CN102796190A

CN102796190A - 从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方法

Info

Publication number: CN102796190A
Application number: CN2012102608667A
Authority: CN
Inventors: 马美湖; 武小芬; 邱宁; 黄西
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-07-26
Filing date: 2012-07-26
Publication date: 2012-11-28

Abstract

本发明公开了一种从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方法，通过硫酸铵分级沉淀蛋白质，然后采用DEAE-Toyopearl650M阴离子交换层析进行分离。本发明获得的核黄素结合蛋白纯度高，回收率较好，通过分级沉淀，能去除蛋清中几乎所有的卵黏蛋白及部分卵白蛋白和卵转铁蛋白，降低了蛋清粘度，从而使后续的阴离子交换层析仅需采用一种层析填料即可获得高纯度的核黄素结合蛋白，无需更换填料，提高了填料的利用率，同时还简化了操作步骤，缩短了提取时间。

Description

从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方法

技术领域

本发明涉及蛋白质分离纯化技术领域，具体涉及一种从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方法。

背景技术

研究发现鸡蛋中含有大量生物活性成分，如卵转铁蛋白、免疫球蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶等。核黄素结合蛋白(riboflavin binding protein，RBP)又叫卵黄素蛋白或核黄素转运蛋白，可结合和转运核黄素（维生素B2），在鸡胚胎发育过程中发挥着重要的作用。此外，核黄素结合蛋白还具有多种生理功能，如作为毛细管电泳和高效液相色谱手性选择物、甜味和苦味抑制剂、储存和转运铜离子等。因此，核黄素结合蛋白在食品和医药行业具有广阔的应用前景。

1958年Rhodes等采用DEAE-Cellulose和CM-Cellulose离子交换层析第一次从蛋清中分离获得核黄素结合蛋白。此后多种方法应用于蛋清核黄素结合蛋白的分离纯化，如Miller等采用盐沉淀和多步离子交换层析从蛋清中分离该蛋白；Piskarev等人采用盐沉淀和有机溶剂沉淀进行粗提，阳离子交换（TSK SP-5P）高效液相色谱制备获得核黄素结合蛋白；李永茂等采用DE-32纤维素离子交换层析、CM-Sephadex C-25阳离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤也从蛋清中纯化获得了该蛋白。但这些工艺均需采用多步层析，在各步层析之间需要更换缓冲液或对溶液进行浓缩，操作复杂，工艺耗时漫长，可达3~5天。此外，在分离过程中，每一步骤的操作都将不可避免地导致目标蛋白不同程度的损失，由于操作步骤繁多，因此产品得率很低，一般仅为30%以下。

蛋清因含卵粘蛋白使其具有较高粘度，直接进行离子交换层析会影响填料的使用寿命与分离效果，而核黄素结合蛋白仅占蛋清蛋白质的0.8%，因此必须采用适当的工艺对鸡蛋清进行前处理和初步分离，才能使一步层析纯化核黄素结合蛋白成为可能。

发明内容

本发明针对目前核黄素结合蛋白分离纯化中存在的问题，采用硫酸铵盐析技术对鸡蛋清溶液进行处理，获得富含核黄素结合蛋白的组分，并进一步使用阴离子交换层析技术对其进行纯化，从而实现了核黄素结合蛋白的提取。具体技术方案如下：

一种从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）蛋清预处理：向蛋清稀释液中添加核黄素，使核黄素浓度达到3-3.5μg/g，得到饱和核黄素的蛋清稀释液；

（2）提取核黄素结合蛋白：向饱和核黄素的蛋清稀释液中，加入硫酸铵使其饱和度为55%，搅拌后离心，得到上清液，向上清液中继续添加硫酸铵使其饱和度为85%，搅拌后离心，得到沉淀，将沉淀用少量水溶解，用水透析后冷冻干燥，即为核黄素结合蛋白粗品；

（3）分离纯化：将核黄素结合蛋白粗品用pH值为6.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液配制成浓度20mg/mL，用DEAE-Toyopearl色谱柱分离，用含0.25mol/L 氯化钠的pH值为6.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液洗脱，洗脱液用蒸馏水透析后冷冻干燥获得成品。

所述蛋清稀释液是将鸡蛋清与等体积水组成。

本发明的有益效果是：

1、本发明采用硫酸铵盐析法提取核黄素结合蛋白，通过分级沉淀，能去除蛋清中几乎所有的卵黏蛋白及部分卵白蛋白和卵转铁蛋白，降低了蛋清粘度，从而使后续的阴离子交换层析仅需采用一种层析填料即可获得高纯度的核黄素结合蛋白，无需更换填料，提高了填料的利用率，同时还简化了操作步骤，缩短了提取时间；

2、本发明提取的核黄素结合蛋白产品纯度高，回收率好。

附图说明

图1为不同饱和度(NH₄)₂SO₄对核黄素结合蛋白盐析效果的影响试验结果图；

图2 为不同PH值的磷酸钠缓冲液离子交换层析图谱；

图3为不同PH值的磷酸钠缓冲液层析后各洗脱峰样品的的SDS-PAGE电泳图；

图4为不同浓度的磷酸钠缓冲液离子交换层析图谱；

图5为不同浓度的磷酸钠缓冲液层析后各洗脱峰的SDS-PAGE电泳图；

图6为不同浓度NaCl洗脱对核黄素结合蛋白纯化效果的影响；

图7为不同上样量对核黄素结合蛋白纯化回收率和纯度影响试验结果图；

图8为核黄素结合蛋白样品（A）和其标准品（B）的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

实施例1

1、蛋清预处理：

（1）将新鲜的鸡蛋打蛋，使用蛋黄分离器分离蛋清和蛋黄，收集蛋清；

（2）取500g蛋清，边搅拌边向蛋清中加入等体积的蒸馏水稀释；.

（3）添加浓度为25μg/mL核黄素溶液125mL使核黄素结合蛋白结合核黄素达饱和状态，磁力搅拌30min，得到饱和核黄素的蛋清稀释液。

2、提取核黄素结合蛋白：

向饱和核黄素的蛋清稀释液中分别添加(NH₄)₂SO₄至饱和度为40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%，搅拌1h，4℃、10000 r/min离心30min。将沉淀用蒸馏水溶解后透析24h（更换4次透析水），定容至1250mL，以相同条件离心，取上清液于455nm处测吸光值，以蒸馏水为空白，结果如图1所示。

由图1可知，核黄素结合蛋白主要存在于55%~85%的(NH₄)₂SO₄沉淀中，因此通过55%/85%两步盐析可以较大程度地保留核黄素结合蛋白，同时去除大部分的卵白蛋白、卵转铁蛋白和几乎所有的卵粘蛋白，利于后续试验的顺利开展。

3、分离纯化：

DEAE-Toyopearl 650M（70mL）预先用磷酸钠缓冲液平衡。取一定质量盐析冻干粗品，用pH值为6.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液配制成浓度20mg/mL，采用恒流泵注入200mL于离子交换柱（1.6cm×40cm）中。磷酸钠缓冲液冲洗去除与填料未结合的蛋白，至280nm处吸光值基线趋于平稳，再用含0.25mol/L 氯化钠的pH值为6.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液洗脱，最后用含1mol/L NaCl的磷酸钠缓冲液进行填料再生，流速均为1mL/min。收集洗脱峰对应洗脱液，蒸馏水透析24h（更换4次透析水）后，冷冻干燥获得核黄素结合蛋白。

实施例2 阴离子交换层析纯化条件的确定

1、缓冲液pH：0.05mol/L 磷酸钠缓冲液，pH值分别为4.5、5.5和6.5，上样量50mL。不同pH层析效果如图2所示，各洗脱峰对应的电泳条带如图3所示。由图3可知，A-a、B-a和C-a样品的分子量在35 kDa~80 kDa之间，主要为卵转铁蛋白和卵清蛋白；A-b、B-b和C-b样品的分子量约为38 kDa，应为卵清蛋白；A-c、B-c和C-c样品的分子量约为28 kDa，与核黄素结合蛋白的一致，为目标蛋白。由上分析可知，pH4.5、5.5、6.5图中峰a、b主要为卵转铁蛋白(OTf)和卵白蛋白(OVA)、峰c为核黄素结合蛋白。根据层析图峰型分析得出，随pH升高，峰b面积逐渐减小，峰c面积增加，说明随pH升高，填料对OTf和OVA结合能力减弱，对核黄素结合蛋白结合能力增强。据Becvar等人报道，通过测定核黄素饱和核黄素结合蛋白（Holo-RBP）在276nm和455nm吸光度的比值(A276/A455)可判定Holo-RBP样品的相对纯度，比值越小表明样品纯度越高，对A、B、C图中峰c对应的洗脱液进行紫外扫描测得A276/A455比值分别为6.74、7.03和5.17，可知缓冲液pH值为6.5时，样品纯度最高，故缓冲液pH值选择6.5为宜。

2、缓冲液浓度：磷酸钠缓冲液浓度分别为0.05mol/L和0.1mol/L，上样量50mL。图4中A、B分别为0.05mol/L、0.1mol/L磷酸钠缓冲液离子交换层析图谱，由图可知，采用0.05mol/L缓冲液时出现了两个洗脱峰A-b和A-c，而采用0.1mol/L缓冲液时仅有一个洗脱峰B-c。对各峰样品进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图5所示。由图分析可知，峰A-c和B-c分子量约28 kDa，与核黄素结合蛋白分子量一致，且两个样品均显示为单一条带，表明纯度均较高。进一步A-c和B-c样品溶液进行紫外扫描，得A₂₇₆/A₄₅₅比值分别为5.26和4.84，说明采用0.1mol/L缓冲液层析分离获得样品的纯度较高。以上结果表明，采用0.1mol/L缓冲液冲洗时，分离的核黄素结合蛋白纯度更高，且高浓度的缓冲液具有较高的缓冲能力，可减少平衡所需要的时间。因此，缓冲液浓度以选择0.1mol/L为宜。

3、NaCl洗脱液浓度：上样量均为50mL，分别采用0.05mol/L、0.10mol/L、0.15mol/L、0.20mol/L、0.25mol/L、0.30mol/L NaCl进行洗脱。对不同浓度NaCl洗脱层析图谱和目标洗脱峰溶液进行分析，计算目标洗脱峰的峰面积并计算其溶液的A₂₇₆/A₄₅₅比值，结果如图6所示：随着NaCl浓度升高，洗脱获得样品量增加，当浓度上升至0.25mol/L时洗脱峰面积不再变化。此外，随着NaCl浓度升高，洗脱获得样品A₂₇₆/A₄₅₅比值呈下降趋势，说明高浓度盐洗脱获得产物的纯度较高，可能是由于使用低浓度NaCl可将少量杂蛋白全部洗脱下来，却只能洗脱部分核黄素结合蛋白，导致分离获得样品中核黄素结合蛋白的相对含量降低，从而导致其纯度降低。当NaCl浓度达0.25mol/L时，样品纯度和峰面积基本不再发生变化。因此，NaCl洗脱浓度以选择0.25mol/L为宜。

4、上样量：分别设置上样量为50mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL，对不同上样量下的洗脱层析图谱和目标洗脱峰溶液进行分析，计算目标洗脱峰的峰面积并计算其溶液的A₂₇₆/A₄₅₅比值，结果如图7所示。由图分析可知，上样量≤200mL，产品回收率基本处于55%左右，当上样量＞200mL，样品回收率快速下降，说明随着上样量的增加，填料对核黄素结合蛋白结合效率下降。此外，上样量≤200mL，A₂₇₆/A₄₅₅比值稍有升高，当上样量＞200mL，A₂₇₆/A₄₅₅比值也急剧增大，说明样品的纯度降低。因此，上样量以选择200mL为宜。

5、SDS-聚丙酰胺凝胶电泳鉴定：浓缩胶浓度5%，分离胶浓度12%。样品(2mg/mL)溶于上样缓冲液，上样量10μL，浓缩胶电泳恒压80V，分离胶电泳恒压120V。凝胶用50%乙醇和10%冰醋酸固定30min，0.1%考马斯亮蓝R-250染色30min，温度40℃，25% 乙醇和8%冰醋酸混合液进行脱色。

实施例3 核黄素结合蛋白纯度测定及回收率计算

1、蛋白质产品纯度测定

核黄素结合蛋白样品和标准品浓度均为1mg/mL，色谱柱为赛分SRT SEC-300柱(4.6mm×300mm，5μm)，柱温25℃，流动相为0.15mol/L磷酸钠pH 7.0缓冲液，流速0.4mL/min，进样量10μL，运行时间15min，检测波长280nm。结果如图8所示。其中A为本试验分离获得的核黄素结合蛋白样品的高效液相色谱图，B为核黄素结合蛋白标准品的高效液相色谱图，由图可知，样品与标准品保留时间一致，进一步说明了获得的蛋白确为核黄素结合蛋白。进一步由软件对峰面积进行积分，根据峰面积比对核黄素结合蛋白产品纯度进行定量计算，计算结果为95.32%。

2、蛋白质产品中的蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白含量。分离获得的蛋白产品中的蛋白含量测定结果为42.99%。

3、回收率计算

根据从100 g鸡蛋清中纯化所得核黄素结合蛋白的质量、蛋白含量和纯度，使用以下公式计算所得的各个蛋白质的回收率，

Figure 2012102608667100002DEST_PATH_IMAGE001

。

100g蛋清分离获得核黄素结合蛋白的样品干重为112mg，样品蛋白含量为42.99%，蛋白纯度为95.32%，因此计算获得纯核黄素结合蛋白质量为45.89 mg；蛋清中蛋白质理论含量约为10%，核黄素结合蛋白占蛋清蛋白质0.8%，因此100g蛋清中总核黄素结合蛋白含量为80 mg，计算可得核黄素结合蛋白回收率高达57.36%。

综上所示，采用本发明所述的从鸡蛋清中高效提取多种蛋白质的方法，获得了较好的回收率，产品纯度高。

Claims

1.一种从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）蛋清预处理：向蛋清稀释液中加入核黄素，使核黄素浓度为3-3.5μg/g，得到饱和核黄素的蛋清稀释液；

（2）提取核黄素结合蛋白：向饱和核黄素的蛋清稀释液中加入硫酸铵，使硫酸铵饱和度为55%，搅拌后离心，得到上清液，向上清液中继续添加硫酸铵，使硫酸铵饱和度为85%，搅拌后离心，得到沉淀，将沉淀用少量水溶解，透析后冷冻干燥，即为核黄素结合蛋白粗品；

（3）分离纯化：将核黄素结合蛋白粗品用pH值为6.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液配制成浓度为20mg/mL，用DEAE-Toyopearl色谱柱分离，用含0.25mol/L 氯化钠的pH值为6.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液洗脱，洗脱液用蒸馏水透析后冷冻干燥获得成品。

2.如权利要求1所述的从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方法，其特征在于，所述蛋清稀释液是由鸡蛋清与等体积水组成。