CN104906139B - 异源造血干细胞移植的增强 - Google Patents

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Abstract

本文提供了在异源造血细胞移植(HCT)后增加混合造血细胞嵌合向完全供体细胞嵌合转化的方法和组合物，其中这样的移植可以用于治疗诸如白血病和淋巴瘤的癌症，或用于治疗需要重建造血系统的其他疾病，例如治疗贫血、地中海贫血、自身免疫病等。本发明通过在异源HCT之后利用充分纯化的供体记忆性CD8+T细胞的组合物作为DLI改善了常规DLI，其中在移植后的适合时间给予该细胞。该方法提供更完全的供体嵌合，并且还具有杀死肿瘤细胞而不发生GVHD的益处。记忆性CD8+T细胞可包括中枢记忆性T细胞和效应记忆性T细胞中的一者或二者，通常包括二者。

Description

异源造血干细胞移植的增强
本申请是在2013年8月9日提交的申请号为201280008500.9的发明名称为“异源造血干细胞移植的增强”的专利申请的分案申请。
政府权利
本申请在国立卫生研究院(National Institutes of Health)给予的政府支持下做出(批准号为CA49605)，并且还获得了白血病和淋巴瘤学会(Leukemia and淋巴瘤Society) 给予的支持(批准号为6038-09)。
背景技术
癌症也被称为恶性肿瘤，其特征为表现为不受控细胞分化的细胞的异常生长、侵袭和破坏临近的组织、并且有时转移至体内的其他位置。存在超过100种类型的癌症，包括乳腺癌、皮肤癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和淋巴瘤。在美国，癌症是导致死亡的第二大主要原因，所有死亡的约13％是由癌症导致的。癌症会影响所有年龄段的人，甚至胎儿，但大多数类型癌症的风险随年龄增加。癌症能够影响所有的动物。
化疗已经成为许多癌症的标准治疗方法。化疗是指使用抗肿瘤药物来治疗癌症或将这些药物结合到细胞毒素标准化治疗方案中。最常用的是，化疗通过杀死快速分化的细胞(这是癌细胞的主要特性之一)而起作用。这种方法也会伤害在正常情况下快速分化的细胞：骨髓、消化道和毛囊中的细胞；这会导致的最常见的副作用是化疗-骨髓抑制(血细胞产生减少)、粘膜炎(消化道内衬发炎)和秃头症(脱发)。新的抗癌药物直接对癌细胞中的异常蛋白起作用；这被称为靶向治疗。
异源造血细胞移植(HCT)能够用于对患有白血病和淋巴瘤的患者进行治疗，尤其是当移植时接受治疗的患者处于完全缓解(complete remission)状态时。然而，如果接受治疗的患者在移植时处于部分缓解状态，或者当采用非清髓性处理(non-myeloablativeconditioning)时发生混合嵌合而不是完全嵌合，则进行性疾病和复发的风险相当大。
尽管出现了这些新的药剂和改进的组合，但目前的治疗方法对于许多类型的癌症或不同阶段的癌症仍然是无效的。对于癌症治疗非常需要改进的治疗方案和治疗方法。
发明内容
在本发明的一种实施方式中，提供了用于在异源造血细胞移植(或异基因造血细胞移植)之后通过加入纯化的供体淋巴细胞亚群来促进癌症(包括但不限于白血病和淋巴瘤)治疗的组合物和方法，该供体淋巴细胞亚群能够杀死肿瘤细胞而不引起移植物抗宿主病(GVHD)的主要并发症。
在一种相关的实施方式中，提供了在异源造血细胞移植(HCT)之后增强混合的造血细胞嵌合向完全供体细胞嵌合转化的方法和组合物，其中这样的移植可被用于治疗癌症或需要重建造血系统的其他病症，例如用于治疗贫血症、地中海贫血、自身免疫病等。混合嵌合与比通过随后的异源HCT达到完全供体嵌合的患者高得多的癌症发展或复发率相关。尽管在移植后的时间点可常规地进行供体淋巴细胞输注(DLI)，但DLI通常由血液中含有T细胞全部亚群的外周血单核细胞构成，因此会带来引起严重GVHD的主要风险。
本发明通过利用基本上纯的供体记忆性CD8+T细胞的组合物作为异源HCT之后的DLI来改善常规DLI，其中在人类中进行移植后的适合时间给予该细胞，例如从约2个月至约6个月，以防止肿瘤复发，或在肿瘤复发时候给予该细胞以治疗该复发。该方法提供了更完全的供体嵌合，并且具有杀死肿瘤细胞的进一步益处。该记忆性CD8+T细胞可包括中枢记忆性T细胞和效应记忆性T细胞中的一种或两种，通常包括二者。该供体记忆性T细胞通常是纯化的，并且可以单独利用特异于CD8的亲和性试剂或与本领域已知的这种细胞的其他标志物(包括但不限于CD8+CD44+群)的组合来进行选择。以对于促进完全嵌合有效的剂量给予该T细胞，并且在适当的时候，增强肿瘤细胞的杀灭。
在一些实施方式中，癌症是实体瘤。能够利用本发明所述的方式治疗的实体瘤的实例包括，但不限于，结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌和卵巢癌。在其他实施方式中，癌症为白血病或淋巴瘤，包括但不限于，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、淋巴瘤(如霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤)等。在一些实施方式中，肿瘤细胞为原发瘤或转移瘤。
附图说明
所附权利要求书特别地描述了本发明的新特征。通过参照以下描述了其中利用了本发明的原则的示例性实施方式的详细说明和附图将更好地理解本发明的特征和优势。
图1.用供体C57BL/6TCD BM细胞移植的、具有或不具有总T细胞或T细胞亚群的BALB/c宿主的存活。A，致死性辐照(800cGy)宿主给予来自供体的2×106TCD BM 细胞，具有或不具有(N＝12)来源于脾脏的0.5×106分选的供体总T(N＝10)或总CD4+ T(N＝10)细胞。从两次独立实验收集数据。B，从图1 A中确定小鼠体重的连续测量值。 +当组中的仅剩不超过两只小鼠时停止体重测量。C，在辐照后6小时使宿主接受500 BCL1淋巴瘤细胞。向经致命性辐照的宿主给予2×106TCD BM细胞，具有或不具有(N＝8) 0.5×106分选的CD62LhiCD44lo初始(N＝10)或CD44hi记忆性表型CD4+T细胞(N＝10)。也向对照未处理宿主给予肿瘤细胞(N＝8)。从两次独立实验收集数据。D和F，示出了在仅TCD BM移植或分别与记忆性CD4+T细胞或记忆性总T细胞移植28天后，分别在C和E中来自具有进行性肿瘤生长的受体的外周血中的CD19与BCL1 -个体基因型标志物的代表性双色流式细胞分析。
图2.初始表型CD8+T细胞和记忆性表型CD8+T细胞的表征。A，用抗-CD8、抗 -CD44和抗-CD62L mAbs对C57BL/6脾细胞进行染色。分析门控CD62LhiCD44low和 CD44hiCD8+T的CCR9、a4β7,、CD122和CXCR3表达。通过同型染色来确定门。对于 CD44lo CD8+T细胞(粗线)和CD44hiCD8+T(彩色区域)，各标志物的柱状图重叠。B，在MLR的第5天在三个平行孔中每一次细胞混合的C57BL/6应答初始表型CD8+T细胞或记忆性表型CD8+T细胞(2×105)与BALB/c刺激细胞(8×105)的3H-胸苷结合(平均值±SE)。结果为至少3次MLR试验的代表性结果。Allo和Syn分别表示BALB/c 和C57BL/6刺激细胞。+表示3H-胸苷结合小于5,000cpm。C，在MLR中第60小时示出了C57BL/6供体初始表型CD8+T细胞和记忆性表型CD8+T细胞(1×105)对经辐照的BALB/c刺激细胞(5×105)的细胞因子反应。左图示出了IL-2的平均值±SEM浓度；右图示出了IFN-γ的平均值±SEM浓度。#，细胞因子的浓度为<10pg/ml。结果是至少三次MLR培养的代表性结果。D，分选的初始细胞(naive cells)和记忆性细胞被用于针对表达的荧光素酶-BCL1细胞的细胞毒性实验。用经辐照的BALB/c脾细胞刺激分选的初始或记忆性表型CD8+T细胞96小时。将表达荧光素酶的BCL1淋巴瘤细胞与经刺激的初始或记忆性表型细胞以不同的效应细胞:靶细胞比率混合。在16小时后测量荧光素酶信号。然后与在每一时间点无效应细胞的相同靶细胞数目相比较来确定细胞毒素百分比。
图3.接受移植的供体C57BL/6TCD BM细胞、具有或不具有分选的、总的、初始或记忆性表型CD8+T细胞的BALB/c的受试者的存活和体重变化。A和C，示出了从具有或不具有1.0×106初始、1.0×106记忆、0.5×106初始、0.5×106记忆或0.5×106总CD8+供体T细胞(N＝8-11)的供体给予2×106TCD BM细胞的经致死辐照的BALB/c宿主的存活。从两个独立的实验收集数据。B和D，如在A和C中给予具有或不具有分选的初始、记忆或总CD8+T细胞的TCDBM的宿主小鼠的初始体重半分比。括号示出了平均值的SE。
图4.接受了500BCL1淋巴瘤细胞之后移植来自C57BL/6供体的TCD BM、包含或不包含分选的初始、或记忆性、或总CD8+T细胞的BALB/c宿主的存活、体重变化和器官病理学评分。该宿主在辐照后6小时接受500BCL1淋巴瘤细胞。A，被给予包含或不包含(N＝10)0.5×106分选的初始(N＝14)、记忆性(N＝12)、或总CD8+T细胞(N＝10) 的来自C57BL/6供体的2×106TCD BM细胞的经辐照宿主的存活。从2-4次独立实验收集数据。B，如A中被给予包含或不包含分选的初始、记忆性或总CD8+T细胞的TCD BM 的宿主小鼠的初始体重百分比。括号示出了平均值的SE。C，仅由初始、记忆性表型、或总CD8+T细胞和TCD BM诱发的组织病理学变化。代表性组织切片获自A中的宿主。在移植后100天从宿主的肝脏和大肠获得组织病理学样本，并在福尔马林中固定，之后包埋在石蜡块中。用苏木精和曙红对厚度为4-5mm的组织切片进行染色。利用Eclipse E1000M显微镜(Nikon,Melville,NY)用SPOT RT数字摄像机和获取软件(Diagnostic Instruments,Sterling Heights,MI)获得显微镜图像，全部图像的最终放大倍率为300倍。利用Photoshop CS(Adobe,San Jose,CA)以标准调节的量度、对比度和色平衡对图像进行处理以获得完整图像。在TCD BM组中在第21天进行组织病理学分析(上图)。除了罕见的细胞凋亡(箭头，左侧照片)之外，在结肠中没有发生GVHD的证据，而在肝脏中淋巴瘤是明显的(箭头，右侧照片)。在初始细胞组中(第二行照片)，在结肠中没有发生GVHD的证据。肝脏汇管具有显著的淋巴细胞浸润，这与2级GVHD一致(星号(asterix)，右侧照片)。在记忆性细胞组(第三行照片)中，在结肠或肝脏中均没有 GVHD或淋巴瘤的证据。在具有总CD8+T细胞的TCD组中，在结肠隐窝(箭头)中观察到细胞凋亡增加以及固有层发炎增加(开箭头，第四行左侧照片)。类似地，在肝脏中观察到肝门发炎和胆管损伤(星号)，这与GVHD一致。用H&E对组织切片进行染色。每一幅照片代表所检查的5-10个宿主。D，来自四个组(N＝6/组)的肝脏、小肠和结肠的组织病理学GVHD评分的平均值(±SE)。NS＝不显著(p>0.05)。
图5.在移植TCD BM并且结合或不结合分选的初始或记忆性CD8+T细胞之后， BCL1肿瘤细胞的存活、嵌合和清除。A，在全身辐照(TBI，800cGy)、BCL1细胞、以及包含或不包含初始或记忆性表型CD8+T细胞的2×106TCD BM骨髓细胞移植后的 28天来自受体的外周血中的CD19与BCL1 -个体基因型标志物的代表性双色流式细胞分析。向未处理的对照受体仅给予BCL1。盒中封入BCL1个体基因型+CD19+细胞，并示出了盒中细胞的百分比。B，在第28天的外周血的代表性流式细胞分析示出了门控TCRβ+细胞中的供体(H-2Kb+)细胞百分比。C和D，被给予来自C57BL/6供体的包含或不包含(N＝8)0.5×106、0.1×106或0.05×106分选的初始(N＝15；N＝9；N＝8)(C)或记忆性表型表型(D)CD8+T细胞(N＝12；N＝9；N＝8)的2×106TCDBM细胞的经致命性辐照 BALB/c宿主的存活。从两次单独实验收集数据。
图6.荧光素酶基因改造的初始和记忆性CD8+T细胞在移植非基因改造TCD BM 之后的运输和增殖的比较。BALB/c宿主经致死性辐照，接受500BCL1淋巴瘤细胞，然后注射具有来自B6-L2G85(H-2b)luc+小鼠的0.5×106初始或记忆性表型CD8+T细胞的2×106C57BL/6(H-2b)野生型TCD BM细胞。A，移植后连续时间点的BLI图像。B，随时间的BLI光子发射定量分析。TCD BM组的受体在第28天前死亡。C，在注射后第 3天后以及第5天后小鼠的体内成像，以及肠道(中间位置)、肝脏(左上位置)、脾(右下位置)和肺(右上位置)的离体成像。D，用具有CFSE-标记的0.5×106同类系C57BL/6 (H-2b,Thy1.1)分选的初始或记忆性表型细胞CD8+T细胞的2×106C57BL/6(H-2b, Thy1.2)TCD BM细胞对经致死性辐照的BALB/c受体小鼠进行注射。在第3天，对脾中来自初始和记忆性表型细胞Thy1.1+的CFSE染色强度进行分析。阴影部分示出了在移植前的染色，而无阴影部分(open profile，开放轮廓线)示出了移植后的染色。
图7.经过总T细胞或记忆性CD8+T细胞输注治疗的具有进行性肿瘤生长的受体中的存活、体重变化、嵌合以及血液中含有的BCL1细胞。A，实验方案；在辐照后6小时用100BCL1细胞对经致死性辐照的BALB/c受体小鼠进行注射。第二天(第0天)其接受2×106C57BL/6TCD BM细胞(N＝10)。骨髓移植后的第16天，一些小鼠接受0.5×106分选的记忆性表型CD8+T细胞(N＝8)或总T细胞(N＝8)的静脉内输注。B，经历或未经历输注的受体的存活。C，如A中所述经历输注或未经历输注的被给予TCD BM的宿主小鼠的初始体重百分比。D，上图示出了经历(右图)或未经历输注(左图)的情况下在移植2×106TCD BM骨髓细胞后在第28天来自受体的外周血中的CD19与BCL1- 个体基因型标志物的双色流式细胞分析。盒中封入BCL1-个体基因型+CD19+细胞。下图示出了在门控TCRβ+细胞中供体(H-2Kb+)细胞与TCRβ+细胞染色第28天时外周血的代表性流式细胞分析。E，经历或未经历输注的小鼠中淋巴瘤生长的BLI的代表性实例。在全身辐照后，向BALB/c宿主体内注射100BCL1-荧光素酶+转导的淋巴瘤细胞，之后在第二天(天0)注射2×106TCD-BM。骨髓移植16天后，实验小鼠接受0.5×106记忆性表型CD8+T细胞输注，而对照不接受输注。在骨髓移植的第16天和第30天实施成像。示出了每组5只小鼠中的两只代表性小鼠。F，经历或未经历记忆性细胞输注的移植受体的血液和骨髓中TCRβ+和Mac1/Gr1+细胞中供体型细胞的百分比。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下定义了一些术语。
在描述本发明的活性药剂和方法之前，应当理解，本发明并不限于所描述的特定方法、产品、装置和因素，因为这样的方法、装置和配方当然可以是变化的。还应当理解，本文中所使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式，而不是意在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限定。
必须注意到，如本文中和所附权利要求中使用的，除非在文中有明确所指，否则单数形式的“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数对象。因此，例如，所称的“一种药物候选物”是指一种这样的药物候选物或这样的药物候选物的混合物，并且所称的“该方法”是指包括本领域技术人员已知的等同步骤和方法，等等。
除非另外定义，本文中使用的全部科技术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员的通常理解相同的含义。本文中提到的全部出版物出于描述并披露可与本发明一起使用的、该出版物中所描述的装置、配方和方法的目的以引用方式结合于本文作为参考。
当提到数值范围时，应该理解，除非文中另外明确说明，该范围内的每一个值在该范围上限和下限之间包括下限单位的十分之一，并且该所述范围中的任何所述值或中间值都包括在本发明的范围内。可独立地包括在该较小范围内的这些较小范围的上限和下限也包括在本发明的范围内，这取决于该所述范围内的任何具体排除的上下限。当所述范围包括该上下限中的一者或二者时，不包括所包括上下限的二者中任一者的范围也包括在本发明的范围内。
在以下的描述中，描述了大量的具体细节从而更全面地理解本发明。然而，对于本领域技术人员而言，没有这些具体细节中的一个或多个也能够实施本发明。在其他情况下，为了避免使本发明晦涩难懂，没有描述本领域技术人员公知的公知特征和程序。
一般而言，本发明采用本领域公知的蛋白质合成、重组细胞培养和蛋白质分离的常规方法以及重组DNA技术。这样的技术在文献中有详细描述，参见例如Maniatis,Fritsch&Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；Sambrook,Russell和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2001)；Harlow,Lane和Harlow,Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol No.I,Cold SpringHarbor Laboratory(1998)；以及Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory；(1988)。
如本文中使用的，术语“纯化的”或“进行纯化”是指从样品中除去杂质。例如，可通过基于细胞表面表型除去效应(非记忆性)T细胞来除去有可能与宿主反应的效应(非记忆性)T细胞。除去不需要的细胞可使得样品中所需细胞的百分比增加。
如本文中使用的，术语“治疗”等是指获得所需的药理学和/或生理学效果。该效果可以是预防性的，即完全或部分预防疾病或其症状，和/或可以是治疗性的，即部分或完全治愈疾病和/或由该疾病引起的不利影响。如本文中使用的，“治疗”包括哺乳动物中，尤其是人类中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防可能预先倾向于患疾病但尚未诊断其患有该疾病的患者中发生该疾病；(b)抑制该疾病，即，阻止其发展；以及(c)缓解该疾病，例如，使该疾病衰退，例如完全或部分地清除该疾病的症状。
当癌症的至少一种症状减轻、终止、减慢或预防时，癌症被“抑制”。如在本文中使用的，当癌症的复发或转移减少、减慢、延迟或预防时，癌症被“抑制”。类似地，当癌症的至少一种症状减轻、终止、减慢或预防时，患有癌症的人是对治疗“有反应”的。如在本文中使用的，当癌症的复发或转移减少、减慢、延迟或预防时，患有癌症的人是对治疗“有反应”的。
记忆性T细胞.现有技术中已经描述了大量表型独特的记忆性T细胞并对其进行了表型表征。用于本发明的方法的记忆性T细胞通常为CD8+细胞，其可包括中枢记忆性T 细胞和效应记忆性T细胞中的一种或两种，通常包括二者。中枢记忆性T细胞已被描述为L-选择蛋白和CCR7阳性，并且分泌IL-2，而不分泌IFNγ或IL-4。已报道了效应记忆性T细胞不表达L-选择蛋白或CCR7，但产生包括IFNγ和IL-4的效应细胞因子。
这样的细胞可以从供体外周血单核细胞中分离，并且通常选择这样的细胞用于CD8 的表达。可选地选择该细胞作为小鼠中CD44阳性；CD56阴性、CD57阴性中的一种或多种，并且通过在人类中的CD45标志物(例如CD45RO+CD45RA)的表达进一步细分。参见，例如Cui等人(2010)Immunol Rev.236:151-66；
Figure BDA0000711451370000071
等人(2010)Immunol Rev.235(1):206-18；Zanetti等人(2010)Adv Exp Med Biol.684:108-25；Suzuki等人 (2008)HumImmunol.69(11):751-4；Tough(2003)Trends Immunol.24(8):404-7；其中每一篇均具体地结合于本文作为参考。
记忆性T细胞可获自适合的来源，包括人外周血、骨髓、淋巴结、脐带、体外细胞培养物等。在分析之前能够通过离心、冲洗、密度梯度分离、血浆分离置换、亲和选择、淘洗(panning)、FACS、Hypaque离心等来分离这样的样品，并且通常会使用单核流分 (PBMC)。获得样品后，可以直接使用、冷冻后使用或在适合的培养基中短时间保存。能够使用各种培养基来保存细胞。可通过任何常规程序获得样品，例如采血、血浆分离置换、静脉穿刺、活组织检查等。适合的溶液可用于细胞样品的分散和悬浮。这样的溶液通常为平衡盐溶液，例如标准盐水、PBS、Hank’s平衡盐溶液等，常规补充有胎牛血清或其他天然存在的因子，以及可接受的低浓度(通常为5-25mM)缓冲液。常规缓冲液包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。
细胞染色和富含所需记忆性T细胞群的选择会使用常规方法。提供精确选择的方法包括荧光活化细胞分选、磁选法、亲和柱等。
亲和试剂可以是上文所述的细胞表面分子的特异性受体或配体。尤其感兴趣的是使用抗体作为亲和试剂。通常，这些抗体与在分离中使用的标签结合。标签包括磁珠(其使得能够进行直接分离)、生物素(能够利用结合于载体的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素将其除去)、荧光染料(其能够与荧光活化细胞分选仪一起使用)等，以使得能够容易地分离特定细胞类型。发现可使用的荧光染料包括藻胆蛋白，例如藻红蛋白和别藻蓝蛋白、荧光素和得克萨斯红。通常，每一种抗体用不同的荧光染料进行标记，以允许对于每一种标志物进行单独分选。
将抗体加入到细胞悬液中，并孵育足以结合可获得的细胞表面抗原的一段时间。孵育过程通常为至少约5分钟并且通常少于约30分钟。反应混合物需要具有足够的抗体浓度，以使得分离的效率不会由于缺少抗体而受到限制。通过滴定确定适合的浓度。细胞被分离的培养基可以是保持细胞存活力的任何培养基。优选的培养基为含有0.1％至 0.5％BSA的磷酸盐缓冲盐水。各种培养基是可商购的并且可根据细胞的性质来使用，包括达尔伯克改良的伊格尔培养基(dMEM)、Hank's基础盐溶液(HBSS)、达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(dPBS)、RPMI、Iscove’s培养基、含有5mM EDTA的PBS等，通常补充有胎牛血清、BSA、HAS等。
如之前所述选择用于表达细胞表面标志物的细胞。通常提供给患者的细胞为至少约 50％的所选择表型、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多的所需表型。
以有效剂量给予细胞以提供受体造血系统与供体细胞基因型的基本完全嵌合。另外，该剂量可足以抑制或杀死肿瘤细胞(当这样的细胞存在时)。举例而言，对于成人而言，细胞剂量可以为至少约106细胞，至少约107细胞，至少约108细胞或更高。对于儿童患者而言，该剂量可以适当减少，例如至少约5x105，至少约106，至少约107或更多的细胞。
可在异源造血细胞移植(HCT)之后给予该细胞，其中这样的移植可以被用于在人类中移植后的适合的时间(例如，约2个月至约6个月)治疗癌症或用于需要重建造血系统的其他病症，例如治疗贫血、地中海贫血、自身免疫病等，以防止复发或者在复发时治疗复发。
在本发明的一种实施方式中，提供了用于在异源造血细胞移植后通过加入纯化的供体淋巴细胞亚群来促进癌症(包括但不限于白血病和淋巴瘤)治疗的组合物和方法，该供体淋巴细胞亚群能够杀死肿瘤细胞而不引起移植物抗宿主病(GVHD)的主要并发症。
在一种相关的实施方式中，提供了在异源造血细胞移植(HCT)之后增强混合的造血细胞嵌合向完全供体细胞嵌合转化的方法和组合物，其中这样的移植可被用于治疗癌症或需要重建造血系统的其他病症，例如用于治疗贫血症、地中海贫血、自身免疫病等。混合嵌合与比通过随后的异源HCT达到完全供体嵌合的患者高得多的癌症发展或复发率相关。尽管在移植后的时间点可常规地进行供体淋巴细胞输注(DLI)，但DLI通常由血液中含有T细胞全部亚群的外周血单核细胞构成，因此会带来引起严重GVHD的主要风险。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，包括用化疗剂或放疗剂对患者进行治疗；随后破坏受体的造血系统、实施造血细胞(包括干细胞)的异源移植，以及随后如上文所述在移植后，将来源于供体的记忆性CD8+T细胞群输注到患者体内。能够通过本发明的所述方法治疗的癌症的实例包括但不限于淋巴瘤、白血病和实体瘤，例如结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌和卵巢癌。肿瘤可以是原发瘤或转移瘤。
在对小鼠进行的研究中，在实施了全身辐照之后，向患有B细胞淋巴瘤的受体给予缺乏T细胞的骨髓移植物。该受体变为混合嵌合体并且肿瘤进行性生长。在约2-3周后向受体给予DLI，其由通过流式细胞术纯化的总T细胞和记忆性CD8+T细胞 (CD8+CD44hi)构成。然而，总T细胞DLI诱发致命性GVHD，记忆性CD8+DLI根除肿瘤而不会引起GVHD。CD8+T细胞还促进向完全供体嵌合的转化。小鼠记忆性 CD8+T细胞通过增殖和伴有少量IL-2分泌的IFN-γ分泌在体外响应于同种抗原。类似地，人记忆性CD8+T细胞(CD8+CD45RO+)通过增殖和伴有少量IL-2分泌的IFN-γ分泌在体外响应于同种抗原。
在之前对MHC-匹配的小鼠的研究中，新鲜分离自未与抗原接触的(unprimed)供体的组合的CD8+中枢和效应记忆性(CD8+CD44hi)T细胞、或在与宿主型树突状细胞一起培养后产生的效应记忆性CD8+T细胞不会诱发GVHD。
在恶性疾病的治疗中，骨髓移植已被人们所接受。伴随造血干细胞支持的高剂量化疗被广泛用于大多数恶性血液病，以及用于一些实体瘤。纵观在血液祖细胞收获方面的最新发展，尤其是通过粒系集落刺激因子动员并通过白细胞单采术(leukapheresis)收集的大量血液干细胞的可获得性，能够克服HLA-错配患者中的组织相容性屏障。其他的最新研究包括，但不限于用于血液祖细胞动员以及祖细胞和免疫细胞离体扩增的新方法、脐带血作为干细胞可替代来源的应用、以及支持通过造血细胞和免疫细胞的异源移植有效治疗癌症的其他分子技术。
临床效力
在癌症的治疗过程中和之后通过本发明所述的方法监控肿瘤生长和疾病进展。可通过本领域已知的任何方法来测量临床效力。在一些实施方式中，通过测量临床受益率(CBR)来确定所述治疗方法的临床效力。
通过确定在治疗结束后至少6个月的时间点处于完全缓解(CR)状态的患者的百分比、处于部分缓解(PR)状态的患者数目和具有稳定疾病(SD)的患者数目之和来测量临床受益率。该公式简略表达为CBR＝CR+PR+SD月。在一些实施方式中，所述治疗方法的CBR为至少约50％。在一些实施方式中，所述治疗方法的CBR为至少约 55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。
在本发明中，临床前数据示出了通过在异源造血细胞移植之后输注供体来源的CD8+记忆性T细胞对荷瘤宿主进行治疗，肿瘤杀死改善和移植物抗宿主病减少。
异源HCT的一个重要局限性是移植物抗宿主病(GVHD)，其在约30-50％的接受该治疗的人中以严重形式发生。通过利用本发明方法的记忆性T细胞输注可显著减少 GVHD。
本文中使用的术语“受试者”包括人类和其他哺乳动物。本文中使用的术语“治疗”包括达到治疗益处和/或预防性益处。治疗益处意指癌症的根治和缓解。尽管动物受试者可能仍经受癌症折磨，但与癌症相关的一种或多种生理学症状的根除或缓解以使得在动物受试者中观察到改善也可实现治疗益处。
能够利用本发明所述方法治疗的癌症类型包括，但不限于白血病、淋巴瘤、肾上腺皮质癌、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、脑癌、中枢神经系统(CNA)癌、外周神经系统(PNS)癌、乳腺癌、宫颈癌、儿童非霍奇金淋巴瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏肿瘤家族(Ewing's family of tumors，例如尤文氏肉瘤)、眼癌、胆囊癌、胃肠道良性肿瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌和咽癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、儿童白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、肝癌、肺癌、肺部良性肿瘤、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病、鼻腔癌和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、黑素瘤皮肤癌、非黑素瘤皮肤癌、胃癌、睾丸癌；胸腺癌、甲状腺癌、子宫癌(例如子宫肉瘤)、移行细胞癌、阴道癌、外阴癌、间皮瘤、鳞状细胞癌或表皮样癌、支气管腺瘤、恶性蜕膜瘤(choriocarinoma)、头颈癌、畸胎瘤、或原发性巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括向对其有需要的受试者给予抗肿瘤剂，或其可药用盐或前药。在一些实施方式中，该抗肿瘤剂包括但不限于抗肿瘤烷化剂、抗肿瘤抗代谢剂、抗肿瘤抗菌剂、植物来源的抗肿瘤剂、抗肿瘤有机铂化合物、抗肿瘤喜树碱衍生物、抗肿瘤酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体、干扰素、生物应答调节剂、以及具有抗肿瘤活性的其他药剂，或它们的可药用盐。
实施例
实施例1
CD8+CD44hi而不是CD4+CD44hi记忆性T细胞介导有效的移植物抗淋巴瘤活性，而无GVHD
对比新鲜分离的初始CD4+、CD8+或总T细胞，和/或来自未接触抗原供体的记忆性CD4+CD44hi、CD8+CD44hi、和总T CD44hi细胞针对MHC-错配模型中天然存在的B细胞淋巴瘤(BCL1)诱发GVHD、促进完全嵌合以及介导抗肿瘤活性的能力。只有含有中枢和效应记忆性细胞的CD8+CD44hi记忆性T细胞亚群能够根除淋巴瘤细胞而不会诱发 GVHD。相对而言，CD4+和CD8+初始T细胞、记忆性CD44hiCD4+T细胞、初始总T 细胞、以及记忆性总T CD44hi细胞均会诱发致命性GVHD且缺少潜在的抗肿瘤活性。相对于那些接受CD8+初始T细胞的受体，CD8+CD44hiT细胞的荷瘤受体具有明确的存活优势，因为CD8+初始T细胞会诱发致命性GVHD。CD8+CD44hiT细胞也被用在骨髓移植后治疗进行性淋巴瘤生长的模型中，并且能够促进完全嵌合以及根治肿瘤而不诱发 GVHD。
材料和方法
动物。野生型Thy1.2C57BL/6(H-2b)雄性小鼠(8至12周龄)和雄性BALB/c (H-2d)Thy 1.2小鼠(8至12周龄)购自斯坦福大学比较医学部的繁育机构或杰克逊实验室(TheJackson Laboratory)(Bar Harbor,ME,USA)。使用如前文中描述的表达荧光素酶(luc+)的基因改造B6-L2G85(H-2b,Thy1.1)小鼠16。在特定的无病原体环境中饲养所有的小鼠。根据公共机构和国立卫生研究院指南照料实验动物。
抗体和流式细胞术分析(FACS)。非结合的抗-CD16/32(2.4G2)、抗-CD8PE(53-6.7)、抗-TCRβAPC(H57-597)、抗-CD62L FITC(Mel-14)、抗-CD44PE(IM7)、抗-LPAM-1 PE(α4β7整合素复合物)(DATK32)、抗-H-2Kb FITC(AF6-88.5)、抗-CD19APC(1D3)、抗-B220PacificBlue(RA36B2)、单克隆抗体(mAbs)购自BD Pharmingen(圣地亚哥， CA)。抗-CD8Alexa 700(53-6.7)和抗-Thy1.1Pacific Blue(OX-7)获自Biolegend(San Diego,CA)。抗-CCR9PE(242503)和抗-CXCR3PE(220803)mAbs购自R&D systems (Minneapolis,MN)。抗-个体基因型BCL1抗体由分泌大鼠IgG2a的杂种细胞纯化。抗体与Alexa-Fluor-488结合以用于FACS染色。前文中已详细描述了染色和流式细胞分析以及分选。
细胞制备。利用
Figure BDA0000711451370000121
系统(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)用抗-CD4和抗-CD8磁性微珠使单个脾细胞悬液富含CD4+、CD8+或TCRβ+总T细胞。在用抗-CD8PE、抗-CD4、抗-CD62L FITC和抗-CD44APC染色后，利用Aria流式细胞仪 (Becton-Dickinson,MountainView,CA)将细胞分选为CD62LhiCD44lo初始或总CD44hi (记忆性)细胞群。分选的初始和记忆性细胞的纯度≥98％，如通过分选细胞再分析所判断的。之前已经报道了去除T细胞的骨髓(T cell-depleted bone marrow，TCD BM)细胞的制备。为了监测经移植小鼠中的外周血中的BCL1肿瘤细胞和供体嵌合，将红细胞溶解并将富含白细胞的血细胞用于FACS染色。
混合白细胞反应、细胞因子实验、和细胞毒性实验。在所描述的混合白细胞反应(MLR)中，使用来自C57BL/6的供体小鼠的分选的初始或记忆性CD8+T细胞亚群作为应答细胞(responder)并将其与作为刺激细胞(stimulator)的经辐照的(3,000cGy) 异源BALB/c脾细胞混合。在5天后测量3[H]胸苷结合，并在60小时后在多元实验系统中用微球珠分析上清中的细胞因子分泌。用经辐照的(3,000拉德)BALB/c脾细胞以 1:2的比率刺激分选的初始或记忆性表型CD8+T细胞96小时。所培养的细胞用作效应细胞，并将其与表达荧光素酶的BCL1luc/gfp淋巴瘤靶细胞混合。通过前文中所述的生物发光成像来评价细胞溶解。
GVHD模型、GVHD严重程度的组织病理学分选、以及BCL1肿瘤模型。如之前所述诱发急性GVHD。简言之，在24小时内用200Kv X-射线源对BALB/c宿主给予800cGy 的全身辐照，并经由尾静脉注射供体细胞。以单盲方式利用Kaplan等人所述的组织病理学评分系统来实施肝脏、小肠和结肠GVHD的组织学评价。BCL1是来源于具有IgMλ表面Ig表现型的BALB/c小鼠的天然存在的B-细胞白血病/淋巴瘤。如之前所述通过在 BALB/c小鼠中连续传代来保持这种细胞系。之前已报道了具有luc-gfp基因构建体的 BCL1肿瘤细胞的使用。
体内和离体生物发光成像。根据Edinger等人所述来实施体内生物发光成像。简言之，用荧光素(10μg/g体重)对小鼠进行腹膜内注射。10分钟后，利用IVIS100电荷耦合器件成像系统(Xenogen,Alameda,CA)使小鼠成像5分钟。分析成像数据并用Living ImageSoftware(Xenogen)定量化。根据Beilhack等人所述的方法进行离体生物发光成像。
体内CFSE增殖实验。为了分析细胞增殖，如所描述的将来自Thy1.1C57BL/6供体的分选的初始或记忆性CD8+T细胞装载于Vybrant CDDA SE(羧基二乙酸荧光素、琥珀酰亚胺酯)示踪试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将Thy1.1CFSE标记的初始和记忆性细胞(0.5×106)和2×106TCD BM细胞(C57BL/6,Thy1.2)注射到经致死性辐照的BALB/c小鼠中。在BMT后第3天(天3+)，通过FACS分析来自脾脏的经输注 Thy1.1细胞的CFSE染色，并用Flowjo软件利用增殖分析来进行细胞分化数目的比较。
统计学分析。利用Prism(GraphPad Software,San Diego,CA)制作Kaplan-Meier存活曲线。通过对数秩(log-rank)检验来分析动物存活中的统计学差异。利用双尾学生氏t检验来分析体外实验中平均3[H]胸苷结合和平行测定的细胞因子产生之间的差异。利用Mann-Whiltney U检验来比较GVHD评分。对于所有的检验，p≤0.05被认为是显著的。
结果
GVHD和供体T亚群的抗淋巴瘤活性。我们研究了具有移植物抗淋巴瘤活性而不诱发严重GVHD的新鲜分离的供体T细胞。最初，用2×106C57BL/6(H-2b)供体TCD BM 细胞和恒定量(0.5×106)的总T细胞(初始和记忆性细胞，未分离)或CD4+T细胞(初始和记忆性细胞，未分离)对经致死辐照的BALB/c(H-2d)宿主进行移植。单独移植了TCD BM的宿主存活超过100天并且它们的体重回到移植前水平(图1A)。在移植的一周内向TCD BM中加入CD4+和总T细胞诱发急性GVHD，在移植后三周时会导致腹泻、进行性体重减轻以及全部受体死亡(图1)。与仅接受TCD BM的受体相比，体重和存活显著减少(分别为p≤0.0001和p<0.001)(图1A和图1 B)。
一些之前的研究(包括我们的研究)已经示出CD44hi记忆性CD4+T细胞并不会诱发致死的GVHD10。我们确定了被给予C57BL/6CD44hi记忆性CD4+T细胞、TCD BM 和BCL1淋巴瘤细胞的BALB/c移植受体的血液中的肿瘤细胞的存活和存在。其他组以相同剂量接受了初始CD4+T细胞、初始总T细胞或记忆性总T细胞来替代记忆性CD4+ T细胞(图1C-图1 F)。到第28天时，所有仅接受TCD BM的动物死亡，并且血液中淋巴瘤细胞发展(图1D)。没有迹象表明GVHD。在移植后10天内，接受初始CD4+T或初始总T细胞以及TCD BM的动物出现致死的GVHD，伴有腹泻和体重减轻(图1C和图1 E)。尽管记忆性CD4+T细胞和TCD BM的受体并未表现出GVHD的迹象，但它们不能控制淋巴瘤生长并且在用外周血中的BCL1个体基因型阳性细胞移植后的30天内全部死亡(图1D)。感兴趣的是，40％接受记忆性T细胞的宿主死亡时血液中有淋巴瘤细胞(图1F)。其余60％的宿主的血液中未发展淋巴瘤细胞，并且存活超过100天而无GVHD的临床体征(图1E)。
来自未免疫供体的CD8+初始和记忆性T细胞是同种异体反应性的(alloreactive)。我们继续研究分离的初始和记忆性CD8+T细胞在体外的同种异体反应性，以及GVHD 和GVT活性。最初，我们分析了来自未处理的C57BL/6小鼠的门控的初始CD8+T细胞和记忆性CD44hiCD8+T细胞关于CCR9、α4β7、CXCR3和CD122的表达。初始CD8+T 细胞对于CCR9显示出强烈的染色而对于α4β7显示出较弱染色，而记忆性CD8+T细胞对于二者均显示出负染色(图2A)。记忆性表现型细胞显示出高于初始细胞的CXCR3 和CD122水平(图2A)，这证实了它们是如上文中所述的记忆性标志物。
为了评价细胞亚群的同种异体反应性，将分选的初始或记忆性C57BL/6CD8+T细胞与作为异源刺激细胞的经辐照的BALB/c脾细胞一起孵育。将恒定数量的分选的应答细胞(1×105)与恒定数量的刺激细胞(4×105)一起孵育。在培养5天后测量增殖，并且在培养后60小时在上清中测量IL-2和IFN-γ细胞因子分泌。我们之前利用该培养系统的研究显示了初始CD4+T细胞是同种异体反应性的，但记忆性CD4+T细胞不是，如通过增殖和细胞因子分泌不高于背景所判断的。初始CD8+T细胞比记忆性CD8+T细胞结合的3H胸苷高7倍(p＝0.0004)(图2B)。与同源刺激细胞相比，使用异源刺激细胞这两个亚群显著更多地结合3H胸苷结合。图2C示出了分选的初始CD8+T细胞在与异源刺激细胞培养后分泌的IL-2的平均浓度为150-200pg/ml，并且异源培养物和同源培养物之间的差异是显著的(p＝0.01)。相反，在异源培养物和同源培养物中，由分选的记忆性CD8+T细胞分泌的IL-2的平均浓度均低于50pg/ml(对于异源(Allo)，记忆性细胞相对于初始细胞p＝0.02)(图2C)。图2C示出了具有分选的记忆性细胞CD8+T细胞的异源培养物与具有初始CD8+T细胞的异源培养物(p＝0.04)或同源培养物(p<0.005) 相比分泌显著增加的IFN-γ(平均大约1000pg/ml)。在上清中对所有培养物的IL-4、IL-10 和TNFα进行分析，但并未在多元细胞因子实验中检测这些细胞因子。
为了研究介导记忆性或初始表型CD8+T细胞的细胞毒性的细胞，我们使用了用荧光素酶基因构建体转导的BCL1淋巴瘤靶细胞。在异源培养物中用经辐照的BALB/c刺激细胞活化初始和记忆性CD8+T细胞96小时。针对BCL1靶细胞，这些活化的细胞以不同的比率被用作效应细胞。荧光素酶的酶活性被用作BCL1细胞存活的量度。BCL1细胞细胞溶解的百分比与所测试的所有细胞比率的初始和记忆性CD8+T细胞相似(图2D)。因此，两个亚群均显示出相似的杀死肿瘤细胞的能力。
CD8+初始而不是记忆性T细胞诱发致命性GVHD。在进一步的实验中，经辐照的BALB/c宿主接受1.0×106或0.5×106剂量的初始或记忆性C57BL/6供体CD8+T细胞和/ 或2×106TCD BM细胞。图3A和图3B示出了所有的仅接受了TCD BM细胞的经辐照受体存活100天。尽管在辐照后第一周出现短暂的体重减少，但在之后的第三周恢复至基线并稳定(图3B)。这些小鼠并未表现出GVHD的通常临床特征，包括腹泻、驼背、皮毛褶皱、脱发和面部肿胀。相对而言，约50％接受了1×106初始CD8+T细胞的宿主在约40天时发生腹泻，并且表现出进行性体重减少直至移植后60-100天死亡(图3A和图3 B)。相对而言，记忆性CD8+T细胞组中的全部受体存活(图3A)。初始和记忆性CD8+T 细胞组之间在存活(p<0.05)和体重损失(p<0.01)上存在显著差异。当宿主接受较低细胞剂量0.5×106初始CD8+T细胞时，约40％的宿主会发生GVHD的临床特征(图3C)。被给予0.5×106总CD8+T细胞的受体的存活与被给予相同剂量初始CD8+T细胞的受体相似。与记忆性CD8+T细胞相比，总CD8+T细胞和初始CD8+T细胞的存活均显著减少(p＝0.04)(图3C)。尸检示出了GVHD的组织病理学证据(数据未示出)。以该细胞剂量的所有记忆性表型CD8+T细胞的受体均存活超过100天，并且表现出与TCD BM 组相似的体重减少(图3D)。初始细胞组和记忆性细胞组的存活和体重减少之间的差异是显著的(p<0.05)(图3D)。
CD8+记忆性T细胞以最小的GVHD介导抗-淋巴瘤活性。我们评价了在给予500 BCL1淋巴瘤细胞(非转导的)之后给予具有或不具有0.5×106总CD8+T细胞或分选的初始或记忆性CD8+T细胞的2×106TCD BM的经致死辐照的BALB/c小鼠中的供体细胞的抗肿瘤活性。大多数仅接受TCD BM的小鼠在移植后30天死亡(图4A)，这与血液中存在BCL1-个体基因型+肿瘤细胞相关(图5A)。与仅接受TCD BM的宿主相比，接受总CD8+T(p<0.0001)、初始CD8+T细胞(p<0.0001)或记忆性CD8+T细胞(p<0.0001) 的各组中的宿主的存活显著改善(图4A)。总CD8+T细胞和初始CD8+T细胞组中约25％的宿主在60天时死亡，且该组中的所有宿主的血液中均未检测到肿瘤细胞(图4A和图 5A)。接受记忆性CD8+T细胞的所有小鼠超过100天仍存活，血液中没有任何肿瘤细胞 (图4A和图5A)。与接受记忆性CD8+T细胞的组相比，接受总CD8+T细胞或初始CD8+ T细胞的组的存活(率)显著减少(分别为p＝0.03和p＝0.04)。体重减少也显著不同(p＝0.03 和p＝0.004)。所有接受BCL1肿瘤细胞的未处理小鼠在50天时死亡。
图4C示出了骨髓移植受体的结肠和肝脏的代表性组织切片。尽管接受具有或不具有记忆性CD8+T细胞的TCD BM的受体的结肠表现出隐窝和杯状细胞的保留，具有最小的淋巴细胞浸润，但接受初始CD8+T细胞或总CD8+T细胞的受体表现出不具有隐窝、缺失杯状细胞和相当大的浸润。接受TCD BM的受体的肝脏在血管周围显示出肿瘤细胞，而初始或总CD8+T细胞的受体显示出外周淋巴细胞浸润。记忆性CD8+T细胞的受体未显示出异常。图4D示出了肝脏、结肠和小肠中GVHD损伤的组织病理学评分。尽管接受具有或不具有记忆性CD8+T细胞的TCD BM的受体的评分之间没有显著差异 (p>0.05)，但接受具有初始CD8+T细胞或总CD8+T细胞的TCD BM的组与仅具有 TCD BM的组相比，评分显著增加(p＝0.02-0.008)。初始组与记忆组相比，肝脏中的 GVHD评分显著更高(p＝0.04)。
我们评价了28天时3组受体外周血中T细胞的供体细胞嵌合性(图5B)。所有移植TCD BM的宿主为混合嵌合体，如用TCRβ+T细胞中的供体型(H-2Kb+)细胞代表性染色示出的(图5B)。全部接受0.5×106初始或记忆性CD8+T细胞的受体具有超过99％的供体型细胞，并且在100天后仍保持稳定的供体嵌合(数据未示出)。因此，加入初始或记忆性CD8+T细胞均可导致从混合嵌合向完全嵌合的改变。混合嵌合体在血液中使肿瘤细胞发展，而完全嵌合体却不会(图5A)。
我们确定了接受较低剂量初始或记忆性CD8+T细胞以及TCD BM和BCL1细胞的宿主的存活。约70％接受0.5×106或0.1×106初始CD8+T细胞的宿主存活超过100天(图 5C)，且血液中没有BCL1淋巴瘤(数据未示出)。当细胞剂量为0.05X106时，约30％的宿主存活超过100天且没有肿瘤细胞，而约70％血液中含有肿瘤细胞的宿主死亡。相对而言，接受0.5×106或0.1×106记忆性CD8+T细胞的宿主100％能够存活超过100天，且没有任何证据证明血液中含有淋巴瘤，而当剂量减少至0.05×106时80％死亡且具有淋巴瘤(图5D)。与图1E中所示的接受0.5×106总记忆性T细胞的组相比，接受0.1×106记忆性CD8+T细胞的组的存活得到了显著改善(p<0.05)。
CD8+初始T细胞而不是记忆性T细胞在GVHD靶器官中的快速累积。为了说明初始和记忆性CD8+T细胞之间GVHD严重性的差异，我们研究了这些细胞在淋巴组织和 GVHD靶器官中累积的范围和快速程度是否存在任何差异。通过将来自C57BL/6-L2G85 luc+小鼠的0.5×106初始或记忆性CD8+T细胞与来自野生型C57BL/6供体的2×106TCD BM移植到接受500BCL1肿瘤细胞的经辐照的BALB/c受体中来评价初始和记忆性 CD8+T细胞的运输和存活。3天后初始CD8+T细胞归巢至脾脏和颈部淋巴结，并且在5 天后胃肠道和皮肤中观察到强烈的信号(图6A)。在接受记忆性CD8+T细胞的小鼠的这些器官中该些信号低得多(图6A)。TCDBM对照没有信号，并且如前所述这些小鼠由于淋巴瘤在28天后死亡。在84天的整个观察期中，来自初始CD8+T细胞的信号在胃肠道区域中持续存在，而在这期间该信号从记忆性CD8+T细胞降低。BLI的光子发射的量化表明，初始CD8+T细胞的信号迅速增加至第7天，然后到第70天下降至逼近背景(图 6B)。信号强度继续升高至高于记忆性CD8+T细胞直到第60天(p＝0.002)(图5B)。我们在新鲜制备的器官(例如肝、脾和胃肠道)上实施了离体BLI成像，以分析BMT 后3天和5天该信号的组织分布。离体图像显示，在第3天时初始CD8+T细胞归巢至次级淋巴组织(包括脾)、肠系膜淋巴结、和皮氏小结(Peyer’s patches)，之后在第5 天时发生胃肠道浸润(图6C)。记忆性CD8+T细胞显示相似的图案，然而，来自记忆性CD8+T细胞受体中小肠和大肠的信号比初始CD8+T细胞的信号弱得多且慢得多(图 6C，第5天)。
脾中CD8+初始T细胞与记忆性T细胞的细胞分化增加。BLI研究的观察结果提示了我们研究在BMT之后初始和记忆性CD8+T细胞增殖的差异。为了评价移植后这两种细胞群的增殖，我们将来自C57BL/6-L2G85luc+Thy1.1小鼠的0.5×106CFSE标记的分选的初始或记忆性CD8+T细胞以及野生型C57BL/6Thy1.2TCD BM注射到经辐照的 BALB/c小鼠体内。我们通过改变CFSE的染色强度分析了BMT之后第3天宿主脾中初始和记忆性CD8+T细胞的细胞分化速率(图6D)。代表性增殖分析显示，约10％的初始CD8+T细胞和约5倍多的记忆性CD8+T细胞已经历了2次或更少的细胞分化，如通过利用Flowjo软件进行增殖分析所确定的。这些结果与MLR数据一致(图2B)，其示出了在同种抗原刺激之后，记忆性CD8+T细胞与初始CD8+T细胞相比3H-胸苷结合为其七分之一。
BMT之后，CD8+记忆性T细胞是用于进行性淋巴瘤有效的治疗手段。我们研究了在第16天作为输注液给予的记忆性CD8+T细胞是否能够根除在第0天注射有供体TCD BM细胞移植的BCL1肿瘤细胞(图7A)。选择在第16天进行输注是因为在那时初步试验中luc+肿瘤细胞已在移植受体的淋巴组织中被扩增(图7E)，但还没有在血液中检测到。在随后的实验中，对宿主血液中的非转导BCL1肿瘤和GVHD信号进行连续监控。到第35天，所有未接受输注的宿主死亡，其血液中含有肿瘤细胞(图7B和D)。所有接受含有0.5×106记忆性CD8+T细胞的输注的宿主存活超过100天(p<0.001)，且在血液中未发现肿瘤细胞(图7B和图7 D)。在100天结束时输注处理组中的存活小鼠获得了其初始体重的至少90％，并且未显示出GVHD的临床体征(图7C)。当给予含有等量总T细胞的输注液来代替CD8+记忆性T细胞时，到第40天时所有的宿主死亡并且具有 GVHD的临床体征。体重减轻显著多于CD8+记忆性T细胞组(p＝0.004)(图7B和图 7C)。接受CD8+记忆性T细胞的组在全部宿主中显示出>99％供体T细胞嵌合，而没有进行输注治疗的对照组显示出混合的供体T细胞嵌合(图7D)。图7F示出了接受输注治疗的5个受体中的5个在T细胞谱系和粒细胞/巨噬细胞谱系中全部为完全嵌合，而没有接受输注的受体在这些谱系中全部为混合嵌合。用于准确确定B220+细胞的B细胞产量太低。发生致命性GVHD的接受总T细胞输注的组也具有>99％T细胞嵌合，并且血液中未出现BCL1肿瘤细胞。
还在另外的接受BCL1-luc+细胞的受体的组中通过BLI评价了BCL1淋巴瘤发展。图7E示出了在包含或不包含记忆性CD8+T细胞输注治疗的TCD BM移植后宿主中表达荧光素酶的BCL1细胞的淋巴瘤生长。在第16天可容易地检测未接受输注的宿主中的淋巴瘤累积，以及在第30天肿瘤发展的强度增加并延伸至另外的组织。相对而言，在用记忆性CD8+T细胞输注的小鼠中，在第30天未检测到BLI信号。
之前对鼠科动物的研究显示，与初始T细胞相比，记忆性T细胞诱发程度显著更轻的GVHD9-15。因此，对于诱发致命性GVHD，我们比较了未被分离成纯化的初始和记忆性亚群的供体总T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞。我们还分析了相同MHC错配的移植物模型(C57BL/6→BALB/c)中抗-BCL1淋巴瘤活性的亚群，该模型与单倍型错配的移植最相关。与仅用TCDBM相比，总T细胞、初始总T细胞、CD4+T细胞和 CD8+T细胞诱导显著增加的致命性GVHD。与记忆性CD8+T细胞相比，记忆性总T细胞缺乏强大的抗肿瘤活性，因为是记忆性总T细胞的五分之一的记忆性CD8+T细胞在更高比例的受体中诱发完全肿瘤缓解。因此，记忆性CD8+T细胞是本文研究的重点。
在C57BL/6→BALB/c菌株组合中，CD4+总T细胞和初始T细胞比CD8+总T细胞和CD8+初始T细胞诱导明显更严重的GVHD。尽管在约30天时0.5×106CD4+总T细胞诱导一致的致命性GVHD，但相等数量的CD8+总T细胞在75天时诱导约40％的受体死亡。我们没有研究CD4+总或初始T细胞的移植物抗淋巴瘤活性，因为由GVHD引起的死亡明显比血液中肿瘤细胞的出现以及随后的与肿瘤相关的死亡更快。
经记忆性CD4+T细胞没有体外或体内同种异体反应性，但在本研究中，记忆性 CD8+T细胞响应于异源刺激细胞，如通过增殖和细胞因子分泌所判断的。然而，与初始细胞相比，记忆性细胞的增殖和IL-2分泌显著下降(约为七分之一)，而IFN-γ分泌却显著增加。两种亚群均显示出在最初同种抗原刺激后有效杀死异源靶细胞。在我们之前的研究中记忆性CD8+T细胞是同种异体反应性的而记忆性CD4+T细胞不是同种异体反应性的原因还不清楚。来自未处理小鼠的大多数记忆性CD44hiCD8+T细胞是中枢记忆性T细胞，而大多数的记忆性CD4+CD44hiT细胞为效应记忆性T细胞。
CD8+CD44hi记忆性T细胞在经辐照的宿主中不诱发致命性GVHD，而相等数量的 1×106或0.5×106初始CD8+T细胞或总CD8+T细胞在约40％至50％不具有肿瘤细胞的受体中诱发致命性GVHD。对照受体接受TCD BM和BCL1肿瘤细胞，全部死于进行性肿瘤生长。当向后者受体给予0.5×106初始或总CD8+T细胞时候，未出现由肿瘤生长导致的死亡。然而，约25％死于GVHD，且与仅被给予TCD BM细胞的受体相比，在被给予初始细胞或总CD8+T细胞的这些受体的肝脏、结肠和小肠中的GVHD组织生理学评分显著增加。相对而言，被给予记忆性CD8+CD44hiT细胞的受体在100天的观察期间内未出现死亡，并且GVHD评分与仅被给予TCD BM细胞的那些受体相比没有显著差异。被给予初始细胞的宿主中的肝脏GVHD评分显著高于被给予记忆性CD8+T细胞的评分。后者的结果与关于利用CD8+CD44hi细胞不会引起GVHD的先前报道一致12，但不同于近来的一个报道，其是将纯化的中枢记忆性CD62LhiCD44hiCD8+T细胞注射到骨髓移植的经致命性辐照的MHC错配受体中。该中枢记忆性CD8+T细胞诱发显著高于TCD BM对照的GVHD评分。一种可能的解释是，在现有的CD8+CD44hi研究中，中枢和效应记忆性CD8+T细胞联合使用，以及效应记忆性细胞的加入会削弱中枢记忆性T 细胞的GVHD的效力。已经报道了效应记忆性T细胞即使暴露于同种抗原时也几乎不诱发或不诱发GVHD，而尚未研究该亚群对GVHD的调控。最近的研究表明，表达记忆性表型的CD8+CD122hi细胞T细胞具有强大的调控活性。
尽管通过记忆性细胞不发生GVHD，初始和记忆性CD8+T细胞都具有促进完全嵌合建立和肿瘤根除的能力。初始细胞诱发GVHD的能力高于记忆性细胞与其在淋巴组织、肝脏和肠内的快速累积和扩增有关，如通过生物体发光成像和CFSE染色所判断的。初始T细胞的IL-2分泌增加可促进早期增殖增加，而CCR9和α4β7整合素肠道归巢受体(gut homingreceptor)的表达增加可促进将更多的初始T细胞早期运输至肠道。
记忆性CD8+T细胞根除肿瘤细胞的能力很可能取决于其同种异体反应性，因为耐受(tolerize)BALB/c同种抗原的C57BL/6CD8+T细胞损失了其对BCL1淋巴瘤的移植物抗-肿瘤活性。可通过其与环境中病毒抗原的交叉反应性来解释记忆性CD8+T细胞的同种异体反应性，其已经被示出能够在器官移植物上增强对同种抗原的免疫应答。另外，初始CD8+T细胞能够在稳态增殖后伪装成记忆性表型细胞，并保持初始T细胞TCR谱系(TCRrepertoire)。
目前的研究还探索了CD8+CD44hi记忆性T细胞和未分离的总T细胞作为在第0 天被给予TCD BM细胞和肿瘤细胞的受体的移植后输注治疗。在第16天进行该输注，在该时间点通过生物体发光成像观察到的在淋巴组织中的肿瘤增大明显。当使用未分离的总T细胞进行输注时，在所有的受体中观察到急性致命性GVHD。相对而言，纯化的 CD8+记忆性T细胞使得受体能够100％存活，并且存活者在至少100天保持无肿瘤。接受TCD骨髓而未进行输注的对照全部发生肿瘤生长。总之，当加入到TCD BM移植物中时，含有中枢和效应记忆性亚群的CD8+记忆性T细胞能够分离GVHD和抗淋巴瘤活性。

Claims (13)

1.对于加强杀死残余肿瘤细胞有效的、有效量的至少1×106并且80％纯的、未接触抗原的人类供体来源的中枢和效应记忆性CD8+T细胞在制备用于在针对癌症进行治疗的人类个体中增强异源造血细胞移植的药物中的应用，其中在所述异源造血细胞移植后从2个月至6个月向宿主人类给予所述有效量的人类供体来源的记忆性CD8+T细胞，所述人类供体来源的中枢和效应记忆性T细胞是CD8+CD45RA-和/或CD8+CD45RO+。
2.权利要求1所述的应用，其中，所述记忆性T细胞的剂量在不存在移植物抗宿主病的情况下增强完全嵌合。
3.权利要求1所述的应用，其中，所述癌症是淋巴瘤。
4.权利要求1所述的应用，其中，所述癌症是白血病。
5.权利要求1所述的应用，其中，所述供体来源人类记忆性CD8+T细胞收集自所述异源造血细胞移植的供体。
6.权利要求1所述的应用，其中，所述供体来源人类记忆性CD8+T细胞被直接使用。
7.权利要求1所述的应用，其中，所述癌症是恶性血液病。
8.权利要求1所述的应用，其中，所述供体来源的人类记忆性CD8+T细胞被获得并且直接使用、冷冻或在适合的培养基中离体保存。
9.权利要求1所述的应用，其中给予所述人类个体的剂量是至少1×107并且80％纯的、未接触抗原的供体来源的CD8+CD45RA-和/或CD8+CD45RO+T细胞。
10.权利要求1所述的应用，给予所述人类个体的剂量是至少1×108并且80％纯的、未接触抗原的供体来源的CD8+CD45RA-和/或CD8+CD45RO+T细胞。
11.权利要求1所述的应用，其中所述人类个体是儿童患者。
12.权利要求1所述的应用，其中所述人类个体是成人患者。
13.权利要求1所述的应用，其中所述人类个体处于缓解期。
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