CN101469323A - 从全血中分离红细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型快速分离人全血中红细胞的方法，特别是涉及使用预包被植物凝集素或抗红细胞抗体的含有磁性材料的聚合物微球分离人全血中的红细胞的方法。本发明的方法可以快速且高效地从人全血标本中分离红细胞。

Description

从全血中分离红细胞的方法

发明领域

本发明涉及一种从人全血中分离红细胞的方法，特别是一种涉及使用预包被植物凝集素或抗红细胞抗体的含有磁性材料的聚合物微球分离人全血中的红细胞的方法。本发明可广泛应用于临床检验和医学科学研究等大量使用人全血标本的领域。

发明背景

血液标本是临床和科研使用最多的标本，但一般仅限于去除红细胞的血清或血浆，因此在很多情况下需要对全血标本进行从中分离出红细胞的预处理。临床和科研上分离全血中的红细胞的方法有多种，包括自然沉降、离心、排阻过滤和吸附过滤等。这些方法各有特点，但都需要耗费较长的时间，操作较复杂。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种快速高效分离人全血红细胞的方法，特别是提供一种使用预包被植物凝集素或抗红细胞抗体的含有磁性材料的聚合物微球作为载体，从人全血中分离红细胞的方法。

本发明的另一个目的是提供一种分离人全血红细胞的装置，特别是提供了一种使用预包被植物凝集素或抗红细胞抗体的含有磁性材料的聚合物微球作为载体，将该载体与全血标本混合后，使用外置或内置永磁体或电磁体提供的磁力吸附作用，将吸附了红细胞的磁性微球从全血中分离开出来的装置。

本发明的分离方法包括以下步骤：将预包被了植物凝集素或抗红细胞抗体的磁性聚合物微球加到全血中并混合均匀达到均相互溶状态，然后利用永磁体或电磁体，将吸附了红细胞的磁性微球从全血中分离开出来。本方法的特征在于使用预包被植物凝集素或抗红细胞抗体的磁性聚合物微球，并使用磁力分相达到快速分离的目的。

本发明所说的“均相互溶状态”是指红细胞与全血中的其他成分处于均匀混和的状态。

本发明所说的“异相分离状态”是指红细胞在空间上富集在一起且与全血的其他绝大部分成分分开，处于相对分离的状态。

本发明提供一种快速高效分离人全血红细胞的方法，特别是提供一种使用预包被了植物凝集素或抗红细胞抗体的含有磁性材料的聚合物微球作为载体，借助外加磁力从全血中分离出红细胞的方法。

为了克服现有技术中的缺陷和不足，本发明提供了一个适于快速高效分离人全血中红细胞的方法，该方法包括：(1)将植物凝集素或抗红细胞抗体预包被于磁性聚合物微球上；(2)将微球加到人全血中并混合均匀；(3)利用磁力吸附具磁性的微球，吸附了红细胞的微球在磁力作用下从均相互溶状态转变为异相分离状态，从而达到分离全血红细胞的目的。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的“人全血”是指从人体新鲜采集的，未经自然分离或人工分离的全血标本。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的“植物凝集素”采用从红豆中提取的植物凝集素。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的“抗红细胞抗体”是使用人红细胞免疫小鼠，常规制备的抗红细胞单克隆抗体。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的“磁性聚合物微球”是平均直径为10—20微米，掺入了四氧化三铁的聚苯乙烯微球。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的“磁力”是由永磁铁或电磁铁提供的。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的植物凝集素来源于红豆提取物。将红豆用纯水洗净并浸泡约24小时后机械粉碎成乳浆状，然后离心(6000g，30min)分离上清并使用饱和硫酸氨法进一步提纯。

根据本发明的一个优选实施方案，可以按下述方法使用凝集素或抗红细胞抗体包被磁性聚合物微球：预先将磁性聚合物微球溶于PBS缓冲液(50mM，pH7.4)中(浓度为10％，m/v)，快速搅拌下加入凝集素或抗红细胞抗体并室温搅动(100转/分钟)反应30分钟，然后加入牛血清白蛋白(BSA)至终浓度0.2％，再次室温下搅动(100转/分钟)反应15分钟，最后10000g离心20分钟后弃上清，再用PBS缓冲液(50mM，pH7.4)重悬沉淀，即得到标记好的磁性聚合物微球溶液。

现针对本发明的几个主要步骤，分别详述如下：

1.将植物凝集素或抗红细胞抗体预包被于磁性聚合物微球上

本发明采用的是优化的包被方法：首先优化了包被pH值，比较了在pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0时的包被效率，结果发现pH7-8时最好，继续优化比较，发现pH7.4时包被效率最高，并将PBS缓冲液盐浓度从10mM提高到50mM，有助于包被后的稳定性，尤其是加入到全血样品后的稳定性，减少植物凝集素或抗红细胞抗体的脱落，提高吸附效率。另外采用高磁性四氧化三铁制备的聚合物(聚苯乙烯、聚乙烯)微球，可以大大提高借助磁力分离的速度，同时也比较了不同的微球直径(40nm、60nm、100nm、150nm、200nm、300nm)的包被及分离效果，结果100nm的微球的包被和分离效率是最好的。

2.利用磁力分离红细胞

本发明采用的磁力来源可以是永磁体或电磁体，永磁体包括普通的磁铁和高磁力的合金磁铁。其中优选的是电磁体。电磁铁可以控制磁力通断，可在不移动容器的情况下实现同位置分离红细胞。磁体可置于容器的多个位置，包括底部、侧壁、顶端甚至容器内部等，可以是一端，也可以环绕于容器。

如前所述，由于本发明采用了强磁性的聚合物微球和强磁力的永磁体，使得磁力分离的速度大大加快。另外，本发明可采用各种磁体，便于设计不同成本和性能的装置，满足不同应用和需求，利于推广应用。

附图说明

图1显示底端固定磁体的磁力分离装置分离全血红细胞的示意图。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明方法的优选实施方案。

实施例1：采用植物凝集素包被磁性颗粒分离红细胞的方法

取100g红豆，用纯水洗净，浸泡于200ml纯水中24小时，用榨汁机将红豆打碎成豆乳浆，打碎过程中加入50ml纯水以提高研磨效率，乳浆于6000g离心30分钟，保留上清并用饱和硫酸氨法进一步提纯，获得植物凝集素纯品备用。

按照每毫升10％浓度的磁性聚合物微球(平均直径100nm)溶液包被20ug植物凝集素的比例，预先将磁性聚苯乙烯微球溶于PBS(50mM，pH7.4)缓冲液中(浓度10％，m/v)，在快速搅拌的情况下加入植物凝集素，室温下搅动(100转/分钟)反应30分钟。然后加入BSA至终浓度0.2％，室温下搅动(100转/分钟)反应15分钟，最后10000g离心20分钟后弃上清，用PBS(50mM pH7.4)缓冲液重悬沉淀，获得标记好植物凝集素的磁性聚苯乙烯微球溶液(微球终浓度10％(m/v)。

采集新鲜正常人全血样本5ml，不加任何凝集素或其它试剂，备用。同时准备一个底部预置好磁铁的试管架，按照每毫升全血加入0.2毫升微球溶液的比例加入标记好植物凝集素的磁性聚苯乙烯微球溶液，混匀后置于试管架上，静置10分钟后可见明显的分层现象：上层是清亮的血清/血浆，下层是红色的红细胞。

经红细胞计数检测分离后的上清，计算得该方法分离红细胞的效果达到99％以上。

实施例2：采用抗红细胞抗体包被磁性颗粒分离红细胞的方法

取购自北京新创生物工程有限公司的抗红细胞抗体1mg。按照每毫升10％浓度的磁性聚乙烯微球(平均直径100nm)溶液包被20ug抗红细胞抗体的比例，预先将磁性聚乙烯微球溶于PBS缓冲液(50mM pH7.4)中(浓度10％，m/v)，在快速搅拌的情况下加入抗红细胞抗体，室温下搅动(100转/分钟)反应30分钟，加入BSA至终浓度0.2％，室温下搅动(100转/分钟)反应15分钟，最后10000g离心20分钟后弃上清，用PBS(50mM pH7.4)缓冲液重悬沉淀，获得标记好抗红细胞抗体的磁性聚乙烯微球溶液(微球终浓度10％(m/v))。采集新鲜正常人全血样本5ml，不加任何凝集素或其它试剂，备用。

准备一个底部预置好磁铁的试管架，按照每毫升全血加入0.2毫升磁性聚乙烯微球溶液的比例加入标记好植物凝集素的磁性聚合物微球溶液，混匀后置于试管架上，静置10分钟后，可见明显的分层现象：上层是清亮的血清/血浆，下层是红色的红细胞。

经红细胞计数检测分离后的上清，计算得该方法分离红细胞的效果达到99％以上。

Claims (2)

1.一种分离人全血红细胞的方法，该方法包括以下步骤：(1)将植物凝集素或抗红细胞抗体预包被于磁性聚合物微球上；(2)将微球加到人全血中混合均匀；(3)利用由永磁体或电磁体提供的磁力吸附具磁性的微球，将被微球吸附的红细胞从均相互溶状态转变为异相分离状态，从而达到分离全血红细胞的目的。

2.根据权利要求1的方法，其中所说磁性聚合物微球是掺入了磁性物质的各种聚合物微球。