CN1658940A - 细胞分离组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于细胞分离的组合物和方法。这些试剂和技术通过表面抗原识别特别地凝集细胞,并可用来以高产率回收更稀有的细胞类型。
Description
技术领域
本发明涉及分离细胞的组合物和方法。
背景
许多常规的血细胞分离过程包括通过密度梯度沉降初步大量分离红细胞和粒细胞组分。密度梯度分离取决于不同细胞类型的密度的细微差别,这种差别使它们在可变密度的流体介质中以不同的水平分离。细胞类型之间密度的差别可以是微小的,各个细胞类型在大小和密度上都可能不同。因此,特定的细胞类型分散在整个密度梯度介质中而不是精确分离在该密度介质的不连续区域中。这种现象会导致所需细胞的回收差和/或被不需要的细胞类型污染。在富集稀有血细胞类型如造血祖细胞的过程中,密度梯度沉降通常导致低产率。例如,据报道用常规的密度梯度法从脐带血中分离祖细胞(如CD34+造血干细胞)导致所需干细胞的显著损失。参见,Wagner,J.E.,Am J Ped Hematol Oncol 15:169(1993)。另一个例子报道,用常规的密度梯度法来分离淋巴细胞导致特定的淋巴细胞子集的选择性丧失。参见Collins,D.P.,J Immunol Methods 243:125(2000)。
增加稀有细胞类型从供体组织中的回收可戏剧性地提高移植和免疫治疗(如骨髓移植、基于干细胞的基因治疗和免疫细胞治疗)的成功率,其成功率显然与用来治疗的细胞的实际数目有关。
概述
本发明提供了分离细胞的组合物和方法。所述组合物和方法可用于,例如,有效制备供组织培养、免疫表型鉴定、其它诊断试验以及纯化和治疗施用的细胞。
本发明的方法包括含有血细胞的样品(如外周血样品、脐带样品和骨髓样品)与细胞分离组合物接触。不局限于特定的机制,本发明的组合物可通过与细胞表面抗原反应和/或通过刺激细胞-细胞粘着(例如通过增加细胞表面粘着因子的表达)相互作用可选择性地凝集细胞。被凝集的细胞从未凝集的细胞中分开,后者仍然留在溶液中。可从凝集相或上清液相中回收细胞。
所述组合物和方法可用来分离或富集各种细胞类型,例如包括T淋巴细胞、T辅助细胞、T抑制细胞、B细胞、造血干细胞、循环胚胎干细胞、母体循环中的循环胎细胞以及循环转移性肿瘤细胞。所述组合物和方法可用于异基因和自体移植。在自体移植中,所述组合物和方法可用来,例如,从患者血液或骨髓中除去不需要的细胞,如转移性癌细胞。然后将需要的细胞(如造血干细胞)返回患者,其中没有或基本上没有对生命造成威胁的肿瘤细胞。所述组合物和方法可用于任何哺乳动物的细胞,包括人类、非人灵长类、啮齿类、猪、牛和马。
细胞分离组合物可含有葡聚糖、抗血型糖蛋白A抗体,以及抗细胞表面抗原如CD9、CD15、CD2、CD3、CD4、CD8、CD72、CD16、CD41a、I型HLA、HLA-DR、CD29、CD11a、CD11b、CD11c、CD19、CD20、CD23、CD39、CD40、CD43、CD44、CDw49d、CD53、CD54、CD62L、CD63、CD66、CD67、CD81、CD82、CD99、CD100、Leu-13、TPA-1或表面Ig的抗体,以及它们的组合。细胞分离组合物可含有抗其它细胞类型的表面抗原(如肿瘤细胞的细胞表面蛋白质)的抗体。
抗细胞表面抗原的抗体可以可溶或基质结合的形式,或以这两种形式存在于细胞分离组合物中。抗体可与基质结合,基质如胶乳微粒、酸蚀玻璃颗粒、聚集的多肽、多糖、抗生物素蛋白颗粒或生物素化的琼脂糖凝胶颗粒。细胞分离组合物中的抗体可以是单克隆的,并且可以是IgM或IgG抗体。在一些实施方案中,细胞分离物包括抗人的抗体。细胞分离组合物中可溶性抗体的浓度约为0.1mg/l-15mg/l。基质结合的抗体在细胞分离组合物中的浓度可约为0.1-50.0×109颗粒/升。
细胞分离组合物可含有肝素、二价阳离子(如Ca+2、Mg+2),和磷酸缓冲盐溶液。一些实施方案中,组合物的pH在6.8-7.8之间(如在7.2-7.4之间)。
本发明还提供了含有细胞分离组合物成分和包装物质的试剂盒。试剂盒包括血液收集容器如血袋或真空管。
除非另有说明,这里使用的所有技术和科学术语与精通本发明所属领域的技术人员的一般理解有着一样的含义。尽管与这里所述方法和材料类似或等价的方法和材料可用来实践本发明,下面描述了合适的方法和材料。在此全文并入这里提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料以供参考。如发生冲突,以本说明书(包括定义)为准。此外,所述材料、方法仅是为了阐述而不是限制。
从以下详细描述和权利要求中可显见本发明的其它特征和优点。
详细描述
本发明以分离细胞的组合物和方法为特征。本发明的组合物可用来从含有血细胞的样品中选择性凝集细胞。不局限于特定机制,本发明的组合物可通过与细胞表面抗原相互作用和/或通过刺激细胞表面粘着因子如LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1、CD11a/CD18)和ICAM-1(胞间粘着分子-1,CD54)的表达凝集细胞。被凝集的细胞从未凝集的细胞中分开,后者仍然留在溶液中。可从凝集相或上清液相中回收细胞。
细胞分离组合物
本发明的细胞分离组合物可含有葡聚糖和一种或多种抗细胞表面抗原的抗体(即对细胞表面抗原有特异性结合亲和性)。
葡聚糖是一种主要以α(1-6)模式连接的葡萄糖单元构成的多糖。葡聚糖可造成红细胞的堆积(即红细胞钱串形成),因此有助于从溶液中除去红系细胞。抗细胞表面抗原的抗体有助于通过同型凝集(即相同细胞类型的细胞的凝集)和/或异型凝集(即不同细胞类型的细胞的凝集)从溶液中除去血细胞。
细胞分离组合物可含有抗血细胞表面抗原的抗体,所述表面抗原包括,例如,血型糖蛋白A、CD15、CD9、CD2、CD3、CD4、CD8、CD72、CD16、CD41a、I型HLA、HLA-DR、CD29、CD11a、CD11b、CD11c、CD19、CD20、CD23、CD39、CD40、CD43、CD44、CDw49d、CD53、CD54、CD62L、CD63、CD66、CD67、CD81、CD82、CD99、CD100、Leu-13、TPA-1、表面Ig,以及它们的组合。因此,可制成细胞分离组合物来选择性凝集特定的血细胞类型。
一些实施方案中,细胞分离组合物包括抗血型糖蛋白A抗体。抗血型糖蛋白A抗体有助于通过至少两种机制从溶液中除去红细胞。首先,抗血型糖蛋白A抗体可造成红细胞的同型凝集,因为血型糖蛋白A是红细胞上主要的表面血型糖蛋白。此外,抗血型糖蛋白A抗体还能稳定葡聚糖介导的红细胞钱串的形成。示例性的单克隆抗血型糖蛋白A抗体包括但不限于107FMN(鼠IgG1同种型)、YTH89.1(大鼠IgG2B同种型)和E4(鼠IgM同种型)。例如参见Vanderlaan等,Molecular Immunology20:1353(1983);Telen M.J.和Bolk,T.A.,Transfusion 27:309(1987);以及OutramS.等,Leukocyte Research.12:651(1988)。
一些实施方案中,细胞分离组合物包括抗CD15抗体。抗CD15抗体可通过交联存在于粒细胞表面的CD15分子造成粒细胞的同型凝集。抗CD15抗体还可通过刺激粘着分子(如L-选择蛋白和β-2整联蛋白)在粒细胞表面的表达使粒细胞与单核细胞、NK细胞和B细胞的同型和异型凝集,所述粒细胞与单核细胞、NK细胞和B细胞上的粘着分子相互作用。这些细胞类型的异型凝集有助于连同红细胞组分一起从溶液中除去这些细胞。单克隆抗CD15抗体的例子包括但不限于AHN1.1(鼠IgM同种型)、FMC-10(鼠IgM同种型)、BU-28(鼠IgM同种型)、MEM-157(鼠IgM同种型)、MEM-158(鼠IgM同种型)、MEM-167(鼠IgM同种型)。例如参见
Leukocyte typing IV(1989);
Leukocyte typing II(1984);
Leukocyte typing VI(1995);Solter D.等,Proceedings of National Academy of Sciences USA 75:5565(1978);KannagiR.等,Journal of Biological Chemistry 257:14865(1982);Magnani,J.L.等,Archives of Biochemistry and Biophysics 233:501(1984);Eggens I.等,Journalof Biological Chemistry 264:9476(1989)。
一些实施方案中,细胞分离组合物含有抗CD9抗体。抗CD9抗体可造成血小板的同型凝集。抗CD9抗体还可通过附着到粒细胞和单核细胞表面的血小板造成粒细胞和单核细胞的异型凝集。CD9抗体可促进血小板选择蛋白的表达,这种蛋白质有助于血小板与白细胞表面的结合。因此,抗CD9抗体可促进多细胞-细胞连锁,因此有助于凝集以及从溶液中除去。单克隆抗CD9抗体的例子包括但不限于MEM-61(鼠IgG1同种型)、MEM-62(鼠IgG1同种型)、MEM-192(鼠IgM同种型)、FMC-8(鼠IgG2a同种型)、SN4(鼠IgG1同种型)、BU-16(鼠IgG2a同种型)。例如参见
Leukocyte typing VI(1995);
Leukocyte typing II(1984);Von dem Bourne A.E.G.Kr.和Moderman P.N.(1989),见
Leukocyte typing IV(W.Knapp等编),989-92页,牛津大学出版社,牛津;Jennings,L.K.等,见
Leukocyte typing V,S.F.Schlossmann等编,1249-51页,牛津大学出版社,牛津(1995);Lanza F.等,Journal ofBiological Chemistry 266:10638(1991);Wright等,Immunology Today15:588(1994);Rubinstein E.等,Seminars in Thrombosis and Hemostasis21:10(1995)。
一些实施方案中,细胞分离组合物含有抗CD41的抗体,CD41可选择性凝集血小板。一些实施方案中,细胞分离组合物含有抗CD3的抗体,CD3可选择性凝集T细胞。一些实施方案中,细胞分离组合物含有抗CD2的抗体,CD2可选择性凝集T细胞和NK细胞。一些实施方案中,细胞分离组合物含有抗CD72的抗体,CD72可选择性凝集B细胞。一些实施方案中,细胞分离组合物含有抗CD16的抗体,CD16可选择性凝集NK细胞和嗜中性粒细胞。
如上所述,可制成细胞分离组合物以选择性凝集特定的血细胞。如一个实施例,一种含有抗血型糖蛋白A、CD15和CD9抗体的细胞分离组合物有助于红细胞、粒细胞、NK细胞、B细胞和血小板的凝集。然后可从溶液中回收T细胞、NK细胞和稀有的祖细胞。如果所述制剂还含有抗CD3的抗体,则可凝集T细胞,并可从溶液中回收NK细胞和稀有的前体细胞。
细胞分离组合物可含有抗其它细胞类型的表面抗原(如肿瘤细胞的细胞表面蛋白)的抗体。那些精通此领域的技术人员可用常规的方法来制备抗细胞表面抗原的抗体,这些抗原来自人类和其它哺乳动物,例如包括非人灵长类、啮齿类(如小鼠、大鼠、仓鼠、兔和豚鼠)、猪、牛和马的血液和其它细胞。
通常,用于所述组合物的抗体是单克隆抗体,单克隆抗体是针对抗原内特定表位的同源的抗体群体。合适的单克隆抗体可商业上获得,或者可用标准杂交瘤技术制备。特别地,单克隆抗体可通过连续细胞系培养来生产抗体分子的技术获得,这些技术包括Kohler,G.等在Nature,1975,256:495中所述的技术,人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等,Immunology Today 4:72(1983);Cole等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2026(1983)),以及EBV-杂交瘤技术(Cole等,《单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)》,AlanR.Liss,Inc.,77-96页(1983))。
抗体可以是任何免疫球蛋白类,包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。IgG和IgM同种型的抗体在本发明的细胞分离组合物中特别有效。与IgG抗体相比,五聚体的IgM抗体含有更多的抗原结合位点,因此在一些情况下(如抗血型糖蛋白A和抗CD15)是特别有效的细胞分离试剂。其它情况下(如抗CD9抗体),IgG同种型的抗体对于刺激同型和/或异型凝集特别有效。
抗细胞表面抗原的抗体可以液相(即可溶的)提供。液相抗体通常以约0.1-15mg/l(例如,在0.25-10、0.25-1、0.5-2、1-2、4-8、5-10mg/l之间)的浓度在细胞分离组合物中提供。
抗细胞表面抗原的抗体还可以与固相关联(即基质结合)的形式提供。抗不同细胞表面抗原的抗体可与固相共价连接以促进细胞表面分子的交联和细胞表面粘着分子的活化。使用基质结合的抗体有助于细胞分离(例如,依靠颗粒有助于凝集的细胞的物质,或依靠有助于纯化的特性)。
一些实施方案中,具有基质结合的抗体的固相是颗粒。一些实施方案中,抗体结合到胶乳微粒,如顺磁珠(例如通过生物素-抗生物素蛋白连接、共价连接到聚苯乙烯珠上的COO基团,或共价连接到经过修饰的珠上的NH2基团)。一些实施方案中,抗体结合到酸蚀刻的玻璃颗粒(例如通过生物素-抗生物素蛋白连接)。一些实施方案中,抗体结合到聚集的多肽上,如聚集的牛血清白蛋白(例如通过生物素-抗生物素蛋白连接,或共价连接到多肽COO基团或NH2基团)。一些实施方案中,抗体是共价连接到多糖如高分子量(例如>1,000,000Mr)葡聚糖硫酸盐。一些实施方案中,生物素化的抗体连接到抗生物素蛋白颗粒,产生每个抗生物素蛋白分子具有四个抗体分子的四聚体复合物。一些实施方案中,抗体通过生物素-抗生物素蛋白-生物素化的抗体连接结合到生物素化的琼脂糖凝胶颗粒(One Cell Systems,坎布里奇,马萨诸塞州,美国)。这种颗粒的大小通常约有300-500微米,并可在超声水浴或迅速混合的水浴中产生。
细胞-基质颗粒(即包括细胞和基质结合的抗体的颗粒)可作为凝集物从溶液中沉降。细胞-基质颗粒还可从溶液中除去,例如当颗粒是顺磁珠时通过采用磁场。基质结合的抗体通常以约0.1-50.0×109颗粒/升(例如在0.25-10.0×109、1-20.0×109、2-10.0×109、0.5-2×109、2-5×109、5-10×109和10-30×109颗粒/升之间)的浓度在细胞分离组合物中提供,这里的颗粒是指其上结合有抗体的固相颗粒。
细胞分离组合物还可含有二价阳离子(例如Ca+2、Mg+2)。例如,二价阳离子可以平衡的盐溶液(例如Hank氏平衡盐溶液)提供。据报道Ca+2离子对于选择蛋白介导的和整联蛋白介导的细胞-细胞附着是重要的。
本发明的细胞分离组合物还含有抗凝血剂,如肝素。肝素可防止凝血和高钙环境下与凝血有关的非特异性细胞损失。肝素还促进血小板凝集。凝集的血小板可附着在粒细胞和单核细胞上,因此较单个血小板的凝集更可促进异型凝集。肝素可作为肝素盐(如肝素钠、肝素锂或肝素钾)提供。
细胞分离法
例如,所述组合物可用来有效制备细胞以进行组织培养、免疫表型鉴定、其它诊断试验、进一步纯化和治疗施用。不局限于特定机制,本发明的组合物可通过与细胞表面抗原西相互作用和/或通过刺激细胞-细胞粘着(例如通过增加细胞表面粘着因子的表达)选择性地凝集细胞。被凝集的细胞从未凝集的细胞中分开,后者仍然留在溶液中。
凝集后,可从溶液相中回收未凝集的细胞。还可从凝集物中回收细胞。例如可通过将细胞转移到含有二价阳离子螯合物如EDTA或EGTA的缓冲液中来分离凝集的细胞。可用抗细胞表面抗原的抗体进一步分离从凝集物中回收的细胞。可将凝集物加热至仅仅高于熔点的温度以从凝胶微粒-抗体-细胞凝集物中回收细胞。
所述组合物可用来从各种样品中分离细胞,样品包括外周血(例如通过静脉穿刺获得的)、脐带血(例如在产后获得的)和骨髓(例如来自抽吸物)。含有血细胞的样品可与细胞分离组合物接触以使特定类型的细胞凝集。例如,用含有针对这些细胞的表面抗原的抗体的细胞分离组合物可选择性凝集红细胞和分化的骨髓血组分。所述组合物和方法可用来分离和富集各种细胞类型,例如包括T淋巴细胞、T辅助细胞、T抑制细胞、B细胞、造血干细胞、循环胚胎干细胞、母体循环中的循环胎细胞以及循环转移性肿瘤细胞。所述组合物可用来凝集任何哺乳动物的细胞,包括人类、非人灵长类、啮齿类、猪、牛和马。
所述组合物和方法可用于异基因和自体移植。在自体移植中,所述组合物和方法可用来,例如,从患者血液或骨髓中除去不需要的细胞,如转移性癌细胞。然后将需要的细胞(如造血干细胞)返回患者,其中没有或基本上没有对生命造成威胁的肿瘤细胞。
含有抗肿瘤细胞细胞表面蛋白质的抗体的细胞分离组合物可用来从患者的血液或骨髓中除去肿瘤细胞。这些组合物还可用于诊断过程,例如以得到并检测凝集物中的肿瘤细胞,它们凝聚在其中,因此与在循环血液或骨髓中相比更加容易检测。含有抗表皮生长因子受体的抗体的细胞分离组合物可用来凝集来自上皮肿瘤(例如头和颈的肿瘤)的肿瘤细胞。含有抗雌激素受体的抗体的细胞分离组合物可用来凝集来自乳腺和卵巢肿瘤的肿瘤细胞。含有抗表面免疫球蛋白的抗体的细胞分离组合物可用来凝集与慢性淋巴细胞白血病、浆细胞瘤和多发性骨髓瘤有关的肿瘤细胞。乳腺癌细胞在其细胞表面表达CD15,可用含有抗CD15抗体的细胞分离从骨髓中将其除去。其它成分可基于细胞类型和细胞表面蛋白,以从患者的血液或骨髓中得到或除去来自其它癌(例如红白血病、内皮癌和肠胃癌)的转移肿瘤细胞。
细胞分离试剂盒
细胞分离试剂盒可包括包装物质并以试剂盒的形式出售。细胞分离组合物组分可分别包装或相互结合。一些实施方案中,包装物质包括血液收集容器(如血袋或真空管)。试剂盒中的包装物质通常包括描述如何使用细胞分离组合物来凝集特定细胞类型的说明书或标签。生产这种试剂盒的成分和方法是熟知的。
在以下的实施例中进一步描述了本发明,这些实施例不是要限制本发明的范围,其范围在权利要求书中描述。
实施例
实施例1:分离血细胞
该实施例描述了用下述细胞分离试剂分离细胞的一般方法。在50ml的锥形管中将等体积的细胞分离试剂(即25ml)与等体积的EDTA抗凝固的肝素化的外周血样品(即25ml)合并。将一份白血细胞数大于20×106细胞/毫升的样品与两份细胞分离试剂合并。室温下在振荡器台上将试管轻轻混合30-45分钟。使试管在架上直立放置30-50分钟以使凝集的细胞与仍留在溶液中的未凝集的细胞分开。在不破坏凝集物的条件下,用移液管从上清液中回收未凝集的细胞。用25ml PBS洗涤回收的细胞并在500×g下离心7分钟。将细胞球再悬浮在4ml PBS中。
还可用含有乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA)的低渗裂解溶液从凝集物中回收细胞。用25ml VitaLyseTM(BioErgonomics,圣保罗,明尼苏达州)处理凝集的细胞并涡流搅拌。10分钟后,将细胞暴露于施加的磁场以回收与连接在顺磁珠上的抗体结合的细胞,或在500×g下离心7分钟并除去上清。任一种情况下,将细胞再悬浮于4ml PBS。
红细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、T细胞、B细胞和NK细胞的回收率由流式细胞仪和免疫表型决定。在使用流式细胞仪之前,用Coulter Onyx血液学分析仪确定白细胞回收率(即白血细胞计数),并用PBS将样品调节至细胞计数为1×107细胞/毫升。在室温下将每份100μl的体积经过调节样品在黑暗中用FITC标记的抗CD3抗体(与T细胞反应)、PE标记的抗CD19抗体(与B细胞反应)或PE标记的抗CD16抗体(与NK细胞反应)染色15-30分钟。在每份样品中加入2mlPBS,然后涡流振荡样品并离心成细胞球。丢弃上清液,涡流搅拌细胞球并再悬浮于0.5ml PBS。通过流式细胞术,用Coulter XL流式细胞仪分析被染色和未被染色的细胞。基于上面的诊断和侧光散射特性鉴别红细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和血小板。基于光散射和被标记抗体的染色鉴别B细胞、T细胞和NK细胞。
实施例2:红细胞的凝集
按照实施例1中所述的方法,用表1中所述的试剂来分离细胞。
表1
葡聚糖(平均分子量413,000) | 20g/l |
Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(10×) | 100ml/l |
肝素钠(10,000单位/毫升) | 1ml/l |
Hank平衡盐溶液(pH7.2-7.4) | 50ml/l |
抗-人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体,克隆E4) | 1.0mg/l |
分离的结果显示在表2中。上清液中红细胞减少了99.7%。相对于单核细胞和粒细胞,淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)富集在上清液中。
表2
分离前 | 分离后 | |
每毫升的红细胞 | 4.41×109 | 0.015×109 |
每毫升的白细胞 | 5.9×106 | 5.3×106 |
淋巴细胞(%) | 28.7 | 41.9 |
单核细胞(%) | 8.69 | 4.78 |
粒细胞(%) | 62.5 | 52.6 |
T细胞(CD3+) | 19.7 | 31.8 |
B细胞(CD19+) | 4.46 | 5.42 |
NK细胞(CD16+) | 3.15 | 5.9 |
实施例3:红细胞和CD2+细胞的凝集
按照实施例1中所述的方法,用表3中所述的试剂来分离细胞。
表3
葡聚糖(平均分子量413,000) | 20g/l |
Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(10×) | 100ml/l |
肝素钠(10,000单位/毫升) | 1ml/l |
Hank平衡盐溶液(pH7.2-7.4) | 50ml/l |
抗-人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体,克隆E4) | 1.0mg/l |
抗-人CD2顺磁凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD2,克隆d118.10.1标记) | 14.02×109颗粒/升 |
分离的结果显示在表4中。上清液中,红细胞减少了99.7%,T细胞减少了95.1%,NK细胞减少了69.1%。相对于其它细胞,B细胞富集在上清液中。
表4
分离前 | 分离后 | |
每毫升的红细胞 | 4.41×109 | 0.014×109 |
每毫升的白细胞 | 5.9×106 | 2.63×106 |
淋巴细胞(%) | 28.7 | 16.0 |
单核细胞(%) | 8.69 | 6.04 |
粒细胞(%) | 62.5 | 75.6 |
T细胞(CD3+) | 19.7 | 3.3 |
B细胞(CD19+) | 4.46 | 9.63 |
NK细胞(CD16+) | 3.15 | 4.32 |
实施例4:红细胞和CD72+细胞的凝集
按照实施例1中所述的方法,用表5中所述的试剂来分离细胞。
表5
葡聚糖(平均分子量413,000) | 20g/l |
Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(10×) | 100ml/l |
肝素钠(10,000单位/毫升) | 1ml/l |
Hank平衡盐溶液(pH7.2-7.4) | 50ml/l |
抗-人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体,克隆E4) | 1.0mg/l |
抗-人CD72顺磁凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD2,克隆BU40标记) | 2.63×106颗粒/升 |
分离的结果显示在表6中。上清液中,红细胞减少了99.7%,B细胞减少了81.6%。
表6
分离前 | 分离后 | |
每毫升的红细胞 | 4.41×109 | 0.021×109 |
每毫升的白细胞 | 5.9×106 | 3.2×106 |
淋巴细胞(%) | 28.7 | 47.0 |
单核细胞(%) | 8.69 | 4.78 |
粒细胞(%) | 62.5 | 47.7 |
T细胞(CD3+) | 19.7 | 41.3 |
B细胞(CD19+) | 4.46 | 2.75 |
NK细胞(CD16+) | 3.15 | 4.77 |
实施例5:红细胞、CD15+细胞和CD9+细胞的凝集
按照实施例1中所述的方法,用表7中所述的试剂来分离细胞。
表7
葡聚糖(平均分子量413,000) | 20g/l |
Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(10×) | 100ml/l |
肝素钠(10,000单位/毫升) | 1ml/l |
Hank平衡盐溶液(pH7.2-7.4) | 50ml/l |
抗-人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体,克隆E4) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-CD15(鼠IgM单克隆抗体,克隆MEM-158) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-CD9(鼠IgG单克隆抗体,克隆MEM-61) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
分离的结果显示在表8中。上清液中,红细胞减少了99.9%,单核细胞和粒细胞减少了99.8%,B细胞减少了74%,NK细胞减少了64.9%。此外,分离前上清液中的血小板为226×106/ml,减少至1.4×106/ml,减少了99.4%。
表8
分离前 | 分离后 | |
每毫升的红细胞 | 4.41×109 | 0.006×109 |
每毫升的白细胞 | 5.9×106 | 1.53×106 |
淋巴细胞(%) | 28.7 | 99.0 |
单核细胞(%) | 8.69 | 0.12 |
粒细胞(%) | 62.5 | .083 |
T细胞(CD3+) | 19.7 | 83.2 |
B细胞(CD19+) | 4.46 | 8.10 |
NK细胞(CD16+) | 3.15 | 8.43 |
实施例6:红细胞、CD15+细胞、CD9+细胞和CD2+细胞的凝集按照实施例1中所述的方法,用表9中所述的试剂来分离细胞。
表9
葡聚糖(平均分子量413,000) | 20g/l |
Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(10×) | 100ml/l |
肝素钠(10,000单位/毫升) | 1ml/l |
Hank平衡盐溶液(pH7.2-7.4) | 50ml/l |
抗-人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体,克隆E4) | 1mg/l |
抗-CD15(鼠IgM单克隆抗体,克隆MEM-158) | 1mg/l |
抗-CD9(鼠IgG单克隆抗体,克隆MEM-61) | 1mg/l |
抗-人CD2顺磁凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD2,克隆d118.10.1标记) | 14.02×109颗粒/升 |
分离的结果显示在表10中。上清液中,红细胞减少了99.9%,单核细胞和粒细胞减少了99.9%,B细胞减少了16.8%,NK细胞减少了29%,T细胞减少了91.5%。此外,分离前上清液中的血小板为226×106/ml,减少至0.3×106/ml,减少了99.9%。
表10
分离前 | 分离后 | |
每毫升的红细胞 | 4.41×109 | 0.005×109 |
每毫升的白细胞 | 5.9×106 | 1.26×106 |
淋巴细胞(%) | 28.7 | 99.8 |
单核细胞(%) | 8.69 | 0.06 |
粒细胞(%) | 62.5 | 0.09 |
T细胞(CD3+) | 19.7 | 6.78 |
B细胞(CD19+) | 4.46 | 69.5 |
NK细胞(CD16+) | 3.15 | 20.7 |
实施例7:红细胞、CD15+细胞、CD9+细胞和CD72+细胞的凝集按照实施例1中所述的方法,用表11中所述的试剂来分离细胞。
表11
葡聚糖(平均分子量413,000) | 20g/l |
Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(10×) | 100ml/l |
肝素钠(10,000单位/毫升) | 1ml/l |
Hank平衡盐溶液(pH7.2-7.4) | 50ml/l |
抗-人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体,克隆E4) | 1mg/l |
抗-CD15(鼠IgM单克隆抗体,克隆MEM-158) | 1mg/l |
抗-CD9(鼠IgG单克隆抗体,克隆MEM-61) | 1mg/l |
抗-人CD72顺磁凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD2,克隆BU40标记) | 2.63×109颗粒/升 |
分离的结果显示在表12中。上清液中,红细胞减少了99.9%,单核细胞减少至不可检测,粒细胞减少了99.97%,B细胞减少了97.2%,NK细胞减少了54.9%。此外,分离前上清液中的血小板为226×106/ml,减少至0.1×106/ml,减少了99.96%。
表12
分离前 | 分离后 | |
每毫升的红细胞 | 4.41×109 | 0.006×109 |
每毫升的白细胞 | 5.9×106 | 2.3×106 |
淋巴细胞(%) | 28.7 | 99.9 |
单核细胞(%) | 8.69 | 0 |
粒细胞(%) | 62.5 | 0.1 |
T细胞(CD3+) | 19.7 | 92.4 |
B细胞(CD19+) | 4.46 | 0.59 |
NK细胞(CD16+) | 3.15 | 7.02 |
实施例8:红细胞、CD15+细胞、CD9+细胞、CD19+细胞和CD16+细胞的凝集
按照实施例1中所述的方法,用表13中所述的试剂来分离细胞。T细胞和CD3+细胞从上清中回收。B细胞和粒细胞从凝集物中回收。
表13
葡聚糖(平均分子量413,000) | 20g/l |
Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(10×) | 100ml/l |
肝素钠(10,000单位/毫升) | 1ml/l |
Hank平衡盐溶液(pH7.2-7.4) | 50ml/l |
抗-人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体,克隆E4) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-人CD15(鼠IgM单克隆抗体,克隆MEM-158) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-人CD9(鼠IgG单克隆抗体,克隆MEM-61) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-CD19顺磁凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD19,克隆HIB19标记) | 0.1-30.0×109颗粒/升(优选约19.8×109颗粒/升) |
抗-CD16顺磁凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD16,克隆3G8标记) | 5.5×1011颗粒/升 |
实施例9:红细胞、CD15+细胞、CD9+细胞、CD19+细胞、CD16+细胞和CD4+细胞的凝集
按照实施例1中所述的方法,用表14中所述的试剂来分离细胞。CD8+细胞从上清中回收。
表14
葡聚糖(平均分子量413,000) | 20g/l |
Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(10×) | 100ml/l |
肝素钠(10,000单位/毫升) | 1ml/l |
Hank平衡盐溶液(pH7.2-7.4) | 50ml/l |
抗-人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体,克隆E4) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-人CD15(鼠IgM单克隆抗体,克隆MEM-158) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-人CD9(鼠IgG单克隆抗体,克隆MEM-61) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-CD19顺磁凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD19,克隆HIB19标记) | 0.1-30.0×109颗粒/升(优选约19.8×109颗粒/升) |
抗-CD16顺磁凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD16,克隆3G8标记) | 5.5×1011颗粒/升 |
抗-CD4顺磁凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD4,克隆RFT4-γ或克隆QS4120标记) | 1.2×1010颗粒/升 |
实施例10:红细胞、CD15+细胞、CD9+细胞、CD19+细胞、CD16+细胞和CD8+细胞的凝集
按照实施例1中所述的方法,用表15中所述的试剂来分离细胞。CD4+细胞从上清中回收。
表15
葡聚糖(平均分子量413,000) | 20g/l |
Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(10×) | 100ml/l |
肝素钠(10,000单位/毫升) | 1ml/l |
Hank平衡盐溶液(pH7.2-7.4) | 50ml/l |
抗-人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体,克隆E4) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-人CD15(鼠IgM单克隆抗体,克隆MEM-158) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-人CD9(鼠IgG单克隆抗体,克隆MEM-61) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-CD19顺磁凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD19,克隆HIB19标记) | 0.1-30.0×109颗粒/升(优选约19.8×109颗粒/升) |
抗-CD16顺磁凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD16,克隆3G8标记) | 5.5×1011颗粒/升 |
抗-CD8顺磁凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD8,克隆HIT8a标记) | 7.92×109颗粒/升 |
实施例11:红细胞、CD15+细胞、CD9+细胞、CD19+细胞和CD2+细胞的凝集
按照实施例1中所述的方法,用表16中所述的试剂来分离细胞。CD34+细胞从上清中回收,其纯度>50%,产率>80%。
表16
葡聚糖(平均分子量413,000) | 20g/l |
Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(10×) | 100ml/l |
肝素钠(10,000单位/毫升) | 1ml/l |
Hank平衡盐溶液(pH7.2-7.4) | 50ml/l |
抗-人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体,克隆E4) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/1) |
抗-人CD15(鼠IgM单克隆抗体,克隆MEM-158) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-人CD9(鼠IgG单克隆抗体,克隆MEM-61) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-CD19顺磁凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD19,克隆HIB19标记) | 0.1-30.0×109颗粒/升(优选约19.8×109颗粒/升) |
抗-CD2凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD2,克隆d118.10.1标记) | 0.1-30.0×109颗粒/升(优选约3.0×1010颗粒/升) |
实施例12:红细胞、CD15+细胞、CD9+细胞、CD2+细胞和CD16+细胞的凝集
按照实施例1中所述的方法,用表17中所述的试剂来分离细胞。B细胞从上清中回收。
表17
葡聚糖(平均分子量413,000) | 20g/l |
Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(10×) | 100ml/l |
肝素钠(10,000单位/毫升) | 1ml/l |
Hank平衡盐溶液(pH7.2-7.4) | 50ml/l |
抗-人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体,克隆E4) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-人CD15(鼠IgM单克隆抗体,克隆MEM-158) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-人CD9(鼠IgG单克隆抗体,克隆MEM-61) | 0.1-15mg/l(优选约1.0mg/l) |
抗-人CD2凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD2,克隆d118.10.1标记) | 0.1-30.0×109颗粒/升(优选约3.0×1010颗粒/升) |
抗-CD16顺磁凝集颗粒(抗生物素蛋白涂布的直径4.3微米的顺磁聚苯乙烯颗粒,用饱和剂量的生物素标记的鼠抗人CD16,克隆3G8标记) | 5.5×1011颗粒/升 |
其它实施方案
尽管已经结合上述详细描述和实施例描述了本发明,上述描述和实施例是为了阐述而不是限制本发明的范围,其范围由附加的权利要求书限定。其它方面、优点和修改也在本发明权利要求的范围之内。
Claims (86)
1.一种组合物,其特征在于,所述组合物含有:
a)葡聚糖;
b)抗血型糖蛋白A抗体;
c)抗CD15抗体;
d)抗CD9抗体;和
e)选自抗CD3抗体、抗CD72抗体、抗CD16抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体和抗CD2抗体的抗体。
2.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,它还含有肝素。
3.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,它还含有二价阳离子。
4.如权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述二价阳离子是Ca+2。
5.如权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述二价阳离子是Mg+2。
6.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,它还含有磷酸缓冲盐溶液。
7.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物的pH在6.8-7.8之间。
8.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物的pH在7.2-7.4之间。
9.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗血型糖蛋白A抗体是单克隆的。
10.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗血型糖蛋白A抗体是IgM抗体。
11.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗血型糖蛋白A抗体是IgG抗体。
12.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗血型糖蛋白A抗体是抗人血型糖蛋白A抗体。
13.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗血型糖蛋白A抗体的浓度约为0.1mg/l-15mg/l。
14.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗CD15抗体是单克隆抗体。
15.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗CD15抗体是IgM抗体。
16.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗CD15抗体是IgG抗体。
17.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗CD15抗体是抗人CD15抗体。
18.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗CD15抗体的浓度约为0.1mg/l-15mg/l。
19.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗CD9抗体是单克隆抗体。
20.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗CD9抗体是IgM抗体。
21.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗CD9抗体是IgG抗体。
22.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗CD9抗体是抗人CD9抗体。
23.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述抗CD9抗体的浓度约为0.1mg/l-15mg/l。
24.一种试剂盒,其特征在于,它含有血液收集容器和细胞分离组合物,所述细胞分离组合物含有:
a)葡聚糖;
b)抗血型糖蛋白A抗体;
c)抗CD15抗体;
d)抗CD9抗体;和
e)选自抗CD3抗体、抗CD72抗体、抗CD16抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体和抗CD2抗体的抗体。
25.如权利要求24所述的试剂盒,其特征在于,所述血液收集容器是血袋。
26.如权利要求24所述的试剂盒,其特征在于,所述血液收集容器是真空管。
27.一种分离细胞的方法,其特征在于,所述方法包括:
a)使含有血细胞的样品与组合物接触,所述组合物含有:
i)葡聚糖;
ii)抗血型糖蛋白A抗体;
iii)抗CD15抗体;
iv)抗CD9抗体;和
V)选自抗CD3抗体、抗CD72抗体、抗CD16抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体和抗CD2抗体的抗体;以及
b)使所述样品分离成凝集相和上清液相;和
c)回收所述细胞。
28.如权利要求27所述的方法,其特征在于,所述样品来自人。
29.如权利要求28所述的方法,其特征在于,所述样品是外周血样品。
30.如权利要求28所述的方法,其特征在于,所述样品是脐带样品。
31.如权利要求28所述的方法,其特征在于,所述样品是骨髓样品。
32.如权利要求28所述的方法,其特征在于,所述细胞是转移性肿瘤细胞。
33.如权利要求28所述的方法,其特征在于,所述细胞回收自所述上清液相。
34.如权利要求33所述的方法,其特征在于,所述细胞是干细胞。
35.一种组合物,其特征在于,所述组合物含有:
a)葡聚糖;
b)抗血型糖蛋白A抗体;和
c)抗细胞表面抗原的基质结合的抗体。
36.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述基质结合的抗体与乳胶微粒结合。
37.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述基质结合的抗体与酸蚀的玻璃颗粒结合。
38.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述基质结合的抗体与聚集的多肽结合。
39.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述基质结合的抗体与多糖结合。
40.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述基质结合的抗体与抗生物素蛋白颗粒结合。
41.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述基质结合的抗体与生物素化的琼脂糖凝胶颗粒结合。
42.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗体是抗CD15抗体。
43.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗体是抗CD9抗体。
44.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗体是抗CD3抗体。
45.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗体是抗CD72抗体。
46.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗体是抗CD16抗体。
47.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗体是抗CD4抗体。
48.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗体是抗CD8抗体。
49.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗体是抗CD2抗体。
50.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗体是抗CD3抗体。
51.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,它还含有肝素。
52.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,它还含有二价阳离子。
53.如权利要求52所述的组合物,其特征在于,所述二价阳离子是Ca+2。
54.如权利要求52所述的组合物,其特征在于,所述二价阳离子是Mg+2。
55.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,它还含有磷酸缓冲盐溶液。
56.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述组合物的pH在6.8-7.8之间。
57.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述组合物的pH在7.2-7.4之间。
58.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗血型糖蛋白A抗体是单克隆的。
59.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗血型糖蛋白A抗体是IgM抗体。
60.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗血型糖蛋白A抗体是IgG抗体。
61.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗血型糖蛋白A抗体是抗人血型糖蛋白A抗体。
62.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗血型糖蛋白A抗体的浓度约为0.1mg/l-15mg/l。
63.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述抗血型糖蛋白A抗体是基质结合的。
64.如权利要求42所述的组合物,其特征在于,所述抗CD15抗体是单克隆抗体。
65.如权利要求42所述的组合物,其特征在于,所述抗CD15抗体是IgM抗体。
66.如权利要求42所述的组合物,其特征在于,所述抗CD15抗体是IgG抗体。
67.如权利要求42所述的组合物,其特征在于,所述抗CD15抗体是抗人CD15抗体。
68.如权利要求42所述的组合物,其特征在于,所述抗CD15抗体的浓度约为0.1mg/l-15mg/l。
69.如权利要求42所述的组合物,其特征在于,所述抗CD15抗体是基质结合的。
70.如权利要求43所述的组合物,其特征在于,所述抗CD9抗体是单克隆抗体。
71.如权利要求43所述的组合物,其特征在于,所述抗CD9抗体是IgM抗体。
72.如权利要求43所述的组合物,其特征在于,所述抗CD9抗体是IgG抗体。
73.如权利要求43所述的组合物,其特征在于,所述抗CD9抗体是抗人CD9抗体。
74.如权利要求43所述的组合物,其特征在于,所述抗CD9抗体的浓度约为0.1mg/l-15mg/l。
75.如权利要求43所述的组合物,其特征在于,所述抗CD9抗体是基质结合的。
76.一种试剂盒,其特征在于,它含有血液收集容器和细胞分离组合物,所述细胞分离组合物含有:
a)葡聚糖;
b)抗血型糖蛋白A抗体;和
c)抗人细胞表面抗原的基质结合的抗体。
77.如权利要求76所述的试剂盒,其特征在于,所述血液收集容器是血袋。
78.如权利要求76所述的试剂盒,其特征在于,所述血液收集容器是真空管。
79.一种分离细胞的方法,其特征在于,所述方法包括:
a)使含有血细胞的样品与组合物接触,所述组合物含有:
i)葡聚糖;
ii)抗血型糖蛋白A抗体;和
iii)抗细胞表面抗原的基质结合的抗体。
b)使所述样品分离成凝集相和上清液相;和
c)回收所述细胞。
80.如权利要求79所述的方法,其特征在于,所述样品来自人。
81.如权利要求80所述的方法,其特征在于,所述样品是外周血样品。
82.如权利要求80所述的方法,其特征在于,所述样品是脐带血样品。
83.如权利要求80所述的方法,其特征在于,所述样品是骨髓样品。
84.如权利要求80所述的方法,其特征在于,所述细胞是转移性肿瘤细胞。
85.如权利要求80所述的方法,其特征在于,所述细胞回收自所述上清液相。
86.如权利要求85所述的方法,其特征在于,所述细胞是干细胞。
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