DE68917736T2

DE68917736T2 - System zur magnetischen affinitäts-separation von zellen aus zellkonzentraten.

Info

Publication number: DE68917736T2
Application number: DE68917736T
Authority: DE
Inventors: R Hardwick; William Lake; Michael Prisco
Original assignee: Baxter International Inc
Current assignee: Nexell Therapeutics Inc
Priority date: 1988-10-11
Filing date: 1989-10-10
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2009-10-11
Also published as: JPH0757177B2; WO1990004019A1; JPH04500008A; CA1335181C; DE68917736D1; AU4492789A; EP0438520B1; EP0438520A1

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die Erfindung betrifft eine neue Vorrichtung und ein Verfahren zum Trennen einer spezifischen Zellpopulation aus einem heterogenen Zellgemisch

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Auf dem Gebiet der Zelltrennung ist es üblich, Zellen aus Plasma im Blut zu trennen und außerdem durch Zentrifugieren verschiedene Zellarten wie Erythrozyten von Leukozyten und dergleichen zu trennen. Häufig besteht aber die Notwendigkeit, Zellen zu trennen, die sich von den übrigen Zellen in einer Zellsuspension nur geringfügig unterscheiden. Wenn die Zellen nahezu gleiche relative Dichte haben, können sie nicht durch Zentrifugieren getrennt werden.
Beispielsweise kann es erwünscht sein, verschiedene Arten von Leukozyten aus einem Knochenmarkskonzentrat oder einem peripheren Blutstammzellkonzentrat zu isolieren. Es kann erwünscht sein, eine selektive Trennung von Neuroblastomzellen aus einem Knochenmarkskonzentrat durchzuführen. Es kann erwünscht sein, selektiv spezifische Unterpopulationen von T-Lymphozyten (T-Helfer-Effektor-Zellen oder zytotoxische Suppressor-T-Zellen) aus einem Lymphozytenkonzentrat zu trennen, das unter Anwendung einer Blutzellen-Trenneinrichtung präpariert wird.
Zusätzlich kann es erwünscht sein, Vorläufer von Lymphokinaktivierten Killerzellen (LAK-Zellen), Tumorinfiltrations- Lymphozytenzellen (TIL-Zellen) oder aktivierten Killermonozyten aus Lymphozyten- oder Monozyten-Zellkonzentraten oder aus Gewebepräparaten selektiv zu trennen.
US-A-4 710 472 zeigt eine Vorrichtung zum Entfernen von magnetischen perlenförmigen beschichteten Zellen aus einem heterogenen Zellgemisch unter Anwendung magnetischer Mittel. Dadurch wird die magnetische Trennung von einzelnen Zelluntergruppen aus größeren Populationen in signifikanten Mengen möglich. Das wiederum führt zu neuen Techniken in Forschung und Therapie, wo die gereinigten Zellpopulationen eingesetzt werden, die erhalten werden können.
Die Oberbegriffe der Ansprüche 1 und 20 enthalten Merkmale, die in der Offenbarung von US-A-4 710 472 enthalten sind, und die davon verschiedenen Merkmale der Erfindung sind in den Kennzeichenteilen der Ansprüche 1 und 20 aufgeführt.
Ein weiteres übliches Vorgehen auf dem Gebiet der Zelltrennung verwendet Materialien wie Hohlfaser-Flächenkörpermembranen oder Füllkörperbett- oder teilchenförmige Matrixmaterialien mit physisch adsorbierten oder kovalent daran gebundenen Chemikalien oder Biochemikalien zur selektiven Zelltrennung aus Vollblut oder dergleichen. Diese Vorrichtungen sind ausgebildet, um einen kontinuierlichen Vollblut- oder Blutkomponenten-Zufluß und -Rückfluß zuzulassen. Da diese Vorrichtungen mit normalen Blutdurchflußraten unter Bedingungen arbeiten, bei denen die Konzentration von gewünschten Zellen im Vergleich mit anderen Zellarten sehr niedrig werden kann, ist der Trennvorgang häufig nicht effizient.
Bei der Erfindung werden eine Vorrichtung und ein Verfahren zur selektiven Trennung einer spezifischen Zellpopulation aus einem heterogenen Zellgemisch angegeben. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann das heterogene Zellgemisch zuerst Mitteln ausgesetzt werden, um ein selektives Zellkonzentrat aus dem heterogenen Zellgemisch zu erhalten, indem das selektive Zellkonzentrat auf der Basis der physischen Eigenschaften des Konzentrats getrennt wird. Das selektive Zellkonzentrat wird mit der Vorrichtung und dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet. Insbesondere kann Zentrifugieren als ein erster Trennschritt angewandt werden. Es gibt viele verschiedene Arten von Zellzentrifugensystemen für die Trennung von gewünschten Zelltypen.
Bei der bevorzugten Ausführungsform ist ein flexibler kollabierbarer, keimfrei verschlossener Behälter vorgesehen, in dem sich teilchenförmiges Material befindet, wobei an das teilchenförmige Material bevorzugt eine Substanz chemisch kovalent gebunden ist, die fähig ist, nur an die gewünschten Zellen zu binden unter Ausschluß anderer Zellen. Beispiele einer solchen kovalent gebundenen Substanz können Antikörper, Antigene, Proteine, Glykoproteine, Polysaccharide oder Lipopolysaccharide umfassen. Die teilchenförmige Substanz ist dabei in Langzeitkontakt mit den Behälterwänden oder dergleichen.
Es sind Mittel vorgesehen, um entweder das heterogene Zellgemisch oder das Zellkonzentrat in innigen Kontakt mit der teilchenförmigen Substanz in dem Behälter zu bringen. Diese Mittel können einfach ein flexibles, keimfreies Leitungssystem sein, das eine Verbindung zwischen der Stelle der Bildung des Zellgemischs oder Zellkonzentrats und dem Behälter herstellt, der die teilchenförmige Substanz hat. Eine Inkubation des Zellgemischs oder -konzentrats mit der teilchenförmigen Substanz kann dann zugelassen werden, um eine selektive Bindung einer spezifischen Zellpopulation aus dem Zellkonzentrat an die Teilchen zu bewirken und so ein Teilchen/Zell-Konjugat zu bilden.
Da das neue Teilchen/Zell-Konjugat gegenüber dem Rest der Zellen deutlich verschiedene Eigenschaften hat, ist es dann einfach, es von anderen Zellen beispielsweise durch Zentrifugieren zu trennen. Bevorzugt kann man Teilchen verwenden, die paramagnetisch sind, wonach eine Trennung unter Verwendung von magnetischen Elementen durchgeführt wird.
Das anfängliche Zellfluidvolumen kann in dem Behälter während der Inkubationsperiode verbleiben, während die Bindung an die Teilchen stattfindet. Auch können Mittel vorgesehen sein, um ein zusätzliches Volumen des Zellgemischs oder -konzentrats während der Inkubationsperiode in den Behälter einzuleiten.
Nach der Trennung des Teilchen/Zell-Konjugats von den anderen Zellen, wie oben beschrieben wurde, kann man die spezifische Zellpopulation von den Teilchen trennen oder umgekehrt, beispielsweise durch Aufhebung der Bindung zwischen den Teilchen und den Zellen auf bekannte Weise, so daß eine gereinigte gewählte Zellpopulation zur weiteren Verwendung erhalten werden kann. Alternativ können die ungebundenen Zellen die gewünschten Zellen sein, die von den Teilchen/ Zell-Konjugaten entfernt sind.
Wenn die Teilchen paramagnetisch sind, kann das Teilchen/ Zell-Konjugat durch die Wirkung der magnetischen Elemente an einer festen Stelle zurückgehalten werden, während verbliebene ungebundene Anteile des Zellkonzentrats von dort entfernt werden.
Die magnetischen Elemente, die das Teilchen/Zell-Konjugat zurückhalten, können ein erstes und ein zweites magnetisches Element im Abstand voneinander sein, wobei das eine abstromseitig von dem anderen liegt, so daß das zweite, abstromseitig im Abstand befindliche magnetische Element etwaiges gebundenes Teilchen/Zell-Konjugat aufnehmen kann, das das erste magnetische Element nicht aufgenommen hat, so daß kein Teilchen/Zell-Konjugat mit den verbleibenden Zellen zur Abstromseite geht.
Die magnetischen Elemente können angrenzend an eine Einrichtung zum Tragen und Positionieren des flexiblen kollabierbaren Behälters positioniert sein, der das Teilchen/Zell- Konjugat trägt, um wenigstens einem Innenwandbereich des Behälters zu ermöglichen, innerhalb des Magnetfelds eines magnetischen Elements zu liegen. Daher dient dieser Innenwandbereich als die feste Stelle, an der das Teilchen/Zell- Konjugat zurückgehalten wird.
Eine Flachdrückeinrichtung kann ebenfalls vorgesehen sein, um den kollabierbaren Behälter flachzupressen, während sich der innenwandbereich in dem Magnetfeld befindet, um die Trennung des Teilchen/Zell-Konjugats von dem Rest des Zellkonzentrats zu erleichtern.
Insbesondere besitzt das zweite magnetische Element ein Magnetfeld, das seichter ist (d. h. entfernungsmäßig eine geringere Ausdehnung hat) als das Magnetfeld des ersten magnetischen Elements, aber angrenzend an die Magnetoberfläche stärker ist, um paramagnetische Teilchen stärker zu halten. Bevorzugt ist die magnetische Reichweite des ersten magnetischen Elements im wesentlichen gleich der Breite des daran plazierten Fluidbehälters. Dadurch wird sichergestellt, daß der größte Teil der paramagnetischen Teilchen in dem Behälter innerhalb der Reichweite des Magnetfelds liegt und an die Magnetoberfläche angezogen wird.
Es wird ferner bevorzugt, daß der Behälter, der die teilchenförmige Substanz enthält, keimfrei mit einem flexiblen Mehrkammer-Einsatzelement für eine Blutzellen-Trennzentrifuge verbunden ist. Ein solches Einsatzelement kann der in einer solchen Zentrifuge charakteristisch verwendete, zum Einmalgebrauch bestimmte, Blut führende innere flexible Teil sein. Es kann mit dem Behälter integral keimfrei verbunden sein, so daß frisch gesammelte Blutzellen keimfrei aus dem Einsatzelement in den die teilchenförmige Substanz aufweisenden Behälter überführt werden können, ohne daß eine sterile Verbindung dazwischen hergestellt werden muß. Dadurch wird die Anwendung erheblich vereinfacht, und außerdem wird die Wahrscheinlichkeit erhöht, daß keine Unterbrechung der keimfreien Bedingungen auftritt.
Außerdem kann ein erster Behälter, der die teilchenförmige Substanz hat, mit einer weiteren flexiblen kollabierbaren Behältereinrichtung keimfrei verbunden sein, um behandelte Zellen aus dem ersten Behälter, der die paramagnetischen Teilchen oder Teilchen einer anderen Art enthält, aufzunehmen, falls das gewünscht wird. Typischerweise ist ein zweiter flexibler kollabierbarer Behälter mit dem oben beschriebenen ersten Behälter abdichtend und keimfrei verbunden und zwischen diesem und der weiteren kollabierbaren Behältereinrichtung positioniert. Er kann als abstromseitiger Auffangbereich dienen, der an dem oben beschriebenen zweiten magnetischen Element positioniert ist, um etwaiges Teilchen/Zell-Konjugat aufzufangen, das dem ersten magnetischen Element, gegen das der erste Behälter während des Zelltrennvorgangs gedrückt wird, entgeht. Der zweite flexible kollabierbare Behälter kann bevorzugt Sechseckgestalt haben, wobei Einlaß- und Auslaßöffnung an entgegengesetzten Ecken liegen, um einen allgemein langsamen Durchfluß von Zellen durch den zweiten Behälter relativ zu damit verbundenen Durchflußleitungen zu bewirken. Der Durchflußleitungsdurchmesser ist charakteristisch nicht größer als 1/4 der Breite des zweiten Behälters. Auch sollte die Durchflußbahn, speziell durch den zweiten Behälter, während der magnetischen Trennung eine sehr geringe Tiefe haben, typischerweise 0,508 mm bis 2,54 mm (0,02-0,1 inch).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann ferner ein Verfahren angewandt werden, das die folgenden Schritte umfaßt. Blut vom Patienten kann entweder in einem ersten Behälter gesammelt werden, oder der Patient kann an eine Bluttrennzentrifuge angeschlossen werden, die betätigt wird, um ein Zellkonzentrat zu bilden, das in dem ersten Behälter gesammelt wird. Der erste Behälter wird dicht verschlossen. Wenn sich die teilchenförmige Substanz noch nicht in dem Behälter befindet, kann sie auf irgendeine sterile Weise in den Behälter eingebracht werden, oder ein in dem Behälter positionierter Innenbehälter kann von der Außenseite des Behälters aufgebrochen werden, um die Freisetzung der Teilchen innerhalb des Behälters zu bewirken. Dadurch werden die Zellen und die Teilchen vermischt. Dann wird der primäre Behälter, wenn er nicht bereits integral angeschlossen ist, mit dem Einlaß eines abgeklemmten Trennsets verbunden. Der Primärbehälter und eine gewünschte Sekundärkammer zwischen dem Primärbehälter und dem Rest des Trennsets werden beide in einer magnetischen Trenneinrichtung angeordnet. Ein Primärmagnet zieht die Teilchen der teilchenförmigen Substanz, die nunmehr an die gewünschten Zellen gebunden sind, an, um die teilchenförmige Substanz in dem Primärbeutel zu halten, während der restliche Inhalt des Beutels in Richtung zu dem Trennset strömt. Das gleiche Prinzip wird in der Sekundärkammer unter der Einwirkung eines Sekundärmagneten angewandt, um die Möglichkeit auszuschließen oder erheblich zu verringern, daß teilchenförmige Substanz und daran gebundene Zellen mit dem Rest des Inhalts des Primärbehälters zur Abstromseite fließen.
Dann wird eine Klemme geöffnet, und/oder eine Pumpe wird betätigt, um den Durchfluß aus dem Primärbehälter durch den Sekundärbehälter und über das Magnetfeld des Sekundärmagneten in Speicherbehälter des Trennsets zu initiieren. Die Speicherbehälter können dann dicht verschlossen werden, gefolgt von einer fakultativen Trennung der Speicherbehälter.
Dann können die Magnete entfernt und die anhaftenden Zellen abgespült werden, so daß ein oder mehr Speicherbehälter reines Zell/Teilchen-Konjugat enthalten, während andere Speicherbehälter den restlichen Inhalt des Primärbehälters enthalten. Danach kann ein herkömmliches Verfahren angewandt werden, um die Teilchen der teilchenförmigen Substanz von ihren anhaftenden Zellen zu trennen, wobei die Zellen dann durch Zentrifugieren oder andere gewünschte Mittel wie Filtration oder magnetische Trennung getrennt wenden und in einen Behälter zur Speicherung der reinen Zellen überführt werden. Die Mittel, die eingesetzt werden, um die Verbindung zwischen den Teilchen und den Zellen aufzubrechen, hängt natürlich von dem spezifischen Bindungsmittel ab. Beispielsweise können die Teilchen mit einem Antikörper für die spezifischen gewünschten Zellen beschichtet sein, so daß die Zellen an die Teilchen binden. Wenn dann die Bindung aufgehoben werden soll, kann ein geeignetes Reagens eingesetzt werden, um die Bindung aufzuheben.
Ein Vorteil des Verfahrens ist die Verwendung der magnetischen Trennvorrichtung mit einem Zellkonzentrat in einem Chargenprozeß. In dem Zellkonzentrat ist die zu trennende spezifische Zellpopulation in höherer Konzentration vorhanden, was die Kinetik der Trennung begünstigt. Ein weiterer Vorteil ist, daß zahlreiche unerwünschte Arten von Blutzellen im Fall der Trennung von Blutzellen bereits durch den vorhergehenden, typischerweise durch Zentrifugieren durchgeführten Zelltrennvorgang zahlenmäßig verringert worden sind, um so Reaktionen nichtspezifischer Zellen zu vermindern. Beispielsweise kann das Sammeln einer Lymphozytenzellkonzentration mit minimaler Kontaminierung durch Erythrozyten, Thrombozyten und Granulozyten bei Verwendung eines Blutzellenseparators durchgeführt werden.
Außerdem ermöglicht die Einbringung der Teilchen der teilchenförmigen Substanz in ein Zellkonzentrat unter den oben beschriebenen Bedingungen die Durchführung der Inkubation unter Konstantvolumenbedingungen bei Speicherung innerhalb des Behälters, der die teilchenförmige Substanz aufweist. Somit kann die Zusammensetzung der Inkubationslösung so konfiguriert werden, daß günstige Inkubations-Endbedingungen zur Bildung des Teilchen/Zell-Konjugats leichter erhalten werden. Diese Bedingungen können dann für einen bestimmten Zweck auf eine Weise optimiert werden, die wesentlich vielseitiger ist, als das anderweitig der Fall wäre.
Die anschließende Trennung des Teilchen/Zell-Konjugats wird außerdem auf vorteilhafte Weise erreicht, wobei die Trennzeiten kürzer sind und weniger Zellarten in dem Ausgangskonzentrat ein Endprodukt mit weniger unerwünschten kontaminierenden Zellen ergeben.
Wie bereits gesagt wurde, kann das Material, das kovalent an die teilchenförmige Substanz angelagert ist, beispielsweise ein Antikörper, ein Antigen, ein Protein, ein Glykoprotein, ein Polysaccharid, ein Lipopolysaccharid sein. Das Material kann außerdem eine Nucleinsäure, ein Lipidmolekül oder eine synthetisch oder chemisch modifizierte Komponente einer solchen Substanz sein, die eine selektive Bindungsaffinität für die zu trennende Zellpopulation zeigt. Die Methoden, die für die chemische kovalente Anlagerung dieser Materialien angewandt werden, sind bekannt und werden bei der Produktion von gekoppeltem Matrixmaterial für die Affinitäts-Chromatographie und andere mit selektiver Adsorption arbeitende Verfahren angewandt. Beispiele solcher Techniken der kovalenten Anlagerung an Sepharose-, Gelbildungs- oder andere Perlen sind aus den folgenden Dokumenten ersichtlich: Habeeb, "A Novel Preparation of Immunoadsorbents", Biochimica et Biophysica Acta, 673 (1981) 527-538; Cambier et al., "Isolated Phosphorylcholine Binding Lymphocytes. I. Use of a Cleavable Crosslinking Reagent For Solid-Phase Adsorbent Isolation of Functional Antigen Binding Cells", Journal of immunological Methods, 51 (1982) 209-221; und Bonnafous et al., "Ligands Immobilized Through Cleavable Mercury-Sulfur Bonds.: Journal of Immunological Methods, 58 (1983) 93-107.
Die Lösung, in der die teilchenförmige Substanz suspendiert sein kann, kann eine handelsübliche Pufferlösung sein, die ein Protein wie etwa Albumin enthalten kann und mit den physiologischen Anforderungen des heterogenen Zellkonzentrats und des biologischen Bindungsmaterials, das an der teilchenförmigen Substanz haftet, kompatibel ist. Diese Lösung kann hinsichtlich ihrer chemischen Zusammensetzung und ihrer Eigenschaften so konfiguriert sein, daß sie der Substanz, die kovalent an der Perle oder dem Teilchen haftet, Sterilität verleiht. Außerdem kann die Lösung hinsichtlich ihrer chemischen Zusammensetzung und ihrer Eigenschaften so konfiguriert sein, daß, wenn dem heterogenen Zellkonzentrat eine Perlen- oder Teilchenlösung zugesetzt wird, die Eigenschaften des resultierenden Gemischs für die Bildung des Perlen- oder Teilchenkonjugats günstig sind.
Beispielsweise kann das heterogene Zellgemisch oder -konzentrat ein Knochenmarkpräparat sein, wobei die Zellen in einer Zellkonzentrationszentrifuge oder dergleichen weiter konzentriert werden können. Außerdem kann das heterogene Zellgemisch eine von Gewebe stammende Zellsuspension oder ein aus peripherem Blut unter Verwendung einer solchen Zentrifugiereinrichtung präpariertes Zellkonzentrat sein. Beispiele für letzteres sind Konzentrate von Thrombozyten, Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten oder periphere Knochenmark-Stammzellpräparate, die mit einem Blutzellenseparator wie etwa dem bereits beschriebenen CS3000 Blutzellenseparator oder einer Autopheresis-C-Einrichtung präpariert worden sind.
Die Perlen oder Teilchen, die in dem System eingesetzt werden, können in bezug auf spezielle Eigenschaften von Größe und relativer Dichte so ausgewählt sein, um die anschließende Trennung des Perlen/- oder Teilchen/Zell- Konjugats von den nichtkonjugierten Zellen in dem heterogenen Zellkonzentrat unter Nutzung der Zentrifugier- Leistungsfähigkeit eines Blutzellenseparators zuzulassen. Eine Lösung wie Ficoll-Hypaque oder Percoll könnte eingesetzt werden, um diese Trennung zu vereinfachen.
Die Perlen oder Teilchen der teilchenförmigen Substanz können aus jeder Anzahl von verschiedenen Materialien wie Polystyrol, Latex, plastischen Copolymeren, Glas, synthetisch hergestellten Gelperlen und dergleichen zusammengesetzt sein. Bevorzugt besitzen diese Materialien gute mechanische Eigenschaften, um ein Absplittern oder Zerbrechen der Perlen oder Teilchen zu verhindern, und lassen eine leichte chemische kovalente Anlagerung zu.
Es wird ferner bevorzugt, daß die Perlen oder Teilchen beispielsweise um ein Magnetitpartikel herum geformt sind, um die Trennung des Perlen/- oder Teilchen/Zell-Konjugats unter Anwendung von Magneten zuzulassen, wie oben beschrieben wurde. Beispielsweise können Teilchen entsprechend den Methoden hergestellt werden, die in EP-A-0 344 270 beschrieben sind.
Die typische Größe der bei der Erfindung eingesetzten teilchenförmigen Substanz kann ca. 2-10 um, bevorzugt ca. 3-5 um betragen. Die Teilchen können in einer flüssigen Suspension zugefügt werden, wobei ein typischerweise dunkles schlammartiges Material gebildet wird.
Etwa 10 ml einer solchen flüssigen Suspension können in dem Beutel vorgesehen werden, der die Zellen für die Trennung aufnehmen soll, wobei charakteristisch 100.000 bis zu 20 Billionen Teilchen enthalten sind. Falls es aus irgendeinem Grund unerwünscht ist, daß die Teilchen übermäßig lang in dem Beutel verbleiben, beispielsweise wegen einer Wechselwirkung mit der Beutelwand, können sie dem Beutel auf herkömmliche Weise separat zugesetzt werden, etwa unter Verwendung eines sterilen Verbinders, oder sie können in einem zerbrechbaren Behälter innerhalb des Beutels aufbewahrt werden, der zerbrochen wird, wenn die Verwendung gewünscht wird, so daß sie aus dem zerbrechbaren Behälter in das Beutelinnere gelangen.
Wie oben angegeben, werden die verschiedenen Behälter, die bei der Erfindung verwendet werden, bevorzugt bei der Fertigung integral miteinander verbunden, um die Notwendigkeit einer sterilen Verbindung während der Verarbeitung zu vermeiden. Sie können aber auch mit Hilfe von sterilen Verbindern miteinander verbunden werden, von denen zahlreiche Konstruktionen allgemein bekannt sind, z. B. mit solchen gemäß US-PS Re. 32 056.
Die Dynal Company, Great Neck, New York, stellt paramagnetische Mikroperlen her, die gemäß der Erfindung verwendet werden können.
Bei einer typischen Blutzellentrennung kann die verwendete Anzahl Mikroperlen der teilchenförmigen Substanz zwischen etwa 100.000 und einer Billion liegen. Es wurde gefunden, daß, wenn ein primärer und ein sekundärer magnetischer Separator gemäß der obigen Beschreibung verwendet werden, das Entfernen von Mikroperlen und der an sie gebundenen Zellen aus einer Zellsuspension quantitativ sein kann, wobei nach Durchlaufen der magnetischen Trennvorrichtung praktisch keine Mikroperlen in dem abstromseitigen Ausfluß gefunden werden.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine teilweise schematische Ansicht der Vorrichtung zum selektiven Trennen von Zellen;
Fig. 2 ist eine Perspektivansicht eines Teils einer magnetischen Trenneinrichtung, die mit der Vorrichtung von Fig. 1 verwendet wird;
Fig. 3 ist eine Perspektivansicht eines anderen Teils der magnetischen Trenneinrichtung, die mit der Vorrichtung von Fig. 1 verwendet wird;
Fig. 4 ist eine Perspektivansicht des Trennsystems in der Betriebsposition;
Fig. 5 ist eine Draufsicht auf einen Verbundmagneten, der in der magnetischen Trenneinrichtung der Fig. 2-4 verwendet wird;
Fig. 6 ist eine Endansicht des Magneten von Fig. 5;
Fig. 7 ist eine Endansicht eines zweiten Verbundmagneten, der in der magnetischen Trenneinrichtung der Fig. 2-4 verwendet wird.

Beschreibung der speziellen Ausführungsformen

Fig. 1 zeigt ein Einmalsystem 10 zum Trennen einer individuellen Zellpopulation oder von Zellpopulationen aus einem heterogenen Zellgemisch.
Ein Zellkonzentrationssystem 12, das bei der Erfindung verwendet werden kann, ist schematisch gezeigt und kann gemäß den US-PS'en 4 379 452 oder 4 410 026 ausgebildet sein, oder es kann irgendein Zellkonzentrationselement sein, das in einer bekannten Vorrichtung zur Konzentration von Zellen verwendbar ist. Beispielsweise kann das von Baxter Healthcare Corporation vertriebene Trennsystem CS3000TM verwendet werden, oder es kann das Trennsystem Autopheresis-CTM ebenfalls von Baxter Healthcare Corporation oder jede andere gewünschte, gleichartige Einrichtung verwendet werden.
An der Auslaßöffnung 14 des Zellkonzentrationssystems 12 kann eine gewünschte Zellpopulation bereitgestellt werden, beispielsweise Lymphozyten, die in dem Konzentrationssystem 12 aus Vollblut getrennt worden sind. Die Lymphozyten, die eventuell mit anderen weißen Blutzellen gemischt sind, gehen durch eine flexible Leitung 16 in einen flexiblen kollabierbaren Behälter 18 einer im allgemeinen herkömmlichen Ausbildung, der die teilchenförmige Substanz aus Teilchen in im-Größe enthält, die ein paramagnetisches Material wie etwa Eisen(II)-oxid aufweisen, das mit Kunststoff wie etwa Polymethylmethacrylat überzogen ist, das wiederum mit einem Antikörper oder einem anderen Zellbindungsmittel für die speziellen Markerproteine in der Zellwand einer bestimmten Kategorie von Leukozyten beschichtet ist, so daß die Leukozyten und die Teilchen 20 selektiv aneinander gebunden werden unter Ausschluß der verbleibenden Leukozyten und anderen Zellen.
Die Vorrichtung der Erfindung trägt ferner einen flexiblen Schlauch 22, der eine Verbindung zwischen dem flexiblen kollabierbaren Behälter 18 und einem flexiblen kollabierbaren Behälter 24 herstellt, der an einem Ende mit dem Schlauch 22 und am anderen Ende mit einem Auslaßschlauch 26 verbunden ist. Der Schlauch 26 verzweigt sich in Schläuche 28, 30, die jeweils an weitere flexible kollabierbare Behälter 32, 34 angeschlossen sind.
Das Zellkonzentrationssystem 12 ist zwar bevorzugt integral mit dem flexiblen Behälter 18 verbunden, aber die Verbindung kann mit einem herkömmlichen keimfreien Verbindersystem hergestellt werden, wenn das gewünscht wird. Zusätzlich können die Teilchen 20 entweder außerhalb des Behälters 18 aufbewahrt und mit einem keimfreien Verbindersystem verbunden werden, oder sie können in einem zerbrechbaren Behälter im Inneren des Beutels 18 vorgesehen sein, wobei der Behälter zum Gebrauch zerbrochen wird, so daß die Teilchen 20 nicht zu lang mit den Beutelwandungen in Wechselwirkung treten können, falls dort eine gewisse Adhäsion stattfindet. Selbstverständlich können sich die Teilchen 20 lose in dem Beutel befinden, wenn mit der Beutelwand keine Wechselwirkung erfolgt.
Nachdem die Zellen in der Trennvorrichtung 12 getrennt und konzentriert und in den Beutel 18 überführt worden sind, kann der Zellen enthaltende primäre Behälter 18 durch Thermoschweißen der Leitung 16 und Betätigen einer Klemme 36 dicht verschlossen werden (die Klemme 36 kann allerdings auch in einer früheren Phase des Betriebs geschlossen werden). Wenn die Mikroperlen oder Teilchen 20 dem Behälter nicht bereits zugefügt wurden, können sie ihm nunmehr zugefügt werden, gefolgt von sanftem Vermischen des Inhalts des primären Behälters, also insbesondere der Zellen und der Mikroperlen oder Teilchen. Dabei erfolgt eine Bindung zwischen den gewählten bestimmten Zellen und dem Antikörperüberzug der Teilchen oder Mikroperlen 20.
Wenn der Behälter 18 nicht, wie gezeigt, integral mit dem abstromseitigen Setbereich der Erfindung, beginnend mit der Kammer 24 und umfassend die Beutel 32, 34, verbunden ist, kann danach eine solche Verbindung auf sterile, keimfreie Weise mit herkömmlichen Mitteln hergestellt werden, beispielsweise durch Verwendung eines sterilen Verbindersystems bekannter Konstruktion. Bei der bevorzugten Ausführungsform gemäß Fig. 1 sind die verschiedenen Komponenten integral, um den zusätzlichen Aufwand des Verbindens und die Gefahr einer Kontaminierung des Behälterinhalts zu vermeiden.
Danach werden die Behälter 18 und 24 in dem magnetischen Separator 40 angeordnet, der in den Fig. 2-7 in verschiedenen Aspekten dargestellt ist.
Der Separator 40 trägt ein oberes Basisteil 42, das Magnetanordnungen 44, 46 trägt. Ein oberes schwenkbares, gelenkiges Drückelement 49 weist einen flachen unterseitigen Bereich 50 auf, wird von dem Basisteil 42 getragen und liegt in seiner geschlossenen Position über dem Magneten 46. Das obere Basisteil 42 bildet somit zwei Räume, und zwar an dem Magneten 44 und dem Magneten 46, die jeweils so bemessen sind, daß sie den Beutel 18 und den Beutel 24 aufnehmen. Ein Kanal 47 und ein Raum 48 dienen der Aufnahme des Schlauchs 22, und ein Kanal 51 ist vorgesehen, um den Schlauch 26 aufzunehmen.
Ferner ist ein unteres Basisteil 52 ausgelegt, um das obere Basisteil 42 in einem Lagerbereich 54 aufzunehmen, so daß der Schlauch 26 mit einer Rollenpumpenanordnung 53 verbunden werden kann, um einen kontrollierten Zellfluß aus dem Beutel 18 durch den Zwischenbeutel 24 und in den einen oder anderen der Behälter 32 bzw. 34 zu pumpen.
Eine gelenkige Abdeckung 56 ist positioniert, um nach unten auf die Oberseite des Beutels 18, der sich in dem oberen Basisteil 42 befindet, bewegt zu werden. Das obere schwenkbare gelenkige Drückelement 49 drückt auf ähnliche Weise auf die flexible Kammer 24. Der Zweck insbesondere des Drückelements 49 ist es, eine exakte Definition der Dicke der Durchflußbahn der Kammer 24 während der Bearbeitung vorzusehen, so daß die Durchflußbahn über den zugehörigen Magneten 46 sehr geringe Tiefe von beispielsweise ca. 1,27 mm (0,05 inch) hat. Gleichermaßen ist der Magnet 44 zum Zusammenwirken mit der Kammer 18 positioniert. Wie noch im einzelnen beschrieben wird, sind die Magnete 44 und 46 ausgebildet, um geeignet konfigurierte Magnetfelder zu erzeugen, um paramagnetische Teilchen, die durch die darauf befindlichen Behälter, und zwar die Behälter 18 bzw. 24, gehen, einzufangen und zurückzuhalten. In dieser Beziehung besitzt der Magnet 44 eine größere Reichweite seines Magnetfelds als der Magnet 46, um einen größeren Prozentsatz von Teilchen einzufangen. Das bringt die hindurchgehenden Zellen in eine Position, die von den durch die Magnete 44, 46 erzeugten Feldern stark beeinflußt ist. Somit werden die an magnetische Perlen gebundenen Zellen angrenzend an den einen oder anderen der Magnete zurückgehalten.
Ein Vorteil der Verwendung einer magnetischen Trennvorrichtung 40 mit einem abnehmbaren oberen Basisteil 42 ist, daß das obere Basisteil 42 vor dem Gebrauch auf eine Temperatur in der Größenordnung von 4ºC gekühlt werden kann. Somit halten die kalten Magnete die Zellen während des Betriebs kalt, und außerdem ergibt sich eine gewisse Erhöhung der Magnetfeldstärke. Die kalten Zellen sind weniger aktiv und werden besser konserviert. Außerdem können bei niedrigen Temperaturen Wechselwirkungen nichtspezifischer Zellen mit den paramagnetischen Perlen herabgesetzt werden. Beispielsweise sind vorhandene Phagozyten bei der Aufnahme von verfügbaren Perlen weniger aktiv, wenn sie auf niedrigen Temperaturen gehalten werden.
Wenn die Behälter 18, 24 auf den Magneten 44, 46 liegen, kann die Klemme 36 geöffnet werden, und das schwenkbare Drückelement 56 kann sanft geschlossen werden, um den Behälter 18 flachzudrücken und die Zellen und ihre Trägerflüssigkeiten aus dem Beutel 18 zu drücken, der auf dem Magneten 44 liegt. Das Drückelement 56 kann außerdem magnetisierbare Metallstreifen enthalten, die größenmäßig so bemessen und positioniert sind, daß sie an den Magneten 44 auf solche Weise magnetisch angezogen werden, daß der Kunststoffbeutel 18 gequetscht wird und der Abfluß aus dem Beutel kontrolliert und relativ konstant ist. Alternativ kann die Rollenpumpe 53 aktiviert werden, um zu bewirken, daß die Zellen und ihre Trägerflüssigkeiten aus dem Beutel 18 fließen. Während die Zellen und ihre Trägerflüssigkeiten durch den Schlauch 22 fließen, zieht das Magnetfeld des Magneten 44 die Teilchen oder Mikroperlen 20 und die Zellen, an die sie gebunden sind, an, was dazu führt, daß diese Mikroperlen 20 im allgemeinen fest an der Innenwand 57 (Fig. 6) des Beutels 18, die dem Magneten 44 zunächstliegt, festliegen, wodurch die Teilchen 20 und ihre angelagerten Zellen gehalten werden, während die verbleibenden Zellen und die Suspensionsflüssigkeit durch den Schlauch 22 aus dem Beutel 18 fließen.
Wenn irgendwelche Teilchen 20 und angelagerten Zellen von dem ersten Magneten 44 nicht eingefangen werden, können sie durch die Wechselwirkung zwischen dem Behälter 24 und dem zweiten Magneten 46, auf dem er liegt, eingefangen werden, wobei sie an der Innenwand 59 (Fig. 7) festgehalten werden.
Auch unter signifikanten Durchflußbedingungen zeigt der vergrößerte Behälter 24 relativ langsame Durchflußbedingungen durch ihn hindurch. Das gelenkige Drückelement 49 enthält vier Metallbolzen 81, die bemessen sind, um das Drückelement 49 mit dem richtigen Abstand und der richtigen Magnetkraft in seiner Lage zu halten. Die Fläche 50 des Drückelements 49 ist präzisionsbearbeitet, um die Dicke der Durchflußbahn durch den Behälter 24 exakt zu definieren. Die geringe Tiefe dieser Durchflußbahn veranlaßt alle vorhandenen Teilchen oder Mikroperlen, in den Einfluß des Magnetfelds des Magneten 46 zu driften, um an der Innenwand 59 des Behälters 24 zurückgehalten zu werden, während die restlichen Zellen und Flüssigkeit vorbeifließt, und zwar aus dem Behälter 24 beispielsweise durch den Schlauch 26 in den Beutel 32. In einem solchen Fall kann der Schlauch 30 abgeklemmt sein, um den Beutel 34 leer zu halten.
Wenn dann das Drückelement 56 benutzt worden ist, um die gesamte mögliche Flüssigkeit und alle Zellen aus dem Beutel 18 herauszudrücken, kann eine geringe Menge einer zellkompatiblen Suspensionsflüssigkeit durch das System über die sterile Verbinderöffnung 61, die Vorbereitungsleitung 33 oder einen anderen integral angeschlossenen Behälter geleitet werden, um die restlichen Zellen, die nicht an paramagnetischen Teilchen anhaften, durch das System in den Beutel 32 zu spülen.
Dann kann mit herkömmlichen Klemmeinrichtungen der Schlauch 28 geschlossen und der Schlauch 30 geöffnet werden. Das System kann aus dem Einflußbereich der Magnete 44, 46 entnommen werden, und weitere Suspension/Flüssigkeit kann in den Behälter 18 geleitet werden, um die an Teilchen 20 gebundenen Zellen durch den Schlauch 22, die Kammer 24, in der alle dort zurückgehaltenen gebundenen Zellen aufgenommen werden, und in den Behälter 34 zu spülen.
Dann können die Behälter 32, 34 durch Verschweißen und Durchtrennen der Schläuche 28, 30 auf herkömmliche Weise von dem System getrennt werden, wobei die gewünschte spezielle Zellpopulation von der Hauptmasse der Zellen getrennt ist, und in einen separaten Behälter 34 zur gesonderten Verwendung verbracht werden.
Wie oben angegeben, ist der Magnet 44 ausgebildet, um eine größere Reichweite des Magnetfelds als der Magnet 46 zu haben. Bevorzugt ist diese Reichweite des Magnetfelds wenigstens gleich ungefähr 3/4 der Breite des Behälters 18 und stärker bevorzugt im wesentlichen dieser Breite äquivalent. Dadurch ist sichergestellt, daß ein Großteil der paramagnetischen Teilchen in dem Behälter 18 von dem Magnetfeld eingefangen und zur Oberfläche des Magneten 44 angezogen wird. Infolgedessen hat der Magnet 44 eine Magnetfeldreichweite von ca. 12,7-25,4 mm (0,5-1 inch), bevorzugt von 12,7-19,05 mm (0,5-0,75 inch).
Typischerweise besitzen Magnete mit einer größeren Magnetfeldreichweite geringere Stärke des Oberflächenfelds. Eine teilchenförmige Magnetanordnung, die die gewünschte Magnetfeldreichweite hat, aber doch eine erhebliche Oberflächenfeldstärke behält, wird unter Bezugnahme auf die Fig. 5 und 6 beschrieben. Die Magnetanordnung 46 kann gleichartig aufgebaut sein. Die Magnetanordnung 44 weist einen Stapel von Stabmagneten 64 auf, die von stählernen Polstücken 66 getrennt und damit in Kontakt sind. Als besonders vorteilhaftes Merkmal sind gleiche Pole von benachbarten Stabmagneten 64 in dem Stapel einander und einem speziellen sie trennenden Polstück zugewandt. Das wird durch die Buchstaben "N" und "S" gezeigt, die jeweils die kombinierten Nord- oder Südpole der jeweiligen Magnete bezeichnen, die einander zugewandt sind. Die Stabmagnete 64 definieren lange Seiten 68 und Enden 70, und Nord- und Südpole der Stabmagnete sind entlang einem entgegengesetzten Paar von langen Seiten definiert, wie Fig. 5 zeigt. Bevorzugt bestehen die Stabmagnete aus einer hochmagnetischen Legierung aus Neodymium, Eisen und Bor. In Fig. 5 liegt die Fläche 72 der gezeigten Magnetanordnung im Gebrauch an einer Außenwand des Beutels 18 an, so daß das Magnetfeld von der Magnetanordnung 44 in den Behälter 18 geht, um Teilchen 20 festzuhalten.
Fig. 6 zeigt eine Endansicht der Magnetanordnung 44, wobei die Fläche 72 diejenige Fläche ist, die in Fig. 5 gezeigt ist. Wie zu sehen ist, liegen Magnete 64, die durch Polstücke 66 getrennt sind, auf einer nichtmagnetisierbaren Aluminiumplatte 74 oder dergleichen, um die jeweiligen Magnete und Polstücke abzustützen.
Es ist außerdem ersichtlich, daß jedes Polstück 66 eine abgewinkelte Nut 76 entlang parallelen Endflächen definiert, die von den Stabmagneten 64 beabstandet sind und die der Fläche 72 der Anordnung 44 gegenüberliegen, wobei diese Fläche die feste Stelle zum Zurückhalten des Teilchen/Zell- Konjugats ist, das durch die paramagnetischen Teilchen gemäß der Erfindung gebildet wird.
Die Stabmagnete 64, Polstücke 66 und die Tragplatte 74 können auf jede herkömmliche Weise durch nichtmagnetischen Klebstoff oder unter Verwendung geeigneter Klemmelemente oder Haltebänder miteinander verbunden sein. Geeignete Mittel, die hier verwendet werden können, sind erhältlich von Crucible Magnetics Co., Elizabethtown, Kentucky. Die Magnetanordnung 44 enthält Magnete 64, die 12,7 mm (0,50 inch) dick sind, und Polstücke 66, die 6,35 mm (0,25 inch) dick sind. Damit wird ein Magnetfeld erzeugt, das lokale Maxima von 7000-9100 G (Mittelwert 8300 G) an der Oberfläche des Magneten hat und auf 1100-1700 G (Mittelwert 1400 G) in einer Entfernung von 1 cm von der Magnetoberfläche abnimmt. Diese Magnetanordnung ergibt sowohl eine relativ starke magnetische Haltekraft an der Magnetoberfläche als auch eine relativ gute magnetische "Ausholkraft", um Perlen einzufangen, die sich in einiger Entfernung (bis zu 25,4 mm (1 inch)) von der Magnetoberfläche befinden.
Die Magnetanordnung 46 enthält Magnete 64, die 6,35 mm (0,25 inch) dick sind, und Polstücke 66, die 2,54 mm (0,1 inch) dick sind. Dadurch wird ein Magnetfeld erzeugt, das lokale Maxima an der Magnetoberfläche zwischen 7300 und 8000 G hat und das in einer Entfernung von 1 cm von der Magnetoberfläche auf 80-500 G abnimmt. Verglichen mit der Magnetanordnung 44 hat die Magnetanordnung 46 eine stärkere magnetische Haltekraft an der Magnetoberfläche, hat jedoch eine geringere "Ausholkraft" und damit ein seichteres Magnetfeld. Der zweite flexible Behälter 24 ist ausgebildet, um das spezielle Magnetfeld des Magneten 46 vorteilhaft zu nutzen. Der erste Behälter liegt zur Zelltrennung auf der Magnetanordnung 44.
Das System isoliert daher auf eine keimfreie vereinfachte Weise eine bestimmte Unterklasse von konzentrierten Zellen, die wie gezeigt für jeden gewünschten Zweck getrennt werden können.

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel verdeutlicht eine bestimmte Anwendung der Vorrichtung und des Verfahrens der Erfindung zur Trennung von T-Helfer/Effektor-Lymphozytenzellen, die aus Vollblut gesammelt wurden.

Herstellung der mononuclearen Zellsuspension:

Ungefähr 500 ml Vollblut wurde in einer üblichen Natriumcitrat-Doppelblutpackung von Fenwal gesammelt und zwischen den beiden Packungen aufgeteilt, so daß jede Packung 290 ml enthielt. Hespan Hetastarch (55 ml) wurde jeder Packung zugefügt, und der Inhalt wurde jeweils sanft vermischt durch Hin- und Herneigen der Packung. Man ließ die Erythrozyten absitzen, und die Plasmaschicht, die mononucleare Zellen enthält, wurde in eine übliche 600-ml-Transferpackung von Fenwal überführt unter Anwendung eines Fenwal-Plasmaextraktors und eines üblichen Transferschlauchsets. Die Transferpackung wurde zentrifugiert, um die Zellen als Pellets von dem Plasma zu trennen, und das Plasma wurde unter Verwendung des Plasmaextraktors in eine andere Transferpackung überführt. Die Zellen wurden erneut suspendiert durch Zugabe von 80 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit 10% fetalem Kälberserum und unter sanftem Hin- und Herneigen des Beutels. Eine Teilmenge der Zellsuspension wurde in 2% Essigsaure gezählt und genutzt, um eine Gesamtzellernte von 2,8 · 10&sup9; mononuclearen Zellen für die Zellsuspension zu berechnen. Nach dem Zählen der Zellen wurden der Transferpackung zusätzlich 100 ml HBSS zugefügt, und die Zellsuspension wurde vermischt. Die Hälfte der Zellsuspension wurde in eine zweite Transferpackung überführt, um eine Gesamtzahl von ca. 1,4 · 10&sup9; mononuclearen Zellen in 100 ml HBSS in jedem Beutel zu ergeben.

Präparieren von paramagnetischen Perlen, die an Antikörper gebunden sind

Ungefähr 1 g paramagnetische Perlen (Pandex-Perlen mit aminofunktionellen Gruppen an der Oberfläche) wurden fünfmal mit Kochsalzlösung gewaschen und erneut in 20 ml Kochsalzlösung in einem 50-ml-Teströhrchen aus Glas suspendiert. Frisch präpariertes N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP), das 1,0 ml 20 mM Lösung von SPDP und absolutem Ethanol aufwies, wurde dem Teströhrchen zugefügt. Das Röhrchen wurde für 30 min bei 4ºC um seine Enden gedreht, um 3-(2-Pyridyldithio)propionyl-derivatisierte Perlen zu bilden. Die Perlen wurden mit einem Magneten gesammelt und fünfmal mit 20-ml-Teilmengen von phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Die Perlen wurden dann in 20 ml 50 mM Dithiothreitol in Natriumacetat (0,1 ml Puffer, pH 4,5) suspendiert und inkubiert unter Drehung um die Enden für 30 min bei 4ºC, um das Thiolderivat zu bilden. Das Perlenpräparat wurde dann fünfmal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, und nach jeder Wäsche wurden die Perlen mit einem Magneten gesammelt. Schließlich wurden die Perlen in 20 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung erneut suspendiert.
Maus-Anti-Leu-3a-Antikörper (Typ CD4 Antikörper - 2 mg in 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung) wurden 0,1 ml 20 mM SPDP in absolutem Ethanol zugefügt. Das Gemisch wurde über Nacht gegen 500 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert.
Die resultierende Antikörper-Lösung wurde der derivatisierten Perlensuspension in einem 50-ml-Glaszentrifugenröhrchen zugefügt. Das Röhrchen wurde über Nacht bei Raumtemperatur um seine Enden gedreht, um die Kupplung des Antikörpers an die Perlen zu bewirken. Dann wurden die Perlen fünfmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 30 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung erneut suspendiert.
Während also der erzeugte Antikörper Pyridyldithio-aktive Gruppen trägt, tragen die Perlen infolge ihrer Behandlung mit Dithiothreitol gebundene Sulfhydryl-aktive Gruppen Infolgedessen werden, wenn sie zusammengebracht werden, der Antikörper und die Perlen chemisch aneinander gebunden durch eine Disulfidkopplung, die aus einer Kondensationsreaktion resultiert, wobei 2-Thiolpyridin als ein Nebenprodukt abgespalten wird.

Kupplung von mononuclearen Zellen an CD4-Antikörper, der an Perlen gebunden ist

Ungefähr 300 mg der Antikörper-gebundenen Perlen, die wie oben präpariert worden waren (7 · 10&sup9; Perlen), wurden jedem Beutel von Zellsuspension, die wie vorher beschrieben präpariert worden war, zugefügt, wobei eine 20-ml-Injektionsspritze mit daran angebrachter 21-Gauge-Nadel verwendet wurde. Die resultierende Suspension hatte ein Perlen:Zell- Verhältnis von ungefähr 5:1 und wurde sanft vermischt, wonach sie auf einer Cole-Parmer-Rotationseinrichtung bei Einstellung 4 für 30 min bei 4ºC plaziert wurde. Der Beutel 18 (Fig. 1), der die Perlen- und Zellsuspension enthielt, wurde mit einer 600-ml-Fenwal-Transferpackung 32 durch Schläuche 22, 26 verbunden, die durch eine erweiterte Kammer 24 in Verbindung sind, wie ebenfalls in Fig. 1 gezeigt ist. Der Beutel 18 wurde ebenfalls durch die Vorbereitungsleitung 33 des Schlauchsets an einen 1000-ml-Beutel mit physiologischer Kochsalzlösung angeschlossen, um die Vorbereitung des Sets zwischen dem Behälter 18 und der leeren Transferpackung 32 zu ermöglichen.
Nach dem Vorbereiten wurde das resultierende, untereinander verbundene Beutelsystem in der oberen Magnetbasis 42 installiert, wie insbesondere in Fig. 2 zu sehen ist, wobei der Beutel 28 in dem Bereich 44 und der Behälter 24 in dem Bereich 46 angeordnet wurde. Der entsprechende Schlauch 22 wurde in dem Bereich 48 untergebracht und durchsetzte den Kanal 47, während der Schlauch 26 in dem Kanal 51 installiert und durch die Rollenpumpe 53 geführt wurde. Die jeweiligen Magnete 44, 46 wurden auf ca. 4ºC zum fortgesetzten Kühlen der Zellen vorgekühlt. Dann wurden die gelenkigen Abdeckungen 49, 56 geschlossen, wobei das obere Basisteil 42 auf dem unteren Basisteil 52 angeordnet wurde (Fig. 4).
Nach Ablauf von ca. 5 min, um eine vollständige Bindung der entsprechenden Zellen an die Perlen durch die gebundenen CD4-Antikörper zuzulassen und um ein maximales Einfangen der resultierenden Perlen/Zell-Konjugate an der Innenfläche des Beutels 18 angrenzend an den Magneten 44 zuzulassen, wurde die Rollenpumpe 53 eingeschaltet, um mit einer Rate von 10 ml Fluid/min in den Sammelbeutel 32 zu fördern. Etwaiges Perlen/Zell-Konjugat, das aus dem Beutel 18 entwich, wurde dem Einfluß des zweiten Magneten 46 in dem Beutel 24 ausgesetzt, um an der Innenfläche der Kammer 24 angrenzend an diesen Magneten eingefangen zu werden, während gleichzeitig Zellen, die nicht auf diese Weise an die Perlen gebunden waren, mit Fluiden zum Sammelbeutel 32 abflossen.
Nach im wesentlichen vollständiger Entleerung des Beutels 18 und des Behälters 24 von Fluiden wurde das Perlen/Zell-Konjugat in dem Beutel 18 in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung erneut suspendiert, während gleichzeitig der Beutel 18 und der Behälter 24 von ihren Auflagen auf den jeweiligen Magneten entfernt wurden, und dabei wurde der Durchfluß durch den Schlauch 26 unterbrochen. Danach wurden Beutel 18 und Behälter 24 erneut in ihren Positionen auf dem oberen Magnetbasisteil 42 installiert, und die suspendierende Kochsalzlösung wurde aus dem Beutel 18 von der Rollenpumpe 53 wie vorher durch den Schlauch 26 in den Sammelbeutel 32 abgezogen, und zwar zusammen mit etwa verbleibenden Zellen, die nicht an eine paramagnetische Perle gebunden waren.
Dann wurden der Beutel 18 und der Behälter 24 erneut aus dem Einflußbereich der Magnete entfernt, nachdem der Durchfluß durch den Schlauch 26 blockiert worden war. Das Perlen/Zell- Konjugat in dem Beutel 18 und dem Behälter 24 wurde in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung, die 25 mM Dithiothreitol enthielt, um die Bindung zwischen Zellen und Perlen zu zerstören, erneut suspendiert. Beutel 18 und Behälter 24 wurden auf einer Dreheinrichtung für 20 min bei 4ºC angeordnet. Dann wurden der Beutel 18 und der Behälter 24 an einen Ein-Liter-Gewebekulturkolben Fenwal PL269 (in Fig. 1 durch den Behälter 34 symbolisiert) angeschlossen. Danach wurden der Beutel 18 und der Behälter 24 wieder in dem oberen Basisteil 42 installiert, die gelenkigen Drückplatten wurden geschlossen, und der Fluidinhalt der Beutel wurde in den Gewebekulturkolben 34 gespült, während die paramagnetischen Perlen oder Teilchen angrenzend an die Magnete eingefangen bleiben.
Somit sind die freien Lymphozyten, die für die Wirkung von CD4-Antikörper positiv sind, von anderen Zellen in dem Gemisch getrennt worden und werden in isolierter Form in dem Gewebekulturkolben 34 oder, falls gewünscht, einem Blutbeutel 34 bereitgestellt, wie insbesondere in Fig. 1 gezeigt ist.
Restzellen in dem Trennset an der Abstromseite des Beutels 24 werden ebenfalls mit weiterer physiologischer Kochsalzlösung in den Kolben oder den Beutel 34 gespült.
Die Zellen in dem Kolben 334 können durch Zentrifugieren gesammelt und in 100 ml Gewebekulturmedium RPMI 1640, das zusätzliches Glutamin enthält, erneut suspendiert und zur anschließenden weiteren Untersuchung in einen Kohlendioxid- Inkubator eingebracht werden.

BEISPIEL 2

Mit einem Verfahren, das demjenigen von Beispiel 1 gleicht, können aus Knochenmarkzellen ganz allgemein Zellen der folgenden Typen entfernt werden: B-Lymphom-, Neuroblastom-, Brustkrebs- oder Leukämiezellen, wenn solche Zellen ein einem Tumor zugehöriges Antigen an ihrer Oberfläche exprimieren, das von einer Biochemikalie, die an der Perlen- bzw. Teilchenoberfläche haftet, erkennbar ist. Somit kann das Verfahren zur Reinigung von Knochenmarkszellen vor einer autologen Knochenmarks-Transplantation verwendet werden.
Das Knochenmark kann durch einen herkömmlichen Zellseparator bearbeitet werden, um ein mononucleares Zellpräparat daraus zu extrahieren. Dieses mononucleare Zellpräparat kann mit einem Panel von monoklonalen Maus-Antikörpern gegen die Tumorzellen inkubiert werden, zum Entfernen von überschüssigem Antikörper gewaschen und dann mit paramagnetischen Perlen inkubiert werden, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, die mit Ziegen-Antimaus-Antikörper überzogen sind, um die Tumorzelle selektiv an die Perle zu binden. Die Tumorzelle wird dann wie in Beispiel 1 entfernt, wobei ein magnetischer Separator der gezeigten Art verwendet wird.

BEISPIEL 3

Als ein alternatives Verfahren der Anwendung der Erfindung können T-Lymphozyten aus dem in Beispiel 2 beschriebenen mononuclearen Zellpräparat vor einer allogenen Transplantation entfernt werden, um eine Transplantat/Wirts-Erkrankung zu verhindern. Dieses Verfahren kann angewandt werden, wenn Knochenmarktransplantate zur Behandlung von Krebs vorgesehen werden, oder zur Wiederherstellung des Knochenmarks, nachdem es unabhängig von einer Krebsbehandlung Strahlung ausgesetzt war. In diesem Fall wird das mononucleare Zellpräparat aus dem Knochenmark mit einem monoklonalen Maus-Antikörper (beispielsweise CD3) behandelt, um die T-Lymphozytenzellen zur Bindung durch die mit Ziege-Antimaus-Antikörper beschichteten Perlen zu markieren.

BEISPIEL 4

Das mononucleare Zellpräparat, das vorher aus Knochenmark wie in Beispiel 2 präpariert wird, kann auch auf eine ähnliche Weise wie oben beschrieben behandelt werden unter Anwendung eines monoklonalen Maus-Antikörpers, der an die paramagnetischen Perlen gebunden ist, um die Auswahl von pluripotenten Stammzellen aus dem mononuclearen Zellpräparat zuzulassen. Die isolierten Stammzellen können somit zur Knochenmarktransplantation verwendet werden. Dieses Verfahren könnte angewandt werden, um autologe Knochenmarktransplantate bereitzustellen, die im wesentlichen frei von Tumorzellen sind, während gleichzeitig eine Transplantat/ Wirts-Erkrankung unterdrückt wird. Solche isolierten Stammzellen könnten auch für die Gentherapie eingesetzt werden, wobei Gene in die Stammzellen eingeschleust werden, bevor sie als ein Knochenmarktransplantat eingepflanzt werden.

BEISPIEL 5

Mit einem Verfahren, das demjenigen von Beispiel 1 im wesentlichen gleicht, wobei ein geeigneter monoklonaler Antikörper verwendet wird, können Leber-Hepatozyten oder Insulin-sekretierende pankreatische Betazellen isoliert und anschließend in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet werden, um die Zellen zur Verwendung bei der Organtransplantation zu vergrößern.

BEISPIEL 6

Mit einem Verfahren ähnlich demjenigen von Beispiel 1, wobei ein geeigneter monoklonaler Antikörper verwendet wird, können spezifische Populationen von zytotoxischen T-Lymphozyten wie etwa mit Tetanustoxoid vorbereitete Lymphozytenzellen ausgewählt werden. Diese Zellen können mit einer analogen Technik ähnlich derjenigen von Beispiel 1 getrennt, in vitro manipuliert und transfundiert werden, um die zytotoxischen Zellen auf spezifische B-Lymphozyten zu richten, die Autoimmun-Erkrankungen vermitteln (beispielsweise Myasthenia gravis). Auf diese Weise könnten die die Krankheit vermittelnden Zellen in situ zerstört werden.

Claims

1. Vorrichtung zum selektiven Trennen einer spezifischen Zellpopulation aus einem heterogenen Zellgemisch, wobei die Vorrichtung aufweist: einen Behälter (18), der Teilchen (20) enthält, die aus einem paramagnetischen Material gebildet sind, wobei an den Teilchen (20) eine Substanz haftet, die fähig ist, an die spezifische Zellpopulation des Zellgemischs zu binden; eine Zelldurchflußbahn (16, 22), wobei der Behälter (18) in der Durchflußbahn (16, 22) positioniert ist, um das Zellgemisch aufzunehmen, so daß im Gebrauch das Zellgemisch mit den Teilchen in dem Behälter (18) in innigen Kontakt gelangt und damit inkubiert wird, um die spezifische Zellpopulation des Zellgemischs selektiv an die Teilchen (20) zu binden, wodurch ein Teilchen/Zell- Konjugat gebildet wird; und ein erstes und ein zweites magnetisches Element (44, 46), die jeweils relativ zu der Durchflußbahn positioniert sind, wobei das zweite magnetische Element (46) an der Abstromseite von dem ersten magnetischen Element (16, 22) beabstandet ist, um an unveränderlichen Stellen entlang der Durchflußbahn jeweilige Magnetfelder zu bilden, um das Teilchen/Zell-Konjugat an den unveränderlichen Stellen festzuhalten und zuzulassen, daß verbleibende, ungebundene Teile des Zellgemischs von diesen Stellen (44) entfernt werden, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite magnetische Element (46) an seiner zugeordneten Stelle ein seichteres Magnetfeld bildet, aber an seiner Oberfläche eine größere magnetische Haltekraft als das erste magnetische Element (44) hat.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Behälter (18) ein flexibler, kollabierbarer Behälter ist.

3. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die mindestens einen zweiten Behälter (24) an der Abstromseite des ersten Behälters (18) aufweist, wobei der zweite Behälter (24) flexibel und kollabierbar ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei der zweite Behälter (24) an seinen entgegengesetzten Enden eine Einlaß- und eine Auslaßöffnung aufweist, wobei die Querschnittsfläche der Einlaß- und der Auslaßöffnung nicht mehr als ein Viertel der Querschnittsfläche des zweiten Behälters (24) ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei der zweite Behälter (24) Sechseckgestalt hat, wobei die Einlaß- und die Auslaßöffnung an entgegengesetzten Ecken davon positioniert sind.

6. Vorrichtung nach Anspruch 3, 4 oder 5, wobei das zweite magnetische Element (46) angrenzend an eine Einrichtung (42), die den zweiten Behälter (24) trägt, positioniert ist, wodurch mindestens ein innenwandbereich (59) des zweiten Behälters (24) innerhalb des Magnetfelds des zweiten magnetischen Elements (46) liegt, wobei der Innenwandbereich (59) eine genannte unveränderliche Stelle ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, die eine Flachdrückeinrichtung (49) aufweist, um den kollabierbaren zweiten Behälter (24) flachzudrücken, während gleichzeitig der Innenwandbereich (59) des zweiten Behälters (24) innerhalb des Magnetfelds des zweiten magnetischen Elements (46) liegt, um eine Zelldurchflußbahndicke von 0,5-2,6 mm (0,02-0,1'') in dem zweiten Behälter (24) zu bilden, um das Trennen des Teilchen/Zell-Konjugats von dem restlichen Zellgemisch zu erleichtern.

8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste magnetische Element (44) angrenzend an eine Einrichtung (42), die den ersten Behälter trägt, positioniert ist, wodurch ein Innenwandbereich (57) des ersten Behälters (18) innerhalb des Magnetfelds des ersten magnetischen Elements (44) liegt, wobei der Innenwandbereich (57) des ersten Behälters (18) eine genannte unveränderliche Stelle ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei der zweite Behälter (24) mit dem ersten Behälter (18) abdichtend und aseptisch verbunden ist, wobei das erste magnetische Element (44) an dem ersten Behälter (18) anliegend positioniert ist und das zweite magnetische Element (46) an dem zweiten Behälter (24) anliegend positioniert ist.

10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die einen kollabierbaren Aufnahmebehälter (32) an der Abstromseite des ersten Behälters (18) aufweist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei der erste Behälter (18) mit dem Aufnahmebehälter (32) aseptisch verbunden ist, wodurch der Aufnahmebehälter (32) positioniert ist, um verarbeitete Zellen aus dem ersten Behälter (18) aufzunehmen, ohne daß dazwischen eine sterile Verbindung gebildet werden muß.

12. Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, wobei der zweite Behälter (24) mit dem ersten Behälter (18) und dem Aufnahmebehälter (32) abdichtend und aseptisch verbunden und dazwischen positioniert ist.

13. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die einen Fraktionsbehälter zur Verwendung mit einer Zellgemisch-Trenneinrichtung (12) aufweist, wobei der Fraktionsbehälter an der Aufstromseite des ersten Behälters (18) positioniert ist.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, wobei das Zellgemisch Blut ist und der Fraktionsbehälter eine flexible Mehrkammer-Einsatzeinrichtung für eine Blutzellen-Trennzentrifuge ist, wobei der erste Behälter (18) mit der Einsatzeinrichtung aseptisch verbunden ist, um zu ermöglichen, daß eine konzentrierte Fraktion von frisch gesammelten Blutzellen aus der Einsatzeinrichtung in den ersten Behälter (18) aseptisch überführt wird, ohne daß dazwischen eine sterile Verbindung gebildet werden muß.

15. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste magnetische Einrichtung (44) ein Magnetfeld hat, dessen Reichweite der Breite des ersten Behälters (18) im wesentlichen äquivalent ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei der erste Magnet (44) ein Magnetfeld hat, das eine Reichweite von ca. 1,2 bis ca. 2,6 cm (ca. 0,5 bis ca. 1'') hat.

17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, wobei das erste magnetische Element (44) ein Magnetfeld hat, das eine Reichweite von ca. 1,2 bis ca. 1,9 cm (ca. 0,5 bis ca. 0,75'') hat.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die paramagnetischen Teilchen (20) an ihren Oberflächen einen spezifischen Antikörper für Zellen tragen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus B-Lymphom-, Neuroblastom-, Brustkrebs-, Leukämie-, T-Lymphozyten- und pluripotenten Stammzellen besteht, oder mit einem spezifischen Antikörper für Zellen beschichtet sind, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Hepatozyten und Insulin sekretierenden pankreatitischen Betazellen besteht.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei die paramagnetischen Teilchen (20) an ihren Oberflächen einen spezifischen Antikörper für eine spezifische Population von zytotoxischen T-Lymphozyten tragen.

20. Verfahren zum selektiven Trennen einer spezifischen Zellpopulation aus einem Zellgemisch, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: (a) Vermischen des Zellgemischs mit paramagnetischen Teilchen (20) in einem Behälter (18), wobei an den Teilchen (20) eine Substanz haftet, die fähig ist, nur an die spezifische Zellpopulation des Gemischs zu binden; (b) Aussetzen des Behälters (18) einem Magnetfeld, um die Teilchen (20) und die daran gebundene spezifische Zellpopulation zu immobilisieren, und (c) Fließenlassen nicht gebundener Zellen zu einer ersten Speicherbehältereinrichtung (32), wobei die erste Speicherbehältereinrichtung (32) Zellen aufnimmt, die nicht an die Teilchen (20) gebunden sind, gekennzeichnet durch Fließenlassen von Zellen aus dem ersten Behälter (18) in einen zweiten Behälter (24) in Schritt (b), während gleichzeitig der erste Behälter einem ersten Magnetfeld ausgesetzt wird, und Aussetzen des zweiten Behälters (24) einem zweiten Magnetfeld, das seichter als das erste Magnetfeld ist und an der Oberfläche seines zugeordneten Magneten eine größere magnetische Haltekraft als das erste Magnetfeld hat.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Reichweite des Magnetfelds des ersten Magneten (44) der Breite des ersten Behälters (18) im wesentlichen äquivalent ist.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei das Zellgemisch eine Blutfraktion ist und das Verfahren ferner die folgenden Schritte aufweist: Zentrifugieren von Vollblut, um die Fraktion herauszutrennen, Sammeln der Blutfraktion in dem ersten Behälter (18) und dichtes Verschließen des ersten Behälters (18) gegenüber der Zentrifuge.

23. Verfahren nach Anspruch 20, 21 oder 22, das ferner die folgenden Schritte aufweist: Positionieren des ersten und des zweiten Magneten (44, 46) anliegend an den ersten bzw. den zweiten Behälter (18, 24), um die Behälter (18, 24) den Magnetfeldern auszusetzen.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, das ferner die folgenden Schritte aufweist: Unterbrechen des Durchflusses zwischen dem zweiten Behälter (24) und der ersten Speicherbehältereinrichtung (32); Entfernen des ersten und des zweiten Behälters (18, 24) aus dem Magnetfeld des jeweiligen Magneten (44, 46) und Fließenlassen der spezifischen Zellpopulation aus dem ersten und dem zweiten Behälter (18, 24) in eine zweite Speicherbehältereinrichtung (34).

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Zellen an die paramagnetischen Teilchen (20) gebunden werden, wenn man sie aus den Behältern (18, 24) in die zweite Speicherbehältereinrichtung (34) fließen läßt.

26. Verfahren nach Anspruch 24, das ferner die folgenden Schritte aufweist: Unterbrechen der Fluidverbindung zwischen dem zweiten Behälter (24) und der ersten Speicherbehältereinrichtung (32), Entfernen der Bindungs-Verbindungen zwischen den Zellen der spezifischen Population und den paramagnetischen Teilchen (20), so daß die spezifische Zellpopulation nicht mehr an die Teilchen (20) gebunden ist, und Fließenlassen der Zellpopulation in die zweite Speicherbehältereinrichtung (34), während gleichzeitig der erste und der zweite Behälter (18, 24) unter dem Einfluß der Magnetfelder stehen, wodurch verhindert wird, daß die Teilchen (20) mit den Zellen in die zweite Speicherbehältereinrichtung (34) fließen, um dadurch die Zellen von den Teilchen zu trennen.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 26, wobei das in den ersten Behälter mit paramagnetischen Teilchen eingebrachte Zellgemisch ein Präparat aus zuvor aus Knochenmark getrennten einkernigen Zellen ist.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 27, bei dessen Durchführung die Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19 verwendet wird.