛋白質改変体に変換することを特徴とする活性型HGF蛋白質改変体の製造方法、
[16]切断がプロテアーゼ処理又は化学的処理によって行われることを特徴とする前記[15]に記載の活性型HGF蛋白質改変体の製造方法、
[17]プロテアーゼがGenenase I、エンテロキナーゼ、血液凝固第Xa因子、トロンビン、TEVプロテアーゼ、Rhinovirus 3Cプロテアーゼ及びFurinから選択される少なくとも1のプロテアーゼであることを特徴とする前記[16]に記載の活性型HGF蛋白質改変体の製造方法、
[18]ペプチド鎖XがHis−Tyr又はTyr−Hisの配列を有し、かつ2〜20残基のアミノ酸を有するペプチド鎖であって、該ペプチド鎖Xを挿入した配列を有する一本鎖のHGF前駆体蛋白質改変体を製造し、続いてあるいは同時に該HGF前駆体蛋白質改変体をGenenase Iで処理することを特徴とする前記[15]に記載の活性型HGF蛋白質改変体の製造方法、
[19]前記[1]〜[8]のいずれかに記載のHGF前駆体蛋白質改変体をコードするDNAと、ペプチド鎖Xを切断するプロテアーゼをコードするDNAとを同時に宿主に導入し、HGF前駆体蛋白質改変体とペプチド鎖Xを切断するプロテアーゼを同時に前記宿主に発現させ、当該プロテアーゼにペプチド鎖Xを切断させることを特徴とする前記[16]〜[18]のいずれかに記載の活性型HGF蛋白質改変体の製造方法、及び
[20]前記[9]〜[14]のいずれかに記載の活性型HGF蛋白質改変体を有効成分として含有することを特徴とする医薬、
に関する。
HGFのα鎖の領域とβ鎖の領域の間に挿入されるペプチド鎖Xは、プロテアーゼ反応又は化学反応によってペプチド開裂しうる少なくとも2残基のアミノ酸配列を有するペプチド鎖であれば、特に限定されない。ペプチド鎖Xを構成するアミノ酸数は約20アミノ酸残基以内が好ましい。より好ましいペプチド鎖Xのアミノ酸数は約2〜10残基であり、さらに好ましくは約2〜6残基である。
工程1:
工程1によって、HGF前駆体蛋白質改変体をコードするDNAが作製される。該工程には、HGFのα鎖の領域とβ鎖の領域の間にペプチド鎖Xを挿入してHGF前駆体蛋白質改変体をコードするDNAを含む組換え発現ベクターを作製する工程が含まれる。
ペプチド鎖XをHGFのα鎖の領域とβ鎖の領域の間に挿入する場合、天然のHGFのα鎖とβ鎖の境界にペプチド鎖Xを単に挿入するだけでもよい。この場合はHGFの全アミノ酸数が挿入配列の分だけ増加することになる。また、HGFのα鎖とβ鎖の境界を挟みα鎖のC末端からアミノ酸残基を約1乃至20個及び/又はβ鎖のN末端からアミノ酸残基を約1乃至20個欠失させ、その欠失させた領域にペプチド鎖Xを挿入してもよい。
HGFにおけるα鎖とβ鎖としては、例えば配列番号1で表されるアミノ酸配列の第32位から第494位で表されるアミノ酸配列からなるα鎖、配列番号1で表されるアミノ酸配列の第495位から第728位で表されるアミノ酸配列からなるβ鎖、又は配列番号2で表されるアミノ酸配列の第32位から第489位で表されるアミノ酸配列からなるα鎖、配列番号2で表されるアミノ酸配列の第490位から第723位で表されるアミノ酸配列からなるβ鎖等が挙げられる。α鎖とβ鎖の境界を構成するアミノ酸残基は、例えば配列番号1で表されるHGFの場合は配列番号1の第494位のアルギニンと第495位のバリンである。また、例えば配列番号2で表される5アミノ酸欠失型ヒトHGFにおけるα鎖とβ鎖の境界を構成するアミノ酸残基は、配列番号2の第489位アルギニンと第490位のバリンである。
工程2によって、HGF前駆体蛋白質改変体が合成される。該工程では工程1で構築された組み換え発現ベクターが宿主に導入されて形質転換体が作製され、その形質転換体においてHGF前駆体蛋白質改変体が合成される工程が含まれる。
工程1で構築されたHGF前駆体蛋白質改変体をコードするDNAを含む組み換え発現ベクターが、コンピテント細胞法(J.Mol.Biol.,53,154,1970)、プロトプラスト法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929,(1978)]、リン酸カルシウム法[Science,221,551(1983)]、DEAEデキストラン法[Science,215,166(1982)]、電気パルス法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,7161,(1984)]、インビトロパッケージング法[Proc.Nat.Acad.Sci.USA,72,581(1975)]、ウイルスベクター法(Cell,37,1053,1984)又はマイクロインジェクション法[Exp.Cell.Res.,153,347(1984)]等によって宿主に導入され、形質転換体が作製される。
宿主として用いることのできる細胞としては、特に制限はなく、動物、植物、昆虫、真核微生物等の真核細胞、又は原核微生物等の原核細胞等が挙げられる。これらの細胞は個体を形成していてもよく、動物個体、植物個体又は昆虫個体等を宿主としてもよい。真核細胞では、付着性細胞又は浮遊性細胞等の何れも使用でき、例えばHGF前駆体蛋白質改変体を細胞内に生産蓄積する真核細胞でもよく、あるいはHGF前駆体蛋白質改変体を細胞外に分泌生産する真核細胞でもよい。動物細胞では、例えばCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞)、COS細胞、BHK細胞、マウスC127細胞又はHela細胞等が挙げられる。植物細胞では、例えばイネ、タバコ又はシロイヌナズナ等を挙げることができ、昆虫細胞では、例えばSf9やSf21等の細胞を挙げることができる。昆虫個体では例えばカイコを挙げることができる。真核微生物ではSaccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Candida boidinii又はPichia pastoris等の酵母、あるいはAspergillus属、Trichoderma属又はMucor属等の糸状菌等を挙げることができる。原核微生物では、大腸菌又は枯草菌等が挙げられる。
作製された形質転換体は、HGF前駆体蛋白質改変体をコードするDNAを発現し、HGF前駆体蛋白質改変体を合成し得る。
工程3によって、HGF前駆体蛋白質改変体(以下において、単に前駆体ということもある)を活性型HGF蛋白質改変体に変換させる。
工程2において合成されたHGF前駆体蛋白質改変体は不活性であることから、α鎖の領域とβ鎖の領域の間に挿入されたペプチド鎖X中の少なくとも一ヶ所を切断することによって該前駆体を開裂して、二本鎖に変換し、活性型HGF蛋白質改変体に変換させることが好ましい。
切断の方法は、前駆体に存在するペプチド鎖X中の特定のアミノ酸配列が切断されれば特に限定されない。該方法には、例えばプロテアーゼによる処理又は化学的な処理を含む。
また、プロテアーゼをHGF前駆体蛋白質改変体に作用させる他の方法としては、HGF前駆体蛋白質改変体を生産させる形質転換体にプロテアーゼをコードするDNAも組み込んで、該形質転換体にHGF前駆体蛋白質改変体と同時に該プロテアーゼを発現させる方法等が挙げられる。この場合、ペプチド鎖Xに含まれるプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼをコードするDNAを組み込むのが好ましい。形質転換体は、HGF前駆体蛋白質改変体と同時にプロテアーゼを生産するので、該形質転換体が生産するHGF前駆体蛋白質改変体はペプチド鎖Xに含まれるプロテアーゼ認識配列部位で自動的に切断され、活性化され得る。
工程4によって、活性型HGF蛋白質改変体が分離、精製される。形質転換体の培養上清中又は形質転換体中に生成した活性型HGF蛋白質改変体は、公知の塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、あるいはゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等又はそれらを組み合わせて分離精製することが出来る。特に、硫酸アンモニウムによる塩析法、S−セファロースイオンクロマトグラフィー、へパリンセファロースアフィニティクロマトグラフィー、及びフェニルセファロース逆相クロマトグラフィーの組み合せ、あるいは硫酸アンモニウムによる塩析法、S−セファロースイオンクロマトグラフィー、及び抗HGF抗体セファロースアフィニティクロマトグラフィーの組み合わせ等が好ましく有効な精製法である。
また、本発明で用いられる活性型HGF蛋白質改変体は、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤(例えばデポ剤)とすることもできる。活性型HGF蛋白質改変体は特にデポ剤とすることにより、投薬回数の低減、作用の持続性及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のなかから適宜選択できるが、例えばデンプン、デキストラン又はキトサン等の多糖類;コラーゲン又はゼラチン等の蛋白質;ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチオニン等のポリアミノ酸;ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸・ポリエチレングリコール・ビニルピロリドン共重合体等のポリエステル;ポリオルソエステル又はポリメチル−α−シアノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸;ポリエチレンカーボネート又はポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等が挙げられる。好ましくはポリエステル、更に好ましくはポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体である。乳酸−グリコール酸共重合体を使用する場合、その組成比(乳酸/グリコール酸)(モル%)は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約2週間ないし3カ月、好ましくは約2週間ないし1カ月の場合には、約100/0乃至50/50が好ましい。該ポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量は、一般的には約5,000乃至20,000が好ましい。ポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体は、公知の製造法、例えば特開昭61−28521号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体分解性高分子と活性型HGF蛋白質改変体の配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性高分子に対して、活性型HGF蛋白質改変体が約0.01〜30質量%程度が好ましい。
噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する場合、その噴霧剤に配合される添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であればいずれのものであってもよく、例えば、噴射剤の他、上記した溶剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、pH調整剤等を配合し得る。噴射剤としては、液化ガス噴射剤又は圧縮ガス等が挙げられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化水素(HCFC22、HCFC−123、HCFC−134a、HCFC142等の代替フロン類等)、液化石油又はジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性ガス(炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等)又は不溶性ガス(窒素ガス等)等が挙げられる。
なお、実施例で使用する各略号の意味は次の通りである。
HGF:肝細胞増殖因子
LB培地:Luria−Bertani培地
DMEM培地:ダルベッコ改変イーグル培地
Amp:アンピシリン
FCS:牛胎児血清
Tris:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
Tween80:ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレート
SDS:ドデシル硫酸ナトリウム
PAGE:ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
PVDF:ポリフッ化ビニリデン
A:アデニン
C:シトシン
G:グアニン
T:チミン
Ala:アラニン
Arg:アルギニン
Gly:グリシン
Gln:グルタミン
Lys:リジン
Thr:スレオニン
Leu:ロイシン
His:ヒスタミン
Tyr:チロシン
Pro:プロリン
また、%は特記しない場合は質量%を示す。
HGF−NGのα鎖とβ鎖の境界にGenenase I認識配列(His−Tyr)が導入された改変体として、該HGFα鎖のC末端2残基(Leu−Arg)がHis−Tyrに変換された改変体(HGF−G1と称する)、該HGFα鎖のC末端1残基(Arg)がTyrに、HGFβ鎖のN末端1残基(Val)がHisに変換された改変体(HGF−G2と称する)及び該HGFα鎖のC末端6残基(配列番号14の第484−489位;Lys−Thr−Lys−Gln−Leu−Arg)がPro−Gly−Ala−Ala−His−Tyr(配列番号12)に変換された改変体(HGF−G3と称する)を以下のように調製した。
まず、HGF−G1、HGF−G2、HGF−G3を発現させるためのベクターを作製した。このためには、上記のpCDNA−dHGF−NGをテンプレートとして、クンケル法によりHGFのα鎖とβ鎖の境界をコードする領域の塩基配列に変異を導入し、この変異導入鎖を増幅させた。具体的には、HGF−G1を発現するベクターの調製のためには配列番号16のプライマー(5’−リン酸化)を、HGF−G2を発現するベクターの調製のためには配列番号17のプライマー(5’−リン酸化)を、HGF−G3を発現するベクターの調製のためには配列番号18のプライマー(5’−リン酸化)を用い、pCDNA−dHGF−NGをテンプレートとしてDNA polymeraseにKOD Plus(東洋紡績社製)を用いて変異導入鎖を伸長させ、増幅させた。その後、テンプレートDNAをDpnI処理により消化し、残った変異導入鎖を、塩化カルシウム法により作製した大腸菌DH5α株のコンピテントセル(ニッポンジーン社製)にトランスフォーム(形質導入)することによって、変異ベクターを調製した。
配列番号16の変異プライマーを用いて配列番号14の第488−489位がLeu−ArgからHis−Tyrに置換されるように変異を導入したベクターはpCDNA−dHGF−NG−G1と称する。配列番号17の変異プライマーを用いて、配列番号14の第489−490位がArg−ValからTyr−Hisに置換されるように変異を導入した変異ベクターはpCDNA−dHGF−NG−G2と称する。配列番号18の変異プライマーを用いて、配列番号14の第484−489位がLys−Thr−Lys−Gln−Leu−ArgからPro−Gly−Ala−Ala−His−Tyrに置換されるように変異を導入した変異ベクターはpCDNA−dHGF−NG−G3と称する。
上記の培地を解凍し、再度0.22μmフィルターで濾過した後、50mM Tris−HCl(pH7.5)、0.01%Tween 80、0.3M NaClで平衡化したHeparin Sepharose樹脂(Amersham Biosciences社製)を添加し、室温でHGF−NG前駆体蛋白質、HGF−G1前駆体蛋白質、HGF−G2前駆体蛋白質又はHGF−G3前駆体蛋白質を樹脂に結合させた。樹脂を50mM Tris−HCl(pH7.5)、0.01%Tween 80、0.3M NaClで洗浄後、50mM Tris−HCl(pH7.5)、0.01%Tween 80、2M NaClでHGF−NG前駆体蛋白質、HGF−G1前駆体蛋白質、HGF−G2前駆体蛋白質又はHGF−G3前駆体蛋白質を溶出させることにより、HGF−NG前駆体蛋白質、HGF−G1前駆体蛋白質、HGF−G2前駆体蛋白質又はHGF−G3前駆体蛋白質を部分精製した。
ウエスタンブロット:Genenase Iで処理した後の活性型HGF−G1、活性型HGF−G2又は活性型HGF−G3を還元条件下(100mM DTTの存在下)又は非還元条件下でSDS−PAGEを行い、PVDFメンブレンに転写した。PVDFメンブレンに転写された蛋白質は、ヒトHGFをウサギに免疫することによって作製されたヒトHGFポリクローナル抗体(Matsumoto K,et al.,Proceedings for National Academy of Science of the United States of America,89,3800-3804(1992))をプローブとして検出した。
Genenase I認識配列を挿入したHGF−G1前駆体蛋白質、HGF−G2前駆体蛋白質及びHGF−G3前駆体蛋白質は、いずれもGenenase I処理をしない(図3;−)と細胞遊走活性を示さなかったが、これらをGenenase Iで処理した(図3;+)後の活性型HGF−G1、活性型HGF−G2及び活性型HGF−G3はいずれも、活性型5アミノ酸欠失型ヒトHGFと同等の細胞遊走活性を示した。このことから、Genenase I認識配列を挿入したHGF前駆体蛋白質改変体は、Genenase Iで二本鎖構造に変換されることにより、HGF活性を有する活性型HGF蛋白質改変体になることが確認された。
Claims (20)
- HGFペプチド構造において、HGFのα鎖の領域又はそのα鎖のC末端からアミノ酸残基を1乃至20個欠失するポリペプチドの領域と、HGFのβ鎖の領域又はそのβ鎖のN末端からアミノ酸残基を1乃至20個欠失するポリペプチドの領域との間に、プロテアーゼ反応又は化学反応によってペプチド切断しうる2〜20残基のアミノ酸配列を有するペプチド鎖Xが挿入された配列を有するHGF前駆体蛋白質改変体であって、ペプチド鎖X中の一ヶ所を切断することによって得られる蛋白質がジスルフィド結合でつながったヘテロダイマーを形成してHGFの活性を有することを特徴とするHGF前駆体蛋白質改変体。
- ペプチド鎖Xが、プロテアーゼ認識配列を有することを特徴とする請求項1に記載のHGF前駆体蛋白質改変体。
- プロテアーゼ認識配列がGenenase Iの認識配列、エンテロキナーゼの認識配列、血液凝固第Xa因子の認識配列、トロンビンの認識配列、TEVプロテアーゼの認識配列、Rhinovirus 3Cプロテアーゼの認識配列及びFurinの認識配列から選択される少なくとも1の認識配列であることを特徴とする請求項2に記載のHGF前駆体蛋白質改変体。
- プロテアーゼ認識配列がHis−Tyr又はTyr−Hisであることを特徴とする請求項2に記載のHGF前駆体蛋白質改変体。
- HGFがヒト、ネコ又はイヌ由来HGFであることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載のHGF前駆体蛋白質改変体。
- HGFがヒト由来HGFであることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載のHGF前駆体蛋白質改変体。
- HGFが、
配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
であることを特徴とする請求項6に記載のHGF前駆体蛋白質改変体。 - α鎖が、
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列の第32位から第494位で表されるアミノ酸配列であり、β鎖が、
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列の第495位から第728位で表されるアミノ酸配列、
であるか、α鎖が、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列の第32位から第489位で表されるアミノ酸配列であり、β鎖が、
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列の第490位から第723位で表されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項6に記載のHGF前駆体蛋白質改変体。 - 請求項1〜8のいずれかに記載のHGF前駆体蛋白質改変体における、ペプチド鎖X中の一ヶ所を切断することによって得られる活性型HGF蛋白質改変体。
- 切断がプロテアーゼ処理によって行われることを特徴とする請求項9に記載の活性型HGF蛋白質改変体。
- プロテアーゼがGenenase I、エンテロキナーゼ、血液凝固第Xa因子、トロンビン、TEVプロテアーゼ、Rhinovirus 3Cプロテアーゼ及びFurinから選択される少なくとも1のプロテアーゼであることを特徴とする請求項10に記載の活性型HGF蛋白質改変体。
- 切断が、His−Tyr又はTyr−HisのC末側で行われることを特徴とする請求項10に記載の活性型HGF蛋白質改変体。
- 切断がGenenase I処理によって行われることを特徴とする請求項10又は12に記載の活性型HGF蛋白質改変体。
- 切断が化学的な切断方法によって行われることを特徴とする請求項9に記載の活性型HGF蛋白質改変体。
- 請求項1〜8のいずれかに記載のHGF前駆体蛋白質改変体を製造し、続いてあるいは同時にペプチド鎖X中の1ヶ所を切断することによって前記HGF前駆体蛋白質改変体を活性型HGF蛋白質改変体に変換することを特徴とする活性型HGF蛋白質改変体の製造方法。
- 切断がプロテアーゼ処理又は化学的処理によって行われることを特徴とする請求項15に記載の活性型HGF蛋白質改変体の製造方法。
- プロテアーゼがGenenase I、エンテロキナーゼ、血液凝固第Xa因子、トロンビン、TEVプロテアーゼ、Rhinovirus 3Cプロテアーゼ及びFurinから選択される少なくとも1のプロテアーゼであることを特徴とする請求項16に記載の活性型HGF蛋白質改変体の製造方法。
- ペプチド鎖XがHis−Tyr又はTyr−Hisの配列を有するペプチド鎖であって、該ペプチド鎖Xを挿入した配列を有する一本鎖のHGF前駆体蛋白質改変体を製造し、続いてあるいは同時に該HGF前駆体蛋白質改変体をGenenase Iで処理することを特徴とする請求項15に記載の活性型HGF蛋白質改変体の製造方法。
- 請求項1〜8のいずれかに記載のHGF前駆体蛋白質改変体をコードするDNAと、ペプチド鎖Xを切断するプロテアーゼをコードするDNAとを同時に宿主に導入し、HGF前駆体蛋白質改変体とペプチド鎖Xを切断するプロテアーゼを同時に前記宿主に発現させ、当該プロテアーゼにペプチド鎖Xを切断させることを特徴とする請求項16〜18のいずれかに記載の活性型HGF蛋白質改変体の製造方法。
- 請求項9〜14のいずれかに記載の活性型HGF蛋白質改変体を有効成分として含有することを特徴とする医薬。
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