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Das vorliegende Gebiet betrifft ein Verfahren zum Sterilisieren einer Polystyroloberfläche, an die
ein Antikörper kovalent gebunden ist. Die Oberfläche kann in einer Vorrichtung verwendet
werden, welche eine Spezifität für Zelloberflächenproteine hat, um zelluläre Trennungen zu
bewirken. Insbesondere wird die zelluläre Quelle Blut, Spinalflüssigkeit, Knochenmark,
Tumorhomogenate, Lymphgewebe und dergleichen sein.
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Es gibt zahlreiche Situationen, wo es von Interesse ist, eine spezifische Klasse von Zellen zu
isolieren oder einen bestimmten Satz von Zellen aus einer Mischung von Zellen zu entfernen.
Techniken, welche verwendet worden sind, schließen fluoreszenzaktiviertes Sortieren von Zellen,
magnetische Immunkügelchen, Komplement-vermittelte Lyse, Affinitätschromatographie,
Zentrifugationsauswaschung und Polystyrolpanning von Zellen ein. Zellen mit wesentlichen
Dichteunterschieden, wie denjenigen zwischen Plättchen und roten Zellen, können in einer
groben Weise durch die Verfahren der Gradientenzentrifugation fraktioniert werden. Säugerzellen
mit gleichen Dichten jedoch, wie Tumorzellen, Lymphozytenuntergruppen, Granulozyten oder
Stammzellen erfordern eine Form der Separation unter Verwendung molekularer Erkennung von
Oberflächenmarkern, welche mit ihrem Phänotyp korrelieren. In einer ähnlichen Weise sind
solche molekularen Mechanismen erforderlich, um Viren und Bakterien von einander in
komplexen Mischungen zu trennen. Ein jedes der vorausstehend erwähnten Verfahren hat ernste
Nachteile für viele Anwendungen, wo es ein Interesse daran gibt, bestimmte Untergruppen von
Zellen zu isolieren oder zu entfernen.
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Nachteile des fluoreszenzaktivierten Zell-Sortierens für die Gewinnung lebensfähiger, sortierter
Zellen sind die Langsamkeit des Verfahrens, die Tatsache, daß die isolierten Zellen mit
Antikörper beschichtet sind, und die begrenzten Mengen an Zellen, die durch das Verfahren
erhalten werden können.
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Mit Immunkügelchen ist es schwierig, die Zellen nach der Trennung von den Kügelchen zu
gewinnen; die Zellen sind häufig mit Antikörper und magnetischen Kügelchen beschichtet und
eindeutige Trennungen werden nur auf eine schwierige Weise erreicht. Die
Komplementvermittelte Lyse ist aus zwei Gründen problematisch: Erstens ist die Depletion von Zielzellen
nicht vollständig und zweitens können Zellen, auf die nicht abgezielt wird, auf eine schädliche
Weise durch die Exposition gegenüber Komplement und den toxischen Nebenprodukten der Lyse
der Zielzellen betroffen werden. Die Affinitätschromatographie von Zellen unter Verwendung
von zum Beispiel Sephadex G-10 gekoppelt an Antikörper leidet an einer geringen Ausbeute und
ineffizienten Depletion von Zielzellen. Zentrifugationsauswaschung ist nicht in der Lage,
Subpopulationen unterschiedlichen Phänotyps von Zellen gleicher Größe zu trennen.
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Die letzte Methode, das Panning, entwickelt von Wysocki und Sato, PNAS, 75: 2 844 (1978),
unter Verwendung von passiv an Polystyrol adsorbiertem Antikörper ist besonders unzureichend.
Es können nur geringe Rückgewinnungen erreicht werden, und das Verfahren leidet am Fehlen
von Spezifität und an der Kontamination der separierten Zellen mit Antikörper.
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Während das Immunsystem aufgeklärt wird, wird es in zunehmendem Maße offensichtlich, daß
Subsets von Zellen relativ enge Bereiche von Aktivitäten haben. So können Subsets spezialisiert
sein für die Antwort gegenüber einer bestimmten Erkrankung, wie einer Neoplasie, einer
Infektion, viral oder zellulär, etc., für die Antwort auf Transplantate und dergleichen. Es ist daher
nicht nur von großem Interesse, in der Lage zu sein, diese Subsets von Zellen zu identifizieren
und zu reinigen, um ihre Wirkung zu verstehen, sondern ebenfalls, um diese Zellen für
prophylaktische und therapeutische Zwecke zu nutzen. Um die gewünschten Ergebnisse zu
erreichen, ist es notwendig, daß im wesentlichen reine Populationen des gewünschten Subsets
oder der Subsets von Zellen erhalten werden können. Darüber hinaus sollten die Zellen sein: (1)
frei von Antikörpern auf ihrer Oberfläche, (2) lebensfähig, (3) in der Lage ihre normale Funktion
zu erfüllen und (4) responsiv auf die Aktivierung durch biologische Substanzen auf die selbe
Weise wie normale Zellen in der normalen Umgebung.
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Die Anmeldung Nr. 90 307 080.3, von welcher die vorliegende Anmeldung abgeteilt ist, stellt
Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen für das selektive Fangen und Freisetzen von
biologischen Partikeln bereit, welche in der Lage zur Replikation sind, insbesondere für
Viruspartikel und Zellen. Ein die Partikel enthaltendes Medium wird in Kontakt mit einem festen
Träger mit einer hohen Dichte an spezifischen Rezeptorstellen gebracht, wodurch die Partikel mit
dem komplementären Liganden an die Oberfläche gebunden werden. Die biologischen
Substanzen können von den Rezeptoren freigesetzt werden entweder durch eine biologische
Aktivierung, welche zum Abstoßen des Liganden und der Freisetzung führt, oder durch
physikalische Mittel wie Pipettieren, mechanische Vibration oder Ultraschall, wie geeignet. Diese
Zellen können in numerischer Weise expandiert werden, biologischen Substanzen oder anderen
Faktoren zur Differenzierung und/oder Aktivierung oder dergleichen ausgesetzt werden und
können für die Forschung, für diagnostische, prophylaktische und/oder therapeutische Zwecke
verwendet werden.
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um eine Polystyroloberfläche zu
sterilisieren, an welche ein Antikörper kovalent gebunden ist, wobei dieses Verfahren umfaßt: das
Auftragen auf die Oberfläche einer Zusammensetzung, die eine stabilisierende Menge der
Kombination von humanem Serumalbumin (HSA) und Sucrose umfaßt und das Bestrahlen der
Oberfläche mit einer sterilisierenden Menge an Elektronenstrahlung oder Gammastrahlung.
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Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine sterilisierte Polystyroloberfläche bereit, die durch
dieses Verfahren herstellbar ist. Diese Oberfläche kann die innere Oberfläche eines Gefäßes sein,
insbesondere kann sie innerhalb eines Behälters mit starren oder flexiblen Wänden liegen, der
Polystyrolblätter enthält, die über einander liegen oder auf einander gestapelt sind und von
einander getrennt sind, um einen Flüssigkeitsfluß zwischen den Blättern zu ermöglichen.
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In den begleitenden Zeichnungen:
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Fig. 1 ist eine schematische Zeichnung eines Verfahrens, um Zellen aus dem peripheren Blut oder
dem Knochenmark für die Abfangvorrichtung zu präparieren; und
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Fig. 2 ist eine Diagrammansicht der Innenseite einer Zellabfangvorrichtung.
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Eine bestimmte Population von biologisch replizierbaren Partikeln, insbesondere Zellen, kann aus
einer Mischung von Partikeln durch das Binden der Population an ein festes Substrat durch die
Vermittlung von einem oder mehreren spezifischen Rezeptoren isoliert werden. Wahlweise
können die Partikel dann auf eine Vielzahl von Wegen behandelt werden, um auf die
Populationsgröße und/oder die Eigenschaften der gefangenen Partikel einzuwirken. Die Zellen
können anschließend von dem Träger im wesentlichen frei von Rezeptor freigesetzt werden.
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Das Verfahren wird das In-Kontakt-Bringen einer Quelle von Partikeln mit einem Rezeptor, der
an einen Träger in einer Sammelvorrichtung gebunden ist, einschließen, wo die Population des
Rezeptors auf der Oberfläche für eine hohe Bindungsdichte für den (die) Liganden von Interesse
sorgt. Die Bedingungen für den Kontakt sind derart, daß hinreichend Zeit gelassen wird und ein
niedriger Grad an Turbulenz, um den Partikeln zu gestatten, spezifisch an den Rezeptor zu
binden. Nach einer hinreichenden Zeit für das Eintreten der Bindung kann das Medium entfernt
und die Oberfläche gewaschen werden, um nicht spezifisch gebundene Partikel zu entfernen. Da
die Partikel normalerweise auf der Oberfläche an einer Vielzahl von Stellen gebunden worden
sind, so daß sie eine hohe Bindungsavidität haben, kann das Waschen ziemlich heftig sein, um die
im wesentlichen vollständige Entfernung aller nicht spezifisch gebundenen Partikel sicher zu
stellen. Die Partikel können dann einer weiten Vielzahl von Bedingungen oder von Behandlungen
unterzogen werden, die gewöhnlich den Kontakt mit einem oder mehreren Agenzien
einschließen. Wahlweise kann dann das Medium, welches die Reagenzien enthält, entfernt
werden, und die Partikel können von den Rezeptoren freigesetzt werden. Die Freisetzung kann
entweder durch die Behandlung mit einer Kombination eines mitogenen Mittels und eines
Lymphokins oder mit physikalischen Mitteln wie Pipettieren, Vibration oder Beschallung erreicht
werden. Die Partikel können dann isoliert und für ihren beabsichtigten Zweck verwendet werden.
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Meistenteils werden Mischungen von Zellen verwendet werden und daher wird die verbleibende
Diskussion auf Zellen gerichtet sein. Im wesentlichen die gleichen Verfahren können jedoch für
die Isolation von viralen und bakteriellen Partikeln verwendet werden, und bezugnehmend auf
Zellen versteht es sich, daß Viren und Bakterien gewöhnlicherweise dafür substituiert werden
können.
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Die Vorrichtung findet Anwendung in einer Anzahl von verschiedenen Situationen. Die erste ist
eine Situation, in der man wünscht unerwünschte Zellen zu fangen und aus physiologischen
Flüssigkeiten zu entfernen, und dadurch die Flüssigkeit von den unerwünschten Zellen für einen
therapeutischen Nutzen zu depletieren oder für diagnostische oder Forschungsanwendungen. Dies
kann erläutert werden durch das Depletieren von bestimmten T-Lymphozyten aus dem
Knochenmark, um die Transplantat-Wirt-Erkrankung zu vermindern. Das Knochenmark, von
unerwünschten Zellen depletiert, wird sofort für die Transplantation in den Empfänger des Marks
präpariert.
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Eine zweite Situation ist es, bestimmte Zellen zu fangen und wieder zu gewinnen aus
physiologischen Flüssigkeiten für die Forschung und die Diagnostik. Diagnostische
Anwendungen können das Fangen einschließen und das nachfolgende Zählen und Beschreiben der
gefangenen (1) malignen Zellen aus dem Blut oder anderen Geweben, (2) der viral oder mit
Bakterien infizierten Säugerzellen, (3) der Viren oder Bakterien oder Parasiten selbst aus
physiologischen Flüssigkeiten, (4) der humanen Fötalzellen für die karyotypische Analyse aus
dem Blut, (5) der transplantierten Zellen aus dem Blut als ein Index für die Wiedergewinnung aus
einer Knochenmarktransplantation und (6) der immunkompetenten Zellen mit einem bestimmten
Oberflächenmarker, wie im Falle des Vorhandenseins des IL-2-Rezeptors, was einen Zustand der
Aktivierung anzeigt. Für die Forschung kann man interessiert sein an (1) der genetischen Analyse
oder der Modifikation der gefangenen Zellen, (2) der Analyse und der Modifikation der
Physiologie bestimmter Klassen von Zellen, welche durch einen bestimmten Krankheitsprozeß
aktiviert oder supprimiert sein können und (3) auf dem molekularen Niveau an der Analyse der
Zusammensetzung der Oberflächenmembran und der Modifikation von Zellen, welche an der
Pathogenese einer bestimmten Erkrankung beteiligt sind.
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Die dritte Situation liegt in dem Fangen und Wiedergewinnen von Zellen aus physiologischen
Flüssigkeiten für eine Modifikation (Aktivierung) und Rückgabe an den ursprünglichen Patienten
für eine gewünschte therapeutische Wirkung. Das Verfahren schließt das Fangen von Zellen und
das Wiedergewirmen, das Prozessieren der gefangenen Zellen oder der depletierten
Zellpopulation ein, was zu einer numerischen Expansion und/oder einer biologischen Aktivierung
führen kann, und die nachfolgenden Wiedergewinnung und Verwendung dieser Zellen.
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Die dritte Situation kann weiter in drei Niveaus der Anwendung unterteilt werden. Das erste
Niveau ist die biologische Aktivierung der gefangenen/wiedergewonnenen Zellen selbst. Die
Aktivierung wird ohne eine weitere Fraktionierung der Zellen durchgeführt. Zum Beispiel können
im Falle eines Patienten mit AIDS für CD8 positive Zellen, die aus dem peripheren Blut gefangen
wurden, expandiert und aktiviert werden für die nachfolgende Rückgabe an den ursprünglichen
Patienten. Das zweite Niveau ist die selektive Aktivierung. Gefangene und wiedergewonnene
Zellen werden weiter prozessiert oder fraktioniert, um eine Untergruppe gefangener Zellen bereit
zu stellen, identifiziert zum Beispiel durch die Antigenspezifität, welche dann aktiviert und/oder
expandiert werden. Zum Beispiel können bestimmte Antigen-restringierte Untergruppen der
gefangenen für CD8 positiven Zellen durch bestimmte Kokulturbedingungen und
Konzentrationen von Lymphokinen selektiert werden, welche es nur der gewünschten
Untergruppe ermöglichen, expandiert und aktiviert zu werden. Ein drittes Niveau ist die In-Vitro-
Erzeugung von antigenspezifischen, für den Patienten einzigartigen Zellen für die Aktivierung
oder Supprimierung der Immunfunktion. Beispielhaft für diese Situation ist das Fangen von
Monozyten oder B-Zellen und das Exponieren der gefangenen Monozyten oder B-Zellen
gegenüber einem Patienten-spezifischen Immunkomplex oder anderen Antigenen unter
Bedingungen, welche die Antigenaufnahme von Monozyten oder B-Zellen erhöhen, das
Prozessieren und die Präsentation zusammen mit einer erhöhten Oberflächenexpression von
MHC. Man würde dann eine Untergruppe von Effektor- oder Regulatorzellen, die aus dem selben
Patienten gefangen wurden, zugeben, um mit dem Antigen-geprimten Monozyten oder der B-
Zelle zu interagieren. Das Verfahren der Antigen-spezifischen T-Zell-Aktivierung würde
stattfinden, fast auf die Weise wie sie im Lymphknoten eines intakten Tieres oder Menschen
vorkommt. Ein zusätzliches Beispiel der Modifikation von Zellen, die durch das vorliegende
Verfahren möglich gemacht wird, ist die Einführung exogener Gene über virale oder andere
Vektoren oder andere Mittel in die gefangenen Zellen und das nachfolgende Fangen der
Subpopulation von Zellen, welche das exogene Gen exprimieren, in einer zweiten Vorrichtung.
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Die zelluläre Quelle kann jedwede Mischung von Zellen sein. Es wird jedoch gewünscht, eine im
voraus festgelegte Population zu haben, welche durch einzelne oder multiple Marker oder eine
Mehrzahl von Markern oder von Liganden definiert wird. Zelluläre Quellen von Interesse aus
tierischen Wirten können Organe einschließen wie Blut, Gehirn, Niere, Milz, Herz, Eingeweide,
Knochenmark, Cerebrospinalflüssigkeit, Lymphgewebe oder dergleichen oder neoplastische
Zellen von jedwedem der vorausstehenden Organe. Andere Quellen können Parasiten, Viren oder
Bakterien, die mit tierischen Zellen gemischt sind, sein. Die Zellen werden in einer fließfähigen
Form verwendet, zweckmäßigerweise als eine Dispersion. Wo die Zellen nicht
zusammengehalten werden, wie im Blut, werden aus dem Blut gewöhnlicherweise rote Zellen,
Plättchen und Plasma abgetrennt, um eine Mischung von weißen Zellen bereitzustellen. Wo die
Zellen durch ein membranöses oder ein anderes verbindendes Material zusammengehalten
werden, können die Zellen entweder mechanisch oder enzymatisch in Übereinstimmung mit
herkömmlichen Verfahren dispergiert werden. Die einzelnen Zellen können dann in ihrem
geeigneten Nährmedium dispergiert werden für eine Trennung durch das vorliegende Verfahren.
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Bei Blut können die roten Blutzellen durch Agglutinierung entfernt werden, mit
Ammoniumchlorid lysiert werden sowie mit Lektinen oder durch Zentrifugation in Übereinstimmung mit
bekannten Wegen entfernt werden. Plättchen und rote Blutzellen können ebenfalls durch eine
Gradientendichtezentrifugation entfernt werden, welche Ficoll oder Leucoprep verwendet, und
der Buffy Coats durch Zentrifugation oder dergleichen isoliert werden.
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Die verschiedenartigen Quellen der Zellen können einer Vielzahl von Behandlungen unterzogen
werden, zusätzlich zu denjenigen, die vorausstehend beschrieben wurden. In einigen Situationen
kann es wünschenswert sein, die Zellen durch jedwedes zweckmäßige Mittel zu konzentrieren,
wonach Dispergieren in einem geeigneten Nährmedium erfolgt. In bestimmten Situationen kann
es wünschenswert sein, eine bestimmte Population zu expandieren, um auf eine selektive Weise
eine Gruppe von Zellen gegenüber einer anderen Gruppe von Zellen zu expandieren. Für die
Expansion können verschiedenartige mitogene Agenzien oder Interleukine oder
Wachstumsfaktoren oder dergleichen verwendet werden. Diese Zellen werden dann
üblicherweise, durch jedwedes zweckmäßige Mittel konzentriert werden, um im wesentlichen das
Medium in welchem sie isoliert oder gehalten worden sind, zu entfernen. Gewöhnlicherweise
werden diese Zellen wenigstens 10 Vol-% der Dispersion, die verwendet werden soll, umfassen
und nicht mehr als etwa 90 Vol-%, um so eine fließfähige Dispersion bereitzustellen. Die
Konzentration der in die Vorrichtung eingeführten Zellen basiert passenderweise auf dem
Oberflächenbereich der derivatisierten Polystyroloberfläche und wird in weitem Maße variieren,
abhängig von der Häufigkeit der Zielzelle in der eingeführten Zellsuspension. Gewöhnlicherweise
wird die Konzentration wenigstens 1 · 10³ Zellen/cm² sein und nicht mehr als 1 · 10¹&sup0;
Zellen/cm², gewöhnlicherweise von etwa 1 · 10&sup5; Zellen/cm² bis zu 1 · 10&sup7;/cm².
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Die Trennvorrichtung kann eine weite Vielzahl von Formen annehmen. Meistenteils wird die
Vorrichtung aus Polystyroloberflächen zusammengesetzt sein, wo das Polystyrol normalerweise
im wesentlichen frei ist von Kreuzvernetzung, d. h., weniger als zu etwa 0,5%,
gewöhnlicherweise weniger als zu etwa 0,1%, die bevorzugtermaßen formgepreßt oder extrudiert
sind, so daß sie eine sehr glatte Oberfläche haben. Polystyroloberflächen dieser Natur gestatten
eine wesentliche Einheitlichkeit der Derivatisierung, wo die Orientierung des Rezeptors für ein
hohes Ausmaß der Zugänglichkeit der Bindungsstellen sorgt. (Es versteht sich, daß in Bezug auf
den Rezeptor der Begriff völlig arbiträr ist. Als Rezeptor ist ein Molekül gemeint, welches in der
Lage ist, in spezifischer Weise an ein komplementäres Molekül zu binden. Daher kann der
Rezeptor ein Ligand sein, welcher sowohl Haptene als auch Antigene einschließt oder ein
Oberflächenmembranprotein, welches auf eine spezifische Weise an ein anderes Molekül bindet,
wie ein Immunglobulin, der T-Zell-Rezeptor, der Insulinrezeptor, etc. oder ein Molekül, welches
intrazellulär gefunden wird, so wie ein Steroid bindendes Protein oder Moleküle, welche in
Körperflüssigkeiten gefunden werden, wie Thyroxin bindendes Globulin, Lipoproteine etc..
Daher wird auf das Membranprotein, welches in spezifischer Weise an den an die Oberfläche
gebundenen "Rezeptor" bindet, arbiträr als der "Ligand" bezug genommen. Aus Zweckmäßigkeit
werden sie beide gemeinsam als komplementäre Glieder eines spezifischen Bindungspaares
bezeichnet.)
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Die funktionalisierte Polystyroloberfläche kann die Oberfläche einer Wand, einer Scheidewand,
eines Blattes, einer Hohlfaser, eines Kügelchens, eines Partikels oder dergleichen sein.
Meistenteils wäre es wünschenswert eine flache Oberfläche zu verwenden, obwohl in manchen
Situationen andere Oberflächen eine Anwendung finden können. Die Vorrichtung kann die Form
einer Flasche, einer Standard-T-Flasche, eines Blattes, z. B. einer Tasche oder einer Schachtel mit
mehrfach getrennten Blättern, zylindrischen oder gewundenen Blättern in einem Behälter, einer
rechteckigen Schachtel oder dergleichen annehmen. Die Wahl der Vorrichtung wird von der
Zweckmäßigkeit abhängen sowie vom Zweck der Trennung, der Wechselwirkung mit anderen
Vorrichtungen, der Zellpopulation, die von Interesse ist, der beabsichtigten Behandlung, sowie
davon, ob die Population von Interesse das Resultat einer positiven oder einer negativen Selektion
ist oder dergleichen ist.
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Die Oberfläche wird derivatisiert durch die Substitution des Benzolringes des Polystyrols mit
einem elektrophilen Reagenz, insbesondere durch eine Friedel-Crafts-Reaktion in einem
Lösemittel, welches das Polystyrol nicht weichmacht oder löst. Für diesen Zweck findet Sulfolan
eine besondere Anwendung. Relativ milde Bedingungen können verwendet werden, und das
Benzol kann mit einer Vielzahl von Agenzien derivatisiert werden, wie Nitro, welches zu Amino
reduziert werden kann, Halomethyl, welches verwendet werden kann, um eine Amino-, Hydroxy-
oder Thiolgruppe zu bilden, oder ein substituiertes N-Hydroxymethyl-acetamid, wo der
Substituent ein aktives Halogen oder Pseudohalogen ist. Eine Beschreibung der Reaktion kann in
der EPA 88-304 516.3 gefunden werden.
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Die derivatisierte Polystyroloberfläche kann man dann mit dem Rezeptor reagieren lassen. Unter
den Bedingungen der Derivatisierung findet man, daß ein hoher Prozentsatz der Benzole an der
Oberfläche derivatisiert wird, so daß man eine hohe Dichte des Rezeptors an der Oberfläche
erhalten kann.
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Abhängig von der Natur des Rezeptors können verschiedenartige Reaktionen für die Bindung des
Rezeptors an die Oberfläche durchgeführt werden. Von besonderem Interesse ist das Binden von
Proteinen an die Oberfläche. Proteine können gebunden werden, indem die Proteine in einem
wäßrigen Medium mit der funktionalisierten Oberfläche mit aktivem Halogen, aktivierten
Carboxygruppen, z. B. Estern oder dergleichen unter milden Bedingungen für eine hinreichende
Zeit für eine vollständige Reaktion in Kontakt gebracht werden. Jedwede verbleibenden nicht
reagierten funktionellen Gruppen können blockiert werden durch das Verwenden eines
geeigneten kleinen Molekül-Blocker-Mittels. Zum Beispiel kann aktives Halogen mit
aliphatischen Aminen blockiert werden, Thiole mit Maleimid, oder dergleichen. In einigen
Situationen kann es keine Notwendigkeit geben, überschüssige reaktive Gruppen zu blocken, da
sie nicht mit den nachfolgenden Schritten in dem Verfahren interferieren werden. Die Oberfläche
kann dann gewaschen werden, um den nicht spezifisch gebundenen Rezeptor zu entfernen, und
bewertet werden, um sicher zu stellen, daß geeignetes Binden des Rezeptors aufgetreten ist.
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Abhängig von der Natur der Sammelvorrichtung wird der Kontakt mit dem Zellen enthaltenden
Medium variiert werden. Zum Beispiel kann man im Fall einer Rollflasche das Medium in die
Rollflasche einführen und dann läßt man die Flasche langsam während einer hinreichenden Zeit
rotieren, damit die Zellen gebunden werden. Mit einer T-Flasche oder Platten in einer
Taschen/Schachtel-Konfiguration kann man die Vorrichtung auf der Oberfläche einer Ebene
stehen lassen oder sie leicht auf einer Schüttlerplattform schütteln lassen, wonach Umdrehen der
Vorrichtung und der Wiederholung des Verfahrens auf der anderen Seite erfolgt. Ähnliche
Verfahren können mit anderen Arten von Behältnissen verwendet werden. Zusätzlich kann die
Vorrichtung zentrifugiert werden, um die Zielzellen an die Kontaktoberfläche zu pressen.
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Von besonderem Interesse ist eine Vorrichtung, welche als eine Sammeltasche/-schachtel
bezeichnet wird. Die Tasche/Schachtel wird ein Behältnis mit starren oder mit flexiblen Wänden
sein, enthaltend Polystyrolblätter, die über einander liegen oder über einander gestapelt sind und
von einander getrennt sind, um einen Flüssigkeitsfluß zwischen den Blättern zu ermöglichen.
Gepackte Zellen als ein Ergebnis einer Konzentration, z. B. einer Gradientendichtezentrifugation
oder einer Zentrifugation würde man in die Tasche/Schachtel laufen lassen, welche in einer
horizontalen Position gehalten würde. Die zelluläre Dispersion würde sich durch die
Tasche/Schachtel ausbreiten, so daß sie in Kontakt mit im wesentlichen der ganzen mit Rezeptor
beschichteten Polystyroloberfläche in der Tasche/Schachtel ist. Nach einer für die Zellen
hinreichenden Zeit, um zu binden, kann die Tasche/Schachtel umgedreht werden, um es Zellen zu
gestatten, die immer noch dispergiert oder ungebunden sind, sich auf den Folienoberflächen
abzusetzen, welche nun unter ihnen sind, um so für eine effiziente Verwendung der Oberfläche zu
sorgen. Alternativ kann die Schachtel/Tasche zentrifugiert werden, einmal auf jeder Seite, um die
Zellen auf die Kontaktoberflächen zu pressen.
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Die Kontaktzeit wird in weitem Maße variieren, abhängig von der Konzentration des Liganden
auf der Zelloberfläche, der Bindungsaffinität des Rezeptors, der Konzentration der Zellen in dem
Medium, der Art der Sammelvorrichtung und dergleichen. Gewöhnlicherweise werden
Kontaktzeiten wenigstens etwa 5 min sein und nicht länger als etwa 120 min. gewöhnlicherweise
etwa 15 bis 60 min.
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Die zelluläre Dispersion kann durch die Sammelvorrichtung durch jedwedes zweckmäßige Mittel
bewegt werden. Ein Druckdifferential durch die Sammelvorrichtung kann durch Pumpen erreicht
werden. Alternativ kann der Schwerkraftfluß für eine geeignete Flußrate sorgen. Jedwedes
passende Verfahren, welches eine Flußrate gestattet, die es den Zellen erlaubt, an die Oberfläche
zu binden, ohne in einer signifikanten Weise die Viabilität zu beeinflussen, kann verwendet
werden. Die Vorrichtungen können unter Verwendung von Gamma oder Elektronenstrahlung
ohne die Eigenschaften der Sammelvorrichtung nachteilig zu beeinflussen sterilisiert werden. Das
heißt, die Aktivität des Rezeptors wird erhalten, während zur selben Zeit die kovalente Natur
seiner Bindung an die Oberfläche beibehalten wird. Daher geht, wenn die Sammelvorrichtung in
Verwendung ist, im wesentlichen kein an die Oberfläche gebundener Rezeptor verloren.
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Wenn die Zellen einmal an die Oberfläche gebunden wurden, kann die Sammelvorrichtung einer
weiten Vielfalt von Behandlungen unterzogen werden. Heftiges Waschen kann verwendet
werden, um nicht adhärente Zellen zu entfernen, da die adhärenten Zellen fest an die Oberfläche
an einer Vielzahl von Kontakten gebunden sind. Das Waschmedium kann ein und ausgepumpt
werden, die Liganden können durch die Vorrichtung fließen gelassen werden, oder man wendet
andere Mittel der sanften aber relativ kräftigen Agitation an. Die Waschlösung kann deionisiertes
Wasser, physiologische Kochsalzlösung, phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung,
Nährmedium oder dergleichen sein. Die besondere Waschlösung, die verwendet werden wird,
wird gewöhnlicherweise davon abhängen, wie die Zellen verwendet werden sollen.
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Wo die Zellisolation das Entfernen von Zellen aus der Zellpopulation betrifft (Zelldepletion),
können die gefangenen Zellen verworfen, und die depletierte Zellpopultion kann geerntet werden,
jedweden zusätzlichen Behandlungen unterzogen und dann für ihren beabsichtigten Zweck
verwendet werden.
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Meistenteils findet die hierin beschriebene Isolation besondere Anwendung für Zellen, welche für
eine nachfolgende Verwendung isoliert worden sind. Abhängig von der beabsichtigten
Verwendung sowie von der Natur der Zellen können die Zellen einer weiten Vielfalt von
Behandlungen unterzogen werden. Besonders wo man sich mit den lymphoiden oder den
myeloiden Linien befaßt, können diese Zellen behandelt werden, um zu expandieren oder die
Aktivität eines besonderen Sets oder Subsets von Zellen zu modifizieren. So können
verschiedenartige Faktoren zugegeben werden, was in der Proliferation der Zellen resultiert, in
der Aktivierung, der Erhöhung oder der Verminderung von einem oder mehreren
Oberflächenmembranproteinen oder dergleichen. Abhängig davon, ob man es wünscht, alle Zellen während
der Behandlung gebunden zu haben oder die Bildung freier Zellen zuläßt, kann man für ein
geeignetes Verhältnis von Rezeptor zu den gebundenen Zellen in dem Behältnis sorgen. Indem
man eine große Anzahl von Rezeptoren, verglichen mit den anfänglich gebundenen Zellen hat,
wird jedwede Nachkommenschaft ebenfalls gebunden und an der Oberfläche zurückgehalten.
Dies kann als eine zusätzliche Lösung dienen, da andere Zellen, welche vorhanden sein können
und expandiert haben können, nicht gebunden werden und aus dem Sammelgefäß entfernt werden
können.
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Meistenteils werden die Zellen von Interesse aus Blut, Knochenmark, festen Tumoren und
Lymphgewebe erhalten werden. Diese Zellen können in die lymphoiden und myeloiden Linien
eingeteilt werden. Die erste Linie, die betrachtet werden soll, wird die lymphoide Linie sein.
Diese Linie kann weiter unterteilt werden in die Kategorien von B-Zellen und T-Zellen. B-Zellen
werden dadurch identifiziert, daß sie slg als einen Oberflächenmarker haben, und rearrangierte
Keimbahn-DNA am Immunglobulin Lokus. T-Zellen haben meistenteils CD2 und/oder CD5 als
Oberflächenmarker und rearrangierte Keimbahn-DNA am T-Zell-Rezeptor Lokus. Die B- und T-
Zellen werden ebenfalls bestimmte Vorläuferzellen einschließen, obwohl pluripotente
Stammzellen getrennt diskutiert werden, und in dem Fall von B-Zellen sind Plasmazellen
ebenfalls eingeschlossen.
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Andere spezialisierte lymphoide Zellen, welche durch Marker isoliert werden können, schließen
ein: Lymphokin-aktivierte Killer- (LAK) Zellen, Natürliche Killer- (NK) Zellen, Tumor
infiltrierende Lymphozyten (TIL), Antikörper-abhängige cytotoxische Zellen (ADCC),
cytotoxische T-Lymphozyten (CTL), etc.
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In der myeloiden Linie kann man daran interessiert sein, Monozyten, Makrophagen, Eosinophile,
Basophile, polymorphonukleäre Leukozyten, dendritische Zellen, etc. zu isolieren.
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Die B-Zellen können durch eine Behandlung mit verschiedenen der Interleukine 1-7 oder
anderen, wenn entdeckt, insbesondere IL-1, -2, -3 oder dergleichen expandiert werden. Die B-
Zellen können selektiert werden durch oberflächengebundenes Antigen, Oberflächenmarker (z. B.
CD20) oder durch spezifische Bindung an ein lösliches Antigen, expandiert werden wenn ein
solches Antigen zu den Zellen gegeben werden kann, so daß diejenigen Zellen mit einem
Oberflächenimmunglobulin, welches das Antigen erkennt, an das Antigen binden werden, um
einen Komplex zu bilden, welcher durch Endozytose aufgenommen und prozessiert wird. Ein
Fragment des Antigens mit dem MHC-Antigen der Zellen wird dann präsentiert werden. Durch
das Zugeben von T-Zellen zu dem Medium, welche durch die B-Zellen restringiert sind, werden
T-Zellen, welche das Antigen-Fragment erkennen, Lymphokine sezernieren, was zur Proliferation
der B-Zellen führt. Durch das Bereitstellen eines Überschusses an Rezeptor auf der festen
Oberfläche oder nach der Freisetzung der B-Zellen kann man durch das Trennen der
Zellpopulation in einem zweiten Sammelgefäß in wesentlicher Weise die Anzahl von B-Zellen
und von Plasmazellen, die das Antigen von Interesse erkennen, erhöhen.
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Alternativ können B-Zell-Fusionspartner (Hybridomzellen) oder ander B-Zellen von jedweder
Quelle durch das Binden an eine Polystyroloberfläche selektiert werden, welche kovalent
gebundenes Antigen trägt. Gewünschte Hybridom- oder andere B-Zellen, welche sIg tragen,
welches reaktiv mit dem an Polystyrol gebundenem Antigen ist, werden auf der
Polystyroloberfläche gefangen, was eine Antigen-spezifische Selektion von spezifischen
Hybridom- oder anderen B-Zellen gestattet. Gefangene Zellen können dann wieder gewonnen
und, gemäß den Vorgehensweisen, welche in dem vorliegenden Verfahren beschrieben werden,
expandiert werden. Alternativ können T-Zellen oder kann jedwede Zelle, welche einen
spezifischen Oberflächenrezeptor enthält, durch die Polystyroloberfläche gefangen werden, wenn
die Polystyroloberfläche das Antigen kovalent gebunden enthält.
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Wo man es wünscht, ein spezifisches Subset von B-Zellen zu depletieren, kann man das Antigen
konjugiert an ein Toxin zugeben, sowie Antikörper, die spezifisch für das
Oberflächenimmunglobulin sind, und Komplement verwenden oder ein anderes selektives
cytotoxisches Potential. So kann man auf selektive Weise die Zellen, welche gegenüber einem
bestimmten Antigen responsiv sind, vermindern. Alternativ können Antigen oder ein B-Zell-
Marker (z. B. CD-20) auf dem Polystyrol immobilisiert werden und die B-Zell-Population, auf die
abgezielt wird, auf der Oberfläche gefangen werden. Insbesondere wo Gedächtniszellen
existieren, kann man die humorale Antwort durch ein wesentliches Depletieren der
Gedächtniszellpopulation für ein bestimmtes Antigen reduzieren.
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Die T-Zell-Population ist stärker variiert als die B-Zell-Population, was die Funktion betrifft.
Man kann die reife T-Zell-Population in CD4-MHC-Klasse II restringierte cytotoxische, Helfer
oder Suppressorzellen unterteilen und in CD8-MHC-Klasse I restringierte cytotoxische und
Suppressorzellen, wobei die Zellen unterschiedliche Funktionen haben und ihre Expansion und
ihre Depletion von Interesse sein kann.
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Für jede T-Zell-Population (CD4 oder CD8) kann es wünschenswert sein, die T-Zellen zu
aktivieren, welche ein spezifisches Antigen erkennen. Viele Strategien können für diesen Zweck
verwendet werden. B-Zellen, die spezifisch für ein bestimmtes Antigen sind, können diesem
Antigen ausgesetzt werden und dann als Antigen-präsentierende Zellen verwendet werden, um
das bestimmte Antigen-restringierte T-Zell-Subset zu aktivieren. Alternativ können Monozyten
oder Makrophagen als die Antigen-präsentierenden Zellen verwendet werden. Makrophagen
können bevorzugt werden, da sie nicht die Spezifität der B-Zellen für ein bestimmtes Antigen
haben. Daher würde man Monozyten und/oder Makrophagen, welche vorbehandelt worden sind
oder gemeinsam mit dem Antigen behandelt worden sind, den gebundenen T-Zellen zuführen, um
für eine Expansion derjenigen T-Zellen, welche das Antigen-Fragment erkennen, wenn es durch
die Monozyten/Makrophagen in dem Kontext des MHC präsentiert wird, zu sorgen.
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Eine biologische Aktivierung von Zellen kann als ein Ergebnis eines bestimmten löslichen oder
immobilisierten Lymphokins erreicht werden, z. B. IL-2, oder durch die Verwendung einer
spezifischen bindenden Verbindung, wie ein Antikörper. Zum Beispiel können T-Zellen unter
Verwendung einer Anti-T-Zell- (z. B. CD-5) Oberfläche ausgewählt werden. Die CD-5&spplus; -
gefangenen Zellen können dann freigesetzt und auf eine aktivierende anti-CD3-Oberfläche
geführt werden oder auf eine Oberfläche, an welche ein Lymphokin kovalent gebunden worden
ist. Die Zellen werden binden und aktiviert werden. Nach der Aktivierung können die Zellen
durch Beschallung, mechanisches Aufrühren oder andere zweckmäßige Mittel freigesetzt und
geerntet werden.
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Von besonderem Interesse sind Stammzellen, welche aus Knochenmark oder dem peripheren
Blut erhalten werden können. Diese Stammzellen können als die Vorläufer von einer oder
mehreren der Blutzelllinien dienen. Die Isolation der Stammzellen kann das Resultat von sowohl
einer Depletion (negative Selektion) und/oder einer positiven Selektion sein. Daher kann man
eine Reihe von Vorrichtungen oder Vorrichtungsuntereinheiten bereitstellen, wo anfänglich die
Rezeptoren an unerwünschte Zellen für die Entfernung dieser Zellen aus dem Medium binden
werden (negative Selektion). Die ungebundenen Zellen können dann isoliert werden, befreit von
den gefangenen Zellen und weiter selektiert (positive Selektion) auf Zellen mit unterschiedlichen
mit Stammzellen assoziierten Markern, wobei eine gebundene Population von Zellen
zurückgelassen wird, welche dann freigesetzt werden kann, wonach eine weitere positive
Selektion für einen Marker folgt, der für eine Population spezifisch ist, welche die Stammzellen
einschließt. Auf diese Weise können andere Zellen mit dem analogen Endmarker durch den
vorausgehenden Verfahrensschritt entfernt werden.
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Wo andere als Blutzellen involviert sind, können Zellen von Interesse für die Isolation
Langerhansinselzellen, Gliazellen, Astrozyten, Neuronen, Endothelzellen, Epithelzellen,
Stromazellen, Stammzellen, Plattenepithelzellen oder dergleichen einschließen.
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Im wesentlichen homogene Populationen, d. h., zu mehr als etwa 95%, üblicherweise zu 98%,
von Zellen können erreicht werden, wobei die Zellen in einem ruhenden oder einem aktivierten
Zustand sein können. Zelluläre Zusammensetzungen können jedwede zelluläre Population
einschließen, welche einen Oberflächenmarker exprimiert (Ligand), der durch den
immobilisierten Rezeptor erkannt wird. Solche Zusammensetzungen schließen Zellen ein, welche
jedwedes der erkannten Leukozytenantigene vom CD- Typ (Clusterbezeichnungsreihe, cluster
designation series) oder andere, durch monoklonale Antikörper gegen spezifische
Zelloberflächenliganden erkannte Antigene tragen. Solche Zusammensetzungen können andere
Blutzellen einschließen, Tumorzellen, Bakterien, Viren oder Parasiten, die auf eine ähnliche
Weise einen gemeinsamen Oberflächenmarker teilen. So gut wie jedwede Zellpopulation deren
Mitglieder einen Oberflächenliganden teilen, der durch den immobilisierten Rezeptor erkannt
wird, können eine solche zelluläre Zusammensetzung bilden.
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Eine große Vielfalt von Autoimmun-, neoplastischen, infektiösen, den Metabolismus
betreffenden, hämatologischen und immunologischen Erkrankungen und Zustände (das
Krankheitsgebiet) können in Übereinstimmung mit dieser Erfindung behandelt werden. Unter den
Autoimmunerkrankungen sind Diabetes, Lupus erythematodes und rheumatoide Arthritis. Unter
den infektiösen Erkrankungen sind lokale und systemische Infektionen aufgrund von
grampositiven Kokken, gramnegativen Kokken, gramnegativen Bazillen, anaeroben Bakterien,
Mykobakterien, Pilzen, Viren, Protozoen etc.. Unter den neoplastischen Erkrankungen sind alle
soliden und hämatologischen malignen Erkrankungen. Unter den den Metabolismus betreffenden
Erkrankungen sind Arteriosklerose und septischer Schock. Unter den hämatologischen
Erkrankungen sind Sichelzellanämie und familiäre hypercholesterole Anämie. Unter den
immunologischen Erkrankungen und Zuständen sind Organtransplantation und Zustände der
Immundefizienz.
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Diese und andere Erkrankungen und Zustände können durch das vorliegende Verfahren wie folgt
angegangen werden. Durch ein alternatives Verfahren kann man Immunkomplexe, die mit der
Autoimmun-, der infektiösen oder der neoplastischen Erkrankung assoziiert sind, isolieren (siehe
die mit anhängige Anmeldung Seriennummer 243 786, eingereicht am 13. September 1988). Man
kann das aus den Komplexen erhaltene Antigen verwenden, um sowohl auf B- als auch auf T-
Zellen zu selektieren, wie vorausstehend beschrieben, welche durch das betreffende Antigen
aktiviert werden. Daher kann man Blut aus dem Wirt, der an der Autoimmun- oder an der
neoplastischen Erkrankung leidet, entfernen und entweder selektiv die B- und/oder T-Zellen, die
mit der Erkrankung assoziiert sind, depletieren oder T- oder B-Zellen aktivieren, um die
Autoimmunerkrankung zu unterdrücken oder um die neoplastischen Zellen zu detektieren und zu
eliminieren. Auf diese Weise kann man für eine Remission sorgen, das Fortschreiten der
Krankheit aufhalten oder dergleichen.
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Alternativ kann man in den Fällen einer Infektion sowie von Autoimmun- oder neoplastischen
Erkrankungen für eine Selektion auf B- und T-Zellen sorgen, die mit den betreffenden
Pathogenen oder dem Krankheitsantigen reaktiv sind. In diesem Fall würde man wünschen, die
Konzentration der B- und T-Zellen, die mit der Immunabwehr assoziiert sind, zu erhöhen. Daher
können Komplexe oder Antigene, die mit dem Pathogen, der Autoimmun- oder der
neoplastischen Erkrankung oder der pathogenen, autoreaktiven oder neoplastischen Zelle selbst
assoziiert sind, verwendet werden, um die lymphoide zelluläre Population, die mit der Abwehr
der Erkrankung assoziiert ist, zu erhöhen. Man kann das Pathogen, die autoreaktive oder
neoplastische Zelle unter Verwendung der vorliegenden Vorrichtung isolieren und das isolierte
Pathogen oder die Zelle als das Immunogen oder den Rezeptor, wie vorausstehend definiert,
verwenden, um die geeignete T- oder B-Zelle, die in der Abwehr der Erkrankung aktiv ist, zu
fangen. Auf diese Weise selektiert, könnten diese Zellen für eine nachfolgende Zurückgabe an
den ursprünglichen Patienten wiedergewonnen., expandiert und aktiviert, wie vorausstehend
beschrieben, werden. Dieses Verfahren kann mit einer weiten Vielzahl von Erkrankungen, die mit
Viren, z. B. AIDS, HTLV-I oder II, Bakterien, Protozoen, Pilzen, Würmern und dergleichen
assoziiert sind, verwendet werden.
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Zusätzlich kann das Verfahren für prophylaktische und diagnostische Zwecke auf dem Gebiet der
Erkrankung verwendet werden. Das vorliegende Verfahren wird ebenfalls Verwendung in der
Forschung für den Nachweis von B- und T-Zell-Antworten finden, welche Immunantworten
untersucht, Epitope identifiziert, die mit Autoimmunerkrankungen assoziiert sind, und
letztendlich für die Gentherapie verwendet werden.
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Man kann die vorliegende Vorrichtung ebenfalls für das Herstellen von monoklonalen
Antikörpern verwenden, indem B-Zellen aktiviert werden, gefolgt von einer Immortalisierung der
B-Zellen, gewöhnlicherweise durch eine Fusion mit einem passenden Fusionspartner. Auf diese
Weise kann man humane Lymphozyten gegen Antigene immunisieren, die man normalerweise
einem menschlichen Wirt nicht verabreichen könnte und für eine doppelte Selektion sorgen,
anfänglich auf B-Zellen im allgemeinen, gefolgt von einer Selektion auf diejenigen spezifischen
B-Zellen, welche in der Lage sind, an das Antigen zu binden. Auf diese Weise kann man in
großem Maß B-Zellen, welche für das Antigen spezifisch sind, konzentrieren, um die
Wahrscheinlichkeit für den Erhalt monoklonaler Antikörper, die für das Antigen spezifisch sind,
auf große Weise zu erhöhen.
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Die Zellen können aus der Sammelvorrichtung durch verschiedene Wege isoliert werden. Von
besonderem Interesse ist die Verwendung eines mitogenen Reagenzes, wie Phytohämagglutinin
(PHA), in Zusammenhang mit einer Verbindung mit wachstumsfaktorähnlicher Aktivität, wie
einem Interleukin oder einem Wachstumsfaktor, z. B. Interleukin-2 (IL-2), GM-CSF, etc., was zur
Freisetzung der Zellen durch das Abstoßen der auf der Zelloberfläche an den Rezeptor
gebundenen Liganden führt. Das Medium kann ein Standard-Gewebekulturmedium sein, welches
etwa 20 bis 1000 Einheiten/ml IL-2 und etwa 0,1 bis 5,0 ug/ml Phytohämagglutinin enthält.
Alternativ können die Zellen durch physikalische Verfahren freigesetzt werden, wie
mechanisches Abreißen, insbesondere Scheren, wie durch Vibration, heftiges Pipettieren oder
Beschallung unter Verwendung eines Ultraschallgerätes und das Platzieren des Sammelgerätes in
einem Wasserbad. Zweckmäßigerweise kann ein Crest Ultraschall Modell verwendet werden.
Siehe Menssen et al. J. Immunol Methods (1987) 104: 1-6.
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Die Figuren werden nachfolgend erläutert. Die Fig. 1 ist ein Flußdiagramm eines Verfahrens
gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Blut als der Quelle der Zielzellen. Die
Zeichnung schließt einen ersten Zustand ein, der das Trenngefäß 10 einschließt, wo rote
Blutzellen und Plättchen entfernt werden, um einen Überstand zu ergeben. Der Überstand 12 wird
dann in eine Zentrifuge 14 mit den Röhrchen 16 transferiert, wo der Überstand 12 zentrifugiert
wird, um die Zielzellen 20 in den Röhrchen 16 zu konzentrieren. Die Zielzellen 20 werden dann
in ein Einspeisgefäß 22 transferiert, welches die Zielzellen durch das Ventil 24 in die
Zellfangvorrichtung 26 einspeist, ebenfalls in der Fig. 2 dargestellt. Dieses Verfahren ist nicht
durch das zitierte Beispiel beschränkt. Jedwedes gewöhnlich verwendete Verfahren, um rote
Blutzellen, Plättchen und Plasma zu entfernen kann verwendet werden, um die Zielzellpopulation
20 aus peripherem Blut oder Knochenmark zu erhalten. Alternativ kann festes Gewebe durch
enzymatische oder physikalische Mittel zerteilt werden, um die Zielzellpopulation 20 zu erhalten.
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Die Zellfangvorrichtung 26 hat eine Mehrzahl von Polystyrolfolien oder Blättern 30, getrennt
durch Träger 32. Auf den oberen Folien oder Blättern 30 ist das Vorhandensein des Rezeptors 34,
bezeichnet als R, angezeigt. Die Rezeptoren 34 sind nur auf einigen von den Folien oder Blättern
angezeigt, darauf hinweisend, daß die Rezeptoren auf beiden Seiten der Folie oder des Blattes
sind, obwohl sich versteht, daß alle von den Folien oder den Blättern auf beiden Seiten mit den
Rezeptoren beschichtet sind. Alternativ kann die Zellfangvorrichtung eine T-Flasche, eine
Mikrotitterplatte, eine Multiwellplatte bzw. Multilochplatte, eine Rollflasche, eine Zellfarm oder
jedwedes andere Polystyrolgefäß sein, wobei deren gesamte innere Polystyrolberfläche oder Teile
davon immobilisierten Rezeptor an sich hat.
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Die Zellen treten in die Zellfangvorrichtung 26 über das Rohr 36 ein. Wenn die
Zellfangvorrichtung 26 im wesentlichen voll ist, läßt man sie für eine hinreichende Zeit stehen, damit
sich die Zellen absetzen und die Rezeptoren auf der Folie oder auf dem Blatt unter der flüssigen
Schicht kontaktieren. Nach einer hinreichenden Zeit, damit sich die Zellen abgesetzt und
angeheftet haben, kann die Zellfangvorrichtung 26 dann umgedreht werden, so daß Zellen,
welche nicht spezifisch gebunden worden sind, sich auf der reversen Seite der Folie oder des
Blattes absetzen und an die Rezeptoren auf dieser Seite gebunden werden. Die
Zellfangvorrichtung kann dann durch das Einführen einer Waschlösung durch das Rohr 36 und
indem man sie durch das Rohr 40 austreten läßt gewaschen werden, um so nicht spezifisch
gebundene Zellen zu entfernen.
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Eine oder mehrere Behandlungslösungen oder Zellsuspensionen können dann eingeführt werden,
um die Anzahl von gefangenen Zellen zu expandieren, die gefangenen Zellen zu aktivieren, ein
Subset der gefangenen Zellen zu depletieren, exogene Gene in die gefangenen Zellen einzuführen
oder dergleichen. Nachdem die Behandlung vollständig durchgeführt worden ist, kann das Gefäß
wiederum gewaschen werden, um die Behandlungslösung, zellulären Debris und dergleichen zu
entfernen und ein geeignetes Medium kann eingeführt werden, um die Viabilität der gebundenen
Zellen aufrecht zu erhalten. Die Zellen können dann durch das Zugeben eines Mediums, welches
Interleukin-2 und ein mitogenes Reagenz enthält freigesetzt werden, oder indem man die
Zellfangvorrichtung 26 nimmt und sie in ein Ultraschallbad einführt oder sie mechanischer
Vibration oder heftigem Pipettieren unterzieht. Nach einer kurzen Periode einer solchen
physikalischen Behandlung oder unter relativ milder Schallvibration werden die gefangenen
Zellen freigesetzt und können geerntet werden.
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Die folgenden Beispiele werden als Erläuterung gegeben und nicht um zu beschränken.
Experimentelles
I. Validierung der Vorrichtung und des Verfahrens
A. Synthese von N-(Hydroxymethyl)2-bromacetamid (HMBA) und Erzeugung der
Bromacetamid-Polystyroloberfläche (BA-PS).
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HMBA wird synthetisiert durch herkömmliche Mittel (Leonard et al., J Org. Chem. 50: 2480
(1985)) aus 2-Bromacetamid, erhältlich von kommerziellen Quellen, in der Gegenwart von
Formalin bei pH 10, welches eine 93-%ige Ausbeute des Startreaktanden, N-(Hydroxymethyl)2-
bromacetamid (HMBA) ergibt.
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Der zweite Schritt betrifft die Erzeugung der Bromacetamid-Polystyroloberfläche (BA-PS). In
diesem Schritt werden 2 M Trifluormethansulfonsäure und 0,2 M HMBA, beide in
Tetramethylensulfon (Sulfolan) 1 : 1 in einem Volumen gemischt, das hinreichend ist, um die innere
Oberfläche eines Polystyrolgefäßes, das aktiviert werden soll, zu bedecken. Die Reaktion läßt
man bei 27ºC 3 Stunden lang voranschreiten. Die Reaktionsmischung läßt man ablaufen, die
Vorrichtung wird mit Wasser gewaschen, gefolgt von Ethanol und die aktivierten
Polystyrolkammern werden luftgetrocknet. Die resultierende Bromacetamid-Polystyrol-Oberfläche ist in
Raumluft während sechs (6) Monaten stabil.
B. Präparation der Zellfangoberfläche, Stabilisierung und Sterilisation
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Der nächste Schritt ist das Fangen des Rezeptors (der monoklonale Antikörper, von dem man
wünscht, daß er kovalent an die Bromacetamid-Polystyroloberfläche bindet). Der monoklonale
Antikörper von Interesse wird auf etwa 0,01-0,05 mg/ml in phosphatgepufferter physiologischer
Kochsalzlösung, pH 7,4, verdünnt. Das geeignete Volumen des verdünnten monoklonalen
Antikörpers wird in die Polystyrolkammer eingeführt, und man läßt die Reaktion während etwa
zwei bis zwanzig, bevorzugtermaßen 2 bis 4 Stunden bei 27ºC unter Rotation voranschreiten. Der
nach der Reaktion verbleibende Antikörper wird dekantiert und kann bis zu 10 Mal in
nachfolgenden Beschichtungsreaktionen wiederverwendet werden.
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Die Vorrichtung mit gebundenen Anmtikörpern wird dann zehn Mal mit phosphatgepufferter
physiologischer Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, gewaschen, und die Oberfläche wird dann durch
die Zugabe von 2% Sucrose/0,2% humanes Serum Albumin (HSA), medizinischer Grad, zu jeder
Vorrichtung stabilisiert. Die Sucrose/Albumin-Lösung läßt man die Oberfläche beschichten,
wonach die überschüssige Sucrose/HSA-Lösung dekantiert wird und die stabilisierten
Polystyrolkammern 24-96 Stunden lang in einem Vakuum (< 0,10 Torr) bei 25ºC getrocknet
werden. Nach dem Trocknen wird das Vakuum mit trockenem Stickstoff aufgehoben und die
Vorrichtung wird mit inertem trockenen Gas gespült und fest verschlossen. Die Vorrichtung wird
versiegelt und dann sterilisiert. Die Sterilisation wird erreicht durch eine Bestrahlung mit 2,7 ±
0,2 Megarad Elektronenstrahl oder Gammastrahlung. Sterilitätstests zeigten, daß die Flaschen
nach einer Inkubation von 14 Tagen in situ mit Medium waren.
C. Dichte des Zellfangoberflächenrezeptors
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Eine Vielfalt von Oberflächen funktionalisierenden Gruppen wurde verwendet und auf die
Stabilität der Bindung des Antikörpers an die Oberfläche getestet. Das Polystyrol wurde
funktionalisiert unter Verwendung von N-(Hydroxymethyl)2-haloacetamid, wobei die
Halogengruppe Brom, Chlor oder Iod war; Diazonium und Sulfonium. Nach der Anheftung von
monoklonalem Antikörper unter Verwendung dieser Oberflächen wurden die Flaschen jeweils 10
Mal mit PBS und einmal mit 1% SDS bei 55ºC während 14 Stunden gewaschen. Die
Pastikoberflächen wurden dann auf die Radioaktivität der markierten monoklonalen Antikörper
getestet und die Ergebnisse als Oberflächendichte des monoklonalen Antikörpers in ng/cm²
ausgedrückt. Das Bromacetamid hat eine Oberflächendichte von etwa 250 ng/cm² des
Antikörpers, 2,5 mal mehr als diejenige, die durch Adsorption auf einer Immulon-2TM (Dynatek)
Oberfläche erreicht wird. Während das Bromacetamid für die höchste Oberflächendichte sorgte,
lag die Oberflächendichte für die anderen Funktionalitäten zwischen 200 und etwa 240 ng/cm².
D. Stabilität des fangenden Oberflächenrezeptors
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Die Stabilität der Antikörperbindung wurde durch die Beschichtung der Oberfläche mit 0,02
mg/ml von (³&sup5;S) humanem IgG bestimmt. Die Flaschen wurden 5 mal mit Borat-Carbonat-Puffer
gewaschen, einmal mit Borat-Carbonat-Puffer während 8 Stunden und zweimal mit Borat-
Carbonat-Puffer-Waschschritten über Nacht. Aliquots von jeder Waschung wurden aufbewahrt
und auf Radioaktivität getestet. Nach der zweiten Waschung gab es keinen Beweis für
irgendwelche Auswaschung des Antikörpers. In einer zweiten Studie unter Verwendung eines
ELISA-Tests für den an die Oberfläche gebundenen Antikörper zeigten die beobachteten
Resultate, daß die Menge des extrahierbaren Antikörpers geringer war als die Nachweisgrenze
des Assays (7,7 ng/ml).
E. Dichte des Zellfangens durch die derivatisierte Polystyroloberfläche.
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Weil die Rezeptor-derivatisierte Polystyroloberfläche ihre optische Klarheit beibehält, kann die
Dichte der gefangenen Zellen pro Einheitsfläche des derivatisierten Polystyrols durch direkte
mikroskopische Visualisierung berechnet werden. Für die meisten Anwendungen des Zellfangens
nähert sich die Dichte der gebundenen Zellen der dichtesten Packung von Kugeln auf einer
Monoschicht. Für die Lymphozyten der Maus oder von humanem Ursprung ist die
Bindungsdichte von 0,5 · 10&sup6; Zellen/cm² bis 1 · 10&sup6; Zellen/cm². Abhängig von der Häufigkeit
und der Größe der Zielzellen in der Zellsuspensionseingabe kann die Dichte der gebundenen
Zellen in weitem Maße variieren von 1 · 10³ Zellen/cm² für große, seltene Zielzellen bis zu mehr
als 10 · 10¹&sup0; Zellen/cm² für kleine, reichlich vorhandene Zellen oder Partikel wie Bakterien oder
Viren.
F. Spezifität des Zellfangens durch die derivatisierte Polystyroloberfläche.
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Die Zellbindung an die funktionalisierte Polystyroloberfläche wird in einer spezifischen Weise
durch den an das Polystyrol gebundenen Rezeptor bestimmt. Das folgende Experiment erläutert
die Spezifität der Zellbindung. Mononukleäre Zellen wurden aus dem peripheren Blut durch
Standard-Histopaque-Zentrifugation präpariert und auf 3 · 10&sup6; Zellen/ml PBS verdünnt. Ein
Aliquot der Zufuhr wurde für die Analyse des Phänotyps durch Durchflußzytometrie reserviert.
Die Zellsuspension wurde zu T-25-Flaschen zugegeben, welche auf ihrer inneren
Bodenoberfläche einen gereinigten monoklonalen Antikörper durch das vorliegende Verfahren
kovalent gebunden enthielten mit einer Spezifität für entweder (1) Thy 1.2 (ein muriner T-Zell-
Marker), (2) CD5, (3) CD8 oder (4) eine äquimolare Mischung von CD8 und CD5 Antikörpern
(humane T-Zell-Marker). Die Zellen ließ man 30 min lang inkubieren, dann wurden sie sanft
geschüttelt und man ließ sie sich zusätzliche 30 min lang setzen. Nicht adhärente Zellen
(diejenigen, die sich nicht an die Oberfläche der Flasche angeheftet hatten) wurden durch
Dekantieren zurückgewonnen und Aliquots wurden ebenfalls für die Analyse der
Zusammensetzung des Phänotyps mittels Durchflußzytometrie reserviert. In allen Fällen außer der Thy 1.2
Flasche, in welcher man keine Zellen an die Flasche gebunden sah, zeigte die mikroskopische
Untersuchung der Flaschen ein konfluentes Zellbinden bei einer Dichte von 0,5 · 10&sup6; Zellen /cm².
Die durchflußzytometrische Analyse wurde an allen eingegebenen und ausgeflossenen (nicht
adhärenten) Zellpopulationen für die Marker CD5, CD8 (humane T-Zellen), CD14 (humane
Monozyten), CD16 (humane NK-Zellen) und CD20 (humane B-Zellen) durchgeführt und die
relative Häufigkeit dieser Marker in der Eingabe und dem Ausfluß für jede Flasche verglichen.
Die Ergebnisse zeigten keine Differenzen zwischen der Eingabe und dem Ausfluß für die Thy
1.2-Flasche. Die CD5 und CD8-Flaschen zeigten jeweils eine mehr als 98%-ige Depletion von
CD5- und CD8-Zellen in dem Ausfluß und die CD5/CD8-Flasche zeigte eine Depletion von CD5
und CD8-Zellen in einem Ausmaß, das sowohl demjenigen der monospezifischen CD5 als auch
demjenigen der CD8-Flaschen äquivalent war. Die Marker für Monozyten und NK-Zellen und B-
Zellen zeigten eine relative Anreicherung in dem Ausfluß, da sie nicht durch die Flasche gefangen
wurden. Diese Daten zeigen, daß (1) Zellen quantitativ und spezifisch durch die
Zellfangvorrichtung gefangen werden, (2) die funktionalisierte Oberfläche keine nicht-spezifische
Zellbindung aufweist und (3) mehr als ein Zellphänotyp gleichzeitig durch eine bi-derivatisierte
Polystyroloberfläche gefangen werden kann.
II. A. Knochenmarktransplantation
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In diesem ersten Beispiel wird eine T-Zell-Depletion für eine Knochenmarktransplantation
exemplarisch dargestellt. Daten zeigen an, daß die CD5&spplus; und CD8&spplus;-T-Zellen, welche in dem
Knochenmarkmaterial vorhanden sind, die Transplantat-Wirt-Erkrankung verursachen. Eine
Vorrichtung wie vorausstehend beschrieben, wurde unter Verwendung von monoklonalen
Antikörpern gegen CD5 und CD8 positive humane T-Zellen hergestellt. Aliquots von humanem
Knochenmark, erhalten von normalen menschlichen Freiwilligen, wurden in eine
erfindungsgemäße Vorrichtung eingeführt und die Zellen wurden inkubiert wie beschrieben.
Nicht adhärente Zellen wurden wiedergewonnen, phänotypisch bestimmt und In vitro- Kulturen
unterzogen, um eine Anreicherung von Vorläuferzellen im Vergleich zu dem eingegebenen nicht
fraktionierten Knochenmark zu quantifizieren. Die folgenden Tabellen zeigen typische
Ergebnisse.
Tabelle 1 Depletion von T-Zellen
(% Depletion der Eingabe)
Tabelle 2 Anreicherung der Vorläufer
(% Anreicherung über die Eingabe)
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CFU-EU = colony forming units, erythroid units (Kolonie bildende Einheiten,
erythroide Einheiten)
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BFU-E = burst forming units, erythroid (Burst bildende Einheiten, erythroide)
-
CFU-GM = colony forming units, granulocyte-monocyte (Kolonie bildende
Einheiten, Granulozyt-Monozyt)
-
CFU-M = colony forming units, monocyte (Kolonie bildende Einheiten, Monozyt)
-
CFU-G = colony forming units, granulocyte (Kolonie bildende Einheiten,
Granulozyt)
-
Die Daten in den Tabellen zeigen eine spezifische Depletion von CD5&spplus; und CD8&spplus;-Zellen (CD14&spplus;,
CD16&spplus;-Zellen sind angereichert, CD19&spplus;-Zellen sind unverändert) und eine 2-6-fache
Anreicherung für Vorläuferzellen. Diese Daten erläutern die Verwendung des vorliegenden
Verfahrens, um in einer spezifischen Weise Zellen zu depletieren, die die Transplantat-Wirt-
Erkrankung verursachen, bei einer Anreicherung der gewünschten Vorläuferzellen.
-
In dem zweiten Beispiel der Anwendungen zur Knochenmarktransplantation wird die Fähigkeit
der vorliegenden Vorrichtung gezeigt, eine besonders seltene Zellpopulation in einer Mischung
von Zellen aus Knochenmark oder aus peripherem Blut zu konzentrieren. Zellen, die konzentriert
werden sollen sind Vorläuferstammzellen von humanem Knochenmark. In diesem Beispiel
inkorporiert die vorliegende Vorrichtung einen monoklonalen CD34-Antikörper, kovalent an die
Polystyroloberfläche gebunden. Im ersten Fall dieses Beispiels wurden humane
Knochenmarkproben in die vorliegende CD34-Vorrichtung eingeführt, die Zellen wurden
inkubiert wie beschrieben, die nicht adhärenten Zellen wurden durch Dekantieren und die
gefangenen Zellen wurden durch Beschallung wiedergewonnen. Die drei Fraktionen, die Eingabe,
die nicht adhärenten und die adhärenten Zellen wurden auf CFU-C getestet, ein Standardtest für
Vorläuferzellen. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse:
Tabelle 3
CFU-C/25 000 Zellen
-
Eingegebene Zellen 3
-
Nichtadhärente Zellen 0
-
Adhärente Zellen 44
-
Die Daten zeigen eine 15-fache Erhöhung der Vorläuferzellen an, erreicht durch die vorliegende
Vorrichtung und das vorliegende Verfahren der Zellwiedergewinnung durch Beschallung.
-
In dem zweiten Fall dieses Beispiels wurden mononukleäre Zellen des peripheren Blutes in eine
andere vorliegende CD34-Vorrichtung eingeführt. Nichtadhärente Zellen wurden durch
Dekantieren wiedergewonnen, adhärente Zellen wurden wieder durch Beschallung
wiedergewonnen. Aliquots der Eingabe und der adhärenten Zellen wurden auf den CD34&spplus;-
Phänotyp hin analysiert. Die eingegebenen Zellen waren weniger als 0,1% positiv für CD34&spplus;-
Zellen. Die durch Beschallung wiedergewonnenen adhärenten Zellen waren zu 15% CD34&spplus;, was
die Nützlichkeit der vorliegenden Vorrichtung und des Verfahrens für das Wiedergewinnen
lebensfähiger Vorläuferzellen aus dem peripheren Blut zeigt.
II. B Antivirale zelluläre Therapie, z. B. AIDS
-
In dem nächsten Beispiel wird ein Verfahren zur Behandlung einer viralen Infektion, z. B. AIDS
exemplarisch gezeigt. Die Technik besteht darin, CD8&spplus;-Zellen durch das Fangen von CD8&spplus;
cytotoxischen T-Zellen aus den mononukleären Zellen des peripheren Blutes zu fangen. Die
gefangenen CD8&spplus;-Zellen werden dann wiedergewonnen durch eine kurze Kultur in einem
Medium, welches ein Lektin und rekombinantes IL-2 (Lymphokintriggern; lymphokine drive)
enthält, wonach sich eine Expansion der abgelösten Zellen in einem Standardgewebekulturgefäß
während 14 bis 28 Tagen vor einem endgültigen Waschen und dem Sammeln für eine Reinfusion
in den ursprünglichen Patienten anschließt.
-
Im Einzelnen wurden humane mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC), mit Ficoll-
Histopaque konzentriert, in eine T-150 Polystyrolflasche mit einem kovalent angehefteten
monoklonalen Anti-CD8-Antikörper eingeführt. Nach einer Inkubation von einer Stunde wurde
das Blut dekantiert und das Gewebekulturmedium mit IL-2 (300 Units/ml) und PHA (0,1 ug/ml)
supplementiert. Nach 48 bis 72 Stunden der Kultur lösten sich die CD8&spplus;-Zellen spontan von der
Flasche ab, während sie den Antiköper kovalent an der Oberfläche des Polystyrols gebunden
zurückließen, wie durch eine durchflußzytometrische Analyse gezeigt wurde, welche die
Abwesenheit von monoklonalem Antikörper auf der Oberfläche der abgelösten Zellen zeigte.
C. Tumor infiltierende Lymphozyten
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Durch den enzymatischen Verdau von Tumoren oder lymphoidem Gewebe aus Krebspatienten
erhaltene Zellsuspensionen wurden in Vorrichtungen, welche CD4 oder CD8 monoklonalen
Antikörper an die Oberfläche gebunden enthielten, eingeführt. Nach dem Fangen der CD4&spplus; oder
CD8+-Zellen und ihrer Wiedergewinnung durch entweder Beschallung oder Lymphokintriggern
(lymphokine drive), zeigten die wiedergewonnenen Zellen sich jeweils zu mehr als 98%
lebensfähig und zu mehr als 95% phänotypisch reine CD4&spplus; oder CD8&spplus;-Zellen. In allen
untersuchten Fällen zeigten entweder die gereinigten CD4&spplus; oder CD8&spplus;-Zellen wenigstens
ebensoviel autologe Tumortoxizität wie die nicht getrennte Ausgangsgewebesuspension. Die
gereinigte Population zeigte kein unspezifisches Abtöten von allogenem Tumor. Die gereinigte
Population war zu logarithmischem Wachstum in der Lage, zur Aufrechterhaltung der Viabilität,
von phänotypischer Homogenität und autologer Tumorzytotoxizität. Der Phänotyp der
cytotoxischen Zelle variierte unter den Tumortypen, wobei CD8&spplus; für Melanom und
Plattenepithelzellkarzinom) vorherrschte, CD4&spplus; für Nierenzellkarzinom.
D. Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK)
-
In dem nächsten Beispiel wurden anti-CD5, anti-CD14 und Anti-CD20 monoklonale Antikörper
in Vorrichtungen verwendet, um PBMCs zu depletieren, um durch negative Selektion NK-Zellen
anzureichern. Es wurde gezeigt, daß die Antikörper in der Lage waren, den CD5&spplus;-Phänotyp zu
mehr als etwa 98%, den CD14&spplus;-Phänotyp zu mehr als 50% und den CD20&spplus;-Phänotyp zu mehr als
90% zu depletieren. Um LAK-Zellen zu erhalten, wurden 1,5 · 10&sup8; mononukleäre Zellen zu dem
Sammelgefäß, welches monoklonalen CD5-Antikörper enthielt, gegeben. Nach einer Inkubation
während 30 min wurden die nicht adhärenten Zellen durch Dekantieren wiedergewonnen und in
ein Gefäß transferiert, welches kovalent gebundenen Anti-CD14-Antikörper enthielt. Nach der
Inkubation wurden die nicht adhärenten Zellen wiederum durch Dekantieren wiedergewonnen
und in eine dritte Vorrichtung transferiert, wobei diese monoklonalen CD20-Antikörper kovalent
an die Oberfläche gebunden enthielt. Die Inkubation war wieder 30 min lang bei
Raumtemperatur. Die dritte Population nicht adhärenter Zellen wurde dann in IL-2 48-72 Stunden
lang kultiviert und ihre lytische Aktivität wurde in vierstündigen Standard-
Chromfreisetzungstests unter Verwendung von K562- für die NK-Aktivität und COLO-205-
Zellen für die LAK-Aktivität untersucht. Der Prozentsatz der spezifischen Lyse für die
verschiedenen Verhältnisse von Effektor zu Zielzellen wurde bestimmt, wobei das Verhältnis von
Effektor zu Ziel von 2,5 bis zu 20 variierte. Unter Verwendung von Zellen von einigen
unterschiedlichen normalen Spendern variierte die Anreicherung der LAK-Aktivität von 50% bis
zu 300% über die eingebrachten Zellen, kultiviert unter identischen Bedingungen.
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Die aus der vorliegenden Vorrichtung abgeleitete Zellpopulation zeigte sich wesentlich
angereichert für LAK-Vorläufer, fast frei von T- und B-Zellen und signifikant depletiert von
Monozyten. Man fand, daß der Phänotyp der LAK-Vorläufer, die durch die vorliegende
Vorrichtung gereinigt wurden, CD3&supmin;, CD16&spplus; und Leu 19&spplus; war.
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In der nächsten Studie ging man die Frage an, ob die Aktivität in lytischen Einheiten
überproportional zum Verhältnis der phänotypischen Anreicherungen der NK-Zellen in den
gereinigten Proben erhöht war. Die lytischen Einheiten wurden für die eingebrachten und die
gereinigten Fraktionen pro 10&sup6; NK-Effektorzellen berechnet. Ein 2- bis 50-facher Anstieg in
lytischen Einheiten pro 10&sup6; NK-Zellen wird mit der beschriebenen Methode mit einer negativen
Depletion in drei Schritten mit monoklonalem Antikörper erreicht. Dies zeigte, daß das Protokoll
zur Monozyten-, B-Zellen- und T-Zellen-Depletion die Aktivität der lytischen Einheit,
ausgedrückt pro NK-Effektorzelle um einen Faktor von 2 bis 50 erhöhte. Diese Erhöhung wird
durch die Entfernung von anderen Zellen erreicht, die in einer direkten oder indirekten Weise
hemmende Einflüsse auf die LAK-Aktivität ausüben. Siehe Nii, et al., Int. J. Cancer (1988) 41:
33-40; Hoyer et al., Cancer Res. (1986) 46: 2834-2938. Diese Autoren berichten die
Herabregulation der humanen Lymphokin IL-2 aktivierten Killerzellaktivität durch aktivierte
autologe Monozyten. Das vorliegende Verfahren erreichte eine 90%-ige Verminderung in der
Gesamtzellzahl, was zum Einsparen von Kultur-Ressourcen führte, die erforderlich sind, um die
NK-Aktivierung durchzuführen; und zu einer 2- bis 50-fachen Erhöhung bei der lytischen
Aktivität, berechnet pro NK-Effektorzelle als Basis.