CN105368782A - 用于人细胞分离的小鼠细胞排除 - Google Patents

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Abstract

本发明目标在于用于从人细胞在鼠类宿主上的异种移植物中排除宿主细胞的方法，其特征在于a)将异种移植物破碎成包含单细胞悬液的样品；b)使样品经受偶联检测手段的鼠类CD9表位特异性抗体；c)使用检测手段从被CD9-抗体结合的细胞排除细胞悬液；d)收集不被CD9-抗体结合的细胞作为靶细胞。

Description

用于人细胞分离的小鼠细胞排除
发明背景
本发明涉及在异种移植时用于人细胞的种属分离的小鼠细胞的排除。
人肿瘤异种移植物代表着如药物发现、癌干细胞生物学和转移预测等研究领域的黄金标准方法。异种移植物可从原发性人肿瘤材料、连续移植的肿瘤组织或培养细胞衍生。当与体外细胞培养模型相比时，人肿瘤异种移植物显示对大部分测定更高的有效性(Rubio-Viqueira B和Hidalgo, M. (2009) Clin. Pharmacol. Ther. 85: 217-221)。除了在癌症研究中的应用外，人细胞至小鼠中的异种移植还经常在干细胞研究中使用以确定目标群体的分化潜能。
在体内生长期期间，异种移植的组织血管化并被小鼠起源的细胞，包括异种淋巴细胞亚群、成纤维细胞和内皮细胞浸润。浸润水平高度取决于肿瘤亚型、生长速率和移植区域等因素。然而，即使当这些因素保持不变时，浸润小鼠细胞的量和组成也非常多变，这使得精确的分子下游分析困难。污染的小鼠细胞导致小鼠-衍生的分子与微列阵上的人探针交叉-杂交和/或在下一代测序或蛋白质组分析期间由小鼠信号被测量所导致的灵敏度显著降低(Wong, S.Q.等. (2013) Sci. Rep. 3: 3494)。
此外，人肿瘤细胞培养物常常被长满靶细胞的鼠类成纤维细胞妨碍。为了从期需的人异种移植物分离小鼠细胞或小鼠细胞碎片，已经尝试了排除小鼠细胞或通过软件增强分析过程。
为了在异种移植后排除小鼠细胞，C.C. Zhang等在Stem Cells Transl. Med. 2: 233-242 (2013)中提出了识别小鼠CD45和MHC I型表位的抗体的组合。
S. B. WILLINGHAM等在PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES(国家科学院院刊)，“The CD47-signal regulatory protein alpha (SlRPa) interaction is a therapeutic target for human solid tumors (CD47-信号调节蛋白α (SlRPa)相互作用为人实体瘤的一个治疗靶标)”，第109卷，17期，2012年3月26日，第6662-6667页公开了使用靶向人表位的抗体来富集被小鼠细胞污染的人细胞。小鼠细胞的排除未公开。
现有技术中已经提出了识别小鼠细胞的抗体的进一步组合，例如WO 2009/045201 A1公开了经由鼠类表位CD45、CD31和H-2Kbd排除小鼠细胞。相似地，WO 2008/115601 A1描述了用于排除小鼠细胞的小鼠MHC I抗体。在WO 2012/010904 A1中，公开了小鼠谱系特异性的微珠。
然而，使用这些标志组合，仅能检测小鼠细胞的亚类。
此外，来自异种移植物的人肿瘤细胞培养物常常被小鼠成纤维细胞妨碍，这是因为成纤维细胞更有效地贴附和扩展，因此长满在靶细胞上。即使当靶细胞贴附和生长良好时，体外细胞培养测定(例如药物细胞毒性试验或药代动力学)仍成问题，这是因为在大多数情况下对源于污染小鼠细胞的效应的数学校正是不可能的。
另一从异种移植物分离人细胞的策略为将仅在人细胞上表达而不在鼠细胞上表达的标志物用于从异种移植物排除人细胞。因此分离的人细胞与标志物结合，这可能妨碍进一步的纯化/选择步骤。
发明概述
本发明的一个目标在于提供从宿主细胞特别是从鼠类细胞排除未受影响的人异种移植物的方法。
意想不到地，CD9经鉴定为允许在包含鼠类和人细胞的混合物中检测和排除鼠细胞的合适表位。
因此本发明的目标为从人细胞在鼠类宿主上的异种移植物中排除宿主细胞的方法，其特征在于
a) 将异种移植物破碎成包含单细胞悬液的样品；
b) 使样品经受偶联检测手段的鼠类CD9表位特异性抗体；
c) 使用检测手段从CD9-抗体结合的细胞排除样品；
d) 收集不被CD9-抗体结合的细胞作为靶细胞。
用本发明方法获得的靶细胞为优选的基本“未受影响的”，即没有或基本上没有与任何抗体偶联。
然而，排除宿主细胞后所获得的细胞可与抗体偶联用于进一步纯化。
来自鼠类宿主的绝大多数细胞类型被CD9抗体识别并且可用本发明方法从靶细胞排除。鼠类细胞可为从大鼠或小鼠可获得的任何细胞。这包括横跨多个器官，例如皮肤、肺、脑、肾和骨骼肌(所有这些均代表用于异种移植的靶组织)的鼠类细胞。
本发明方法可用于分离所有类型的人细胞，特别是人肿瘤细胞，例如，人乳腺癌细胞、人结肠癌细胞、人肺癌细胞、人前列腺癌细胞、人胰腺癌细胞、人黑色素瘤癌细胞、人白血病癌细胞和人淋巴瘤癌细胞。
当使用细胞表面表位用于筛查时关键点在于将温和的程序和纯酶用于组织分裂以避免靶分子降解。因此，在本方法的第一个步骤中，通过组织的机械破坏(借助或不借助酶)将异种移植物破碎或分解成基本上单细胞的悬液。
附图简述
参照下列附图描述了各种例示性的细节，其中：
图1显示通过识别鼠类CD45和MHC I表位的方法，仅可检测小鼠细胞的亚类；
图2显示CD9为鼠类细胞上一个广泛表达的表位；
图3显示本发明抗体混合剂用于在一个细胞级分中消除小鼠细胞的效率；
图4显示CD9经鉴定为小鼠肺细胞上的表位甚至在肺组织上与MHC I型和CD45组合相比更广泛表达；
图5显示CD9在小鼠皮肤细胞上比MHC更广泛表达，甚至与MHC I型和CD45组合相比更广泛表达；和
图6A显示通过将CD45/MHC I和CD9用于排除来排除小鼠细胞从小鼠脑分离人成胶质细胞瘤细胞；图6B显示紧接着排除能存活的小鼠细胞后，用CD9-抗体，可将死细胞和碎片从样品去除，当将CD45/MHC用于排除时未观察到此种效果。
发明详述
术语“基本上单细胞”意指将组织分解为分离的单细胞。以完全自动化的方式分离或破碎通过例如使用从Miltenyi Biotec GmbH可获得的具有加热器的gentleMACS™ Octo Dissociator和相应的组织分离试剂盒(如人肿瘤分离试剂盒，其对表位保存进行了优化)而有可能。
根据期需的靶细胞纯度，可通过加入另外的抗体去除小部分的宿主细胞，即使对于那些的大部分而言表达模式与CD9重叠。
在本发明另一个实施方案中，使步骤a)或步骤b)或步骤c)的至少一个中所获得的细胞悬液/样品进一步经受对鼠类CD9表位特异的抗体和对选自CD45、CD51、CD31、CD24、EpCAM、Sca1、CD81、CD44、CD11b、CD95、H2Kk、H2Kd、CD171、CD90.1、CD90.2和Ter119的一种或多种鼠类表位特异的抗体(每种偶联一种检测手段)。在该实施方案中，异种移植物/细胞悬液从与鼠类CD9抗体偶联的细胞和从与这些抗体偶联的细胞排除。
优选使用包含对鼠类表位CD9、CD45、CD51、CD31和Ter119特异的抗体的抗体混合剂，这在本方法步骤b)中给予。
对于本发明方法中所使用的全部抗体而言检测手段可相同或不同。合适的检测手段可选自磁性颗粒、荧光染料或固体载体。
磁性颗粒在本领域已知为超顺磁纳米颗粒(Micro Beads)，其可从Miltenyi Biotec GmbH获得。合适的荧光染料为例如FITC、PE、APC荧光染料或串联染料。固体载体可为塑料平皿或瓶以及柱或微流体元件。当然，抗体可携带一种或多种检测手段。
步骤c)的排除按照检测手段所需进行，所述检测手段例如磁性分离、淘洗或FACS。
现有技术建议从异种移植物分离某些人肿瘤亚群，例如癌干细胞(CSC)。然而，在一个亚群从人细胞级分分离出后，小鼠细胞仍然污染阴性级分，这导致有偏倚的全部主要类型的下游分析结果。在分析靶细胞的功能和分子特征（例如通过基于微列阵的表达图谱或下一代测序）之前，获得非常纯的靶细胞样品是先决条件。
为防止此缺点发生，可使用本发明方法产生无污染性鼠类宿主细胞的人细胞群。在本发明进一步的实施方案中，在步骤e)中，使步骤d)中所获得的靶细胞经受与检测手段偶联的人标志物特异性抗体并使用检测手段进一步分为至少两个包含不同细胞亚群的级分。
不同的细胞亚群可由表达或不表达某些标志物如CSC或EpCam (CD 326)的细胞组成。步骤e)中获得的一个级分可包含表达这些标志物的细胞亚群，另一级分包含不表达这些标志物的细胞亚群。
在本发明步骤e)中，CSC可从，例如，人乳腺癌异种移植肿瘤、人结肠癌异种移植肿瘤、人肺癌异种移植肿瘤、人前列腺癌异种移植肿瘤、人胰腺癌异种移植肿瘤、人黑色素瘤癌异种移植肿瘤、人白血病癌异种移植肿瘤、人淋巴瘤癌异种移植肿瘤分离。
整个方法涉及例如通过使用具有加热器的gentleMACS Octo Dissociator与人肿瘤分离试剂盒组合分离异种移植物，接着在单个步骤中使样品经受已经讨论过的抗体并除去小鼠细胞。随后，使用CSC标志物进行第二次分类，产生纯的人CSC和非-CSC亚群。
实施例
比较实施例 1
从BL6和CD1小鼠移除靶组织、合并并通过使用具有加热器的gentleMACS™ Octo Dissociator和相应的组织分离试剂盒(针对表位保存优化)以完全自动化的方式分离。对于流式细胞仪分析，根据制造商的说明书将细胞用标示的抗体染色并使用MACSQuant™ Analyzer (Miltenyi Biotec GmbH)分析。用已知的识别小鼠CD45和MHC I型表位的抗体的组合，即使在红细胞裂解后，在所有被分析的分离的组织中仅能检测到小鼠细胞的一个亚类，如图1中(左起第一列，其显示皮肤(A)和肺(B)组织)所描述。
比较实施例 2
为了完全检测来自所有器官的所有小鼠细胞，使用CD45、CD31、CD51和Ter119特异性的抗体与CD9抗体组合，如图4和5中的图C)所示。将这4种抗体与CD45和MHC I型特异性抗体组合并非同样有效，如图4和5中图D)所示。图4和5中图E)指出识别CD45、CD31、CD51、Ter119和CD9的抗体(符合“抗-小鼠”)的组合对检测小鼠细胞而言明显比CD45和MHC I型抗体的组合更有效。此外，甚至CD9单独已经比CD45和MHC I型抗体的组合更有效。
比较实施例3
从分离的小鼠脑中分离人成胶质细胞瘤细胞。如图6A中所示，将CD45与MHC I型特异性抗体（上左和下左的点图）的组合用于从异种移植物间接磁性排除小鼠细胞并不充分，然而使用识别CD43、CD31、CD51、Ter119和CD9（上右和下右点图“MCDK”）的抗体组合除去几乎所有小鼠细胞。图6B显示排除能存活的小鼠细胞后，用CD9-抗体，可将死细胞和碎片从样品中除去，当将CD45/MHC用于排除时未观察到此种效果。
CD9 作为标志物的鉴定
使用识别小鼠CD9而非CD45和MHC I型表位的抗体重复该比较实施例的程序。
经鉴定CD9为小鼠细胞上广泛表达的表位，其允许更全面的检测，如针对分离的皮肤和肺组织的图2中所示。在大多数情况下仅红细胞不能被检测到。
为了完全检测来自所有器官的所有小鼠细胞，加入小鼠CD9、CD45、CD51、CD31和Ter119表位特异性抗体以允许所有细胞被多重抗体结合。使用偶联APC荧光染料的此抗体组合物(抗-小鼠-APC)，识别所有小鼠源细胞，包括红细胞是可能的，如图1 (2和3，左列)中所描述，其包括皮肤(A)和肺(B)组织。
本发明实施例 (1)
抗小鼠CD9、CD45、CD51、CD31和Ter119抗体与超顺磁纳米颗粒(MicroBeads)的缀合物按照Microbeads上偶联抗体的领域所已知而产生。每种抗体偶联至单独的Microbeads，通过混合所述由此获得的缀合物制备混合剂。
包含这些缀合物的混合物的混合剂被用于开发通过磁性分离从人肿瘤异种移植物排除小鼠细胞的最优化的方案。为了产生异种移植肿瘤，将5周大的雌性无胸腺裸鼠(Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, Harlan)维持在特定的无病原体的条件下。人癌异种移植物通过将肿瘤碎片移植入无胸腺的裸鼠的肩胛间脂肪垫从患者的原发肿瘤手术标本建立，并如先前所述通过体内传代维持(Marangoni E等, Clin Cancer Res. 2007 Jul 1;13(13):3989-98.)。使用人肿瘤分离试剂盒结合gentleMACS Octo Dissociator (均来自Miltenyi Biotec GmbH)按照制造商的说明书将肿瘤组织分离为单细胞悬液。分离之后，将细胞重悬在PEB缓冲液(PBS，pH 7.2，0.5%牛血清蛋白，和2 mM EDTA；其通过用autoMACS®漂洗液1:20稀释MACS BSA原液制备)中用于磁性细胞分离。
在本发明方法的步骤b)期间使用缀合物混合剂，在20分钟内消除>99%的污染的小鼠细胞是可能的，甚至当污染细胞的频率为约80%时，如图3中所描述。将细胞级分用偶联APC的泛-小鼠抗体混合剂(抗-小鼠-APC)和抗人CD326 (EpCAM)(在本实施例中用作人肿瘤细胞标志物)抗体标记，这允许更容易地量化人和小鼠级分。
本发明实施例 (2)
使用比较实施例3中所述同一程序。相反地，利用偶联MicroBeads的CD9抗体更有效，但并不导致高纯的人肿瘤细胞级分。见图6A和B。意想不到地，通过使用CD9-抗体，可有效排除死细胞和碎片，如显示细胞大小对细胞粒度的图中所示。用本发明的缀合物混合剂，消除>99 %的污染的小鼠细胞和>60 %的碎片是可能的。当将CD45和MHC I型用于排除时未观察到此种效果。
因此，当使用CD45和MHC I用于排除时人成胶质细胞瘤细胞通过排除小鼠细胞从小鼠脑的分离是没有效率的。当使用CD9作为排除标志物时，效率明显改善，然而，小级分小鼠细胞仍保留在样品中。当使用本发明抗体混合剂时排除了几乎所有的小鼠细胞。
尽管结合上面略述的例示性的实施已经描述了各种细节，然而当回顾前述公开内容时，各种备选、修饰、变更、改善和实质性的相等物，无论是已知的还是目前无法预料的或目前无法预料的或目前可能无法预料的，可变得显而易见。因此，上述例示性实施意在为说明性的，而非限制。

Claims (8)

1. 一种用于从人细胞在鼠类宿主上的异种移植物中排除宿主细胞的方法，其特征在于
a) 将异种移植物破碎成包含单细胞悬液的样品；
b) 使样品经受与检测手段偶联的鼠类CD9表位特异性抗体；
c) 使用检测手段从被CD9-抗体结合的细胞排除细胞悬液；
d) 收集不被CD9-抗体结合的细胞作为靶细胞。
2. 权利要求1的方法，特征在于使步骤a)、b)或c)的至少一个中所获得的细胞悬液进一步经受选自CD45、CD51、CD31、CD24、EpCAM、Sca1、CD81、CD44、CD11b、CD95、H2Kk、H2Kd、CD171、CD90.1、CD90.2和Ter119的一个或多个鼠类表位特异性的抗体，每种抗体偶联一种检测手段，并且使用检测手段从偶联这些抗体的细胞另外排除细胞悬液。
3. 权利要求1-3中任一项的方法，特征在于在步骤b)中使所述细胞悬液经受鼠类表位CD9、CD45、CD51、CD31和Ter119特异性的抗体。
4. 权利要求1-4中任一项的方法，特征在于所述抗体的检测手段选自磁性颗粒、荧光染料或固体载体。
5. 权利要求1-4中任一项的方法，特征在于步骤c)的排除作为磁性分离、淘洗或FACS实施。
6. 权利要求1-5中任一项的方法，特征在于小鼠被用作宿主。
7. 权利要求1-6中任一项的方法，特征在于所述人细胞为人肿瘤细胞。
8. 权利要求7的方法，特征在于作为步骤e)，使步骤d)中所获得的靶细胞经受偶联检测手段的人标志物特异性抗体并使用检测手段进一步分为至少两个包含不同细胞亚群的级分。
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