CN1333688A

CN1333688A - 用于改善同种异型的造血细胞移植的方法和组合物

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Publication number: CN1333688A
Application number: CN99815503A
Authority: CN
Inventors: E·K·瓦勒
Original assignee: Emory University
Current assignee: Emory University
Priority date: 1998-11-11
Filing date: 1999-11-10
Publication date: 2002-01-30
Anticipated expiration: 2019-11-10
Also published as: CA2351194A1; CN1213143C; AU779039B2; EP1123384B1; DE69916302D1; WO2000027998A3; WO2000027998A2; KR20010090008A; JP2002529476A; ATE263833T1; EP1123384A2; DE69916302T2; AU1817800A

Abstract

提供了用以在同源异型造血系统重构细胞移植受体中降低或防止移植物VS.宿主疾病的方法,该方法包括以同源异型造血系统重构细胞对受体进行给药,在该系统中树状细胞的数量被有效地降低,如此便降低或防止了移植物VS.宿主疾病。提供了用以增加同源异型造血系统重构细胞移植受体存活的机率的方法,该方法包括以同源异型造血系统重构细胞对受体进行给药,在该系统中树状细胞的数量被有效地降低,如此便增加了该受体存活的机率。公开了一种柱系统,该系统用于在移植前制备造血系统重构细胞,用以选择CD34细胞除去树状细胞。

Description

用于改善同种异型的造血细胞移植的方法和组合物

本发明的领域

本发明的领域为将来自供体的同种异型的造血体系重构细胞移植入遗传上不同的受体的改进方法，本领域还涉及到特定的造血细胞类型的去除，这些被除去的细胞类型的存在相关于移植受体存活的降低。

发明背景

对于多种恶性和遗传的血液病和造血细胞疾病，同种异型骨髓移植是优选的治疗方法。这一疗法的广泛应用受限制于合适的骨髓供体的获得，该供体同患者在遗传上相关并在血细胞表面具有相同的移植抗原。只有25％的患者具有一个同胞为抗原匹配的潜在供体。缺乏适当的同胞供体的患者可以通过使用来自抗原匹配但遗传上无关的供体(由national registry鉴别)的骨髓，或通过使用来自遗传上相关，但在6个人类白细胞抗原上有1到3个同患者不同的同胞或亲本的骨髓来进行骨髓移植。但是，使用抗原不匹配而遗传上相关的的亲本或同胞或者抗原上匹配但遗传上无关的供体时，致命的移植物vs.宿主症(GvHD)和/或抑制物排异的可能性从匹配的同胞供体的25％，在匹配的无关供体和来自患者家庭的不匹配的相关供体的情况下提高至50％。进一步，当无关供体在6个主要移植抗原上有1个不匹配时，移植物排异和/或致命的GvHD的可能性提高至60％。

GvHD是一种发病率较高的疾病。产生急性GvHD的患者可能在其皮肤表面发生水泡，发生大规模的胃肠道出血或急性肝衰竭和黄疸。产生慢性GvHD的患者可能发生导致关节挛缩的硬皮病，皮肤溃疡，毛发脱落和全身性消瘦综合征(generalized wasting syndrome)。患有急性或慢性GvHD的患者的免疫受抑制并有罹患致命的条件性感染的危险，这类似于AIDS患者所发生的感染。

目前，现有的移植技术涉及到T细胞的耗竭(depletion)，其根据是研究表明这些细胞的去除导致移植物vs.宿主的反应的几率降低。供体骨髓的T细胞通过使用几种工艺之一来去除，例如CD3⁺细胞的除去，E红细胞形成玫瑰花结和大豆凝集素的使用。或者使用供体骨髓的富集在同源异型移植物上诱导临床试验，基于表面标记CD34的存在而对造血干细胞正选择来进行富集，通过该方法去除了大量的T细胞。在这一审验中，在CD34⁺选择后进行CD2⁺细胞的去除，该去除耗竭了T细胞和自然杀伤细胞(NK)的一个额外的群体(Clarke，E.，Potter，M.N.，Steward，C.G.，Cornish，J.M.，Marks，D.，Oakhill，A.，andPamphilon，D.H.1997 Blood 90(10)Suppl.1；page 37A；Abst.No.1662；“Double T-cell depletion using sequential +/-Immunoaffinity or CD34⁺cell selection followed by campath-M：Effect on CD34⁺ and progenitor cell recovery”；Bunjes，D.，M.Wiesneth，S.Von Harsdorf，J.Duyster，T.Shreiner，C.Duncker，B.Macari，B.Kubanek 1997 Blood 90(10)Suppl.1；page 1034；Abst.No.454；“T cell depleted allogeneic PBSC transplant In30 patients with hematological malignancies：Benefis andrisks”)。使用目前的CD34⁺选择设备T细胞平均耗竭2～3个数量级；例如，一个典型的CD34⁺选择移植物的移植相对于每kg受体体重可含有2-4×10⁶CD34⁺细胞和0.1-0.5×10⁶CD3⁺细胞(即T细胞)。然而，即使经该处理，这样的患者还需要GvHD预防。

此外，尽管来自匹配的无关或不匹配的相关同胞供体所移植的骨髓中的T细胞的去除减少了GvHD，它还是与患者对同源异型骨髓的排斥的升高的发生率有联系。因此，存在于同源异型骨髓移植物中的白细胞，尤其是T细胞，对于确保在抗原性上和遗传上不匹配的受体中的移植十分重要。存在于同源异型骨髓移植物中的T细胞还在消除受体中的残余癌细胞中起重要作用，该作用称为“移植物vs.白血病效应”。

为最小化以T细胞进行给药的不良影响，Waller等人以非增殖的T细胞进行给药，该非增殖的T细胞在缺少GvHD的情况下改善移植(美国专利号No.5,800,539)。在另一个临床研究中，Aversa等人(NewEngl.J.Med.339：1186-1193)对受体以额外剂量的供体外周血单核细胞进行给药，该受体接受了一个含有骨髓或外周血单核细胞的完全单体的不匹配供体移植物，该供体外周血单核细胞已经进行了T细胞耗竭并且随后进行了CD34⁺选择。

这样，自从30年以前的第一例人类骨髓移植成功以来，尽管移植工艺稳步提高，接受同源移植物的患者仍死于移植物排斥和移植物vs.宿主疾病以及其它并发症。开发一种同源异型骨髓移植的最佳程序仍是迫切需要的。

本发明基于在供体移植物中一个相关细胞类型家族的发现，该家族的存在与移植物的存活的降低有关。除去这些细胞类型的一种或几种提高了同源异型移植物在受体中的存活，这些类型细胞被称为树状细胞或树状细胞前体(DCP)。

发明概述

本发明提供了一种方法，该方法用以在同源异型造血系统重构细胞(reconstituting cell)移植受体中降低或防止移植物VS.宿主疾病，该方法包括以同源异型造血系统重构细胞对受体进行给药，在该系统中树状细胞的数量被有效地降低，如此便降低或防止了移植物VS.宿主疾病。本发明还提供了一种方法，该方法用以增加同源异型造血系统重构细胞移植受体存活的机率，该方法包括以同源异型造血系统重构细胞对受体进行给药，在该系统中树状细胞的数量被有效地降低，如此便增加了该受体存活的机率。本发明还提供了一种方法，该方法用以增加同源异型骨髓受体存活的机率，该方法包括以同源异型造血系统重构细胞对受体进行给药，在该系统中被用于给药的树状祖细胞的数量低于0.25×10⁶/千克受体体重。本发明还提供了一个柱系统，该系统用于在移植前制备造血系统的重构细胞，该系统包括的第一根柱子含有一种结合有可以特异结合CD34的抗体的支持物，第二根柱子含有一种结合有可以特异结合表达于树状细胞前体表面的标记的抗体的支持物，其中第一根柱子在造血系统的重构细胞通过时吸附了至少30％的CD34⁺细胞，以从第一根柱子释放出的被吸附的细胞组分通过第二根柱子并且吸附表达树状细胞前体表面的标记的细胞，这样便有效地减少了树状祖细胞的数量。发明详述

通过参考本文在以下所包括的定义，实施方案的详细描述和实施例可以更容易理解本发明。定义

本文所用的“一个”或“一种”可以指一个或多于一个，这取决于其所使用时的上下文。例如，“一种”细胞可能指一个或多个细胞。

本文所用的“树状细胞”或“DC”指一种成熟的抗原呈递细胞或如下定义的树状细胞母细胞，或以上两者，该成熟的抗原呈递细胞通过其表面的以下标记中的一种或多种来确认：CD1a，CD1b和CD1c，CD4，Cd11c，CD33，CD40，CD80，CD86，CD83，HLA-DR。

本文中可互换使用的“树状细胞祖细胞”、“树状祖细胞”、“树状细胞前体”或树状前体细胞“DCP”指的是一种造血细胞，该细胞通过其表面的以下标记中的一种或多种的表达来确认：CD123，CD45RA，CD36和CD4。

“有效地降低”指的是，在一个造血系统的同源移植物的重构细胞中，DC和/或DCP的数量被降低至满足以下方程：

[CD34⁺细胞数]－2×[DC/DCP数]≥1.5×10⁶细胞/千克受体体重。

“造血系统重构细胞”指的是一个细胞群体，在优选情况下是人类细胞群体，该群体有分裂并产生后代的能力，该后代包括血液中所有成形的的细胞成分。造血系统重构细胞的来源可以包括骨髓(胎儿和成人)和外周血单核细胞(PBMC)。

“供体”和“供体来源”指的是动物，在优选情况下是人类，该动物为天然来源，造血系统的重构细胞可从中原始地移除。

“受体”指的是动物，在典型情况下是人类，该动物被移植入了造血系统的重构细胞。

“同源异型”指的是受体并非造血系统的重构细胞可从中原始地移除的天然来源。

“移植体”、“同源移植物”和“移植物”在本文中可互换使用，它们指的是被移植入一个受体的造血系统的重构细胞。详细描述

本发明提供了一种方法，该方法用以增加同源异型造血系统重构细胞移植受体存活的机率，该方法包括以同源异型造血系统重构细胞对受体进行给药，在该系统中树状细胞的数量被有效地降低。即，移植物中CD34⁺细胞的数量同DC细胞的数量的比值符合以下方程：

[CD34⁺细胞数]－2×[DC数]≥1.5×10⁶细胞/千克受体体重。

在一个实施方案中，用以增加同源异型造血系统重构细胞移植受体存活的机率的方法包括以同源异型造血系统重构细胞对受体进行给药，在该系统中树状细胞前体或DCP的数量被有效地降低。即，移植物中CD34⁺细胞的数量同DCP细胞的数量的比值符合以下方程：

[CD34⁺细胞数]－2×[DCP数]≥1.5×10⁶细胞/千克受体体重。

表1所示为反映出有效降低的移植物的CD34⁺细胞和DCP细胞的代表性组合。

表1.本发明的一种移植物中的细胞数

CD34⁺细胞数 DCP细胞数^* df值

*4.73 0.02 4.69

4.4 1.4 1.6

2.7 0.5 1.6

1.9 0.15 1.6

2.38 0.3 1.77

3.34 0.04 3.27* ×10⁶/每千克受体体重(df＝函数差)

尽管不想通过理论加以限制，据认为从同源移植物中除去树状细胞可以降低移植物vs.宿主疾病(GvHD)。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，该方法用以在同源异型造血系统重构细胞移植受体中降低并或许防止移植物VS.宿主疾病，该方法包括以同源异型造血系统重构细胞对受体进行给药，在该系统中树状细胞的数量被有效地降低。在另一个实施方案中，用以在同源异型造血系统重构细胞移植受体中降低并或许防止移植物VS.宿主疾病的方法包括以同源异型造血系统重构细胞对受体进行给药，在该系统中树状细胞前体(DCP)的数量被有效地降低。在一个特定的实施方案中，发明还提供了一种方法，该方法用以在同源骨髓移植物移植受体中降低或防止移植物VS.宿主疾病，该方法包括以同源异型造血系统重构细胞对受体进行给药，在该系统中被用于给药的树状细胞前体的数量低于0.25×10⁶/千克受体体重。

在一个实施方案中，将被移植的同源异型造血系统重构细胞经过针对CD34⁺表型的正选择，即针对CD34细胞表面标记表达的选择。“正选择”指的是表达CD34蛋白的细胞通过本领域已知的方法被收集，方法例如荧光激活的细胞分选或免疫磁性层析，描述见本文实施例和引用的参考。对重构细胞的CD34⁺造血系统的正选择可以在造血系统的重构细胞中的树状细胞的耗竭或去除之前或之后进行。

本发明的方法可以同其它用于移植造血系统的重构细胞的方法或过程进行组合使用。例如，本文所披露的方法可以同Waller等人的方法(美国专利No.5,800,539)综合使用，Waller等人的方法包括以非增殖的T细胞进行给药，非增殖的T细胞可增强移植以改善同源异型细胞移植。在替代情况下，或者同Waller等人包括以非增殖的T细胞进行给药的方法进一步综合使用的情况下，本文所述的方法可以同Aversa等人的方法(New Engl.J.Med.339：1186-1193)综合使用，Aversa等人的方法包括以额外剂量的经过T细胞耗竭的CD34⁺供体外周血液单核细胞进行给药以提高同源异型细胞移植。

本发明的效能可以通过存活者数量的增加来显示，这一提高是在移植后2或3年在本发明方法的移植造血系统的重构细胞的受体群体中，同非本发明方法的移植造血系统的重构细胞的受体群体相比较来测量。本发明在降低或防止移植物vs.宿主疾病上的的效能可以通过临床医生所熟知的一批临床指数在临床上测定，例如完全移植时间(time to full engraftment)或减低的移植失败率。树状细胞或树状前体细胞的标记

树状细胞是抗原呈递细胞，它们在免疫应答的起始中十分重要。根据体外培养和特征研究，DC被认为代表了相关细胞类型的一个家族，它们可能来自于同一个谱系。基于特定的细胞表面标记的表达，目前在许多组织中鉴别出DC的母细胞(DCP)，如骨髓和血液。在表皮中发现了前体细胞的一个类型，郎格罕氏细胞。在郎格罕氏细胞上的工作显示，这些未成熟的前体细胞能够摄取抗原，但在分化成成熟的DC之前不表现出刺激T细胞的显著能力。

多种可用于定义树状细胞家族的特定细胞类型的标记已被鉴别出来。例如，表达于成熟树状细胞表面的标记包括CD1a，CD11c，DEC-205，CD4，CD33，CD40，CD80，CD83和CD86。在典型情况下，在成熟树状细胞表面找不到以下标记：CD20，CD3，CD14，CD16，CD2，CD45RA，CD56和CD19。存在于树状细胞前体的细胞表面标记包括CD4，CD45RA，CD34，CD10，CD123和CD36，而树状细胞前体表面找不到以下标记：CD11c，CD1a，CD8，CD40，CD80，CD83和CD86(例见Caux et al.Intl.Immunology1994 6(8)：1177-1185；Steptoe et al.J.Immunology 1997159：5483-5491；Grouard et al.(J.Exp.Med.1997185(6)：1101-1111；0’Dokherty et al.Immunology 1994 82：487-493；Galy et al.J.Immunotherapy 1998 21(2)：132-141；Strunk et al.J.Exp.Med.1997 185(6)：1131-1136；Olweus et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997 94：12551-12556；Prignano et al.，Intl.J.Dermatol.1998 37：116-119)。通过这些标记的适当使用可以将树状细胞同树状细胞母细胞区分开来。用于在造血系统重构细胞中除去和/或降低DC和/或DCP的方法

树状细胞和/或树状细胞前体从造血系统的重构细胞中的去除可以通过一批方案，使用细胞分拣和收集技术来完成，这些技术在本领域中为人熟知(例如，0lweus et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 199794：12551-12556)，它们包括荧光激活的细胞分选(FACS)和免疫磁性层析。

例如，为从造血系统的重构细胞中除去DC，该造血系统重构细胞首先同荧光标记的抗体接触，如，FITC标记的抗体，该抗体特异地同成熟树状细胞标记相结合，例如CD1a，CD11c，DEC-205，CD4，CD33，CD40，CD80，CD83和CD86，随后该造血系统的重构细胞被用于荧光激活的流式细胞仪。在尺度为四十(four decade)的对数图上表现出FITC信号高于二十(second decade)的细胞被除去，而包括CD34⁺细胞在内的不发光的细胞被收集用于移植。

用于去除DCP的方案的总体目标是除去具有CD3^-，CD4⁺，CD8^-表型的细胞群体，该群体的进一步特征在于其在FASC(荧光激活的细胞分选)图中具有比典型的单核细胞更低的侧向散射。然而，如下文详述，这一群体可以根据一批不同的表型标记来鉴别和去除。

一种用于有效地降低DCP的数量的方案是除去CD123⁺细胞，该CD123表面蛋白为白细胞介素3(IL-3)受体的α链(IL-3R-α)。作为一个例子，可以将附着于顺磁珠的与CD123特异结合的抗体(可获自PharMingen/Becton-Dickinson，San Diego，CA)同造血系统的重构细胞相接触，接触时磁珠和靶细胞比例为50∶1，随后使用一永磁体或磁化物质将磁珠从造血系统的重构细胞中除去。在另一个实施方案中，特异结合CD123的抗体被结合于一固定支持物，随后将造血系统的重构细胞通过该支持物，被洗脱的细胞被耗竭了DCP。在另一个实施方案中，DCP可以通过先以荧光标记的单克隆抗体结合IL-3R-α/CD1231蛋白，随后经荧光激活的细胞分选除去。在这些实施方案中，所产生的用于移植的造血系统的重构细胞不会表达CD123，但该系统包括有CD34⁺细胞。

DCP还可以基于CD4蛋白的在细胞表面的存在而从造血系统的重构细胞中除去。在一个特定的实施方案中，一个荧光标记的抗CD4的抗体被加入造血系统的重构细胞。该造血系统的重构细胞被用于荧光激活的流式细胞仪，在尺度为四十的对数图上表现出FITC信号高于二十的细胞被除去，而包括CD34⁺细胞在内的不表达的细胞被收集。

同样地，其他用于除去树状细胞和/或树状细胞母细胞的配基可被附着于顺磁珠，该顺磁珠同造血系统的重构细胞相接触，随后通过一顺磁体除去磁珠。这些配基可以是任何与细胞表面蛋白结合的分子。例如，配基可以是抗体，细胞因子或激素。配基抗体可以是多克隆或单克隆并且可以通过该领域所熟知的方法产生。

在替代情况下，配基可以同一支持物相结合，造血系统的重构细胞被通过该支持物并收集未结合的细胞。在另一实施方案中，给配基可以偶联一荧光标记，以使被标记的细胞通过经荧光激活的流式细胞仪的分选而被除去。这些方案的结果为DC/DCP耗竭的造血系统的重构细胞。除抗CD123或抗CD4之外，其它可用于在本发明中除去DCP的配基还有CD45RA抗体和CD36抗体。被发明的任何配剂均可单独使用或综合使用以获得树状细胞群体经有效降低的造血系统的重构细胞。

在替代情况下，IL-3作为CD123表面蛋白的配基其本身可用于从造血系统的重构细胞中除去DCP。如上文对抗体配基的描述，IL-3可结合于一根柱子上或附着于顺磁珠上以从移植物中除去DCP。在另一个实施方案中，IL-3被偶联于一毒性部分并同造血系统的重构细胞孵育该IL-3-毒性部分结合于DCP表面并被摄入细胞，该细胞为该毒性部分杀死。这样，DCP通过选择性细胞杀伤而从造血系统的重构细胞中消除。任何对于人类细胞有毒性并可以同IL-3共价偶联的微粒均可被使用；毒性部分的例子包括diptheria toxin，篦麻毒素和百日咳毒素以及该领域已知的其他毒素，但不限于此。

这些用于除去DC/DCP的工艺的任何一种或任何一种组合均可被使用以有效地降低在一个造血系统重构细胞的同源移植物中的DC/DCP数量。例如，一个同源移植物可以通过上述的一种或几种工艺处理来去除CD4⁺和CD123⁺细胞。或者，一同源移植物可以经处理除去以下任何一种组合：CD123⁺和CD45RA⁺细胞；CD123⁺和CD36⁺细胞；CD45RA⁺和CD36⁺细胞；CD123⁺，CD4⁺和CD45RA⁺细胞；CD123⁺，CD4⁺和CD36⁺细胞；或CD4⁺，CD123⁺，CD45RA⁺和CD36⁺细胞。在一个特定的实施方案中，该同源移植物一开始进行正选择，该选择针对在表面表达CD34标记的细胞，这些CD34正选择的细胞随后经处理以除去表达某些细胞表面蛋白的细胞，这些蛋白为以下组合任何一种：CD123⁺和CD45RA⁺细胞；CD4⁺和CD123⁺细胞；CD123⁺和CD36⁺细胞；CD45RA⁺和CD36⁺细胞；CD123⁺，CD4⁺和CD45RA⁺细胞；CD123⁺，CD4⁺和CD36⁺细胞；或CD4⁺，CD123⁺，CD45RA⁺和CD36⁺细胞。

通过使用任何先前用于除去DCP的工艺，本发明提供了一种组合物，该组合物适用于向有需要的受体移植造血系统的重构细胞的一种移植物，该组合物包括造血系统的重构细胞，在该系统中树状细胞母细胞的数量被有效地降低。

本发明还提供了柱子和柱系统以用于在移植前制备造血系统的重构细胞，这样可使移植物中DCP的数量被有效地降低。作为例子提供了一种双柱系统，该系统包括的第一根柱子含有一种支持物，该支持物结合有可特异结合CD34的抗体，第二根柱子含有一种支持物，该支持物结合有抗体，该抗体与表达于树状细胞母细胞的表面标记特异地结合，其中第一根柱子吸附了至少百分之三十(30％)的CD34⁺细胞。被吸附的CD34⁺细胞从第一根柱子释放(例如，通过搅动)后随即通过第二根柱子，该柱子含有足量的被结合抗体以吸附表达DCP表面标记的细胞，这样便有效地降低了第二根柱子的洗脱流分(pass-through)中的DCP数量。在一个特定的实施方案中，经该双柱系统处理后的移植物的细胞组分含有至少2×10⁶CD34细胞/千克和少于0.25×10⁶DCP/千克受体体重。

在其它的实施方案中，一个用于在移植前制备造血系统的重构细胞以使移植物中DCP的数量被有效地降低的柱子包括一种支持物，该支持物结合有一种抗体，该抗体可与选自以下组合群体的一种细胞表面标记的组合结合：CD4和CD123；CD123和CD45RA；CD123和CD36；CD45RA和CD36；CD123，CD4和CD45RA；CD123，CD4和CD36；或CD4，CD123，CD45RA和CD36。在一个特定的实施方案中，该柱系统含有足量的被结合抗体以吸附表达DCP表面标记的细胞，这样便使造血系统的重构细胞中的DCP数量少于0.25×10⁶DCP/千克受体体重。

本申请自始至终引用了多种出版物。这些出版物的披露内容在此全文引入作为参考。

以下的实施例意图在于阐释而非限定本发明。尽管它们在是典型的可能被用到的方法，其它为本领域的技术人员所知的步骤可能在替代的情况下被使用。

实施例

实施例1.移植患者检查

对移植体或同源移植物的调查的特点在于其在104位患者上进行，这些患者接受了未经T细胞耗竭的同源异型骨髓移植体，该移植体来自HLA匹配的同胞共体。对这些患者的移植前状态调整包括：二甲磺酸丁酯处理(n＝89)，全身照射并给药环磷酰胺(n＝10)以及环磷酰胺(n＝5)。移植物中的细胞总数平均为3×10⁸细胞/千克受体体重。CD34⁺细胞的数目正向关于存活的提高(p＝0.0004，全体存活；p＝0.001，无疾病存活)。另外对移植物的一个细胞群体进行了定量，该群体的特征在于CD3^-，CD4^+(Hi)，CD8^-，低侧向散射，在此被认为DCP，这些细胞在移植物种的数量负相关于整体存活率(OS)和无疾病存活率(DFS，p＝0.005)。在该调查中，供体年龄和性别，CFU-GM(0-41×10⁴每千克体重)，总CFU(4-282×10⁴每千克体重)以及T细胞亚集(subset)、NK细胞、B细胞和单核细胞的数量在任何多变量模型中均非显著变量。

这样，可以基于移植物中的CD34⁺细胞和DCP数量描述出一个简单的数学关系(一个微分方程，df)如下：df＝(CD34⁺细胞数)-2×(DCP数)。对于df的一个阈值，1.5×10⁶每千克体重，将这些患者分为两组：移植物df大于或等于1.5×10⁶每千克体重的患者在3年内DFS为67％，与之相比移植物df小于1.5×10⁶每千克体重的患者在3年内DFS为34％实施例2.选中的干细胞的移植

供体来源：收集自HLA匹配或不匹配的供体的骨髓或外周血液干细胞。

供体PBSC收集：为固定化PBSC，每天以G-CSF进行给药直至完成对白细胞的去除。供体根据其实际体重接受10μg/kg/天皮下注射G-CSF。在动员和白细胞去除期间必须遵从供体支持护理的制度标准。PBSC通过白细胞消除法收集。白细胞去除应根据制度标准方法在一台连续的流式分离仪器上进行。每次白细胞去除收集的终点应为对多于12升全血量的加工或4小时的白细胞去除。白细胞去除应在供体G-CSF治疗的⁺5天开始并且每天进行(白细胞去除最大为四天)直至达到2×10⁶CD34⁺细胞/千克受体体重的目标(加工后)。每天根据流式细胞仪分析CD34⁺细胞数量来决定去除术是否应继续。

供体细胞制备：按照已公开的方案(例如，Kvalheim G，Pharo A，Holte H et al.The Use of immuneomagnetic beads and Isolex 300gives high purity and yield of CD34⁺ cells from peripheral bloodprogenitor cell products.Bone Marrow Transplant 1996；17(suppl1)：S57；and Cancelas JA，Canais C，Querol S et al.CD34⁺ celltransplantion from mobilized peripheral blood byimmuneomagentic absorption in breast cancer patients.BoneMarrow Transplant 1996；17 suppl 1)：S32)使用免疫磁性吸附细胞系统来选择骨髓或PBSC，例如Isolex300系统(BaxterImmunotherapy，Irvine，CA)或下一代Isolex300i系统，该系统可按照出版的方案(Report Series 8，Initial Performance ofAutomates Isolex 300i System in Mulicenter Internationalclinical Trials.I.Purity)完全自动操作。这些设备产生的最终移植物平均纯度为77-93％，选择后细胞数为1.1-6.4×10⁶CD34⁺细胞每千克。如果适当，额外量的移植物被冷冻保存与液氮的气相中以备进一步灌输。

CD34⁺选择的移植物随后经处理以除去DCP(见下文实施例3)。所产生的CD34⁺，DCP耗竭的移植物含有至少2×10⁶CD34⁺细胞/千克受体体重并且少于0.25×10⁶DCP每千克，该移植物被灌输入受体。如果适当，额外量的移植物被冷冻保存与液氮的气相中以备进一步灌输。

供体细胞移植：以如上制备的供体细胞对需要这样的移植物的患者通过中央静脉导管(典型的在胸部)进行给药。在接受供体细胞灌输前的一至两天，接受这些供体细胞的患者可能需要状态预调整处理。该状态预调整处理为全身照射或二甲磺酸丁酯处理同免疫抑制剂治疗联合使用，免疫抑制治疗如fludarabine，三胺硫磷，环磷酰胺和抗体处理以耗竭T细胞。

实施例3.细胞分选

细胞分选的一般方案。使用FITC偶联的CD34特异性单克隆抗体和识别CD4，CD123，CD36或CD45RA的PE偶联的单克隆抗体(Becton-Dickinson，San Jose，CA)对细胞进行染色。用直接偶联的同种型匹配的无关抗体作为参照。细胞在4℃下在染色缓冲液中染色30分钟，缓冲液的成份为Hank’s盐缓冲溶液(HBSS，Mediatech，Herndon，VA)，溶液中含2％v/v自体同源的人类血浆或1％人类血清白蛋白。过量的抗体通过以10倍体积的染色缓冲液稀释并随后500×g离心而除去。被染色的细胞使用FACSCAN流式细胞仪(BDIS，San Jose，CA)而间接分析或使用FACSVANTAGE细胞分选仪(BDIS，San Jose，CA)而进行无菌分选。使用适于可存活的有核细胞的中央和边缘散射门以获得表单模式数据(list-mode data)。使用CellQuest^TM或LYSIS-II软件(BDIS，San Jose，CA)进行数据分析。通过设置光学分选门以涵盖表达CD34的细胞(一次FITC正事件)并排除表达DCP标记的细胞(一次PE正事件)来分选CD34⁺DCP^-细胞，将CD34⁺DCP^-细胞收集入灭菌的管中。实施例4.分离的DCP的特征

树状细胞通过磁性柱分离而分离和纯化，该过程使用MiltenyiBiotec MACS系统以吸附(耗竭)表达淋巴细胞、粒细胞或单核细胞标记的血缘正性细胞(即Lineage^-)。随后使用CD123-PE和CD11c-APC(FACS Vantage系统，自动分选选项，使用一个初级Enterprise488氩激光和刺激染色激光)进行的Lineage^-群体细胞分选显示出树状细胞的两个不同群体，区别在于这两种细胞表面抗原的表达模式：DC1为CD11c⁺和CD123^-，DCP2为CD123⁺和CD11c^-。对这两种亚型的进一步分析表明DCP2群体不能表达共刺激分子CD80，CD86和CD40，而DC1群体表现得可以表达这些标记。如本文所讨论，这三种标记移植表达于成熟的树状细胞，但不表达于树状细胞前体细胞。显示本文披露的两种用于树状细胞前体的方法的相关性的散射图显示的良好的相关性(系数＝0.82)证实这些标记鉴别了相同的细胞群体，这两种方法中CD4⁺/CD3^-低侧向散射为其中一种，CD11c^-/CD123⁺为第二种。

Claims

1.一种方法，该方法用以在同源异型造血系统重构细胞移植受体中降低或防止移植物VS.宿主疾病，该方法包括以同源异型造血系统重构细胞对受体进行给药，在该系统中树状细胞的数量被有效地降低，如此便降低或防止了移植物VS.宿主疾病。

2.权利要求1的方法，其中树状细胞为树状细胞祖细胞。

3.一种方法，该方法用以增加同源异型造血系统重构细胞移植受体存活的机率，该方法包括以同源异型造血系统重构细胞对受体进行给药，在该系统中树状细胞的数量被有效地降低，如此便增加了该受体存活的机率。

4.权利要求3的方法，其中树状细胞为树状细胞祖细胞。

5.一种方法，该方法用以在同源异型骨髓移植受体中降低或防止移植物VS.宿主疾病，该方法包括以同源异型造血系统重构细胞对受体进行给药，在该系统中被用于给药的树状细胞前体的数量低于0.25×10⁶/千克受体体重。

6.一种方法，该方法用以增加同源异型骨髓受体存活的机率，该方法包括以同源异型造血系统重构细胞对受体进行给药，在该系统中被用于给药的树状细胞前体的数量低于0.25×10⁶/千克受体体重。

7.权利要求1或3的方法，其中该树状细胞使用荧光激活的细胞分选而除去。

8.权利要求1的方法，其中树状细胞通过以下方法除去a)令同源异型造血系统的重构细胞同一种结合于顺磁支持物的配基相接触，该配基特异地结合树状细胞表面的一种受体，以及b)以一种磁体从同源异型造血系统重构细胞中除去树状细胞。

9.权利要求3的方法，其中树状细胞通过以下方法除去a)令同源异型造血系统重构细胞同一种结合于顺磁支持物的配基相接触，该配基特异地结合树状细胞表面的一种受体，以及b)以一种磁体从同源异型造血系统重构细胞中除去树状细胞。

10.权利要求1的方法，其中树状细胞通过令同源异型造血系统重构细胞通过一根或几根柱子而除去，所述的柱子含有支持材料，该支持材料结合有一种或多种配基，这些配基与表达与树状细胞表面的一种或多种蛋白相结合。

11.权利要求3的方法，其中树状细胞通过令同源异型造血系统的重构细胞过一根或几根柱子而除去，所述的柱子含有支持材料，该支持材料结合有一种或多种配基，这些配基与表达与树状细胞表面的一种或多种蛋白相结合。

12.权利要求8的方法，其配基选自以下分子组成的群体：IL3，抗CD123，抗CD45RA，抗CD4和抗CD36。

13.权利要求9的方法，其配基选自以下分子组成的群体：IL3，抗CD123，抗CD45RA，抗CD4和抗CD36。

14.权利要求10的方法，其配基选自以下分子组成的群体：IL3，抗CD123，抗CD45RA，抗CD4和抗CD36。

15.权利要求11的方法，其配基选自以下分子组成的群体：IL3，抗CD123，抗CD45RA，抗CD4和抗CD36。

16.权利要求2或4的方法，其中树状前体细胞通过令同源异型造血系统重构细胞与IL-3-毒性部分偶联体相接触，其中树状前体细胞被毒性部分破坏。

17.权利要求16的方法，其毒性部分选自diptheria toxin，篦麻毒素和百日咳毒素组成的群体。

18.权利要求1或3的方法，其中同源异型造血系统重构细胞经过针对CD34⁺表型的正性选择。

19.一种柱系统，该系统用于在移植前制备造血系统重构细胞，该系统包括的第一根柱子含有一种结合有可以特异结合CD34的抗体的支持物，第二根柱子含有一种结合有可以特异结合表达于树状细胞祖细胞表面的标记的抗体的支持物，其中第一根柱子在造血系统的重构细胞通过时吸附了至少30％的CD34⁺细胞，并以从第一根柱子释放出的被吸附的细胞流分通过第二根柱子并且吸附表达树状细胞前体表面的标记的细胞，这样便有效地减少了树状前体细胞的数量。