CN118159651A - 用于制造胶原三肽或者分解软骨的酶剂 - Google Patents

用于制造胶原三肽或者分解软骨的酶剂 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供对制造胶原三肽或者分解软骨等食品或医疗用途有用的安全性高的蛋白酶(胶原蛋白酶)及其用途等。根据本发明，可提供用于制造胶原三肽的酶剂，该酶剂以由序列号1的氨基酸序列或者与其等效的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶为有效成分。

Description

用于制造胶原三肽或者分解软骨的酶剂
技术领域
本发明涉及以胶原蛋白酶为有效成分的、用于制造胶原三肽或者分解软骨的酶剂及其用途。
背景技术
可以预测已知为功能性肽的胶原肽的全球市场会增长。胶原肽中，作为胶原蛋白的最小单位的三肽Gly-X-Y(胶原三肽。以下，有时简称为“CTP”)在体内的吸收性高，另外具有各种功能性，因此认为其利用价值高。
为了高效地制造CTP，能够在胶原蛋白或明胶的Gly残基位置进行特异性切割且分解至三肽的蛋白酶(胶原蛋白酶)是有用的。作为胶原蛋白酶的例子，已知有来自梭菌属(Clostridium)、弧菌属(Vibrio)的胶原蛋白酶、蜡样芽孢杆菌胶原蛋白酶(属于微生物胶原蛋白酶(EC.3.4.24.3))，但胶原蛋白酶生产菌为生物安全等级2(BSL2)，担忧其安全性，因此可以说不适合制造食品用途、医疗用途等所使用的CTP。
作为可用于食品用途的胶原蛋白酶，已知有来自链霉菌属(Streptomyces)的胶原蛋白酶(专利文献1)，但并不清楚是否可利用于制造CTP。另外，现有的胶原蛋白酶通常稳定性差。作为被认为稳定性优异且比活性也高的来自微生物的胶原蛋白酶，已知有来自霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)的胶原蛋白酶(专利文献2中的来自弧菌属(Vibrio sp)1706B菌株的胶原蛋白酶)(专利文献2、专利文献3)。但是，来自霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)的胶原蛋白酶的热稳定性为30℃以下，在实用上并不充分。
另外，已知存在性质不同的各种胶原蛋白酶。例如，来自溶组织梭状芽胞杆菌属的胶原蛋白酶已知有2种不同的胶原蛋白酶类型(I、II)，胶原蛋白酶I与胶原蛋白酶II相比对胶原蛋白和明胶具有高活性且对短链肽具有低活性(专利文献4)。此外，已知来自溶组织梭状芽胞杆菌的胶原蛋白酶从胶原蛋白样序列中切割出CTP的分解率低(专利文献5)。
对适合由胶原蛋白制造可用于食品用途的CTP的胶原蛋白酶要求胶原蛋白酶生产菌为安全菌、具有胶原蛋白分解能力或明胶分解能力、以及具有CTP生成能力，另外，优选还要求稳定性高，但尚未知晓有满足这样的条件并实用化了的胶原蛋白酶。
另一方面，有时需要面向食品用途的具有高的软骨分解能力的胶原蛋白酶，但尚未知晓具有高的软骨分解能力的胶原蛋白酶。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特公平5-16832号公报
专利文献2：日本特开平8-70853号公报
专利文献3：日本特开2010-263880号公报
专利文献4：日本特表2001-510331号公报
专利文献5：日本特开2018-183106号公报
发明内容
在上述背景下，本发明的课题在于提供对制造胶原三肽或者分解软骨等食品或医疗用途有用的安全性高的蛋白酶(胶原蛋白酶)及其用途等。
本发明人等为了获得CTP生成能力高、软骨分解能力高、而且安全性高的胶原蛋白酶，广泛筛选了来自微生物的酶。其结果发现了纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)的特定菌株产生与目标一致的胶原蛋白酶。该胶原蛋白酶表现出胶原蛋白酶分解能力、CTP生成能力，软骨分解能力高，产业上的利用价值高。根据本发明，可提供以下的发明。
＜1＞一种用于制造胶原三肽的酶剂，以由序列号1的氨基酸序列或者与其等效的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶为有效成分。
＜2＞根据＜1＞所述的酶剂，其中，由等效的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶为与序列号1的氨基酸序列具有90％以上的同源性、且由牛骨明胶生成Gly-Glu-Arg的能力与由序列号1的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶同等的胶原蛋白酶。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的酶剂，其中，胶原蛋白酶来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌。
＜4＞一种用于制造胶原三肽的酶剂，以来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌且具有以下理化性质的胶原蛋白酶为有效成分。
(1)最适温度：40℃附近。
(2)温度稳定性：将活性最高的处理温度下的活性设为100％的相对残余活性在4℃～40℃为80％以上，在50℃为10％以下。
(3)最适pH：最适pH在7附近。
(4)pH稳定性：将活性最高的处理pH下的活性设为100％的相对残余活性在pH为6～8的范围为80％以上，在pH5为10％以下。
＜5＞一种用于软化食用肉和/或分解软骨的酶剂，以由序列号1的氨基酸序列或者与其等效的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶为有效成分。
＜6＞根据＜5＞所述的酶剂，其中，由等效的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶为与序列号1的氨基酸序列具有90％以上的同源性、且鸡软骨分解能力与由序列号1的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶同等的胶原蛋白酶。
＜7＞根据＜5＞或＜6＞所述的酶剂，其中，胶原蛋白酶来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌。
＜8＞一种用于软化食用肉和/或分解软骨的酶剂，以来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌且具有以下理化性质的胶原蛋白酶为有效成分。
(1)最适温度：40℃附近。
(2)温度稳定性：将活性最高的处理温度下的活性设为100％的相对残余活性在4℃～40℃为80％以上，在50℃为10％以下。
(3)最适pH：最适pH在7附近。
(4)pH稳定性：将活性最高的处理pH下的活性设为100％的相对残余活性在pH为6～8的范围为80％以上，在pH5为10％以下。
＜9＞一种胶原三肽的制造方法，其特征在于，使＜1＞～＜4＞中任一项所述的酶剂作用于胶原蛋白或明胶。
＜10＞一种软化食用肉和/或分解软骨的方法，其特征在于，使＜5＞～＜8＞中任一项所述的酶剂作用于食用肉和/或软骨。
附图说明
图1表示来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌7128株的胶原蛋白酶的最适温度。
图2表示来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌7128株的胶原蛋白酶的温度稳定性。
图3表示来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌7128株的胶原蛋白酶的最适pH。
图4表示来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌7128株的胶原蛋白酶的pH稳定性。
图5表示确认作为胶原三肽的Gly-Pro-Hyp的生成能力(鱼明胶)的结果。
图6表示确认作为胶原三肽的Gly-Pro-Ala的生成能力(鱼明胶)的结果。
图7表示确认作为胶原三肽的Gly-Glu-Arg的生成能力(鱼明胶)的结果。
图8表示确认作为胶原三肽的Gly-Glu-Arg的生成能力(牛骨明胶)的结果。
图9表示测定软骨分解能力的结果。
具体实施方式
1.用于制造胶原三肽或者分解软骨的酶剂
本发明的第1方面涉及用于制造胶原三肽或者软化食用肉和/或分解软骨的酶剂。本发明的酶剂(以下，也称为“本酶剂”)含有胶原蛋白酶(以下，也称为“本酶”)作为有效成分。本发明的酶剂在制造胶原三肽或者软化食用肉和/或分解软骨中有用(详细情况在下文叙述)。有效成分的胶原蛋白酶、即本酶由序列号1所示的氨基酸序列或者与该氨基酸序列等效的氨基酸序列构成。此处的“等效的氨基酸序列”是指与基准的氨基酸序列(序列号1的氨基酸序列)有一部分不同，但该不同不会对蛋白质的功能(此处指胶原蛋白分解活性)造成实质影响的氨基酸序列，本发明中还表示由牛骨明胶生成Gly-Glu-Arg的能力为同等的氨基酸序列、或者鸡软骨分解能力为同等的氨基酸序列。因此，具有等效的氨基酸序列的酶催化胶原蛋白的分解反应，具有由牛骨明胶生成Gly-Glu-Arg的能力和/或具有鸡软骨分解能力。上述的胶原蛋白分解活性、Gly-Glu-Arg的生成能力和鸡软骨分解能力的程度只要能够发挥作为胶原蛋白酶的功能，就没有特别限定。其中，优选与由作为基准的氨基酸序列构成的酶(具有序列号1的氨基酸序列)同等程度或者比其高。由牛骨明胶生成Gly-Glu-Arg的能力为同等是指与具有基准的氨基酸序列的胶原蛋白酶相比较，具有±10％的生成能力，优选具有±5％的生成能力。鸡软骨分解能力为同等是指与具有基准的氨基酸序列的胶原蛋白酶相比较，具有±10％的分解能力，优选具有±5％的分解能力。
序列号1的氨基酸序列为来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)的胶原蛋白酶的氨基酸序列(成熟体)。应予说明，将还具有信号肽和前序列的、来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌的胶原蛋白酶的氨基酸序列表示为序列号2。
“氨基酸序列的一部分不同”例如通过构成氨基酸序列的氨基酸中的1个或多个氨基酸的缺失、替换、对氨基酸序列附加、插入1个或多个氨基酸、或者它们的任意组合而产生。氨基酸序列的一部分不同只要可保持胶原蛋白分解活性、Gly-Glu-Arg的生成能力和/或鸡软骨分解能力则被允许(活性可以有稍许变动)。只要满足该条件，则氨基酸序列的不同的位置没有特别限定。另外，氨基酸序列的不同可以在多个位置(地方)产生。
造成氨基酸序列的一部分不同的氨基酸的数目为相当于构成氨基酸序列的全部氨基酸的例如约20％以下的数目，优选为相当于约15％以下的数目，更优选为相当于约10％以下的数目，更优选为相当于约5％以下的数目，更优选为相当于约3％以下的数目，更优选为相当于约2％以下的数目，更优选为相当于约1％以下的数目，更优选为相当于约0.7％以下的数目，更优选为相当于约0.5％以下的数目，更优选为相当于约0.3％以下的数目，进一步优选为相当于约0.1％以下的数目。因此，等效蛋白质与基准的氨基酸序列具有例如约80％以上、优选约85％以上、更优选约90％以上、更优选约95％以上、更优选约97％以上、更优选约98％以上、更优选约99％以上、更优选约99.3％以上、更优选约99.5％以上、更优选约99.7％以上、进一步优选约99.9％以上的同源性。
“氨基酸序列的一部分不同”的典型例之一通过构成氨基酸序列的氨基酸中的1～40个(优选为1～30个、更优选为1～10个、进一步优选为1～7个、更进一步优选为1～5个、进一步优选为1～3个)的氨基酸的缺失、替换、对氨基酸序列附加、插入1～40个(优选为1～30个、更优选为1～10个、进一步优选为1～7个、更进一步优选为1～5个、进一步优选为1～3个)的氨基酸、或者它们的组合而使氨基酸序列产生变异(变化)。
优选通过使对胶原蛋白分解能力非必需的氨基酸残基产生保守性氨基酸替换而得到等效的氨基酸序列。此处的“保守氨基酸替换”是指将某个氨基酸残基替换成具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链而分类为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)这样的几个家族。保守性氨基酸替换优选为相同家族内的氨基酸残基间的替换。
二个氨基酸序列的同源性(％)例如可以按照以下步骤来确定。首先，以能够进行最佳比较的方式对二个序列进行排列(例如，可以在第一序列导入空位(Gap)来优化与第二序列的比对)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基)与第二序列中的对应位置的分子相同时，可以说该位置的分子相同。二个序列的同源性是这二个序列共同的相同位置的数量的函数(即，同源性(％)＝相同位置的数量/位置的总数×100)，优选将优化比对所需的空位的个数和尺寸也纳入考虑。
二个序列的比较和同源性的确定可以使用数学算法来实现。作为可用于序列的比较的数学算法的具体例，有Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68中记载并在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77中进行了改变的算法，但并不限定于此。氨基酸序列的同源性可以通过例如National Center forBiotechnology Information(NCBI)的blastp(protein-proteinBLAST)获得。参数可以使用默认的参数，例如可以使用BLOSUM62矩阵将Gap Costs设定为Existence:11、Extension:1。
作为本酶剂的有效成分的胶原蛋白酶、即本酶可以为更大的蛋白质(例如融合蛋白)的一部分。作为融合蛋白中附加的序列，例如，可举出多重组氨酸残基这样的有助于纯化的序列、确保重组生产时的稳定性的附加序列等。
本酶可以通过培养产生该胶原蛋白酶的微生物(胶原蛋白酶生产菌株)、例如纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)而得到。胶原蛋白酶生产菌株可以为野生株，也可以为变异株(例如通过照射紫外线而得到变异株)。
本酶可以通过产生本酶的微生物的培养液和/或菌体来制备。培养条件、培养法只要可生产本酶，就没有特别限定。即，可以将可生产本酶作为条件，适当地设定适于培养所使用的微生物的方法、培养条件。作为培养法，可以为液体培养、固体培养中的任一种，优选利用液体培养。以液体培养为例对其培养条件进行说明。
作为培养基，只要是所使用的微生物能够生长的培养基，就没有特别限定。例如，可以使用添加有葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源、进一步添加有硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵、或者明胶、蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麸皮、肉提取物等氮源、进一步添加有钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐的培养基。为了促进所使用的微生物的生长，可以在培养基中添加维生素、氨基酸等。培养基的pH例如调节至约3～8、优选调节至约4～7左右，培养温度通常为约20～40℃，优选为约25～35℃左右，在需氧的条件下培养1～20天、优选3～10天左右。作为培养法，例如可以利用振荡培养法、基于发酵罐的需氧深层培养法。
按照以上条件进行培养后，从培养液或菌体中回收目标酶。从培养液中回收时，例如可以通过将培养上清液进行过滤、离心处理等而除去不溶物后，适当地组合基于超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀等盐析、透析、离子交换树脂等各种色谱法等进行分离、纯化而得到本酶。另一方面，从菌体内回收时，例如可以通过将菌体利用加压处理、超声波处理等破碎后，与上述同样地进行分离、纯化而得到本酶。应予说明，也可以通过过滤、离心处理等预先从培养液中回收菌体后，进行上述一系列的工序(菌体的破碎、分离、纯化)。
本酶也可以利用基因工程学方法而容易地制备。例如可以通过由编码本酶的DNA转化适当的宿主细胞(例如大肠杆菌)，回收在转化体内表达的蛋白质而制备。将回收的蛋白质根据目的适当地进行纯化。只要如此以重组蛋白质的形式得到目标酶，就可以进行各种修饰。例如，如果将编码本酶的DNA和其它适当的DNA插入相同的载体，并使用该载体进行重组蛋白质的生产，则可以得到由连接有任意的肽或蛋白质的重组蛋白质构成的本酶。另外，也可以实施糖链和/或脂质的附加、或者产生N末端或C末端的加工这样的修饰。通过如上所述的修饰，能够实现重组蛋白质的提取、纯化的简化或生物学功能的附加等。
通常，如上所述利用适当的宿主-载体系统进行基因的表达～表达产物(本酶)的回收，但也可以利用无细胞合成系统。此处，“无细胞合成系统(无细胞转录系统、无细胞转录/翻译系统)”是指不使用活细胞，而是使用来自活细胞的(或者利用基因工程学方法得到的)核糖体、转录·翻译因子等，由作为模板的核酸(DNA、mRNA)在体外合成其所编码的mRNA、蛋白质。无细胞合成系统中一般使用将细胞破碎液根据需要纯化而得到的细胞提取液。细胞提取液一般包含蛋白质合成所需的核糖体、起始因子等各种因子、tRNA等各种酶。进行蛋白质的合成时，在该细胞提取液中添加各种氨基酸、ATP、GTP等能源、磷酸肌酸等在蛋白质的合成中所需的其它物质。当然，在蛋白质合成时，也可以根据需要补充另行准备的核糖体、各种因子和/或各种酶等。
还报告了重建蛋白质合成所需的各分子(因素)的转录/翻译系统的开发(Shimizu,Y.et al.:Nature Biotech.,19,751-755,2001)。该合成系统中，将由构成细菌的蛋白质合成系统的3种起始因子、3种延长因子、参与终止的4种因子、使各氨基酸与tRNA结合的20种氨基酰基tRNA合成酶和甲硫氨酰tRNA甲酰转移酶构成的31种因子的基因由大肠杆菌基因组扩增，使用它们在体外重建蛋白质合成系统。本发明中也可以利用这样重建的合成系统。
术语“无细胞转录/翻译系统”可以与无细胞蛋白质合成系统、体外翻译系统或体外转录/翻译系统交换使用。体外翻译系统中使用RNA作为模板来合成蛋白质。可使用总RNA、mRNA、体外转录产物等作为模板RNA。其它体外转录/翻译系统中可使用DNA作为模板。模板DNA应包含核糖体结合区域，优选还包含适当的终止子序列。应予说明，在体外转录/翻译系统中，设定添加各反应所需的因子以使转录反应和翻译反应连续进行的条件。
也可以将如上所述得到的纯化酶通过例如冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥等制成粉末而提供。此时，可以预先将纯化酶溶解于乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、GOOD的缓冲液。优选可以使用乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液。应予说明，此处，作为GOOD的缓冲液，可举出PIPES、MES或MOPS。
酶的纯化度没有特别限定，例如可以纯化至Pz-肽分解活性为1～20000(U/g)、优选为10～10000(U/g)、更优选为100～1000(U/g)的状态。另外，最终的形态可以液体状，也可以为固体状(包括粉体状)。
根据本发明人等的研究，由序列号1的氨基酸序列构成的来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌的胶原蛋白酶的各性质如下确定(详细参照后述的实施例)。因此，也可以根据以下的酶化学性质来确定本酶。应予说明，评价各酶化学性质时的胶原蛋白酶活性的测定条件、测定步骤等详细内容示于后述的实施例中。
(1)作用
本酶为胶原蛋白酶，作用于胶原蛋白、明胶而生成胶原三肽。
(2)最适温度
本酶的最适温度为40℃。
(3)温度稳定性
本酶即便在Tris-盐酸缓冲液中、pH7的条件下、以40℃以下(0℃～40℃)的条件处理30分钟，也没有实质的活性降低。在上述条件下，以50℃～60℃的条件处理30分钟时，活性下降至10％以下。这点在为了不使反应过度进行而使酶失活时能够在较低温度下失活的方面有用。
(4)最适pH
本酶的最适pH约为7。最适pH例如基于在pH4～6的pH区域的乙酸缓冲液中、在pH6～7的pH区域的PIPES缓冲液中、在pH7～9的pH区域的Tris-盐酸缓冲液(Tris-HCl)中测定的结果进行判断。
(5)pH稳定性
本酶在pH6～8的pH区域显示稳定的活性。例如，如果供于处理的酶溶液的pH在该范围内，则在30℃处理30分钟后，显示最大活性的70％以上的活性，另一方面，在pH5降低至最大活性的10％以下。这点在为了不使反应过度进行而使酶失活时能够在较弱酸性下失活的方面有用。pH稳定性例如基于在pH4～6的pH区域的乙酸缓冲液中、在pH6～7的pH区域的PIPES缓冲液中、在pH7～9的pH区域的Tris-盐酸缓冲液(Tris-HCl)中、在pH9～11的pH区域的甘氨酸缓冲液中测定的结果进行判断。
通过使本酶作用于胶原蛋白或明胶，能够得到在N末端具有Gly(甘氨酸)的Gly-Pro-Hyp、Gly-Pro-Ala、Gly-Glu-Arg等胶原三肽Gly-X-Y(CTP)。本酶的特征在于，作用于胶原蛋白或明胶时，特别地Gly-Glu-Arg的生成量高。
本酶剂中的有效成分(本酶)的含量没有特别限定，例如，可以以每1g本酶剂的Pz-肽分解活性为1U～500U、优选为10U～300U的方式设定或调整有效成分的含量。本发明的酶剂通常以固体状(例如，将该酶固定化于能够在颗粒、粉体、二氧化硅、多孔聚合物等的表面或内部固定酶的素材而得的固定化酶)或液体状提供。本酶剂除了有效成分(本酶)以外，还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形剂，可以使用乳糖、山梨糖醇、D-甘露糖醇、麦芽糊精、白糖等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
2.基因
本酶可以通过获得编码本酶的基因并使该基因表达而制造。一个方式中编码本酶的基因由编码序列号1的氨基酸序列的DNA构成。该方式的具体例为由序列号3表示的碱基序列构成的DNA、和由序列号4表示的碱基序列构成的DNA。前者的DNA(序列号3)仅编码成熟体的氨基酸序列(序列号1)，后者的DNA(序列号4)除了编码成熟体(序列号1的氨基酸序列)以外，还编码信号肽和前序列。
编码本酶的基因典型地用于制备本酶。根据使用了编码本酶的基因的基因工程学制备法，能够得到更均质状态的本酶。另外，该方法可以说是在制备大量的本酶的情况下也优选的方法。应予说明，编码本酶的基因的用途不限于本酶的制备。例如，也可以利用该核酸作为以阐明本酶的作用机制等为目的的实验用工具、或者作为用于设计或制作本酶的变异体(变体)的工具。
本说明书中“编码本酶的基因”是指在使其表达时可得到本酶的核酸，自然包括具有与本酶的氨基酸序列对应的碱基序列的核酸，还包括对这样的核酸附加不编码氨基酸序列的序列而成的核酸。另外，还考虑密码子的简并。
核酸可以参考本说明书或附加的序列表所公开的序列信息，通过标准的基因工程学方法、分子生物学方法、生物化学方法、化学合成、PCR法(例如重叠延伸PCR)或它们的组合而制备成分离的状态。
本发明的其它方式中，提供在与编码本酶的基因的碱基序列进行比较时，虽然其所编码的蛋白质的功能同等，但一部分中碱基序列不同的核酸(以下，也称为“等效核酸”。另外，也将规定等效核酸的碱基序列称为“等效碱基序列”)。作为等效核酸的例子，可举出由以编码本发明的本酶的核酸的碱基序列为基准包含1个或多个碱基的替换、缺失、插入、附加或倒位的碱基序列构成且编码具有本酶特征性的酶活性(即胶原蛋白酶活性)的蛋白质的DNA。碱基的替换、缺失等可以在多个部位产生。此处的“多个”根据该核酸所编码的蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位置、种类而不同，例如为2～40个碱基，优选为2～20个碱基，更优选为2～10个碱基。等效核酸与作为基准的碱基序列(序列号3或序列号4)具有例如90％以上、优选92％以上、更优选94％以上、进一步优选96％以上、更进一步优选约98％以上、最优选99％以上的同源性。
如上所述的等效核酸例如可以通过限制性内切酶处理、利用外切核酸酶或DNA连接酶等的处理、基于定位突变导入法(Molecular Cloning,Third Edition,Chapter 13,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York)、随机突变导入法(MolecularCloning,Third Edition,Chapter 13,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York)导入变异等而得到。另外，也可以通过紫外线照射等其它方法而得到等效核酸。
本发明中，可以使用具有与编码本发明的本酶的基因的碱基序列互补的碱基序列的核酸。本发明的另一方式提供相对于编码本发明的本酶的基因的碱基序列、或者与其互补的碱基序列，具有至少约90％、92％、94％、96％、98％或者99％相同的碱基序列的核酸。
本发明中，也可以使用具有在严格的条件下对与编码本发明的本酶的基因的碱基序列或其等效碱基序列互补的碱基序列进行杂交的碱基序列的核酸。此处的“严格的条件”是指形成所谓的特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。这样的严格的条件是本领域技术人员公知的，例如可以参照Molecular Cloning(Third Edition,ColdSpringHarbor Laboratory Press,New York)、Current protocols in molecularbiology(Frederick M.Ausubel等人著,1987)而设定。作为严格的条件，例如，可举出如下条件：使用杂交液(50％甲酰胺、10×SSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS，10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))在约50℃进行孵育，然后使用0.1×SSC、0.1％ SDS在约65℃进行清洗。作为进一步优选的严格的条件，例如，可举出使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))作为杂交液的条件。
本发明中，可以使用具有编码本发明的本酶的基因的碱基序列或与其互补的碱基序列的一部分的核酸(核酸片段)。这样的核酸片段可以用于对具有编码本发明的本酶的基因的碱基序列的核酸等进行检测、鉴定和/或扩增等。核酸片段例如设计成至少包含与在编码本发明的本酶的基因的碱基序列中连续的核苷酸部分(例如约10个～约100个碱基长度，优选为约20个～约100个碱基长度，进一步优选为约30个～约100个碱基长度)杂交的部分的方式设计。作为探针利用时，可以对核酸片段进行标志化。标志化例如可以使用荧光物质、酶、放射性同位素。
本发明中，可以使用包含上述的基因(编码本酶的基因)的重组DNA。重组DNA例如以载体的形式提供。本说明书中术语“载体”是指能够将插入该载体的核酸输送至细胞等靶内的核酸性分子。
可以根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)、并且考虑宿主细胞的种类而选择适当的载体。作为以大肠杆菌为宿主的载体，可例示M13噬菌体或其变体、λ噬菌体或其变体、pBR322或其变体(pB325、pAT153、pUC8等)等，作为以酵母为宿主的载体，可例示pYepSec1、pMFa、pYES2等，作为以昆虫细胞为宿主的载体，可例示pAc、pVL等，作为以哺乳类细胞为宿主的载体，可例示pCDM8、pMT2PC等。
载体优选为表达载体。“表达载体”是指能够将插入该载体的核酸导入到目标细胞(宿主细胞)内且能够在该细胞内表达的载体。表达载体通常包含对插入的核酸表达所需的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用包含选择标记的表达载体。使用上述表达载体时，可以利用选择标记来确认有无导入表达载体(及其程度)。
核酸向载体的插入、选择标记基因的插入(需要的情况下)、启动子的插入(需要的情况下)等可以使用标准的重组DNA技术(例如，可以参照Molecular Cloning,ThirdEdition,1.84,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York，使用限制性内切酶和DNA连接酶的公知的方法)进行。
作为宿主细胞，从操作的容易性的方面考虑，优选使用大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等微生物，只要是重组DNA能够复制且本酶的基因能够表达的宿主细胞就可以利用。作为大肠杆菌的例子，在利用T7系启动子的情况下，可举出大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，在不利用T7系启动子的情况下，可举出大肠杆菌JM109。另外，作为酿酒酵母的例子，可举出酿酒酵母SHY2、酿酒酵母AH22或酿酒酵母INVSc1(Invitrogen公司)。
本发明中，可以使用保有重组DNA的微生物(即，转化体)。微生物可以通过使用上述载体的转染或转化而得到。例如，可以利用氯化钙法(Journal of Molecular Biology(J.Mol.Biol.)，第53卷，第159页(1970))、Hanahan法(Journal of Molecular Biology，第166卷，第557页(1983))、SEM法(Gene，第96卷，第23页(1990)〕、Chung等人的方法(Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，第86卷，第2172页(1989))、磷酸钙共沉淀法、电穿孔(Potter,H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,7161-7165(1984))、脂转染(Felgner,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,7413-7417(1984))等来实施。应予说明，上述的微生物可以用于生产本发明的本酶。
3.本酶剂的用途
本发明的另一方面涉及本酶剂的用途。作为第1用途，提供胶原三肽(CTP)的制造方法(以下，称为“CTP制造方法”)。本发明的CTP制造方法中，使本酶剂作用于胶原蛋白或明胶(变性胶原蛋白)。例如，将本酶剂添加于胶原蛋白或明胶的溶液中，在例如20～50℃、优选30～40℃的条件下，反应规定时间(例如，1小时～48小时、优选1小时～24小时、更优选1小时～12小时)。通过作为本酶剂的有效成分的胶原蛋白酶进行分解反应，结果生成胶原三肽。制造物中的CTP的组成、比率等会根据所使用的底物(胶原蛋白或明胶)的种类、来源等而变动，但根据本发明的制造方法，可得到含有在N末端具有Gly的三肽(例如，Gly-Pro-Hyp、Gly-Pro-Ala、Gly-Glu-Arg)的组合物，即含有CTP的物质。可以通过单独使用本酶剂而生成CTP也为本发明的特征之一。但也可以并用其它胶原蛋白酶、蛋白酶或肽酶而实现制造效率的提高等。
所使用的胶原蛋白/明胶的来源没有特别限定，作为其例子，可以举出鱼、猪、牛、鸡。也可以使用市售的胶原蛋白或明胶。胶原蛋白或明胶的制备法也没有特别限定。例如，将原料(动物的皮肤、骨、腱或鱼鳞等)水洗并使其干燥后，根据需要使用盐酸等进行脱灰处理，清洗后，通过氢氧化钠、盐酸等的处理而得到粗胶原蛋白。另外，可以通过对粗胶原蛋白进行热处理来提取明胶。
通过本酶剂进行酶反应后，为了实现不溶成分的除去、纯度的提高、或者脱色、除臭等，根据需要进行纯化处理(例如，过滤、离子交换、活性碳处理)。
本酶剂的第2用途为食用肉的品质改良(食用肉的软化等)，优选为含有软骨的食用肉的品质改良或者软骨的分解。如果使用本发明的酶剂，则能够有效地分解软骨，在包含软骨的食用肉的情况下，能够提高口感，另外在包含骨和软骨的食用肉的情况下，能够容易从骨中分离软骨。使酶反应的食用肉只要为包含软骨的食用肉就没有特别限定。术语“食用肉”也以包含食用肉加工品的意思使用。在用本酶剂处理包含软骨的食用肉时，可以通过将食用肉浸渍在酶液(酶剂的溶液)中的方法、进行加压处理使酶液渗透到食用肉中的方法、将酶液注入到食用肉中的方法、将酶液注入到食用肉中进行翻滚(机械浸透酶液的处理)的方法等，使本酶剂作用于食用肉。作用时的温度条件例如为4℃～40，可以为4℃～30℃、4℃～25℃、或者4℃～20℃，或者也可以为10℃～40℃、20℃～40℃、30℃～40、或者35℃～40℃。作用的时间(反应时间)例如为1小时～1天，可以为1小时～12小时、1小时～6小时、1小时～3小时、或者1小时～2小时。
实施例
＜参考例＞
1、胶原蛋白酶生产菌株的筛选
为了找出可用于食品的胶原蛋白酶，首先，作为第1次筛选，从天野酶株式会社的文库中以胶原蛋白酶活性为指标实施筛选，挑选出113种显示高活性的生物安全等级1(BSL1)生产菌。
接着，作为第2次筛选，使挑选出的113种生产菌的培养上清液与明胶反应，评价反应产物中的在N末端具有Gly的肽的含有率，挑选出19种生产菌。总肽量用茚三酮试剂进行定量。另一方面，在N末端具有Gly的肽的量使用胶原蛋白定量试剂盒(Cosmo Bio制)进行定量。
作为第3次筛选，由19种生产菌的培养上清液与明胶反应产物，通过凝胶过滤色谱对三肽进行部分纯化后，通过反相色谱进行分析。将根据分析结果被认为有希望的生产菌的培养上清液进行部分纯化后，对胶原蛋白酶的CTP生成能力进行评价，由此最终挑选出胶原蛋白酶生产菌纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)57413株。
2、57413株的胶原蛋白酶粗酶液的制备和纯化
将57413株在含有明胶的培养基(5％鱼明胶、0.5％酵母提取物、2％NaCl)中以30℃进行2天通气搅拌培养。将得到的培养液进行离心分离后，将上清进行硅藻土过滤而得到粗酶液。进一步利用疏水色谱(Pheny HP,GE Healthcare Life Science公司制)、阴离子交换色谱(DEAE FF,GE Healthcare Life Science公司制)将酶纯化。
3、57413株胶原蛋白酶的基因序列的确认
将57413株在SCD液体培养基中以30℃培养一晚后，利用离心分离回收菌体。使回收的菌体悬浮在TE缓冲液中，使用NucleoSpin(注册商标)Microbial DNA(Takara Bio株式会社制)提取DNA。将提取的DNA作为模板，使用以下的上游和下游引物以及PrimeSTAR(注册商标)Max DNAPolymerase(Takara Bio株式会社制)来实施PCR。对扩增后的PCR产物实施使用与结构基因内外具有同源性的引物的碱基序列解析，由此确认序列。
序列号5的氨基酸序列为来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌57413株的胶原蛋白酶的氨基酸序列(成熟体)。应予说明，将还具有信号肽和前序列的、来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌57413株的胶原蛋白酶的氨基酸序列表示为序列号6。
序列号7的DNA仅编码成熟体的氨基酸序列(序列号5)，序列号8的DNA除了编码成熟体(序列号5的氨基酸序列)以外，还编码了信号肽和前序列。
上游：正向引物:GGAAACAATCTAAATGTGTCT(序列号9)
下游：反向引物:CCGCCTTTAAAGGCTCTCCGA(序列号10)
4、胶原蛋白酶的重组表达
通过将57413株胶原蛋白酶基因导入pColdIII(Takara Bio株式会社制)来构建表达质粒。使用所构建的表达质粒，利用常规方法对大肠杆菌BL21进行转化。将转化体在LB培养基(添加氨苄青霉素)中以37℃培养一晚后，将其培养液以1％容量接种于LB培养基(添加氨苄青霉素)，以37℃培养2小时后，添加IPTG，以15℃培养一晚。利用离心分离从该培养液中回收菌体，利用超声波破碎将菌体破碎后，利用离心分离回收上清液，制成重组粗酶液。通过以下的测定方法来确认该粗酶液的酶活性，结果可知具有胶原蛋白分解活性、Pz-肽分解活性和CTP生成能力。此外，不具有酪蛋白分解活性，特异性作用于胶原蛋白、明胶的可能性极高。
＜Pz-肽分解活性＞
在1mg/mL Pz-肽(Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH,BACHEM制)、20mM CaCl2-200mMTris盐酸盐缓冲液900μL中添加酶液100μL，以37℃开始反应。在反应开始后10分钟和20分钟时取样100μL反应液，添加于25mM柠檬酸液200μL中，由此制成反应终止液。在该反应终止液中添加1mL的乙酸乙酯搅拌10秒后进行离心分离(12000×g 10分钟)，回收上清液的乙酸乙酯层。测定所回收的上清的乙酸乙酯层的320nm的吸光度，由此求出因胶原蛋白酶而游离的Pz-Pro-Leu量。酶活性通过由10分钟后和20分钟后的Pz-Pro-Leu生成量算出每1分钟的Pz-Pro-Leu生成速度而进行评价。将1分钟内分解1μmol Pz-肽的(使1μmol Pz-Pro-Leu游离的)酶量定义为1U。
＜胶原蛋白酶活性＞
胶原蛋白酶活性使用PROTAZYME OL TABLETS(Megazyme公司制)进行测定。一边对使1片OL悬浮于10mM CaCl2-200mM Tris缓冲液的底物溶液进行搅拌，一边分注300μL到1.5mL管中并置于冰上。在分注后的底物溶液中添加混合酶液100μL，用设定为40℃的生物摇床搅拌30分钟，由此使其反应。反应30分钟后，添加2％磷酸三钠溶液1mL，由此使酶反应终止，进行离心分离(13000g,10分钟)。将上清液200μL移至微量滴定板，测定590nm的吸光度。利用在30分钟内上升的590nm值来判断胶原蛋白酶活性的强度。
＜酪蛋白分解活性＞
酪蛋白分解活性使用PROTAZYME AK TABLETS(Megazyme公司制)进行测定。一边对使1片AK悬浮于10mM CaCl2-200mM Tris缓冲液的底物溶液进行搅拌，一边分注300μL到1.5mL管中并置于冰上。在分注后的底物溶液中添加混合酶液100μL，用设定为40℃的生物摇床搅拌30分钟，由此使其反应。反应30分钟后，添加2％磷酸三钠溶液1mL，由此使酶反应终止，进行离心分离(13000g,10分钟)。将上清液200μL移至微量滴定板，测定590nm的吸光度。利用在30分钟内上升的590nm值来判断酪蛋白分解活性的强度。
＜CTP生成能力的确认＞
使梯度稀释后的酶液与明胶(终浓度2％明胶)反应12小时后，煮沸10分钟，由此使反应终止。将该反应终止液用超纯水稀释10倍后，利用Superdexpeptide7.5/300进行凝胶过滤分析，由此确认CTP生成量。凝胶过滤的条件如下。
Superdex_peptide7.5/300
缓冲液：含有0.25M NaCl的0.02M磷酸缓冲液,pH 7
流速：0.28mL/min
进样量：100μL
检测：214nm
系统：AKTA/低温柜
＜实施例＞
1、7128株胶原蛋白酶的酶粉末的制备
通过参考例的“1、胶原蛋白酶生产菌株的筛选”，挑选出胶原蛋白酶生产菌纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)7128株。
在发酵罐(30L容积)中制备20L的含有明胶的培养基(5％鱼明胶、0.5％酵母提取物、2％NaCl)，进行蒸气杀菌，向其中添加在SCD培养基中培养一晩的7128株200mL后，以30℃、搅拌数200rpm、通气量0.5vvm培养36小时。将得到的培养液供于硅藻土过滤而得到粗酶液。将该粗酶液用1％活性炭进行过滤，得到澄清液。将该澄清液供于超滤(馏分分子量6000)，添加4倍量的水进行脱盐浓缩。将其供于硅藻土过滤、膜过滤器过滤(0.45μm)，并使得到的滤液冷冻干燥，将其作为7128株胶原蛋白酶的酶粉末。
2、7128株胶原蛋白酶的序列鉴定
使用基于来自57413株的胶原蛋白酶的序列信息设计的引物来确认基因序列。由基因序列也确定了氨基酸序列。
序列号1的氨基酸序列为来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌7128株的胶原蛋白酶的氨基酸序列(成熟体)。应予说明，将还具有信号肽和前序列的、来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌7128株的胶原蛋白酶的氨基酸序列表示为序列号2。
序列号3的DNA仅编码成熟体的氨基酸序列(序列号1)，序列号4的DNA除了编码成熟体(序列号1的氨基酸序列)以外，还编码了信号肽和前序列。
＜序列号1＞
AEKTPYNVLQMKPIGIEMSKDEMVHSTMAEETLSYEERLEMGDFSQRPAPIMEQMDTQQLQEQYSMAELNNMSNRELIHTLGSIRWYQITDLFQFNDDTKAFYQNEERMQVIINELGNRGSSFTKDDSKGIETFVEVLRSAFYVAFYNNELGYLNERSFQDKCLPALNEIAKNPNFKLGTDEQDKVVSAYGKLIGNASSDVETVQHATNILKQYNENLSTYESENSKGQAIYDIIHGIDYDLQSYLYDTRKEANTTMWYGKIDSFIEEVNNIALIHNVTDSNSWLINNGIYYAGRLGQFHSNPNKGLEVVSQAMHMYPYLSEAYFVAVEQITTNYGGRDLNGNTVDLQKVREEGKKQYLPKTYTFDDGSIVFKTGDQVTEDKIQRLYWAAKEVKAQYHRVIGNDQALEPGNADDILTVVIYNSPDQYRLNRQLYGYETNNGGIYIEETGTFFTYERTPEQSIYSLEELFRHEYTHFLQGRFEVPGLFGTGDMYQNERLTWFQEGNAEFFAGSTRTNDVVPRKSIISGLSHDPSQRYTAEQTMFATYGSWDFYNYSFALQSYMYTHQFDMFDRIQDLIRANDVKNYDAYRDTLSKDSQLNMEYQAYMQQLIDNQETYEVPQVAEDYLMPHEPKALNEVQQEIVDIAHVKDANMTKHQSQFFNTFTLEGTYVGSATQGESQDWKTMSKQVNQMLEQLSQKEWSGYKTMTAYFVNYRVNAANQFEYDVVFHGVSTDDGETQAPIVQVNGPYTGMINEKIQFNSDGSKDTDGEIVSYLWDFGDGATSEAANPTHVYENEGTYKVTLTVKNNKGQESKGQTTATVQKGGQTGQEHAMTIPFNKPIKGSLIENDTNVYQFDITSLEEIDISVVNENQIGMTWVLYHESDKENYVAYGQEDGQTIKGKYNAKPGKYYLYVYKFDDENGTYTVQVQNSTKTEIEPNNRPEEATMLPFHTPLSGSLMEDDHTDVYEFNVTSPKEIDISVLNENQIGMTWVLYHESDSQNYASFGQEDGNMINGKLNAKPGKYYLYVYKFENENGTYTVHVQ
3、7128株胶原蛋白酶的酶性质
(1)最适温度
确认温度对本酶的反应性的影响。采用以Pz-肽为底物的测定法，使反应时的温度从4℃变化到60℃而测定活性。利用将最大活性(活性的最高值)设为100％的相对活性(Relative activity)进行评价。如图1所示，最适温度为40℃附近。
(2)温度稳定性
调查本酶的温度稳定性。对用200mM PIPES缓冲液(pH7.0)将本酶液稀释5倍而得的样品在各温度(4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)下处理30分钟后，通过以Pz-肽为底物的测定法测定活性。利用将活性最高的处理温度下的活性设为100％的相对残余活性(Relative residual activity)进行评价。如图2所示，可知从4℃处理到40℃处理没有活性降低，到40℃为止稳定。
(3)最适pH
调查pH对本酶的反应性的影响。使溶解Pz-肽的缓冲液为200mM的各缓冲液(pH4、5、6使用乙酸缓冲液，pH6、7使用PIPES缓冲液，pH7、8、9使用Tris盐酸缓冲液，pH9、10、11使用甘氨酸缓冲液)，测定活性。利用将最大活性设为100％的相对活性(Relative activity)进行评价。如图3所示，可知最适pH在7附近。
(4)pH稳定性
调查本酶的pH稳定性。将本酶溶液用200mM的各缓冲液(pH4、5、6使用乙酸缓冲液，pH6、7使用PIPES缓冲液，pH7、8、9使用Tris盐酸缓冲液，pH9、10、11使用甘氨酸缓冲液)稀释5倍，在30℃处理60分钟后，通过以Pz-肽为底物的测定法测定活性。利用将活性最高的处理pH下的活性设为100％的相对残余活性(Relative residual activity)进行评价。如图4所示，可知在pH为约6～约9(Tris-HCl)的范围维持了高活性(80％以上)，在该pH区域稳定。
4、7128株胶原蛋白酶的CTP生成能力的确认
使用7128株胶原蛋白酶(本发明的酶)、57413株胶原蛋白酶、和比较用的来自链霉菌(Streptomyces)的胶原蛋白酶，确认胶原三肽的生成。
使梯度稀释后的酶液与最终浓度2％的鱼明胶或者最终浓度2％的牛骨明胶)在40℃反应12小时后，煮沸10分钟使反应终止。将该反应终止液用超纯水稀释10倍后，利用Superdexpeptide7.5/300进行凝胶过滤分析来确认CTP生成量。凝胶过滤的条件如下。
Superdex_peptide7.5/300
缓冲液：含有0.25M NaCl的0.02M磷酸缓冲液,pH 7
流速：0.28mL/min
进样量：100μL
检测：214nm
系统：AKTA/低温柜
将结果示于图5～图8。
发现本发明的酶展现出Gly-Pro-Hyp、Gly-Pro-Ala、Gly-Glu-Arg的生成能力。发现特别是Gly-Glu-Arg的生成能力优异。
5、7128株胶原蛋白酶的鸡软骨分解能力
在切成5mm见方的鸡胸软骨0.44g中添加8mg/mL的酶溶液5mL，在37℃进行1.5小时振荡处理。将处理样品用纱布过滤并回收残渣。将残渣用纯化水清洗后，在室温下放置一晩使其干燥。测定干燥残渣的重量。作为空白试验，使用纯化水代替酶溶液同样地实施。作为比较对象，使用来自57413株的胶原蛋白酶和作为市售嫩肉剂的“SUJIMADEYAWARAKASYOKUNIN”(KITII株式会社)同样地实施。按照下式算出软骨分解度。
软骨分解度(％)＝(空白试验的干燥残渣的重量－酶处理干燥残渣的重量)÷空白试验的干燥残渣的重量×100
＜结果＞
将结果示于图9。
本发明的来自7128株的胶原蛋白酶展现出优异的软骨分解能力。
产业上的可利用性
本发明的酶剂以来自安全性高的微生物的胶原蛋白酶为有效成分。因此，适合用在食品、医疗用途的领域中，产业上的利用价值高。
本发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明任何限定。在不脱离专利请求的范围的记载的情况下本领域技术人员可以容易想到的范围内的各种变形方式也包含于本发明中。本说明书中明示的论文、日本公开专利公报和日本专利公报等内容的全部内容通过援引而引用。
序列表自由文本
序列号9：人工序列的说明：正向引物
序列号10：人工序列的说明：反向引物。

Claims (10)

1.一种用于制造胶原三肽的酶剂，以由序列号1的氨基酸序列或者与其等效的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶为有效成分。
2.根据权利要求1所述的酶剂，其中，由等效的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶为与序列号1的氨基酸序列具有90％以上的同源性、且由牛骨明胶生成Gly-Glu-Arg的能力与由序列号1的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶同等的胶原蛋白酶。
3.根据权利要求1或2所述的酶剂，其中，胶原蛋白酶来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌。
4.一种用于制造胶原三肽的酶剂，以来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌且具有以下理化性质的胶原蛋白酶为有效成分，
(1)最适温度：40℃附近，
(2)温度稳定性：将活性最高的处理温度下的活性设为100％，相对残余活性在4℃～40℃为80％以上，在50℃为10％以下，
(3)最适pH：最适pH在7附近，
(4)pH稳定性：将活性最高的处理pH下的活性设为100％，相对残余活性在pH为6～8的范围为80％以上，在pH5为10％以下。
5.一种用于软化食用肉和/或分解软骨的酶剂，以由序列号1的氨基酸序列或者与其等效的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶为有效成分。
6.根据权利要求5所述的酶剂，其中，由等效的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶为与序列号1的氨基酸序列具有90％以上的同源性、且鸡软骨分解能力与由序列号1的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶同等的胶原蛋白酶。
7.根据权利要求5或6所述的酶剂，其中，胶原蛋白酶来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌。
8.一种用于软化食用肉和/或分解软骨的酶剂，以来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌且具有以下理化性质的胶原蛋白酶为有效成分，
(1)最适温度：40℃附近，
(2)温度稳定性：将活性最高的处理温度下的活性设为100％，相对残余活性在4℃～40℃为80％以上，在50℃为10％以下，
(3)最适pH：最适pH在7附近，
(4)pH稳定性：将活性最高的处理pH下的活性设为100％，相对残余活性在pH为6～8的范围为80％以上，在pH5为10％以下。
9.一种胶原三肽的制造方法，其特征在于，使权利要求1～4中任一项所述的酶剂作用于胶原蛋白或明胶。
10.一种软化食用肉和/或分解软骨的方法，其特征在于，使权利要求5～8中任一项所述的酶剂作用于食用肉和/或软骨。
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