JPH04500008A - 特定細胞分離装置及び特定細胞分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 鉗 細胞１１＠縮物からの選択的細胞分離用システム挟止分野 本発明は、不均質細胞混合物から特定細胞集団を分離するための新規なシステム に関するものである。

発咀偽背景 細胞分離分野においては、血液中の血漿から細胞を分離すること、および例えば 赤血球の如き種々の型の細胞を白血球などから遠心分離により分離することは− ｉ的である。しかしながら、他の細胞とほんの僅かだけ異なる細胞をそれらの懸 濁液中で分離する必要性がしばしばある。細胞がほとんど等しい比重を有してい る場合には、それらを遠心分離によって分離することはできない。

例えば、種々の型の白血球を骨！１１１１縮物または末梢血液幹細胞濃縮物から 単離することが望まれている。骨髄濃縮物からの神経芽細胞腫の選択的分離を行 うことも望まれている。血液細胞分離器を使用して製造されたリンパ細胞１ｍ物 から特定のＴ−リンパ細胞部分集合集団（ヘルパー−インデューサーまたはサプ レッサー−細胞毒性Ｔ−リンパ細胞）を選択的に分離することが望まれている。

さらに、リンパ液で活性化されたキラー（ＬＡＫ）細胞、腫瘍浸潤リンパ（ＴＩ Ｌ）細胞、または活性化されたキラー単細胞の先駆体を、リンパ細胞もしくは単 細胞ｆＡ縮物からまたは組繊細胞製剤から選択的に分離することも望ましい。

例えばサラエル（Ｓａｕｅｒ）他の米国特許番号４．７１０．４１２の如き最近 の先行技術によると、比較的大きい集団から細胞の個別部分集合を実質的な量で 磁気的に分離することが可能になっている。これはまた、得られるであろう精製 された細胞集団を用いる研究や治療技術の新展型を開くものである。

細胞分離に関する分野における最近の別の方法は、生理的に吸着または共有結合 された化学試薬または生化学試薬を存する中空繊維、平らなシート膜または充填 床球もしくは粒子マトリックス物質を、全血などから選択的に細胞を分離するた めに使用している。これらの装置は、全血または血液成分の連続的流入および逆 流を可能にするように設計されている。これらの装置は正常の血液流速では希望 する細胞濃度が他の細胞型と比べて非常に低くなる条件下で操作されるため、こ の分離方法はしばしば効率的ではない。

発明の記載 本発明では、不均質な細胞混合物から特定の細胞集団を選択的に分離するための 改良されたシステムが提供される。不均質な細胞混合物をｆＡ縮物の物理的性質 を基にして選択的な細胞濃縮物を分離することにより不均質な細胞混合物から選 択的な細胞濃縮物を得るための手段に最初にかけることができる。好適には、選 択的な細胞濃縮物が本発明のシステムおよび方法と共に使用される。特に、第一 の分離段階としては遠心分離を使用することができる。希望する型の細胞の分離 用には多種類の型の細胞遠心分離システムを使用することができる。

粒子手段を内部に有する柔軟で折りたたみ可能な無菌的に密封された容器が提供 さねへここで粒子手段は好適にはそれと化学的に共有結合された物質を有してお り、該物質は他の細胞を除外しながら希望する細胞にだけ結合可能である。その ような共有結合される物質の例には、抗体、抗原、蛋白質、糖蛋白質、多１１類 、または脂肪多糖類が包含される０粒子手段は長期にわたり容器壁などと接触す るようになっている。

不均質な細胞混合物または細胞４縮物を容器内の粒子手段と密に接触させるため の手段が提供される。これは簡単には、細胞混合物または濃縮物の生成位置と粒 子手段の間を連結している柔軟な無菌的導管システムであることができる。次に 粒子手段を用いる細胞混合物または−ａ縮物の培養を行って、細胞濃縮物からの 特定細胞集団を粒子と選択的に結合させて、粒子／細胞結合体を生成することが できる。

すると、新しい粒子／細胞結合体は細胞の残りとは相当異なる性質を有している ため、それらを例えば遠心分離により他の細胞から分離することは容易なことと なろう、好適には、常磁性である粒子を使用し、磁石システムにより分離するこ とができる。

最初の細胞流体容量は培養期間中に容器内に残っており、その時点で粒子との結 合が生しる。また、培養期間中に追加量の細胞混合物または′ａ縮物を容器中に 加えるための手段を備えることもできる。

上記の如く他の細胞から粒子／細胞結合体を分離した後に、例えば周知の方法で 粒子および細胞の間の結合を除去することにより、特定の細胞集団を粒子からま たはその逆に分離して、精製された細胞選択集団がそれ以後の使用のために供さ れる。一方、未結合細胞が希望する細胞であり、粒子／細胞結合体から除去でき る。

粒子が常磁性である時には、粒子／細胞結合体を磁石手段の作用により固定位置 に保持することができ、細胞濃縮物の残りの未結合部分がその位置から除去され る。

好適には、粒子／細胞結合体を保持する磁石手段は第一および第二の隔てられた 磁石部材を規定することができ、一方は他方の下流にあるため、下流に隔てられ ている第二の磁石部材は第一の磁石部材が拾い損ねた結合した粒子／細胞結合体 を拾うことができ、その結果、粒子／細胞結合体は残りの細胞と共に下流にし） くことはない。

磁石手段は、柔軟で折りたたみ可能な容器を運びそして配置する手に隣接して配 置することができ、該容器は粒子／細胞結合体を運んで容器の少なくとも１個の 内壁部分が磁石手段の磁場内にくるようにさせる。従って、この内壁部分は粒子 ／細胞結合体が保持されている固定位置として機能する。

折りたたみ可能な容器をその内壁部分を磁場内に１きながら平らに圧縮し、細胞 ′ａ縮動物残部らの粒子／細胞結合体の分離を促進するための平らな圧縮手段を 備えることもできる。

特に、第二磁石部材は第一磁石部材の磁場より狭くしかも距離の短い磁場を有し ているのであるが、より強い常磁性粒子保持用の磁石表面と隣接している比較的 強い磁場を有している。好適には、第一磁石部材の磁気範囲はそこに置かれてい る流体容器の幅と実質的に等しい。これにより容器中の常磁性粒子の大部分が磁 場の範囲内となりそして磁石表面に引き付けられる。

粒子手段を含有している容器が血液細胞分離遠心分離器用の柔軟な複数室挿入部 材と無菌的に連結していることも好ましい、そのような挿入部材は該遠心分離器 中で典型的に使用されている使い捨ての血液運搬用の内部柔軟性部分である。

それは本発明に従う容器と一体に無菌的に連結されているため、新たに集められ た血液細胞を挿入部材から粒子手段を有する容器に、それらの間に殺菌性連結部 を設ける必要なしに、無菌的に移すことができる。これにより、本発明に従う使 用が非常に簡単になり、そして無菌状態が保たれる可能性が増加する。

また、希望により粒子手段を有する第一容器を、常磁性粒子手段または他の型の 粒子手段を含有している第一容器からの処理された細胞を受けるための別の柔軟 で折りたたみ可能な容器手段と、無菌的に連結させることもできる。典型的には 、第二の柔軟で折りたたみ可能な容器は上記の第一容器と別の折りたたみ可能な 容器手段の間で密封して無菌的に連結されておりそして配置されている。これは 上記の第二磁石に対して配置されている下流収集区域として作用して、細胞分離 操作中に第一溶液が圧縮されている第一磁気的手段を逃れた粒子／細胞結合体を 収集することができる。第二の柔軟で折りたたみ可能な容器は好適には六角形で あり、反対側の角に入り口および出口を有しており、該第二容器中でそれと連結 している流管に関して一般的に遅い細胞流を生じさせる。流管の直径は典型的に は第二容器の幅の１／４以下である。また、特に磁気的分離中の第二容器を通る 流路は非常に浅くすべきであり、典型的には０．０２−０．１インチである。

さらに、本発明に従い下記の工程を含む方法を実施することができる。患者から の血液を第一容器中で集めるかまたは患者を血液分離遠心分離器とつないで遠心 分離器を操作して細胞濃縮物を製造し、それを第一容器中に集める。第一容器を 密封する０粒子手段があらかじめ容器中にない場合には、それらを容器中にある 種の無菌的方法で入れるか、または容器内に配置されている内部容器を容器の外 部から破壊してそれらを容器内に放出させる。このようにして細胞および粒子手 段を混合する。次に、あらかしめ一体的に連結されていない場合には第一容器を クランプで挾まれている分離セントの入り口と連結させる。第一容器および第一 容器と分離セント残部との間の希望する第二室の両者が磁気分離器手段中に置か れている。第一磁石は今は希望する細胞と結合されている粒子手段の粒子を引き 付けて、粒子手段を第一袋中に分離セントに向かう製法の残りの内容物として保 持する。同じ原理が第二磁石の影響下にある第二室中でも起きて、粒子手段およ び付着細胞が第一容器の内容物の残部と共に下方に流れる可能性を排除または大 きく減少させる。

次にクランプを開くかおよび／またはポンプを作動させて第一容器からの流を第 二容器中に流し始めそして第二磁石の磁場を越えて分離セントの貯蔵容器中に流 す。次に貯蔵容器を密封し、その後に、貯蔵容器を任意に取り外す。

次に磁石を除去しそして付着細胞を流して、１個以上の貯蔵容器が純粋な細胞／ 粒子結合体を含有しながら他方の貯蔵容器が第一容器の残存内容物を含有してい る。この後に、一般的方法を使用して粒子手段の粒子を付着細胞から分離し、次 に細胞を遠心分離または例えば濾過もしくは磁気的分離の如き他の希望する手段 により分離し、そして純粋な細胞貯蔵用の容器に送る。粒子と細胞との間の連結 を切るために使用される手段はもちろん特定の結合剤に依存している。例えば、 粒子手段を特定の希望する細胞用の抗体で被覆することもでき、その結果として 細胞が粒子手段と結合する。次に、結合を切ろうとする時には、適当な試薬を使 用して結合を切ることができる。

本発明の方法の利点は、本発明の磁気的分離システムをバッチ方法で細胞ａＷ物 と共に使用することである。細胞濃縮物では、分離しようとする特定の細胞集団 が比較的高濃度で存在しており、それは分離力学にとっては好ましい傾向である 。別の利点は、血液細胞を分離しようとする状況下では非−特定細胞反応を減少 させる予備的な典型的遠心分離細胞分離方法により多くの望ましくない血液細胞 型はすでに数量的に大きく減じられており例えば、最小の赤血球細胞、血小板、 および顆粒球汚染を伴うリンパ細胞濃度の収集を血液細胞分離器を用いて実施で きる。

さらに、本発明の条件下における細胞４縮物への粒子手段粒子の導入により、粒 子手段を有する容器内で貯蔵しながら一定容量条件下で培養が起きる。従って、 粒子／細胞結合体の生成用の好ましい最終的培養条件をさらに容易に得るために 、システム溶液組成物を遠心分離することができる。次にこれらの条件を非常に 応用自在な方法で特定目的用に最適にできる。

粒子／細胞結合体のそれ以後の分離も本発明の条件下では有利であり、分離時間 は比較的迅速であり、しかも最初のｉ動物中の細胞型が少ないなら望ましくない 汚染細胞の数の少ない最終的生成物を与える。

上記の如く、粒子手段と共有結合されている物質は、例えば、抗体、抗原、蛋白 質、糖蛋白質、多Ｗ類、脂肪多ｍ類であることができる。該物質は、核酸、脂質 分子、または分離しようとする細胞集団に対する選択的な結合親和力を示す物質 の合成的にもしくは化学的に改質された成分であることもできる。そのような化 学的共存結合用に使用される方法は周知であり、そして親和クロマトグラフィー および他の選択的吸着用途用の結合されたマトリックス物賀の製造において使用 されている。セファロースに対する共有結合技術、ゲル化、または他の球の例は 、下記の文献中に見られる；ハビーブ（Ｈａｂｅｅｂ）、「免疫吸着剤の新規な 製造（Ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏ ｒｂｅｎｔｓ）Ｊ、バイシミ力・工・バイオフィジカ・アクタ（Ｂ　ｉ　ｏ　ｃ 　ｈ　１ｍ１ｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ）、６７３　（１９ ８１）、５２７−５３８ｉカンビニル（Ｃａｍｂ　ｉ　ｅ　ｒ）他、「単離され たホスホリルコリン結合用リンパ細胞。■０機能的抗原結合用細胞の固相吸着剤 型乱用の分裂可能な架橋結合剤の使用」、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル ・メソンズ（Ｊ。

ｕｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、５１（１９ Ｂ２）２０９−２２１　；およびボナファス（Ｂｏｎｎａ　ｆ　ｏｕｓ）他、「 分裂可能な水銀〜硫黄結合により固定された配位子」：ジャーナル・オブ・イミ ュノロジカル・メリンス（Ｊｏｕｎａｌ　ｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　 Ｍｅｔｈｏｄｓ）、５８　（１９８３３）、９３−１０７゜本発明の粒子手段を 懸濁させられる溶液は緩衝食塩水溶液であることができ、それは例えばアルブミ ンの如き蛋白質を含有することができそして不均質な細胞ｅ４縮物および粒子手 段と結合する生物学的結合用物質の生理的条件と相客性である。この溶液は、球 または粒子と共有結合される物質に殺菌性を付与するようなそれの化学的組成お よび性質に構成することができる。さらに、球または粒子懸濁液を不均質な細胞 ａ動物に加える時には生成した混合物の性質が球または粒子結合体を生成する傾 向があるような溶液を化学的組成および性質で構成することもできる。

例えば、不均質な細胞混合物または′ａ縮動物骨髄製剤であることができ、そこ では細胞を細胞濃縮遠心分離器などの中でさらに濃縮することができる。さらに 、不均質な細胞混合物は組織誘導細胞懸濁液またはコ亥遠心分離装置を用いて末 梢血液から製造された細胞′ａ、縮物動物ることもできる。後者の例は、例えば 前記のＣ３３０００血液細胞分離器またはオートフェレシス（Ａｕｔｏｐｈｅｒ ｅｓｉｓ）−Ｃ装置の如き血液細胞分離器を用いて製造された血小板、リンパ細 胞、顆粒球、単核細胞、または末梢骨髄幹細胞製剤である。

°　血液細胞分離器の遠心分離能力を用いて不均質な細胞ｆＡ縮物中での非結合 細胞から粒子／細胞結合体をそれ以後に分離できるようにするためには、該シス テム中で使用される球または粒子を特定の寸法および特定の比重性質に関して選 択することができる０例えばフィコルーハイバク（Ｆ　ｉｃｏ　Ｉ　Ｉ−Ｈｙｐ ａｑｕｅ）またはペルコル（Ｐｅｒｃｏｌｌ）の如き溶液を使用してこの分離を 促進させることができる。

粒子手段の球または粒子は多数の異なる物質、例えばポリスチレン、ラテックス 、プラスチック共重合体、ガラス、合成的に製造されたゲル球などからなること ができる。好適には、該物質は良好な機械的性質を有しており球または粒子の剥 離または破壊を防止し、そして容易に化学的共有結合が可能となるものであろう 。

球または粒子がマグネタイト粒子の周りで生成して、上記の如き磁石を使用して の球または粒子／細胞結合体の分離を可能にすることが好ましい。例えば、１９ ８７年１０月２６日に出願された「磁気的に応答する重合体粒子の製造方法およ びそれの用途」という名称のチェオーフーエイＪ、ワン（Ｃｈａｅｏ−ｈｕｅｉ 、Ｊ、Ｗａｎｇ）他の特許出願番号１１３．２９４中に記されている如き方法に 従い粒子を製造することができる。

本発明で使用される粒子手段の典型的な寸法は、約２−１０ミクロン、好適には 約３−５ミクロン、であることができる。粒子を液体懸濁液状で加えて、典型的 には濃いスラジ状の物質を製造することができる。

１０ｍ１程度の該液体懸濁液を、１０万一２０＃個の粒子を典型的には含んでい る分離用の細胞を受けるための袋の中に入れることができる。粒子が長すぎる時 間にわたって袋内に保持されることがいずれの理由、例えば袋の壁との相互作用 のために、望ましくない時には、それらを例えば殺菌性連結器の如き一般的手段 により別個に袋に加えることができ、またはそれらを袋内の詭い容器内に入れて おき使用時に破壊して袋の内部にこの脆い容器から加えることもできる。

上記の如く、本出願で使用される種々の容器は好適には本発明に従う処理中の殺 菌性連結の必要性を避けるためにそれらの最初の製造時に一体的に一緒に連結さ れている。しかしながら、それらを殺菌性連結器と共に連結することもでき、そ れらの多数の設計、例えば米国特許番号Ｒｅ、３２，０５６のもの、は周知であ る。

ニューヨーク州グレート・ネックのダイナル・カンパニーは、本発明に従い使用 できる常磁性微細球を製造している。

典型的な血液細胞分離用では、粒子手段の微細球の使用数は約１０万一１億個で ある。上記の如き第一および第二の磁気的分離器を使用する時には、微細球およ びそれと結合している細胞の細胞懸濁液からの除去は定量的であり、本発明の磁 気的分離システムを通過した後の下方流中では事実上微細球が見られないことが 見いだされている。

凹皿Ω記載 図１は細胞を選択的に分離するための本発明に従う装置の部分的に図式的な平面 図である。

図２は図１の装置と共に使用される磁気的分離装置の一部の透視図である。

図３は図１の装置と共に使用される磁気的分離器の他部分の透視図である。

図４は操作位置における分離システムの透視図である。

図５は図２−４の磁気的分離器中で使用された複合磁石の平面図である。

図６は図５の磁石の端面図である。

図７は図２−４の磁気的分離器中で使用された第二複合磁石の端面図である６特 定実施倒ｐ説朋 図１を参照すると、本発明に従い不均質な細胞混合物から細胞の個々の集団また は集団群を分離するための使い捨てシステム１０が開示されている。

本発明と共に使用できる細胞４縮器部分１２が図式的に示されており、そしてそ れは米国特許番号４，３７９，４５２または４．４１０，０２６中に示されてい る如きデザインであることができ、または細胞４縮用の周知の装置中で使用可能 な細胞濃縮器部品であることもできる。例えば、バクスター・ヘルスケア・コー ポレーションにより販売されているＣ３３０００”°九分離システムを使用する ことができ、或いはバクスター・ヘルスケア・コーポレーションにより販売され ているオートフェレンスーＣ４，８・分離システムまたは他の同様な希望する装 置を使用することもできる。

遠心分層器システム】２の出口１４のところで、例えば濃縮器システム１２中で 全血から分離されたリンパ細胞の如き希望する細胞集団を供給することができる 。多分他の白血球細胞と混合されているであろうリンパ細胞が柔軟な導管１６を 通って一般的に従来デザインの柔軟で折りたたみ可能な容器１８の中に行き、該 容器は一定の白血球範晴の細胞壁中の特定標識蛍白質に対する抗体または他の細 胞結合剤でさらにコーティングされている例えばポリメチルメタクリレートの如 きプラスチックでコーティングされている酸化第二鉄の如き常磁性物質を含むミ クロン寸法粒子の粒子手段を含有しているため、白血球および粒子２０が互いに 選択的に結合して、残りの白血球および他の細胞は除外される。

本発明の装置は、柔軟で折りたたみ可能な容器１８と柔軟で折りたたみ可能な容 器２４との間を連結している柔軟な管状物２２も有しており、一端では管状物２ ２をそして他端で出口管状物２６と連結している。管状物２６は管状物２８．３ ０に分岐しており、それらのそれぞれは他の柔軟で折りたたみ可能な容器３２． ３４と連結している。

細胞濃Ｉｉｉ器部分１２は好適には柔軟な容器１８と一体的に連結しており、８ 亥連結は希望により一般的な殺菌性連結器システムによりなされている。さらに 、粒子２０を容器１８の外部に貯蔵しそして殺菌性連結器手段と連結させること もでき、またはそれらを袋２８の脆い容器内部中に置くこともでき、ここで容器 は使用時に破壊できるため、ある程度の接着がそこで起きている際にも粒子２ｏ は袋の壁と過剰時間にわたって相互作用をしない。もちろん、粒子が袋の壁と相 互作用しない場合には粒子２０を袋内に自由に置くことができる。

細胞を分離しそして分Ｈ’装置１２中で濃縮しそして袋１８に移した後に、第一 の細胞−含有容器１８を線１６の熱密封およびクランプ３６の操作により密封す ることができる（しかし、クランプ３６は操作の初期段階に閉じることができる ）、微細球または粒子２０がすでに容器に加えられていない場合には、それらを その時点で加え、その後、第一容器の内容物、特に細胞および微細球または粒子 、を静かに混合することができる。この時点で、選択された粒子細胞と粒子また は微細球２０の抗体被覆の間で結合が生しる。

その後に、容器１８がそこに示されているように室２４から始まり袋３２．３４ を含んでいる本発明の下流セット部分と一体的に連結されていない場合には、そ のような連結を殺菌性の無菌的方法で、例えば周知のデザインの殺菌性連結器シ ステムの使用によるような一般的手段により、行うことができる１図４の好適態 様では、種々の部品が一体化されており、連結の不便さおよび容器内容物の汚染 危険性が避けられる。

その後に、容器１８および２４は磁気的分離器４０に入れられ、該分離器は図２ −７中に種々の面から示されている。

分離器４０は、磁石組み立て部品４４．４６を有する上部の基礎部品４２を備え ている。上部の回転可能なヒンジ付き圧縮具部品４９は平らな表面下部分５０を 含んでおり、そしてそれはベース４２により支えられており、それの閉しられた 位置の磁石４６と重なっている。上部のベース部品４２は従ってそれぞれが磁石 ４４および磁石４２と対している２個の空間を与え、それらの磁石はそれぞれ袋 １８および袋２４を受けるように配置されている０通路４７および空間４８が管 状物２２用の余地を与えており、一方通路５１が管状物２６を受けるために備え られている。

さらに、下部のベース部品５２はクレードル区域５４中の上部ベース部品４２を 受けるために配置されていて、管状物２６がローラーポンプ組み立て部品５３と 連結できて、袋１８から出た細胞流を中間袋２４を通して容器３２または３４の 一方または他方に調節しながらポンプで送る。

ヒンジ付きカバー５６が配置されており、上部ベース部品４２中に設置されてい るように袋１８の頂部で下になっている。上部の回転可能なヒンジ付き圧縮具部 品４９が同様な方法で柔軟な室２４の上で下方に圧縮させている。特定の圧縮具 部品４９の目的は、処理中の室２４の流路の厚さを正確に規定して付随している 磁石を越える波路を例えば約０．０５インチのような非常に浅い深さにすること である。同様に、磁石４４は室１８と関連するように配置されている。ここにさ らに詳細に記載されている如く、磁石４４および４６はそこに配置されている容 器、すなわちそれぞれ容器１８および２４中を通過する常磁性粒子を捕獲しそし て保持するために適切に構成された磁場を与えるように設計されている。これに 関すると、磁石４４は粒子の比較的大きい割合を捕獲する絶えに磁石４６より大 きい磁場範囲を有するであろう。このため、その中をｉｉ１遇する細胞が磁石４ ４．４６により発生する場により強く影響を受けるような位置になる。従って、 磁気法と結合された細胞は磁石の一方または他方に保持されるであろう。

適当な上部ベース部品４２を有する磁気的分離器装置４０を使用する利点は、上 部ベース部品４２が使用前に４°Ｃ程度の温度に再冷蔵できることである。従っ て、冷たい磁石は細胞を操作中ムこ冷たく保ち、同時に磁場強度も幾分増加させ る。冷たい細胞は比較的不活性でありしかも比較的良好に保存される。また、低 温においては、常磁性法と非−特異的細胞との相互作用を減少できる。例えば、 存在している食細胞は低温に保たれる時には摂取使用可能な球の中で比較的不活 性である。

容器１８．２４が磁石４４．４６上に置かれている時には、クランプ３６を開く ことができ、そして回転可能な圧力部品５６を静かに閉して容器１８を平らに圧 縮しそして磁石４４上に残っている細胞および袋から出たそれらの担体液体を圧 縮できる。圧縮器５６はプラスチック袋１８が絞られて袋からの効率的な流が比 較的一定に調節されるような方法で磁石４４に磁気的に引き付けられるような寸 法および配置にされている磁気化可能金属片を含有することもできる。一方、ロ ーラーポンプ５３を作動させて、細胞およびそれらの担持液体を袋１８から流出 させることもできる。細胞およびそれらの担持液体が管状物２２を通って流れる につれて、磁石４４からの磁場は粒子または微細球２０およびそれらが結合して いる細胞を引き付けて、そのような微細球２０を磁石４４と最も近い袋ユ８の内 壁５７（図６）に対して一般的にはしっかりと固定させ、粒子２０およびそれら の結合細胞は保たれながら、残存細胞および懸−／ＩＡｆ１．体は管状物２２を 通って袋１８から出る。

粒子２０および結合している細胞が第一磁石４４を逃れた場合には、それらを容 器２４と第二磁石４６との間の相互作用により収集することができ、該磁石の下 でそれは内壁５９（図７）に対して保持される。相当な流条件下でも、拡大され た容器２４はその中を通る比較的遅い流条件を示している。ヒンジ付き圧縮具部 品４９は、圧縮具部品４９をその場で適当な間隔および量の磁力を用いて保持す るような寸法にされている４個の金属ボルト８１を含有している。圧縮具部品４ ９の表面５０は正確にｌ！械製作されており、容器２４中の流路の厚さを正確に 規定している。この流路の浅い深さにより、存在している粒子または微細球を磁 石４６の磁場の影響下に押し流して、容器２４の内壁５９の上に保ちながら、残 りの細胞および液体は容器２４から出て管状物２６を通って例えば袋３２中に流 れる。そのような環境下では、管状物３０ははずされて、袋３４は空に保たれて いる。

次に圧力部品５６を使用して袋１８から出た全ての存在している可能性のある液 体および細胞を絞り、少量の細胞−相容性懸濁液体をシステム中に殺菌性連結器 口６１、充填用の管３３、または他の一体的に連結された容器を介して通過させ て、常磁性粒子と未結合の残存細胞をシステムを通して袋３２に流す。

次に、−ｉ的なりランプ手段により管状物２８を閉しそして管状物３０を開く。

システムを磁石４４．４６の影響下か−ら除去し、そしてさらに懸濁液／溶液を 容器１８中に通して粒子２０と結合された細胞を管状物２２を通し、室２４を通 して流して、そこに保持されている結合された細胞を吸収し、そして容器３４中 に流す。

次に、容器３２．３４をシステムから一般的方法での管状物２日、３０の密封お よび切断により分離し、ここで細胞の希望する特定集団は細胞主体から分離され そして分離用途用の分離容器３４中に置かれる。

上記の如く、磁石４４は磁石４６より大きい磁場範囲を有するように設計されて いる。好適には、この磁場範囲は容器１Ｂの幅と少なくとも等しいものから約３ ／４までであり、そしてより好適にはその幅と実質的に等しい。これにより、容 器１日内の常磁性粒子の大部分は磁場により捕獲されそして磁石４４の表面に引 き付けられる。従って、磁石４４は約１／２インチー１インチの、好適にはｌ／ ２インチ−３／４インチの、磁場範囲を有する。

典型的には、比較的大きい磁場範囲を有する磁石は比較的低い表面磁場強度を有 している。希望する磁場範囲を与えるが実質的な表面磁場強度も保持している粒 子磁気的組み立て部品が、図５および６に参考に記載されている。磁石組み立て 部品４６は、同様な構造に製造することができる。磁石組み立て部品４４は、鋼 柱部品６６により分離されておりしかもそれと接触している棒磁石６４の積層を 含んでいるように示されている。これは「ＮＪおよびｒ５．の文字により示され ており、それらのそれぞれは互いに面している各磁石のまとめられた北極または 南極を示している。棒磁石６４は長い側部６８および端部７０を規定しており、 そして棒磁石のＮ極およびＳ極は図５に示されている長い側部の反対の対に沿っ て規定されている。好適には棒磁石はネオジミウム、鉄およびホウ素の高磁性合 金製である。図５では、示されている磁石組み立て部品の面７２は使用時に袋１ ８の外壁に対して静止しているため、磁石組み立て品４４からの磁場は粒子２０ の保持のために容器１８中を通る。

図６に関すると、磁石組み立て部品４４の端面図が示されており、面７２は図５ に示されている面である。そこに示されている如く、種部品６６により分離され ている磁石６４は磁性化不能なアルミニウム板７４などの上に静止して、各磁石 および種部品を支持している。

種部品６６がそれぞれ棒磁石６４から離れている平行な端部面に沿って角度の付 いている溝７６を規定しており、そしてそれは組み立て部品４４の面７４と反対 側であり、その面は本発明における如き常磁性粒子中で生成した粒子／細胞結合 体を保持する固定位置である。

棒磁石６４、種部品６６、および支持Ｗ７４を一般的方法で非−磁性セメントと 一緒に結合させることもでき、または適当なりランプもしくは保持片を使用する こともできる。ここで使用するのに適している磁石は、ケンタンキー州エリザベ スタウンのクスシブル・マグネティックス・カンパニーから得られる。磁石組み 立て部品４４は、厚さが０．５０インチである磁石６４および厚さが０，２５イ ンチである種部品６６を含有している。これは、磁石の表面で７０００−９１０ ０ガウス（平均８３００ガウス）の局在最大値を有する磁場を発生させ、そして それは磁石表面から１ｃｍの距離のところで１１００−１７００ガウス（平均１ ４００ガウス）に減少する。この磁石組み立て部品は磁石表面に比較的強い磁気 保持力および比較的良好な磁気［範囲逸脱、ｌ　（ｒｅａｃｈ　ｏｕｔ）力の両 者を与えて、磁石表面からある距離（１″まで）では球を破壊させる。

磁石組み立て部品４６は、厚さが、２５インチである磁石６４および厚さが００ １インチである種部品６６を含有している。これは、磁石の表面で７３００−８ ０００ガウスの局在最大値を有する磁場を発生させ、そしてそれは磁石表面から Ｉｃｍの距離のところで８０−５００ガウスに減少する。磁石組み立て部品４４ と比べて、磁石組み立て部品４６は磁石表面で比較的強い磁気保持力を有してい るが比較的少ない磁気「範囲逸脱」力を有しており、従って比較的狭い磁場を有 している。第二の柔軟な容Ｂ２４は磁石４６の特定磁場の利点を与えるように設 計されている。第一容器１８は細胞分離用に磁石組み立て部品４４の上に静止す るように示されている。

従って、無菌的な簡素化された方法で４縮細胞の特定集合部分を単離するための システムが提供され、該細胞は希望する目的用に指示されているように分離でき る。

下記の実施例および本出願の他の開示は説明目的用にだけ供されており、そして 下記の請求の範囲に記載されている本出願の発明の範囲を限定しようとするもの ではない。

実施例１ この実施例は、全血から集められたＴ−−−ルバー／インチユーザーリンパ細胞 の分離における本発明の装置および方法の特定適用を示している。

籠゛′の１１浩 約５００ｍ１Ｏ全血を標準的フェンワル・ソデューム・サイトレート・ダブル・ ブランド・パック（Ｆｅｎｗａｌ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃ１ｔｒａｔｅ　ＤｏｕｂＩ ｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｐａｃｋ）中で集め、そして２個のパックに分けて各パックを ２９０ｍ１とした。ヘスパン・ヘタスターチ（Ｈｅｓｐａｎ　Ｈｅｔａｓｔａｒ ｃｈ）（，５５ｍ１）を各パ、りに加え、そしてパンクを前後運動で静かに傾け ることにより内容物を混合した。赤色細胞を自然に沈澱させ、そして分子状細胞 を含有している血漿層をフェンヮル（Ｆｅｎｗａｌ）血漿抽出器および標準的移 動管セットを使用して標準的フェンフル６００ｍ１移動パックに移した。該移動 パンクを遠心分離して血漿から細胞を粒状化させ、そして血漿を血漿抽出器を使 用して別の移動パンクに移した。１０％の牛胎児血清を含有している８０ｍ１の ハンクス・バランスド・ソルト・ソリューション（ＨＢＳＳ）を加えそして袋を 前後に静かに傾けることにより、細胞を再懸濁させた。細胞懸濁液の検定試料を ２％酢酸中で計数しそして細胞懸濁液に関する２、８ＸｌＯ’単核細胞の合計細 胞収穫量を計算した。細胞の計数後に、別の１００ｍ１のＨＢＳＳを移動パック に加え、そして細胞懸ｉ液を混合した。細胞懸濁液の１／２を第二の移動バック に移して、各袋中の１００ｍ１のＨＢＳＳ中で合計で約１．４Ｘ１０’この単核 細胞を与えた。

−人　か　の１ＩＩＩ′告 約１グラムの常磁性法（アミノ表面官能基を有するバンデンクス球）を食塩水溶 液で５回洗浄し、そして５０ｍ１のガラス試験管内の２０ｍ１食塩水中に再懸濁 させた。１．０ｍｌの５ＰＤＰの２０ミリモル溶液および無水エタノールからな る新たに製造されたＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピ オネート（ＳＰＤＰ）を試験管に加えた。管を４°Ｃにおいて３０分間にわたり 端から端まで回転させて、チオール誘導体を製造した。次に球状製剤を燐酸塩緩 衝食塩水中で５回洗浄し、各洗浄後に球を磁石で集めた。最後に、球を２０ｍ１ の燐酸塩緩衝食塩水中に再懸濁させた。

ハッカ不ズミの抗−Ｌｅｕ３ａ抗体（ＣＤｄ型抗体−２ｍ１の燐酸塩緩衝食塩水 中の２ｍｇ）をＯ，１ｍｌの無水エタノール中２０ｍＭ５ＰＤＰに加えた。混合 物を５００ｍ１の燐酸塩緩衝食塩水に対して一夜透析させた。

生成した抗体溶液を５０ｍ１のガラス遠心分離管中で誘導化された球！！！濁液 に加えた。管を室温において端から端まで回転させて抗体を球に結合させた。次 に、球を燐酸塩緩衝食塩水で５回洗浄し、そして３０ｍ１の燐酸塩緩衝食塩水中 に再懸濁させた。

このようにして、生じた抗体はピリジルジチオ活性基を運びながら、球はそれら のジチオスレイトール処理のために結合されたスルフヒドリル活性基を運んでい る。従って、まとめると、抗体および球は縮合反応から生したジスルフィド結合 により化学的に一緒に結合され、２−チオールピリジンが副生物として分離され る。

入れ−ＣＤ　に・１　〕の４ ４３３００ｍの上記の如くして製造された抗体〜結合法（７Ｘ１０ｑ個の球）を 上記の如くして製造された細胞懸濁液の各袋に２１ゲージ針付き２０ｍ１注射器 を用いて加えた。生成した懸濁液は５対１の球対細胞の比を有しており、そして それを静かに混合し、次にコール−バーマー回転器の上に４の設定値で３０分間 にわたり４℃において置いた。球および細胞懸濁液を含有している袋１日（図１ ）は、これも図１に示されている拡大室２４中で連結している管２２．２６を通 して、６００ｍ１のフェンヮル移動バック３２と連結されていた。袋１８は管セ ットの充填管３３を通して１，０００ｍ１の生理的食塩水溶液袋とも連結されて おり、容器１８および空の移動パンク３２０間のセットの充填を可能にしていた 。

生成した相互関連している袋の充填後に、システムを特に図２に示されている如 く上部磁石台４２中に設置し、袋２８は区域４４中に置かれており、そして容器 ２４は区域４６中に置かれていた。適当な管状物２２は通路４７を通っている区 域４日中に貯蔵されており、一方、管２６は通ｆｍ５１中に設置されており、そ してローラーポンプ５３を通って細くなっていた。各磁石４４．４６は細胞の連 続的冷却のために約４°Ｃに予備冷却されていた。上部台４２を底部台５２上に 設置させながら、ヒンジ付きカバー４９．５６を次に閉した（図４）。

結合されたＣＤ４抗体を介しての球に対する適当な細胞の完全結合を可能にしそ して磁石４４に隣接している袋１Ｂの内表面における生成した球−細胞結合体の 最大成熟を可能にするための約５分間が経過した後に、ローラーポンプ５３を作 動させて毎分１０ｍ１の流体速廣で収集袋３２中にポンプで加えた。袋１８から 逃げた球−細胞結合体を袋２４中の第二磁石４６の影響下において磁石と隣接し ている室２４の内表面上で破壊させ、一方、球とそのように結合されていない細 胞は流体と共に収集袋３２に流出した。

流体の袋１８および容器２４を実質的に空にした後に、袋１８中の球〜細胞結合 体を１００ｍ１の生理的食塩水中に再懸濁させながら、袋１８および容器２４を 各磁石上のそれらの位置から除去し、そしてそうしながら管２６を通る流を閉し た。その後に、袋１８および容器２４を上部磁石台４２上のそれらの位置に再配 置し、そして懸濁している食塩水溶液を袋１８からローラーポンプ５３により前 記の如く管２６を通って収集袋３２に、常磁性味と結合していない残りの細胞と 共に、除去された。

次に、管２６を通る流を閉じた後に、袋１８および容器２４を再び磁石の影響下 から取り除いた。袋１８および容器２４中の球−細胞結合体を１００ｍ１の２５ ｍＭジチオスレイトール含有生理的食塩水中に再懸濁させて、細胞と球との間の 結合を破壊させた。袋１８および容器２４を回転器上に４”Ｃにおいて２０分間 装いた。次に、袋１８および容器２４を１リツトルのフェンワルＰＬ２６９組織 培養フラスコ（図１中では容器３４として表示されている）と連結させた。この 後に、袋１８および容器２４を上部台４２中に再配置し、ヒンジ付き圧縮板を閉 し、そして常磁性球粒子を磁石と隣接してトラップに保持しながら袋の流体内容 物を組織培養フラスコ３４中に流し入れた。

そのようにして、ＣＤ４抗体の作用に対して陽性である遊離リンパ細胞が混合物 中の他の細胞から分離され、そして組織培養フラスコ３４または希望により図１ に特に示されているような血液袋３４中で単離された形で提供される。

袋２４から下方にある分離セント中の残存細胞も比較的多量の生理的食塩水と共 にフラスコまたは袋３４中に流し入れられる。

フラスコ３４中の細胞を遠心分離により集めそして補充グルタミンを含有してい る１００ｍ１のＲＰＭ１１６４０組織培養媒体中に再懸濁させ、そしてその後の 研究のために二酸化炭素培養器中に置くことができる。

実施例Ｉ 細胞が球粒子表面と接触している生物学的製剤により認識できるそれらの表面上 の腫瘍関連抗原を表示している時には、実施例１で開示されている方法と同様な 方法により、一般的に骨髄から下記の型の細胞二Ｂ−リンパ腫、神経芽細胞種、 胸部症、または白血病細胞：を除去することができる。従って、本発明は自生的 骨髄移植前の骨髄細胞の精製方法として使用することができる。

骨髄を一般的細胞分訓器により処理してそこから単核細胞製剤を抽出できる。

二の単核細胞製剤をハツカネズミから誘導されたモノクローン性抗体のパネルを 用いてＩ！瘍細胞に対して培養し、洗浄して過剰の抗体を除去し、そして次に実 施例１に記載されている如くして常磁性味と共に培養し、山羊の抗ハツカネズミ 抗体で被覆して、腫瘍細胞を球と選択的に結合させることができる。次に腫瘍細 胞を実施例１中の如くそこに開示されている型の磁気分離器を用いて除去する。

実施例１ 本発明の使用の別技術として、対移植片宿主疾病を防止するための同種移植の前 に、Ｔ−リンパ細胞を実施例２に記されている単核細胞製剤から除去することが できる。これは、骨髄移植片が癌の治療用にまたは癌治療とは別の放射線露呈後 の骨髄の再構成用に供される場合に、使用できる。この場合には、骨髄からの単 核細胞製剤をハツカネズミのモノクローン性抗体（例えば、抗ＣＤ３）で処理し て、山羊の抗ハツカネズミ抗体被覆球による結合用のＴ−リンパ細胞に標識を付 ける。

実施例（ 実施例２中の如くして骨髄からあらかじめ製造された単核細胞製剤を上記の方法 と同様な方法で処理して、常磁性味と結合されたハツカネズミのモノクローン性 抗体を使用して単核細胞製剤から多性能幹細胞を選択することができる。単離さ れた幹細胞は従って骨髄移植用に使用することができる。この方式を使用して、 対移植片宿主疾病を抑制しながら、実質的にＩｌｌ瘍細胞を含まない自生的骨髄 移植物を提供するために使用できる。そのような単離された幹細胞を遺伝子治療 において使用することもでき、そこでは遺伝子を骨髄移植物としての移植前に幹 細胞中に挿入する。

犬施別五 適当なモノクローン性抗体を使用する実施例１の方法と実質的に同様な方法によ り、肝臓細胞またはインシュリン分泌膵臓ベータ細胞を単離しそしてその後に適 当な培養媒体中で培養して器官移植用に細胞を拡大さゼることかできる。

実施例１ 適当なモノクローン性抗体を使用する実施例１の方法と実質的に同様な方法によ り、例えば破傷風トキソイド充填リンパ細胞の如き細胞毒性Ｔ−リンパ細胞の特 定集団を選択することができる。これらの細胞は実施例１の技術と同様な技術に より分離され、試験管内で増殖されそして自己免疫疾病（例えば無筋力症）に介 在する特定Ｂ−リンパ細胞に対する細胞毒性細胞を目標付けることができる。

この方法で、疾病に介在する細胞をその場で破壊することができる。

ＦＩＧ、　１ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成３年４月１１日

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．特定の細胞集団を不均質な細胞混合物から選択的に分離するためのシステム であり、 選択的細胞濃縮物を該濃縮物の物理的性質を基にして分離することにより該不均 質な細胞混合物から選択的細胞濃縮物を得るための手段、該細胞濃縮物からの一 部だけの細胞と結合可能な物質を連結させて有している粒子手段を有する容器、 該容器中で該細胞濃縮物を該粒子手段と密に接触させて、それにより該粒子手段 を用いて該細胞濃縮物を培養可能にさせ、それにより該細胞濃縮物からの特定細 胞集団を該粒子手段と選択的に結合させて、粒子／細胞結合体を生成するための 手段、および 該細胞濃縮物の残部から該粒子／細胞結合体を分離するための手段を含んでいる 、システム。
2. ２．最初の細胞濃縮物流体容量が培養期間中に該容器内に残っている、請求項１ 記載のシステム。
3. ３．さらに、培養期間中に追加量の該細胞濃縮物を該容器に加えるための手段も 含んでいる、請求項１記載のシステム。
4. ４．該粒子手段が常磁性物質を含んでおり、そして該粒子／細胞結合体を分離す るための手段が該細胞濃縮物の残部未結合部分を該位置から除去しながら該粒子 ／細胞結合体を固定位置に保持させるための磁石手段を含んでいる、請求項１記 載のシステム。
5. ５．該磁石手段が第一および第二の間隔か置かれている磁石部材を規定しており 、該第二磁石部材は第一磁石部材より狭い磁場を与えるがそれの表面では強い磁 気保持力を与える、請求項４記載のシステム。
6. ６．該磁石手段が少なくとも１個の柔軟で折りたたみ可能な容器を該容器の少な くとも１個の内壁部分が該磁石手段の磁場内になるように運びそして配置するた めの手段と隣接して配置されており、該内壁部分は該固定位置として作用してい る、請求項４記載のシステム。
7. ７．該折りたたみ可能な容器を平らに押さえながら該内壁部分を内部に０．０２ −０．１インチの細胞流通路さを与える磁場内にいれて、該細胞濃縮物残部から の該粒子／細胞結合体の分離を促進するための平らに圧縮する手段も供されてい る、請求項６記載のシステム。
8. ８．粒子手段を有する該容器が柔軟で折りたたみ可能な容器である、請求項４記 載のシステム。
9. ９．粒子手段を有する該容器が血液細胞分離遠心分離器用の柔軟な複数室挿入手 段と無菌的に連結しており、それにより、間に殺菌性連結部を形成する必要なし に新たに集められた血液細胞の濃縮留分を該挿入手段から粒子手段を有する該容 器に無菌的に移すことができる、請求項４記載のシステム。
10. １０．請求項４記載のシステム中で使用するための、該常磁性粒子手段を密封し て含有している柔軟で折りたたみ可能な第一容器であり、該柔軟で折りたたみ可 能な容器が該第一容器からの処理された細胞を受けるための別の柔軟で折りたた み可能な容器手段と無菌的に連結されており、該第一容器は血液細胞分離遠心分 離用の柔軟な手段とも無菌的に連結されており、それにより、間に殺菌性連結部 を形成する必要なしに集められた血液細胞の新たに濃縮された留分を挿入手段か ら該第一容器にそして該第一容器から別の容器手段に無菌的に移すことができる ような容器。
11. １１．全分離中に該常磁性粒子手段の追加保持用の磁石手段との相互作用のため に、柔軟で折りたたみ可能な第二容器が該第一容器および該別の折りたたみ可能 な容器手段とそれらの間で無菌的に密封して連結されている、請求項４記載のシ ステム。
12. １２．粒子手段と連結している該物質が抗体、抗原、蛋白質、グリコ蛋白質、多 糖類、脂肪多糖類、核酵、および脂質からなる群から選択される、請求項４記載 のシステム。
13. １３．該細胞濃縮功用の波路が備えられており、それは入り口および出口を反対 側の端部に規定している拡大された柔軟な容器を含んでおり、該入り口および出 口の断面積が該容器の断面積の１／４以下である、請求項４記載のシステム。
14. １４．該容器が六角形であり、該入り口および出口がそれの反対側の角に配置さ れている、請求項１３記載のシステム。
15. １５．特定細胞集団を不均質な細胞混合物から選択的に分離するためのシステム であり、 希望する細胞だけと結合できて粒子／細胞結合体を生成する物質と連結している 粒子手段を有する折りたたみ可能な第一容器、該柔軟で折りたたみ可能な容器を 含んでいる流路を規定する手段、該容器内で該細胞混合物を粒子手段と密に接触 させて、それにより該粒子手段を用いる該細胞混合物の培養を可能にし、それに より該細胞混合物からの特定細胞集団を選択的に該粒子手段と結合させて、該粒 子／細胞結合体を生成するための手段、および 該粒子／細胞結合体を固定位置に保持しながら該細胞混合物の残部未結合部分を 該流路に沿って動かして該位置から除くための順番に該流路に沿って配置されて いる第一および第二の間隔がおかれている磁石部材であり、該第一および第二の 磁石部材は少なくとも１個の柔軟で折りたたみ可能な容器を該容器の少なくとも １個の内壁部分が該磁石手段の磁場内になるように運びそして配置するための手 段と隣接して配置されており、該内壁部分は該固定位置として作用しており、該 第二磁石部材は該第一磁石部材から下方に配置されており第一磁石部材より狭い 磁場を与えるがそれの表面ではそれより強い磁気保持力を与えるような該第一お よび第二の部品 を含んでいる、該システム。
16. １６．柔軟で折りたたみ可能な第二容器が粒子手段を有する該第一容器と無菌的 に密に連結されており、該第一磁石部材が該柔軟な第一容器に対して配置されて おりそして該第二磁石部材が該柔軟で折りたたみ可能な第二容器に対して配置さ れている、請求項１５記載のシステム。
17. １７．第二磁石手段に対して配置されている柔軟な第二容器がそれの反対側の端 部に入り口を規定しており、該入り口および出口の断面積は該柔軟な第二容器の 断面積の１／４以下である、請求項１６記載のシステム。
18. １８．該第二容器が六角形であり、該入り口および出口がそれの反対側の角に配 置されている、請求項１７記載のシステム。
19. １９．該折りたたみ可能な容器を平らに押さえながら該内壁部分が内部に０．０ ２−０．１インチの細胞流通路厚さを与える該磁場内にして、該細胞濃縮物残部 からの該粒子／細胞結合体の分離を促進するための平らに圧縮する手段も供され ている、請求項１７記載のシステム。
20. ２０．粒子手段を有する該容器が血液細胞分離遠心分離器用の柔軟な複数室挿入 手段と無菌的に連結しており、それにより、間に殺菌性連結部を形成する必要な しに新たに集められた血液細胞の濃縮された留分を該挿入手段から粒子手段を有 する該容器に無菌的に移すことができる、請求項１７記載のシステム。
21. ２１．別の折りたたみ可能な容器が粒子手段を有する該柔軟で折りたたみ可能な 第一容器手段と該流路に沿って連結されており、該柔軟で折りたたみ可能な第二 容器は粒子手段を有する該容器と該別の折りたたみ可能な容器とその間に無菌的 に密に連結されている、請求項２０記載のシステム。
22. ２２．第一容器中で血液細胞遠心分離器を摸作して血液細胞を集め、該第一容器 を密封しそして該第一容器を遠心分離器から取り外し、該第一容器中に置かれて いる血液細胞を粒子手段と連結している希望する細胞の一部だけを結合させるこ とのできる物質を有する該第一容器中の常磁性粒子手段と混合し、該第一容器と 管および容器を含む細胞分離装置の入り口との連結を開き、該第一容器と連結さ れている該分離装置の第一容器と第二容器を磁気分離器手段中に設置し、該第一 容器および第二容器中の流を開始させ、ここで該第一および第二容器は該磁気分 離器手段の影響下にあって該粒子手段およびそれと結合している細胞を不動化さ せ、該第二容器および該第一貯蔵容器手段の間の流を閉じ、該第一および第二容 器を磁気分離手段から除去し、該第二容器および第二貯蔵容器手段の間の流れを 開き、そして該粒子手段と結合している細胞の該第二貯蔵容器手段中への流を起 こして、該結合された細胞をシステム中の残りの細胞から分離する段階からなる 、血液細胞の選択的分離方法。
23. ２３．第一容器中に置かれている血液細胞を粒子手段と連結している希望する細 胞の一部だけを結合させることのできる物質を有する該第一容器中に細胞の混合 物を入れ、該第一容器と管および容器を含む細胞分離装置の入り口との連結を開 き、該第一容器と連結されている該分離装置の第一容器と第二容器を第一および 第二の磁石を有する磁気分離器手段中に設置し、ここで該第一磁石は第一容器に 対して配置されておりそして該第二磁石は該第二容器に対して配置されており、 該第二磁石は第一磁石より狭い磁場を与えるがそれの表面において強い磁気保持 力を与え、該第一磁石は該第一容器の幅と実質的に等しい磁性化された範囲を有 しており、該第一容器および第二容器中の流を開始させ、ここで該第一および第 二容器は該磁気分離器手段の影響下にあって該粒子手段およびそれと結合してい る細胞を不動化させ、そして該第二容器から第一貯蔵容器への流を起こして該粒 子手段と結合されていない粒子を受ける段階からなる、細胞の混合物から細胞を 選択的に分離する方法。
24. ２４．該第二容器および該第一貯蔵容器手段の間の流を閉じ、該第一および第二 容器を磁気分離手段から除去し、該第二容器および第二貯蔵容器手段の間の流れ を開き、そして該粒子手段と結合している細胞の該第二貯蔵容器手段中への流を 起こして、該結合された細胞をシステム中の残りの細胞から分離する追加段階も 含んでいる、請求項２３記載の方法。
25. ２５．該磁気分離器手段の影響下で少なくとも該第二容器中の細胞流路が０．０ ２−０．１インチの厚さに保たれている、請求項２３記載の方法。
26. ２６．該第二の容器がそれらの反対側の端部に該細胞流路用の入り口および出口 を規定しており、該入り口および出口は該第二容器の断面積の１／４以下の断面 積を有している、請求項２３記載の方法。
27. ２７．該第二容器が六角形であり、該入り口および出口がそれの反対側の角に配 置されている、請求項２６記載の方法。
28. ２８．該第二容器および該第一貯蔵容器手段の間の流を閉じ、該第一および第二 容器を磁気分離手段から除去し、該第二容器および第二貯蔵容器手段の間の流れ を開き、該第一および第二容器からの第二貯蔵容器手段中への流を起こしながら 該第一および第二容器を該磁気分離器手段の影響下において、それにより該粒子 手段が該細胞と共に粒子手段からの細胞の分離用の第二貯蔵容器手段中に流れる のを防止するという追加段階も含んでいる、請求項２３記載の方法。
29. ２９．該常磁性粒子手段がそれらの表面上に、Ｂ−リンパ腫、神経芽細胞腫、胸 部癌、白血病、Ｔ−リンパ細胞、および幹細胞からなる群から選択された細胞に 対する特定の抗体を運ぶ、請求項２３記載の方法。
30. ３０．常磁性粒子手段を有する第一容器中に置かれている細胞の混合物が骨髄か らあらかじめ分離された分子状細胞の製剤である、請求項２９記載の方法。
31. ３１．該常磁性粒子手段を、比較的大きい細胞群からの分離用に、肝臓およびイ ンシュリン分泌膵臓ベータ細胞からなる群から選択された細胞に対する特定の抗 体でコーティングする、請求項２３記載の方法。
32. ３２．該常磁性粒子手段がそれらの表面上に、細胞の混合物からの分離用に、細 胞毒性のＴ−リンパ細胞の特定集団に対する特定抗体を運ぶ、請求項２３記載の 方法。
33. ３３．該第一磁気手段が該柔軟で折りたたみ可能な第一容器の幅と実質的に等し い範囲を有する磁場を有している、請求項１６記載のシステム。
34. ３４．該第一磁気手段が約１／２インチ−約１インチの範囲を有する磁場を有し ている、請求項３３記載のシステム。
35. ３５．該第一磁気手段が約１／２インチ−約３／４インチの範囲を有する磁場を 有している、請求項３３記載のシステム。
36. ３６．該第一磁気手段が約１／２インチ−約１インチの範囲を有する磁場を有し ている、請求項２３記載の方法。
37. ３７．該第一磁気手段が約１／２インチ−約１／３インチの範囲を有する磁場を 有している、請求項２３記載の方法。
38. ３８．該第一磁気手段が約１／２インチ−約１インチの範囲を有する磁場を有し ている、請求項３１記載の方法。
39. ３９．該第一磁気手段が約１／２インチ−約１／３インチの範囲を有する磁場を 有している、請求項３１記載の方法。