DE69916302T2

DE69916302T2 - Verwendung von dendritischen zellen-depletierten zusammensetzungen zur verbesserung der transplantation von allogenen hämatopoietischen zellen

Info

Publication number: DE69916302T2
Application number: DE69916302T
Authority: DE
Inventors: K. Edmund WALLER
Original assignee: Emory University
Current assignee: Emory University
Priority date: 1998-11-11
Filing date: 1999-11-10
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2019-11-11
Also published as: CN1213143C; JP2002529476A; AU1817800A; KR20010090008A; EP1123384A2; EP1123384B1; WO2000027998A2; ATE263833T1; DE69916302D1; AU779039B2; CA2351194A1; CN1333688A; WO2000027998A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Das Gebiet der Erfindung besteht in verbesserten Methoden der Transplantierung von das allogene hematopoietische System rekonstituierenden Zellen von Spendern zu genetisch verschiedenen Empfängern und beinhaltet die Entfernung bestimmter hematopoietischer Zelltypen des Spenders, deren Gegenwart mit reduziertem Überleben der Transplantationempfänger korreliert ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die allogene Knochenmarkstransplantation ist die bevorzugte Behandlung für eine Vielzahl von malignen und genetischen Erkrankungen der Blut- und blutbildenden Zellen. Die weit verbreitete Anwendung dieser Therapie wird durch die Verfügbarkeit von geeigneten Knochenmarkspendern begrenzt, die mit dem Patienten genetisch verwandt sind und sich die gleichen Transplantationsantigene auf der Oberfläche der Blutzellen teilen. Nur 25% der Patienten besitzen Geschwister, die potentielle, Antigen-übereinstimmende Spender darstellen. Die Knochenmarkstransplantation kann den Patienten angeboten werden, denen ein geeigneter Geschwisterspender fehlt, indem Knochenmark von Antigen-übereinstimmenden, genetisch unverwandten Spendern (die durch eine staatliche Registratur identifiziert werden) verwendet werden, oder indem Knochenmark aus genetisch verwandten Geschwistern oder Eltern verwendet wird, deren Transplantationsantigene sich durch einen bis drei der sechs humanen Leuko zytenantigene von jenen des Patienten unterscheiden. Die Verwendung von Antigen-unpassenden, genetisch verwandten Eltern oder Geschwistern, oder von Antigen-übereinstimmenden, genetisch unverwandten Spendern führt jedoch zu einer Erhöhung der Wahrscheinlichkeit einer fatalen Transplantat/Wirts-(Graft vs. Host) Erkrankung (GvHD) und/oder Transplantatabstoßung von 20% für übereinstimmende Geschwisterspender auf 50% in den Fällen von übereinstimmenden, unverwandten Spendern und nicht übereinstimmenden Spendern aus der Familie des Patienten. In den Fällen, in denen ein unverwandter Spender nicht mit einem der sechs Haupt-Transplantationsantigenen übereinstimmt, nimmt ferner die Inzidenz der Transplantatabstoßung und/oder fatalen GvHD auf 60% zu.
Die GvHD ist eine Erkrankung mit beträchtlicher Sterberate. Patienten, die eine akute GvHD entwickeln, können Blasen, die den größten Teil ihrer Hautoberfläche bedecken, massive gastrointestinale Blutungen oder ein fulminantes Leberversagen oder eine Gelbsucht entwickeln. Patienten, die eine chronische GvHD entwickeln, können eine Sklerodermie entwickeln, die zu Gelenkskontrakturen und Hautgeschwüren, Haarverlust und einem allgemeinen Schwächesyndrom führt. Patienten mit akuter oder chronischer GvHD sind immun-supprimiert und unterliegen einem Risiko gegenüber lebensbedrohlichen opportunistischen Infektionen, ähnlich zu denen, die sich unter AIDS-Patienten entwickeln.
Die gegenwärtige existierende Transplantationstechnologie beinhaltet die Verminderung von T-Zellen, beruhend auf Studien, die zeigen, dass die Entfernung solcher Zellen zu einer verringerten Inzidenz von Transplantat/Wirts-Reaktionen führt. Die T-Zellen im Spender-Knochenmark werden unter Verwendung einer von mehreren verfügbaren Techniken entfernt, wie der Entfernung von CD3⁺ Zellen, der E-Rosettenbildung, und der Verwendung von Sojabohnenagglutinin. Alternativ wurde ein klinischer Test mit allogenen Transplantaten durchgeführt unter Verwendung der Anreicherung des Spender-Knochenmarks durch eine positive Selektion gegenüber hematopoietischen Stammzellen auf der Basis der Gegenwart des Oberflächen-CD34-Markers, wodurch viele T-Zellen entfernt werden. In diesem Test folgte der CD34⁺-Selektion eine Entfernung von CD2⁺-Zellen, was eine zusätzliche Population von T- und natürlichen Killer(NK)-Zellen verminderte (E. Clarke, M. N. Potter, C. G. Steward, J. M. Cornish, JD. Marks, A. Oakhill und D. H. Pamphilon, 1997, Blood 90(10) Suppl. 1; Seite 37A; Abst. No. 1662; „Double T-cell depletion using sequential +/– immunoaffinity or CD34+ cell selection followed by campath-M: Effect on CD34+ and progenitor cell recovery"; D. Bunjes, M. Wiesneth, S. Von Harsdorf, J. Duyster, T. Shreiner, C. Duncker, B. Macari, B. Kubanek, 1997, Blood 90(10) Suppl. 1; Seite 1034; Abst. No. 454; „T cell depleted allogeneic PBSC transplants in 30 patients with hematological malignancies: Benefits and Risks"). Mit vorliegenden CD34⁺-Selektionsvorrichtungen gibt es einen Vorteil einer T-Zell-Verminderung um 2–3 Logarithmen; z. B. ein typisches Transplantat eines CD34⁺-selektierten Transplantats kann 2–4 × 10⁶ CD34⁺-Zellen und 0,1–0,5 × 10⁶ CD3⁺ (d. h. T-Zellen) pro kg Körpergewicht des Empfängers enthalten. Selbst bei dieser Behandlung benötigen solche Patienten jedoch eine GvHD-Prophylaxe.
Während die Entfernung von T-Zellen aus dem Knochenmark, welches von übereinstimmenden unverwandten oder nicht übereinstimmenden Geschwisterspendern transplantiert wurde, die GvHD reduziert, ist sie darüber hinaus mit einer erhöhten Inzidenz der Abstoßung des allogenen Knochenmarktransplantats durch den Patienten korreliert. Somit sind Lymphozyten und insbesondere T-Zellen, die im allogenen Knochenmarktransplantat vorliegen, wichtig, um die Einimplantierung in antigenisch und genetisch nicht übereinstimmenden Empfängern sicherzustellen. T-Zellen, die im allogenen Transplantat vorliegen, besitzen ferner eine wichtige Rolle bei der Eliminierung restlicher Krebszellen im Empfänger – einem Phänomen, das als „Transplantat/Leukämie-Effekt" („graft vs. leukemia effect") genannt wird.
Um die nachteiligen Wirkungen der Verabereichung von T-Zellen zu minimieren, verabreichten Waller et al. nicht-proliferierende T-Zellen, die die Einimplantierung bei der Abwesenheit einer GvHD-Antwort verstärken (U.S. Patent Nr. 5,800,539). In einer anderen klinischen Studie verabreichten Aversa et al. (New Engl. J. Med. 339: 1186–1193) zusätzliche Dosen von mononukleären Zellen des peripheren Bluts des Spenders, die T-Zell-vermindert wurden (unter Verwendung der E-Rosettenbildung), und anschließend CD34⁺, das selektiert war auf Empfänger, die ein nicht übereinstimmendes Voll-Haplotyp-Spendertransplantat empfingen, das aus Knochenmark oder mononukleären Zellen des peripheren Bluts bestand.
Während Transplantationstechniken stetig verbessert wurden, seit die erste erfolgreiche Knochenmarktransplantation in Menschen vor 30 Jahren durchgeführt wurde, sterben nach wie vor Patienten, die Allotransplantate empfangen, wegen Transplantatabstoßung und Transplantat/Wirts-Erkrankungen – neben anderen Erkrankungen. Es bleibt ein dringendes Bedürfnis, eine optimale Prozedur für die allogene Knochenmarktransplanatation zu entwickeln.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Auffinden einer Familie von verwandten Zelltypen im Spendertransplantat, deren Ge genwart mit dem verringerten Transplantierüberleben korreliert. Die Entfernung einer oder mehrerer dieser Zelltypen, die als dentritische Zellen und Vorfahren oder Vorläufer dentritischer Zellen (DCP) bezeichnet werden, erhöht das Überleben allogener Transplantate im Empfänger.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung, zur Herstellung eines Medikaments zur Reduzierung oder Verhinderung der Transplantat/Wirts-Erkrankung in einem Transplantatempfänger von das allogene hematopoietische System rekonstruierenden Zellen, von das allogene hematopoietische System rekonstituierenden Zellen zur Verfügung, in denen die Anzahl von dentritischen Zellen wirksam reduziert worden ist, indem CD3– (negative) Zellen mit einem oder mehreren der Zelloberflächenmarker CD123, CD45RA, CD4 und CD36 entfernt werden, ohne CD3+ (positive) Zellen zu entfernen, wodurch die Transplantat/Wirts-Erkrankung reduziert oder verhindert wird. Ferner wird eine Methode der Erhöhung der Überlebenswahrscheinlichkeit für einen Transplantatempfänger von das allogene hematopoietische System rekonsituierenden Zellen beschrieben, die das Verabreichen von das allogene hematopoietische System rekonstituierenden Zellen, bei denen die Anzahl von dentritischen Zellen wirksam reduziert worden ist, gegenüber dem Empfänger umfasst, wodurch die Überlebenswahrscheinlichkeit des Empfängers verbessert wird. Die Erfindung beschreibt zusätzlich eine Methode zur Erhöhung der Überlebenswahrscheinlichkeit für einen Transplantatempfänger eines allogenen Knochenmarks, die das Verabreichen von das allogene hematopoietische System rekonstituierenden Zellen, in denen die Anzahl von verabreichten dentritischen Vorläuferzellen weniger als 0,25 × 10⁶/kg Körpergewicht des Empfängers beträgt, gegenüber dem Empfänger umfasst.
Ferner wird ein Säulensystem zum Präparieren von das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen vor deren Transplantation beschrieben, umfassend eine erste Säule, die einen Träger enthält, an den Antikörper gebunden sind, die CD34 spezifisch binden, und eine zweite Säule, die einen Träger enthält, an den Antikörper gebunden sind, die spezifisch Zelloberflächenmarker binden, die auf dentritischen Vorläuferzellen exprimiert werden, wobei die erste Säule mindestens 30% der CD34⁺-Zellen adsorbieren, wenn die das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen durch die erste Säule laufen gelassen werden, und die adsorbierte Zellfraktion, die von der ersten Säule freigegeben wird, über die zweite Säule laufen gelassen wird, und Zellen, die Oberflächenmarker für dentritische Vorläuferzellen exprimiert, adsorbiert werden, so dass die Anzahl der dentritischen Vorläuferzellen wirksam reduziert wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung kann unter Bezugnahme auf die hier eingeschlossenen, nachfolgenden Definitionen, die detaillierte Beschreibung spezieller Ausführungsformen und die Beispiele leichter verstanden werden.
DEFINITIONEN
„Ein" oder „eine", wie hier verwendet, kann ein ein(e) oder mehr als ein(e) bedeuten, je nach dem Zusammenhang, in dem es verwendet wird. „Eine" Zelle zum Beispiel kann eine Zelle oder mehr als eine Zelle bedeuten.
„Dentritische Zellen" oder „DC" wie hier verwendet, bezieht sich auf eine reife, Antigen-präsentierende Zelle, die durch die Expression eines oder mehrerer der folgenden Marker auf ihrer Zelloberfläche identifiziert ist: CD1a, CD1b, und CD1c, CD4, CD11c, CD33, CD40, CD80, CD86, CD83 und HLA-DR, oder ein dentritischer Zellvorläufer wie nachfolgend definiert, oder beides.
„Dentritischer Zellvorläufer", „dentritische Vorläuferzellen", „dentritische Vorfahrzelle", „dentritischer Zellvorfahr" oder „CDP", die hier austauschbar verwendet werden, bedeuten eine hematopoietische Zelle, die durch die Expression eines oder mehrerer der folgenden Marker auf ihrer Zelloberfläche identifiziert ist: CD123, CD45RA, CD36, und CD4.
„Wirksam reduziert" bedeutet, dass die Anzahl der DC und/oder DCP in einem Transplantat von das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen so reduziert ist, dass die folgende Gleichung erfüllt ist: [Anzahl der CD34+-Zellen] – 2 × [Anzahl der DC/CDP] ≥ 1,5 × 106 Zellen/kg Körpergewicht des Empfängers.
„Das hematopoietische System rekonstituierende Zellen" bedeutet eine Population von Zellen, vorzugsweise humanen, die die Fähigkeit der Teilung und der Produktion von Nachkommen, die alle der gebildeten zellulären Elemente des Bluts einschließend, besitzen. Quellen von das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen können Knochenmark (sowohl fötale als auch adulte) und mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) einschließen.
„Donor" oder „Donorquelle" bedeutet das Tier, vorzugsweise der Mensch, das bzw. der die natürliche Quelle darstellt, von der die das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen ursprünglich entfernt wurden.
„Empfänger" bedeutet das Tier, typischerweise der Mensch, in das bzw. den die das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen transplantiert werden.
„Allogen" bedeutet, dass der Empfänger nicht die natürliche Quelle ist, von der die das hematopoietische System rekonstruierenden Zellen entfernt worden sind.
„Transplantat", „Allotransplantat" und „Graft" werden hier austauschbar verwendet und beziehen sich auf die das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen, die in einen Empfänger transplantiert werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die vorliegenden Erfindung stellt die Verwendung von das allogene hematopoietische System rekonstituierenden Zellen, in denen die Anzahl dentritischer Zellen wirksam reduziert ist, indem CD3– (negative) Zellen mit einem oder mehreren der Zelloberflächenmarker CD123, CD45RA, CD4 und CD36 entfernt wurden, ohne CD3⁺ (positive) Zellen zu entfernen, zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Überlebenswahrscheinlichkeit eines Transplantatempfängers von das allogene hematopoietische System rekonstituierenden Zellen zur Verfügung. Das heißt, das Verhältnis der Anzahl von CD34⁺-Zellen zur Anzahl der DC im Transplantat ist in Übereinstimmung mit der folgenden Gleichung: [Anzahl von CD34+-Zellen] – 2 × [Anzahl der CD] ≥ 1,5 × 106 Zellen/kg Körpergewicht des Empfängers.
In einer Ausführungsform umfasst die Methode der Erhöhung der Überlebenswahrscheinlichkeit eines Transplantatempfängers von das allogene hematopoietische System rekonstituierenden Zellen die Verabreichung von das allogene hematopoietische System rekonstituierenden Zellen, in denen die Anzahl dentrischer Zellvorläufer oder DCP wirksam reduziert worden ist, gegenüber dem Empfänger. Das heißt, das Verhältnis der Anzahl von CD34⁺-Zellen gegenüber der Anzahl von DCP im Transplantat ist in Übereinstimmung mit der folgenden Gleichung: [Anzahl der CD34+-Zellen] – 2 × [Anzahl der DCP] ≥ 1,5 × 106 Zellen/kg Körpergewicht des Empfängers.
Jeweilige Kombinationen von CD34⁺-Zellen und DCP, die ein wirksam reduziertes Transplantat Wiederspiegeln, sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Anzahl von Zellen in einem Transplantat der Erfindung

df: Differenzfunktion

Obgleich die Begrenzung auf eine Theorie nicht beabsichtigt ist, wird angenommen, dass die Entfernung von dentritischen Zellen aus einem Allotransplantat die Transplantats/Wirts-Erkrankung (GvHD) reduzieren und vielleicht verhindern kann. Somit beschreibt die vorliegende Erfindung in einer anderen Ausführungsform eine Methode des Verringerns oder Verhinderns der GvHD in einem Transplantatempfänger von das allogene hematopoietische System rekonstituierenden Zellen, umfassend das Verabreichen der das allogene hematopoietische System rekonstituierenden Zellen, in denen die Anzahl dentritischer Zellen wirksam reduziert worden ist, gegenüber dem Empfänger. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verringern oder Verhindern der GvHD in einem Transplantatempfänger von das allogene hematopoietische System rekonstituierenden Zellen die Verabreichung von das allogene hematopoietische System rekonstituierenden Zellen, in denen die Anzahl dentritischer Zellvorläufer (DCP) wirksam reduziert worden ist. In einer speziellen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung eine Methode des Verringerns oder Verhinderns der Transplantat/Wirts-Erkrankung in Transplantatempfängern von allogenem Knochenmark, umfassend das Verabreichen von das allogene hematopoietische System rekonstituierenden Zellen, in denen die Anzahl der verabreichten dentritischen Vorläuferzellen weniger als 0,25 × 10⁶/kg Körpergewicht des Empfängers beträgt.
In einer Ausführungsform sind die zu transplantierenden, das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen auf den CD34⁺-Phänotyp, d. h. der Expression des CD34⁺-Zelloberflächenmarkers, positiv selektiert. „Positiv selektiert" bedeutet, dass die das CD34⁺-Protein exprimierenden Zellen durch Methoden angereichert werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie etwa der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung oder der immunomagnetischen Chromatographie, und wie in den Beispielen hier sowie in den hier zitierten Dokumenten beschrieben. Die positive Selektion für CD34⁺-hematopoietische System-rekonstituierenden Zellen kann vor oder nach der Verminderung oder Entfernung dentritischer Zellen aus den das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen erfolgen.
Die Methoden dieser Erfindung können in Kombination mit anderen Methoden und Prozessen zum Transplantieren von das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen verwendet werden. Zum Beispiel können die hier offenbarten Methoden in Kombination mit der Methode von Waller et al. (US Patent Nr. 5,800,539) verwendet werden, die die Verarbreichung nicht-proliferierender T-Zellen, die die Einimplantierung verstärken, umfasst, um die allogene hematopoietische Zelltransplantation zu verbessern. Alternativ oder in weiterer Kombination mit der Methode von Waller et al., die die Verabreichung nicht-proliferierender T-Zellen umfasst, können die hier beschriebenen Methoden in Kombination mit Methoden verwendet werden, die durch Aversa et al. (New Engl. J. Med. 399: 1186 1193) beschrieben wurden, umfassend die Verabreichung zusätzlicher Dosen von T-Zellen-verminderter CD34⁺-Spender mononukleärer Zellen des peripheren Bluts, um die allogene hematopoietische Zelltransplantation zu verbessern.
Die Wirksamkeit dieser Erfindung kann demonstriert werden durch die vergrößerte Anzahl von Überlebenden, die zum Beispiel zwei oder drei Jahre nach der Transplantation aus der Gruppe der Empfänger der transplantierten, das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen gemäß den Methoden dieser Erfindung untersucht werden, im Vergleich zu den Gruppen der Empfänger von Transplantaten der das hematopoietische Sys tem rekonstituierenden Zellen nicht in Übereinstimmung mit diesen Methoden. Die Wirksamkeit dieser Erfindung zur Verminderung oder Verhinderung der Transplantat/Wirts-Erkrankungen kann unter klinischen Bedingungen bestimmt werden durch Messen einer Zahl klinischer Indizien, die dem Mediziner gut bekannt sein dürften, wie etwa der Dauer bis zur vollen Eintransplantierung oder der verringerten Inzidenz des Transplantatversagens.
Marker für dentritische Zellen und dentritische Vorläuferzellen
Dentritische Zellen (DC) sind Antigen-präsentierende Zellen, die bei der Initiierung von Immunantworten wichtig sind. Basierend auf in vitro-Kultivierung und -Charakterisierung wird von den DC angenommen, dass sie eine Familie verwandter Zelltypen, vielleicht von einer einzigen Linie, repräsentieren. Vorläufer von DC (DCP) können nun in vielen Geweben, etwa dem Knochenmark und dem Blut, identifiziert werden, basierend auf der Expression gewisser Zelloberflächenmarker. Ein Typ der Oberflächenmarker der Langerhans'schen Zelle wird in der Epidermis gefunden. Arbeiten mit Langerhans'schen Zellen stellten fest, dass diese unreifen Vorläufer in der Lage sind, Antigene aufzunehmen, dass sie aber keine bedeutende Fähigkeit zeigen, T-Zellen zu stimulieren, bis sie zu reifen DC differenzieren.
Eine Vielzahl von Markern sind identifiziert worden, die zur Definition gewisser Zelltypen der dentritischen Zellfamilie nützlich sind. Zum Beispiel schließen Marker, die auf der Oberfläche von reifen dentritischen Zellen exprimiert werden, CD1a, CD11c, DEC-205, CD4, CD33, CD40, CD80, CD83 und CD86 ein. Typischerweise werden die folgenden Marker nicht auf der Oberfläche reifer dentritischer Zellen gefunden: CD20, CD3, CD14, C16, CD2, CD45RA, CD56 und CD19. Zelloberflächenmarker, die auf dentritischen Zellvorläufer vorliegen, schließen CD4, CD45RA, CD34, CD10, CD123 und CD36 ein, während die folgenden Marker nicht auf der Oberfläche dentritischer Zellvorläufer gefunden werden: CD11c, CD1a, CD8, CD40, CD80, CD83 und CD86 (siehe zum Beispiel Caux et al. Intl. Immunology 1994 6(8): 1177–1185; Steptoe et al., J. Immunology 1997 159: 5483–5491; Grouard et al. (J. Exp. Med. 1997 185(6): 1101–1111; O'Doherty et al. Immunology 1994 82: 487–493; Galy et al., J. Immunotherapy 1998 21(2): 132–141; Strunk et al., J. Exp. Med. 1997 185(6): 1131–1136; Olweus et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997 94: 12551–12556; Prignano et al., Intl. J. Dermatol. 1998 37: 116–119). Durch die passende Verwendung dieser Marker können dentritische Zellen von dentritischen Zellvorläufern unterschieden werden.
Methoden zum Entfernen und/oder Reduzieren der Anzahl von DC und/oder DCP in das Hematopoietische System Rekonstituierenden Zellen
Die Entfernung dentritischer Zellen und/oder dentritischer Zellvorläufer aus das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen kann durch eine Reihe von Protokollen unternommen werden unter Verwendung der Zellsortierung und Sammeltechniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind (z. B. J. Olweus et al. 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12551–12556), einschließlich jedoch nicht beschränkt auf die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) und immunomagnetische Chromatographie.
Zum Beispiel werden zum Entfernen von DC aus das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen die das hematopoietische System rekonstituierende Zellen zuerst mit fluoreszenzmarkier ten, z. B. FITC-markierten Antikörpern, die an einen der Marker reifer dentritischer Zellen, d. h. CD1a, CD11c, DEC-205, CD4, CD33, CD40, CD80, CD83 und CD86, spezifisch binden, in Kontakt gebracht werden und dann der Floureszenz-aktivierten Durchflusszytometrie unterworfen werden. Zellen, die ein FITC-Signal oberhalb der zweiten Dekade auf einer logarithmischen Auftragung mit vier Dekaden zeigen, werden entfernt, wohingegen Zellen, die nicht aufleuchten, einschließlich CD34⁺-Zellen, zur Verwendung in einer Transplantation gesammelt werden.
Ein Gesamtziel der Protokolle, die zur Entfernung von DCP angewandt werden, besteht in der Entfernung der Population von Zellen, die einen CD3^–-, CD4⁺-, CD8^–-Phänotyp aufweisen, die ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine geringere Seitenstreuung in einer FACS (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungs)-Grafik aufweist als die typische Monozytenpopulation. Diese Population kann jedoch auf der Basis einer Reihe verschiedener phänotypischer Marker, wie unten genauer spezifiziert, identifiziert und entfernt werden.
Ein Protokoll zum wirksamen Entfernen der Anzahl von DCP besteht in der Entfernung von CD123⁺-Zellen, wobei das CD123-Oberflächenprotein die Alpha-Kette für den Interleukin 3 (IL-3)-Rezeptor (IL-3-R-α) darstellt. Als einem Beispiel können spezifisch an CD123 bindende Antikörper (verfügbar von Phar-Mingen/Becton-Dickinson, San Diego, CA), die an paramagnetische Kügelchen angeheftet sind, mit denen das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen in einem Kügelchen-zu-Zielzellen-Verhältnis von ungefähr 50 : 1 kontaktiert werden, gefolgt von einer Entfernung der Kügelchen von den das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen unter Verwendung eines festen Magneten oder eines magnetisierten Materials. In einer anderen Ausführungsform werden Antikörper, die spezi fisch CD123 binden, an einen immobilisierten Träger gebunden, und die das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen werden durch den Träger laufen gelassen, wobei die Zellen des Ausflusses DCP-vermindert sind. In einer anderen Ausführungsform können DCP durch Floureszenz-aktivierte Zellsortierung in der Folge der Anbindung des IL-3R-α/CD123-Proteins mit einem floureszenzmarkierten monoklonen Antikörper entfernt werden. In diesen Ausführungsformen vermögen es die resultierenden, das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen, die in der Transplantation zu verwenden sind, nicht, CD123 zu exprimieren, schließen jedoch CD34⁺-Zellen ein.
DCP können ebenfalls aus das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen auf der Basis des Vorliegens des CD4-Proteins auf der Zelloberfläche entfernt werden. In einer speziellen Ausführungsform wird ein fluoreszenzmarkierter Anti-CD4-Antikörper zu den das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen hinzugefügt. Die das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen werden der Fluoreszens-aktivierten Durchflusszytometrie unterworfen, und die Zellen, in denen das CD4-Signal auf einer logarithmischen Grafik mit vier Dekaden über der zweiten Dekade liegt, werden entfernt, wohingegen Zellen, die CD4 nicht zu exprimieren vermögen, einschließlich CD34⁺-Zellen, gesammelt werden.
Auf ähnliche Weise können andere Liganden, die zur Entfernung dentritischer Zellen und/oder dentritischer Zellvorläufer nützlich sind, an paramagnetische Kügelchen angeheftet werden, die mit das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen in Kontakt gebracht werden, wobei die Kügelchen dann über einen Magneten entfernt werden. Liganden können irgendwelche Moleküle sein, die Zelloberflächenproteine binden. Ein Ligand kann zum Beispiel ein Antikörper, ein Cytokin oder ein Hormon sein. Liganden-Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein und können durch im Stand der Technik gut bekannte Methoden hergestellt werden.
Alternativ kann der Ligand an einen Träger gebunden werden, durch den die das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen laufen gelassen werden und nicht-gebundene Zellen gesammelt werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Ligand mit einer fluoreszenten Markierung konjugiert werden, was die Entfernung markierter Zellen von den das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen über Sortierung durch die Floureszenz-aktivierte Cytometrie gestattet. Das Ergebnis all dieser Protokolle besteht in den DC/DCP-verringerten, das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen. Zusätzlich zu Anti-CD123 oder Anti-CD4 sind andere Liganden, die zur Entfernung von DCPs in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, CD45RA-Antikörper und CD36-Antikörper. Irgendwelche Liganden dieser Erfindung können in Kombination oder alleine verwendet werden, um die das hematopoietische System rekonstituierende Zellen zu erhalten, in denen die dentritische Zellpopulation wirksam reduziert worden ist.
Alternativ kann IL-3 selbst, als einem Liganden für das CD123-Oberflächenprotein, verwendet werden, um DCP aus das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen zu entfernen. IL-3 kann an eine Säule gebunden oder an paramagnetischen Kügelchen befestigt werden, wie oben für die Antikörper-Liganden beschrieben worden ist, um die DCP aus dem Transplantat zu entfernen. In einer anderen Ausführungsform wird IL-3 mit einem toxischen Strukturelement konjugiert und mit den das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen inkubiert. Das Konjugat aus IL3-toxisches Strukturelement bindet an IL3R-α auf der Oberfläche der DCP und wird in die Zelle aufgenommen, die durch das toxische Strukturelement getötet wird. Somit werden DCP aus den das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen durch selektive Zellabtötung eliminiert. Irgendein Strukturelement, das gegenüber humanen Zellen toxisch ist und das konvalent an IL-3 gebunden werden kann, kann verwendet werden; Beispiele toxischer Strukturelemente schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Diphterie-Toxin, Rizin und Pertussis-Toxin, wie auch irgendwelche anderen Toxine, die im Stand der Technik bekannt sind.
Irgendeine oder eine Kombination dieser Techniken zum Entfernen von DC/DCP kann so angewandt werden, dass die Anzahl von DC/DCP in einem Allotransplantat der das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen wirksam reduziert ist. Ein Allotransplantat kann zum Beispiel durch eine oder mehrere der oben beschriebenen Techniken behandelt werden, um CD4⁺ und CD123⁺-Zellen zu entfernen. Alternativ kann ein Allotransplantat behandelt werden, um irgendeine der folgenden Kombinationen zu entfernen: CD123⁺- und CD45RA⁺-Zellen; CD123⁺- und CD36⁺-Zellen; CD45RA⁺- und CD36⁺-Zellen; CD123⁺-, CD4⁺- und CD45RA⁺-Zellen; CD123⁺-, CD4⁺- und CD36⁺-Zellen; oder CD4⁺-, CD123⁺-, CD45RA⁺- und CD36⁺-Zellen. In einer speziellen Ausführungsform wird das Allotransplantat anfänglich nach Zellen, die den CD34-Marker auf ihrer Oberfläche exprimieren, positiv selektiert, und solche CD34-positiv selektierten Zellen werden anschließend behandelt, um Zellen zu entfernen, die Zelloberflächenproteine von irgendeiner der folgenden Kombinationen exprimieren: CD123⁺- und CD45RA⁺-Zellen; CD4⁺- und CD123⁺-Zellen; CD123⁺- und CD36⁺-Zellen; CD45RA⁺- und CD36⁺-Zellen; CD123⁺-, CD4⁺- und CD45RA⁺-Zellen; CD123⁺-, CD4⁺- und CD36⁺-Zellen; oder CD4⁺-, CD123⁺-, CD45RA⁺- und CD36⁺-Zellen.
Unter Verwendung irgendeiner der vorangehenden Techniken zur DCP-Entfernung stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die zur Transplantierung in einen Empfänger geeignet ist, der einen Bedarf hat an einem Transplantat von das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen, umfassend das hematopoietische System rekonstituierende Zellen, in denen die Anzahl dentritischer Zellvorläufer effektiv reduziert worden ist.
Ferner werden in dieser Erfindung Säulen und Säulensysteme zur Herstellung von das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen vor ihrer Transplantation derart, dass die Anzahl von DCP im Transplantat wirksam reduziert ist, beschrieben. Als einem Beispiel wird ein Zweifach-Säulensystem beschrieben, umfassend eine erste Säule, die einen Träger enthält, an den Antikörper gebunden sind, die spezifisch CD34 binden, sowie eine zweite Säule, die einen Träger enthält, an den Antikörper gebunden sind, die spezifisch Zelloberflächenmarker binden, die auf dentritischen Zellvorläufern exprimiert werden, wobei die erste Säule mindestens dreißig Prozent (30%) der CD34⁺-Zellen adsorbiert. Die aus der ersten Säule (z. B. durch Bewegung) freigegebenen, adsorbierten CD34⁺-Zellen werden dann durch die zweite Säule passieren gelassen, die ausreichend gebundene Antikörper enthält, um Zellen zu adsorbieren, die Oberflächenmarker für DCP exprimieren, so dass die Anzahl von DCP in der Rusfluß-(Durchlass-)Fraktion der zweiten Säule wirksam reduziert ist. Der Zellgehalt eines Transplantats nach der Behandlung durch dieses Zweifach-Säulensystem enthält mindestens 2 × 10⁶ CD34⁺-Zellen/kg und weniger als 0,25 × 10⁶ DCP/kg Körpergewicht des Empfängers.
Eine andere Säule zur Herstellung von das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen vor ihrer Transplantation derart, dass die Anzahl von DCP wirksam reduziert ist, umfasst einen Träger, an den Antikörper gebunden sind, die spezifisch an eine Kombination von Zelloberflächenmarkern binden, die aus der Gruppe von Kombinationen ausgewählt wird, bestehend aus: CD4 und CD123; CD123 und CD45RA; CD123 und CD36; CD45RA und CD36; CD123, CD4 und CD45RA; CD123, CD4 und CD36; oder CD4, CD123, CD45RA und CD36. Die Säule enthält ausreichend Antikörper gegenüber Zelloberflächenmarkern auf DCPs, so dass die Anzahl der DCPs in den das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen weniger als 1,25 × 10⁶ DCPs/kg Körpergewicht des Empfängers ist.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, jedoch nicht begrenzen. Während sie typisch sind für solche, die verwendet werden können, können andere Prozeduren, die den Fachleuten bekannt sind, alternativ angewandt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1: Transplantat-Patienten-Untersuchung
Eine statistische Untersuchung der Transplantat- oder Allotransplantat-Eigenschaften von 104 Patienten wurde durchgeführt, die Nicht-T-Zell-verminderte, allogene Knochenmarktransplantate von HLA-übereinstimmenden Geschwisterspendern empfingen. Die Konditionierung dieser Patienten schloss ein: Busulfan-basierte Behandlung (n = 89), Gesamtkörperbestrahlung mit Cyclophosphamid (n = 10) und Cyclophosphamid (n = 5). Die Gesamtzahl der Zellen in den Transplantaten waren im Mittel 3 × 10⁸ Zellen/kg Körpergewicht des Empfängers. Die Zahl der CD34⁺-Zellen wurde mit einem verbesserten Überleben korreliert (p = 0,0004 für das Gesamtüberleben und p = 0,001 für das krankheitsfreie Überleben). Zusätzlich wurde eine Population von Zellen in den Transplantaten, die als CD3^–, CD4^+(hi), CD8^–, Streuung an der unteren Seite – hier als DCPs bezeichnet – charakterisiert war, quantifiziert, und die Zahl solcher Zellen in den Transplantaten wurde negativ mit dem Gesamtüberleben (OS) und dem krankheitsfreien Überleben (DFS, p = 0,005) korreliert. Bei dieser Begutachtung waren Alter und Geschlecht des Spenders, CFU-GM (im Bereich von 0–41 × 10⁴ pro kg Körpergewicht), Gesamt-CFU (im Bereich von 4–282 × 10⁴ pro kg) und die relative Zahl der T-Zell-Untergruppen, NK-Zellen, B-Zellen und Monozyten keine signifikanten Variablen in irgendwelchen multivariablen Modellen.
Somit kann eine einfache mathematische Beziehung (eine Differenzfunktion df) beschrieben werden, basierend auf der Anzahl von CD34⁺-Zellen und der Zahl von DCPs im Transplantat, und zwar wie folgt: df = (Anzahl der CD34⁺-Zellen) – 2 × (Anzahl von DCP). Ein Schwellenwert von 1,5 × 10⁶ pro kg Körpergewicht des Empfängers für df trennte diese Patienten in zwei Gruppen: Jene Patienten, deren Transplantate einen df von größer als oder gleich 1,5 × 10⁶ pro kg Körpergewicht des Empfängers aufwießen, besaßen nach 3 Jahren einen DFS von 67%, verglichen mit 34% DFS der Patienten mit Transplantaten, in denen das df weniger als 1,5 × 10⁶ pro kg Körpergewicht des Empfängers betrug.
Beispiel 2: Transplantierung Selektierter Stammzellen
Spenderquelle: Knochenmark oder Stammzellen des peripheren Bluts (PBSC), gesammelt aus einem HLA-übereinstimmenden oder Nicht-HLA-übereinstimmenden Spender.
Spender-PBSC-Anreicherung: Um PBSC zu mobilisieren, wird G-CSF täglich verabreicht, bis eine Leukapherese abgeschlossen ist.
Spender empfangen subkutan 10 μg/kg/Tag G-CSF, basierend auf dem aktuellen Körpergewicht des Spenders. Während der Mobilisierung und Leukapherese sollten institutionelle Standards für die unterstützende Pflege des Spenders aufrechterhalten werden. PBSC werden durch Leukapherese gesammelt. Die Leukapherese wird durch eine institutionelle Standardmethode mit einem Trennungsgerät mit kontinuierlichem Fluss ausgeführt. Der Endpunkt jeder Leukaphereseanreicherung ist entweder die Verarbeitung zu einem Minimum von 10 Litern Gesamtblut, oder 4 Stunden der Leukapherese. Die Leukapherese beginnt am Tag ⁺5 der G-CSF-Therapie des Spenders und wird täglich (einem Maximum von 4 Tagen der Leukapherese) ausgeführt, bis das Ziel von 2 × 10⁶ CD34⁺-Zellen/kg des aktuellen Gewichts des Empfängers erhalten wird (nach der Prozessierung). Die CD34⁺-Zellzahl zur Bestimmung, ob die Apherese fortgesetzt wird, beruht auf täglich durchgeführten Durchflusscytometrietests.
Spenderzellpräparation: Knochenmark oder PBSC werden unter Verwendung eines immunomagnetischen Adsorptions-Zell-Trennungssystems wie dem Isolex 300-System (Baxter Immunotherapy, Irvine, CA) unter Befolgung veröffentlichter Protokolle (z. B. G. Kvalheim, Pharo A, H. Holte et al., The use of immunomagnetic beads and Isolex 300 gives high purity and yield of CD34⁺ cell from peripheral blood progenitor cell products. Bone Marrow Transplant 1996; 17 (Suppl. 1): 557; und J. A. Cancelas, C. Canais, S. Querol et al. CD34⁺ cell transplantation from mobilized peripheral blood by immunomagnetic adsorption in breast cancer patients. Bone Marrow Transplant 1996; 17 Suppl. 1): S32) oder dem Isolex 300i System der nächsten Generation, das einen vollautomatischen Betrieb darstellt, unter Befolgung veröffentlichter Protokolle (Report Series 8, Initial Performance of Automated Isolex 300i System in Multicenter International Clinical Trials. I. Purity) selektiert. Diese Vorrichtungen führen zu einem Endtransplantat, in dem die mittlere Reinheit von 77–93% reicht, mit einer Zellzahl nach Selektion von 1,1–6,4 × 10⁶ CD34⁺-Zellen pro kg. Zusätzliche Volumina des Transplantats werden in einer Dampfphase flüssigen Stickstoffs für weitere Infusionen, falls passend, cryopräserviert.
Das CD34⁺-selektierte Transplantat wird anschließend behandelt, um CDP zu entfernen (siehe Beispiel 3 unten). Das resultierende CD34⁺, DCP-verminderte Transplantat, das mindestens 2 × 10⁶ CD34⁺-Zellen/kg des Empfängerkörpers und weniger als 0,25 × 10⁶ DCP pro kg enthält, wird in den Empfänger infundiert. Zusätzliche Volumina des Transplantats werden in einer Dampfphase flüssigen Stickstoffs für weitere Infusionen, falls erforderlich, cryopräserviert.
Spenderzelltransplantation: Donorzellen, die wie oben präpariert wurden, werden dem Patienten, der einen Bedarf an einem solchen Transplantat hatte, durch einen zentralvenösen Katheder (typischerweise in der Brust) verabreicht. Patienten, die diese Spenderzellen empfangen, können eine Präkonditionierbehandlung ein oder zwei Tage vor der Infusion der Spenderzellen durchlaufen. Solche Präkonditionierbehandlungen wären entweder eine Gesamtkörperbestrahlung oder Busulfan in Kombination mit immunsuppressiver Therapien wie Fludarabin, Thiotepa, Cyclophosphamid und Antikörpern zum Verringern von T-Zellen.
Beispiel 3: Zellsortierung
Allgemeines Protokoll zur Zellsortierung: Zellen wurden unter Verwendung von FITC-konjugierten CD34-spezifischen monoklonaten Antikörpern sowie PE-konjugierten monoklonalen Antikörpern, die CD4, CD123, CD36 oder CE45RA erkennen (Becton- Dickinson, San Jose, CA) angefärbt. Als Kontrollen dienten direkt konjugierte Isotyp-übereinstimmende, irrelavante Antikörper. Zellen wurden bei 4°C 30 Minuten in einem Anfärbepuffer, das aus Hank's-gepufferter Salzlösung (HBSS, Mediatech, Herndon, VA), welches 2% v/v autologes humanes Plasma oder 1% humanes Serumalbumin enthielt, angefärbt. Überschüssige Antikörper wurden durch Verdünnung mit 10 Volumina Färbepuffer, gefolgt von einer Zentrifugation bei 500 × g, entfernt. Angefärbte Zellen wurden sofort unter Verwendung eines FACSCAN-Durchflusscytometers (BDIS, San Jose, CA) analysiert, oder unter Verwendung eines FACSVANTAGE-Zellsorters (BDIS, San Jose, CA) steril sortiert. Daten im Listenmodus wurden unter Verwendung von Vorwärts- und Seitwärts-Streugates erhalten, die für variable nukleäre Zellen geeignet sind. Die Datenanalyse wurde unter Verwendung der CellQuest^TM- oder LYSIS-II-Software (BDIS, San Jose, CA) ausgeführt. CD34⁺-DCP-Zellen wurden sortiert, indem das orthogonale Sortiergate so gesetzt wurde, dass Zellen, die CD34 exprimieren (einem FITC-positiven Fall), eingeschlossen werden, und dass Zellen, die einen DCP-Marker (einem PE-positiven Fall) exprimieren, ausgeschlossen werden, und indem die CD34⁺-DCP-Zellen in einem sterilen Röhrchen gesammelt werden.
Beispiel 4: Charakterisierung Isolierter DCP
Dentritische Zellen wurden aus Knochenmark durch magnetische Säulentrennung unter Verwendung eines Miltenyi Biotec MACS-Systems zum Absorbieren (Vermindern) abstammungs-positiver Zellen, die Lymphoid-, Granulocyten- oder Monocyten-Marker exprimierten (d. h. Abstammung-), isoliert und gereinigt. Eine anschließende Zellsortierung der Abstammung-Population unter Verwendung von CD123-PE und CD11c-APC (FACS Vantage System, mit einer Turbo-Sortieroption, unter Verwendung eines primären Enterprise 488-Argonlasers und einem sekundären Farbstofflaser) zeigten zwei unterschiedliche Populationen dentritischer Zellen, basierend auf dem Expressionsmuster dieser zwei Antigene auf der Zelloberfläche: DC1, die CD11c⁺ und CD123^– waren, und DCP2, die CD123⁺ und CD11c^– waren. Eine weitere Analyse dieser zwei Unterarten zeigte, dass die DCP2-Population die co-stimulierenden Moleküle CD80, CD86 und CD40 nicht exprimierten, wohingegen die DC1-Population die Expression dieser Marker zeigte. Wie hier diskutiert, sind diese drei Marker dafür bekannt, dass sie auf reifen dentritischen Zellen, jedoch nicht auf dentritischen Zellvorläufer-Zellen exprimiert werden. Eine Streugrafik, die die Korrelation zwischen zwei, hier offenbarten Analysemethoden für dentritische Zellvorläufer zeigt, d. h. einer CD4⁺/CD3^–-Streuung an der unteren Seite als einer Methode, und CD11c^–/CD123⁺ als der zweiten Methode, zeigte eine ausgezeichnete Korrelation (Koeffizient = 0,82), was bestätigte, dass diese Marker dieselbe Zellpopulation identifizierte.

Claims

Verwendung von das allogene hematopoietische System rekonstituierenden Zellen, bei denen die Anzahl dentritischer Zellen wirksam reduziert worden ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Überlebenswahrscheinlichkeit bei einem Patienten, der eine das allogene hematopoietische System rekonstituierende Zelltransplantation benötigt, wobei die Anzahl dentritischer Zellen wirksam reduziert worden ist durch Entfernen von CD3^– (negativen)-Zellen, die einen oder mehrere der Zelloberflächenmarker CD123, CD45RA, CD4 und CD36 aufweisen, ohne CD3⁺ (positive)-Zellen zu entfernen.
Verwendung von Anspruch 1, wobei die dendritischen Zellen Vorläufer dendritischer Zellen sind.
Verwendung von Anspruch 2, wobei die Zahl der verabreichten Vorläufer dendritischer Zellen weniger als 0,25 × 10⁶/kg Körpergewicht des Empfängers beträgt.
Verwendung von Anspruch 1, wobei die dendritischen Zellen unter Verwendung der Fluoreszenz-aktivierten Zell-Sortierung entfernt sind.
Verwendung von Anspruch 1, wobei die dendritischen Zellen entfernt sind durch a) Kontaktieren der das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen mit einem Liganden, der spezifisch einen Rezeptor auf der Oberfläche von dendritischen Zellen bindet, wobei der Ligand an einen paramagnetischen Träger gebunden ist, und b) Entfernen der dendritischen Zellen von den das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen mit einem Magneten.
Verwendung von Anspruch 1, wobei die dendritischen Zellen entfernt sind durch Passieren der das hematopoietische System rekonstituierenden Zellen durch eine Säule oder Säulen, die ein Trägermaterial enthält (enthalten), an welches ein oder mehrere Ligand(en) gebunden ist (sind), der (die) ein oder mehrere auf der Oberfläche einer dendritischen Zelle exprimiertes (exprimierte) Protein(e) bindet (binden).
Verwendung von Anspruch 5, wobei der Ligand aus der aus IL3, anti-CD123, anti-CD45RA, anti-CD4 und anti-CD36 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung von Anspruch 6, wobei der Ligand aus der aus IL3, anti-CD123, anti-CD45RA, anti-CD4 und anti-CD36 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung von Anspruch 2, wobei die Vorläufer der dendritischen Zellen entfernt sind durch Kontaktieren der das hematopoetische System rekonstituierenden Zellen mit einem Konjugat von IL-3 und einem toxischen Strukturelement, wobei die Vorläufer der dendritischen Zellen durch das toxische Strukturteil zerstört werden.
Verwendung von Anspruch 9, wobei das toxische Strukturelement aus der aus Diphterie-Toxin, Rizin und Pertussis-Toxin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.