JP2656988B2 - 細胞捕獲及び回収のための装置及び方法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、細胞表面タンパク質に対する特異性を有す
る装置を用いての細胞分離に関する。特に、その細胞源
は、血液、脊髄液、骨髄、腫瘍ホモジネート、リンパ様
組織及び同様のものであろう。
る装置を用いての細胞分離に関する。特に、その細胞源
は、血液、脊髄液、骨髄、腫瘍ホモジネート、リンパ様
組織及び同様のものであろう。
細胞混合物から細胞の特定の種類を分離し、又は特定
の組の細胞を除くことに興味がある多くの情況が存在す
る。これまで使用されて来た技法は、螢光細胞選別、磁
気免疫ビーズ、補体介在溶解、アフィニティクロマトグ
ラフィー、遠心溶離及び細胞のポリスチレンパンニング
を包含する。実質的な密度の差異を有する細胞、たとえ
ば血小板と赤血球細胞とは、傾斜遠心分離方法により総
合的に分別され得る。しかしながら、同じ密度を有する
哺乳類細胞、たとえば腫瘍細胞、リンパ球サブセット、
顆粒球又は幹細胞は、それらの表現型と相互関係する表
面マーカーの分子認識を用いての分離形を必要とする。
同様に、分子機構は、複雑な混合物においてお互いから
ウィルス及び細菌を分離するのに必要とされる。それぞ
れの前記方法は、多くの用途(細胞の特定のサブセット
の単離又は除去に興味がある)のために重大な欠点を有
し、選別された生存細胞の回収のための螢光活性化細胞
選別の欠点は、その工程の遅さ、単離された細胞が抗体
により被覆される事実、及びその方法により得られる細
胞の制限された量である。
の組の細胞を除くことに興味がある多くの情況が存在す
る。これまで使用されて来た技法は、螢光細胞選別、磁
気免疫ビーズ、補体介在溶解、アフィニティクロマトグ
ラフィー、遠心溶離及び細胞のポリスチレンパンニング
を包含する。実質的な密度の差異を有する細胞、たとえ
ば血小板と赤血球細胞とは、傾斜遠心分離方法により総
合的に分別され得る。しかしながら、同じ密度を有する
哺乳類細胞、たとえば腫瘍細胞、リンパ球サブセット、
顆粒球又は幹細胞は、それらの表現型と相互関係する表
面マーカーの分子認識を用いての分離形を必要とする。
同様に、分子機構は、複雑な混合物においてお互いから
ウィルス及び細菌を分離するのに必要とされる。それぞ
れの前記方法は、多くの用途(細胞の特定のサブセット
の単離又は除去に興味がある)のために重大な欠点を有
し、選別された生存細胞の回収のための螢光活性化細胞
選別の欠点は、その工程の遅さ、単離された細胞が抗体
により被覆される事実、及びその方法により得られる細
胞の制限された量である。
免疫ビーズに関しては、分離の後、ビーズから細胞を
回収することが難かしく;細胞は時々、抗体及び磁気ビ
ーズにより被覆され、そして明確な分離を達成するのは
難かしい。補体介在溶解は、2つの理由のために問題が
ある:第1に、標的細胞の消耗が不完全であり、そして
第2に、非標的細胞が、補体及び標的細胞溶解の毒性副
生成物への暴露により悪影響を受ける。たとえば抗体に
結合されたSephadex G−10を用いての細胞のアフィニテ
ィクロマトグラフィーは、標的細胞の良好でない回収及
び不十分な消耗を有する。遠心溶離は、細胞の異なった
表現型サブ集団及び異なった大きさの細胞を分離するこ
とができない。
回収することが難かしく;細胞は時々、抗体及び磁気ビ
ーズにより被覆され、そして明確な分離を達成するのは
難かしい。補体介在溶解は、2つの理由のために問題が
ある:第1に、標的細胞の消耗が不完全であり、そして
第2に、非標的細胞が、補体及び標的細胞溶解の毒性副
生成物への暴露により悪影響を受ける。たとえば抗体に
結合されたSephadex G−10を用いての細胞のアフィニテ
ィクロマトグラフィーは、標的細胞の良好でない回収及
び不十分な消耗を有する。遠心溶離は、細胞の異なった
表現型サブ集団及び異なった大きさの細胞を分離するこ
とができない。
ポリスチレン上に受動的に吸着された抗体を利用す
る、Wysocki及びSato,PNAS,75:2844(1978)により開
発された最後の方法、すなわちパンニングは、特に不適
切である。低い回収率が達成され、そしてその方法は、
特異性の欠除及び分離された細胞の抗体による汚染を有
する。
る、Wysocki及びSato,PNAS,75:2844(1978)により開
発された最後の方法、すなわちパンニングは、特に不適
切である。低い回収率が達成され、そしてその方法は、
特異性の欠除及び分離された細胞の抗体による汚染を有
する。
免疫防御システムが解明されるにつれて、細胞のサブ
セットは、比較的狭い範囲の活性を有することがますま
す明らかになって来た。従って、サブセットは、特定の
疾病、たとえば新形成、感染、ウィルスは細胞、等への
応答のために、移植への応答のために及び同様のために
特殊化され得る。従って、それらの作用を理解するため
だけではなく、また予防及び治療目的のためにこれらの
細胞を使用するために、これらの細胞のサブセットを同
定し、そして精製することができることがひじょうに興
味深い。所望する結果を得るためには、所望する細胞の
サブセットの実質的に純粋な集団を得ることが必要であ
る。さらに、それらの細胞は、(1)それらの表面上に
抗体を有さず、(2)生存しており、(3)それらの正
常な機能を行なうことができ、そして(4)それらの通
常の環境下で正常な細胞と同じ態様で生物物質による活
性化に対して敏感であるべきである。
セットは、比較的狭い範囲の活性を有することがますま
す明らかになって来た。従って、サブセットは、特定の
疾病、たとえば新形成、感染、ウィルスは細胞、等への
応答のために、移植への応答のために及び同様のために
特殊化され得る。従って、それらの作用を理解するため
だけではなく、また予防及び治療目的のためにこれらの
細胞を使用するために、これらの細胞のサブセットを同
定し、そして精製することができることがひじょうに興
味深い。所望する結果を得るためには、所望する細胞の
サブセットの実質的に純粋な集団を得ることが必要であ
る。さらに、それらの細胞は、(1)それらの表面上に
抗体を有さず、(2)生存しており、(3)それらの正
常な機能を行なうことができ、そして(4)それらの通
常の環境下で正常な細胞と同じ態様で生物物質による活
性化に対して敏感であるべきである。
複製できる生物学的粒子、特にウィルス粒子及び細胞
の選択的捕獲及び開放のための方法、組成物及び装置が
提供される。その粒子を含む培地が、高い密度の特異的
受容体部位を有する固体支持体と接触せしめられ、それ
によって、その相補的リガンドを有する粒子が、その表
面に結合するようになる。生物学的物質が、リガンド放
出及び開放をもたらす生物学的活性化又は物理的手段、
たとえばピペット処理、機械的振動又は超音波処理のい
づれかにより受容体から開放され得る。細胞は数的に拡
張され、分化及び/又は活性化又は同様のもののために
生物学的物質又は他の因子にゆだねられ、そして研究、
診断、予防及び/又は治療目的のために使用され得る。
の選択的捕獲及び開放のための方法、組成物及び装置が
提供される。その粒子を含む培地が、高い密度の特異的
受容体部位を有する固体支持体と接触せしめられ、それ
によって、その相補的リガンドを有する粒子が、その表
面に結合するようになる。生物学的物質が、リガンド放
出及び開放をもたらす生物学的活性化又は物理的手段、
たとえばピペット処理、機械的振動又は超音波処理のい
づれかにより受容体から開放され得る。細胞は数的に拡
張され、分化及び/又は活性化又は同様のもののために
生物学的物質又は他の因子にゆだねられ、そして研究、
診断、予防及び/又は治療目的のために使用され得る。
生物学的に複製できる粒子、特に細胞の特別な集団
を、粒子の混合物から、1又は複数の特異的受容体の媒
介体を通して固体支持体に前記集団を結合せしめること
によって単離するための方法、組成物及び装置が提供さ
れる。場合によっては、次に、粒子は、集団サイズ及び
/又は捕獲された粒子の特徴に影響を及ぼすために種々
の方法で処理され得る。次に細胞は、受容体を実質的に
有さない支持体から開放され得る。
を、粒子の混合物から、1又は複数の特異的受容体の媒
介体を通して固体支持体に前記集団を結合せしめること
によって単離するための方法、組成物及び装置が提供さ
れる。場合によっては、次に、粒子は、集団サイズ及び
/又は捕獲された粒子の特徴に影響を及ぼすために種々
の方法で処理され得る。次に細胞は、受容体を実質的に
有さない支持体から開放され得る。
集収装置において支持体に結合される受容体と粒子の
源とを接触せしめる方法が関与し、ここで表面上の受容
体の集団が、対象のリガンドのために高い結合密度を提
供する。接触のための条件は、粒子の受容体への特異的
な結合を可能にするために十分な時間及び低度の濁りで
ある。結合が十分な時間起った後、培地は除去され、そ
してその表面は、非特異的に結合される粒子を除去する
ために洗浄される。粒子は、高い結合活性を有するため
に、通常多くの部位で表面に結合されるので、洗浄は、
すべての非特異的結合粒子の実質的に完全な除去を確保
するために相当に激しく行なわれ得る。次に、粒子は、
広範囲の種類の条件又は処理、通常1又は複数の試薬と
の接触にゆだねられる。場合によっては、次に、その試
薬を含む培地が除去され、そして粒子が受容体から開放
される。開放は、マイトジェン剤及びリンホカインの組
合せ又は物理的手段、たとえばピペット処理、振動又は
音波処理のいづれかにより達成され得る。次に、粒子が
単離され、そしてそれらの意図する目的のために使用さ
れ得る。
源とを接触せしめる方法が関与し、ここで表面上の受容
体の集団が、対象のリガンドのために高い結合密度を提
供する。接触のための条件は、粒子の受容体への特異的
な結合を可能にするために十分な時間及び低度の濁りで
ある。結合が十分な時間起った後、培地は除去され、そ
してその表面は、非特異的に結合される粒子を除去する
ために洗浄される。粒子は、高い結合活性を有するため
に、通常多くの部位で表面に結合されるので、洗浄は、
すべての非特異的結合粒子の実質的に完全な除去を確保
するために相当に激しく行なわれ得る。次に、粒子は、
広範囲の種類の条件又は処理、通常1又は複数の試薬と
の接触にゆだねられる。場合によっては、次に、その試
薬を含む培地が除去され、そして粒子が受容体から開放
される。開放は、マイトジェン剤及びリンホカインの組
合せ又は物理的手段、たとえばピペット処理、振動又は
音波処理のいづれかにより達成され得る。次に、粒子が
単離され、そしてそれらの意図する目的のために使用さ
れ得る。
大部分、細胞の混合物が使用され、そして従って、残
る論議は細胞に向けられるであろう。しかしながら、同
じ方法がウィルス及び細菌粒子の単離のために実質的に
使用され得、そして細胞に関しては、ウィルス及び細菌
は通常、それらのために交換され得ることが理解される
べきである。
る論議は細胞に向けられるであろう。しかしながら、同
じ方法がウィルス及び細菌粒子の単離のために実質的に
使用され得、そして細胞に関しては、ウィルス及び細菌
は通常、それらのために交換され得ることが理解される
べきである。
本発明の装置は、多くの異なった情況で適用される。
第1は、生理学的流体から所望としない細胞を捕獲し、
そして除去することを所望する情況であり、それによっ
て、医療、診断用途又は研究用途のために所望しない細
胞の流体を消費しつくす。これは、移植片対宿主疾患を
減じるために、一定のT−リンパ球の骨髄を消費しつく
すことによって示される。所望しない細胞を消費しつく
された骨髄は、骨髄受容体中への移植のためにすぐに調
製される。
第1は、生理学的流体から所望としない細胞を捕獲し、
そして除去することを所望する情況であり、それによっ
て、医療、診断用途又は研究用途のために所望しない細
胞の流体を消費しつくす。これは、移植片対宿主疾患を
減じるために、一定のT−リンパ球の骨髄を消費しつく
すことによって示される。所望しない細胞を消費しつく
された骨髄は、骨髄受容体中への移植のためにすぐに調
製される。
第2の情況は、研究及び診断のために生理学的流体か
ら一定の細胞を捕獲し、そして回収することである。診
断適用は、捕獲及び続くその捕獲された、(1)血液又
は他の組織からの亜性細胞、(2)ウィルス又は細菌感
染の哺乳類細胞、(3)生理学的流体からのウィルス又
は細菌又は寄生体自体、(4)血液からの核型分析のた
めのヒト胎児細胞、(5)骨髄移植からの回復度の指数
としての血液からの移植細胞、及び(6)活性化の状態
を示す特定の表面マーカー、たとえばIL−2受容体の存
在による免疫コンピテント細胞の列挙及び説明を包含す
ることができる。研究のためには、(1)捕獲された細
胞の遺伝子分析又は変性、(2)特定の疾病過程により
活性化され又は抑制され得るある種の細胞の生理学の分
析及び変性及び(3)分子レベルで、特定の疾病の病原
に関与する細胞の表面膜組成分析及び変性に興味が存在
する。
ら一定の細胞を捕獲し、そして回収することである。診
断適用は、捕獲及び続くその捕獲された、(1)血液又
は他の組織からの亜性細胞、(2)ウィルス又は細菌感
染の哺乳類細胞、(3)生理学的流体からのウィルス又
は細菌又は寄生体自体、(4)血液からの核型分析のた
めのヒト胎児細胞、(5)骨髄移植からの回復度の指数
としての血液からの移植細胞、及び(6)活性化の状態
を示す特定の表面マーカー、たとえばIL−2受容体の存
在による免疫コンピテント細胞の列挙及び説明を包含す
ることができる。研究のためには、(1)捕獲された細
胞の遺伝子分析又は変性、(2)特定の疾病過程により
活性化され又は抑制され得るある種の細胞の生理学の分
析及び変性及び(3)分子レベルで、特定の疾病の病原
に関与する細胞の表面膜組成分析及び変性に興味が存在
する。
第3の情況は、変性(活性化)のために生理学的流体
から細胞の捕獲及び再生及び所望する治療効果のために
元の患者への返還に存在する。その方法は、細胞捕獲及
び回収、数の拡張及び/又は生物学的活性化をもたら
す、その捕獲された細胞又は消耗された細胞集団の処
理、及び続くこれらの細胞の再生及び使用を包含する。
から細胞の捕獲及び再生及び所望する治療効果のために
元の患者への返還に存在する。その方法は、細胞捕獲及
び回収、数の拡張及び/又は生物学的活性化をもたら
す、その捕獲された細胞又は消耗された細胞集団の処
理、及び続くこれらの細胞の再生及び使用を包含する。
第3の情況は、3種のレベルの用途にさらに分けられ
得る。第1レベルは、捕獲され/回収された細胞自体の
生物学的活性化である。活性化は、細胞の追加の分別な
しに行なわれる。たとえば、AIDS患者の場合、末梢血液
から捕獲されたCD8陽性細胞が、元の患者に戻すために
拡張され、そして活性化され得る。第2レベルは、選択
的活性化である。捕獲され、そして回収された細胞は、
捕獲された細胞のサブセットを得るためにさらに処理さ
れ又は分別され、たとえば抗原特異性により同定され、
そして次に活性化され、そして/又は拡張される。たと
えば、捕獲されたCD8陽性細胞のある抗原制限サブセッ
トは、所望するサブセットの拡張及び活性化を単に可能
にする、ある同時培養条件及びリンホカインの濃度によ
り選択され得る。第3レベルは、免疫機能の活性化又は
抑制のために抗原特異的患者のユニーク細胞のインビト
ロでの生成である。典型的なこの情況は、単球又はB−
細胞の捕獲及びその捕獲された単球又はB−細胞の、単
球又はB−細胞抗原摂取、プロセッシング、及び高めら
れた表面MHC発現と共にそれらの表示を高める条件下で
の患者特異的免疫複合体又は他の抗原への暴露である。
次に、抗原−感作単球又はB−細胞と相互作用せしめる
ために、同じ患者から捕獲されたエフェクターのサブセ
ット又は調節細胞が添加される。抗原特異的T−細胞活
性化の過程は、損われていない動物又はヒトのリンパ節
に生じる態様で、多く生じるであろう。本発明の方法に
より可能にされた細胞変性の追加の例は、ウィルス又は
他のベクター又は他の手段による外因性遺伝子のその捕
獲された細胞への導入及びその外因性遺伝子を発現する
細胞のサブ集団の第2装置における続く捕獲である。
得る。第1レベルは、捕獲され/回収された細胞自体の
生物学的活性化である。活性化は、細胞の追加の分別な
しに行なわれる。たとえば、AIDS患者の場合、末梢血液
から捕獲されたCD8陽性細胞が、元の患者に戻すために
拡張され、そして活性化され得る。第2レベルは、選択
的活性化である。捕獲され、そして回収された細胞は、
捕獲された細胞のサブセットを得るためにさらに処理さ
れ又は分別され、たとえば抗原特異性により同定され、
そして次に活性化され、そして/又は拡張される。たと
えば、捕獲されたCD8陽性細胞のある抗原制限サブセッ
トは、所望するサブセットの拡張及び活性化を単に可能
にする、ある同時培養条件及びリンホカインの濃度によ
り選択され得る。第3レベルは、免疫機能の活性化又は
抑制のために抗原特異的患者のユニーク細胞のインビト
ロでの生成である。典型的なこの情況は、単球又はB−
細胞の捕獲及びその捕獲された単球又はB−細胞の、単
球又はB−細胞抗原摂取、プロセッシング、及び高めら
れた表面MHC発現と共にそれらの表示を高める条件下で
の患者特異的免疫複合体又は他の抗原への暴露である。
次に、抗原−感作単球又はB−細胞と相互作用せしめる
ために、同じ患者から捕獲されたエフェクターのサブセ
ット又は調節細胞が添加される。抗原特異的T−細胞活
性化の過程は、損われていない動物又はヒトのリンパ節
に生じる態様で、多く生じるであろう。本発明の方法に
より可能にされた細胞変性の追加の例は、ウィルス又は
他のベクター又は他の手段による外因性遺伝子のその捕
獲された細胞への導入及びその外因性遺伝子を発現する
細胞のサブ集団の第2装置における続く捕獲である。
細胞源は、いづれか細胞の混合物であり得る。しかし
ながら、単一又は複数マーカー又は多くのマーカー又は
リガンドにより定義され得る予定された集団を有するこ
とが所望される。動物宿主からの対象の細胞源は、器
官、たとえば血液、脳、腎臓、脾臓、心臓、腸、骨髄、
脊髄液、リンパ様組織、又は同様のもの、又は上記器官
のいづれかからの腫瘍細胞を包含する。他の源は、動物
細胞と混合される寄生体、ウィルス又は細菌である。細
胞は、流動形、便利には分散液として使用される。細胞
が、血液中におけるように、一緒に保持されない場合、
血液は通常、白血球細胞の混合物を得るために除去され
る赤血球細胞、血小板及び血漿を有するであろう。細胞
が、膜性物質又は他の結合物質により一緒に保持される
場合、その細胞は、従来の技法に従って、機械的に又は
酵素的に分散させ得る。次に、個々の細胞が、本発明の
方法による分離のためにそれらの適切な栄養培地に分散
され得る。
ながら、単一又は複数マーカー又は多くのマーカー又は
リガンドにより定義され得る予定された集団を有するこ
とが所望される。動物宿主からの対象の細胞源は、器
官、たとえば血液、脳、腎臓、脾臓、心臓、腸、骨髄、
脊髄液、リンパ様組織、又は同様のもの、又は上記器官
のいづれかからの腫瘍細胞を包含する。他の源は、動物
細胞と混合される寄生体、ウィルス又は細菌である。細
胞は、流動形、便利には分散液として使用される。細胞
が、血液中におけるように、一緒に保持されない場合、
血液は通常、白血球細胞の混合物を得るために除去され
る赤血球細胞、血小板及び血漿を有するであろう。細胞
が、膜性物質又は他の結合物質により一緒に保持される
場合、その細胞は、従来の技法に従って、機械的に又は
酵素的に分散させ得る。次に、個々の細胞が、本発明の
方法による分離のためにそれらの適切な栄養培地に分散
され得る。
血液に関して、赤血球細胞は凝集により除去され、塩
化アンモニウムにより溶解され、レクチン又は既知の方
法による遠心分離により除去され得る。血小板及び赤血
球細胞はまた、Ficoll又はLeukoprepを用い、そしてバ
ッフィーコートを分離するグラジェント密度遠心分離に
より、遠心分離により又は同様の方法により除去され得
る。
化アンモニウムにより溶解され、レクチン又は既知の方
法による遠心分離により除去され得る。血小板及び赤血
球細胞はまた、Ficoll又はLeukoprepを用い、そしてバ
ッフィーコートを分離するグラジェント密度遠心分離に
より、遠心分離により又は同様の方法により除去され得
る。
種々の細胞源が、上記処理の他に、種々の処理にかけ
られ得る。いくつかの情況においては、細胞を、いづれ
か便利な手段により濃縮し、続いて適切な栄養培地に分
散することが所望される。ある情況においては、特定の
集団を拡張することが所望され、ここで細胞の1つのグ
ループを、細胞の他のグループに対して選択的に拡張す
ることができる。拡張のためには、種々のマイトジェン
剤、又はインターロイキン、増殖因子又は同様のものが
使用され得る。次に、これらの細胞は通常、それらが単
離され又は維持されて来た培地を実質的に除くためにい
づれか便利な手段により濃縮されるであろう。通常、こ
れらの細胞は、流動性分散物を提供するために、少なく
とも約10体積%〜約90体積%の使用されるべき分散体を
含んで成るであろう。装置中に導入される細胞の濃度
は、便利には、誘導体化されたポリスチレン表面の表面
積に基づかれ、そして投入細胞懸濁液中における標的細
胞の頻度に依存して広く異なるであろう。通常、その濃
度は、少なくとも1×103個の細胞/cm2〜1×1010個の
細胞/cm2、通常約1×105個の細胞/cm2〜1×107個の細
胞/cm2であろう。
られ得る。いくつかの情況においては、細胞を、いづれ
か便利な手段により濃縮し、続いて適切な栄養培地に分
散することが所望される。ある情況においては、特定の
集団を拡張することが所望され、ここで細胞の1つのグ
ループを、細胞の他のグループに対して選択的に拡張す
ることができる。拡張のためには、種々のマイトジェン
剤、又はインターロイキン、増殖因子又は同様のものが
使用され得る。次に、これらの細胞は通常、それらが単
離され又は維持されて来た培地を実質的に除くためにい
づれか便利な手段により濃縮されるであろう。通常、こ
れらの細胞は、流動性分散物を提供するために、少なく
とも約10体積%〜約90体積%の使用されるべき分散体を
含んで成るであろう。装置中に導入される細胞の濃度
は、便利には、誘導体化されたポリスチレン表面の表面
積に基づかれ、そして投入細胞懸濁液中における標的細
胞の頻度に依存して広く異なるであろう。通常、その濃
度は、少なくとも1×103個の細胞/cm2〜1×1010個の
細胞/cm2、通常約1×105個の細胞/cm2〜1×107個の細
胞/cm2であろう。
分離装置は、広範囲の種類の形をとることができる。
大部分、装置は、ひじょうに滑らかな表面を有するよう
に、好ましくは成形又は押出されたポリスチレン表面か
ら成り、ここで前記ポリスチレンは、約0.5%以下、通
常約0.1%以下の架橋、好ましくは実質的に架橋を有さ
ない。この性質のポリスチレン表面は、誘導体化の実質
的な均等性を可能にし、ここで受容体の配向は、結合部
位の高いレベルの接近性を提供する。受容体に関して、
その用語はまったく任意であることが理解されるべきで
ある。受容体は、相補的分子に特異的に結合することが
できる分子に向けられる。従って、本発明の目的のため
には、受容体は、ヘプテン及び抗原の両者を含むリガン
ド、又は他の分子に特異的に結合する表面膜タンパク
質、たとえば免疫グロブリン、T−細胞受容体、インシ
ュリン受容体、等、又は細胞内に見出される分子、たと
えばステロイド結合タンパク質、又は体液中に見出され
る分子、たとえばチロキシン結合グロブリン、リポタン
パク質、等である。従って、表面結合“受容体”に特異
的に結合する膜タンパク質は、“リガンド”として任意
に言及される。便利には、それらは、特異的結合対の相
補的膜として言及されるであろう。
大部分、装置は、ひじょうに滑らかな表面を有するよう
に、好ましくは成形又は押出されたポリスチレン表面か
ら成り、ここで前記ポリスチレンは、約0.5%以下、通
常約0.1%以下の架橋、好ましくは実質的に架橋を有さ
ない。この性質のポリスチレン表面は、誘導体化の実質
的な均等性を可能にし、ここで受容体の配向は、結合部
位の高いレベルの接近性を提供する。受容体に関して、
その用語はまったく任意であることが理解されるべきで
ある。受容体は、相補的分子に特異的に結合することが
できる分子に向けられる。従って、本発明の目的のため
には、受容体は、ヘプテン及び抗原の両者を含むリガン
ド、又は他の分子に特異的に結合する表面膜タンパク
質、たとえば免疫グロブリン、T−細胞受容体、インシ
ュリン受容体、等、又は細胞内に見出される分子、たと
えばステロイド結合タンパク質、又は体液中に見出され
る分子、たとえばチロキシン結合グロブリン、リポタン
パク質、等である。従って、表面結合“受容体”に特異
的に結合する膜タンパク質は、“リガンド”として任意
に言及される。便利には、それらは、特異的結合対の相
補的膜として言及されるであろう。
官能化されたポリスチレン表面は、壁、仕切り、シー
ト、中空ファイバー、ビーズ、粒子又は同様のものの表
面であり得る。大部分、いくつかの情況においては、他
の表面が適用されるけれども、平らな表面を使用するこ
とが所望されるであろう。装置は、ボトル、標準のT型
フラスコ、シート、等、容器中に多くの分離されたシー
ト、円柱状又は曲線状シートを有するバック又はボック
ス、長方形のボックス又は同様のものの形を取ることが
できる。装置の選択は、便利さ、分離の目的、他の装置
との相互作用、対象の細胞集団、予定された装置、対照
の集団が陽性又は陰性の選択の結果として存在するかい
づれか、又は同様のものに依存するであろう。
ト、中空ファイバー、ビーズ、粒子又は同様のものの表
面であり得る。大部分、いくつかの情況においては、他
の表面が適用されるけれども、平らな表面を使用するこ
とが所望されるであろう。装置は、ボトル、標準のT型
フラスコ、シート、等、容器中に多くの分離されたシー
ト、円柱状又は曲線状シートを有するバック又はボック
ス、長方形のボックス又は同様のものの形を取ることが
できる。装置の選択は、便利さ、分離の目的、他の装置
との相互作用、対象の細胞集団、予定された装置、対照
の集団が陽性又は陰性の選択の結果として存在するかい
づれか、又は同様のものに依存するであろう。
その表面は、求電子性試薬によるポリスチレンのベン
ゼン環の置換により、特にポリスチレンを軟化又は溶解
しない溶媒中におけるFriedel−Craft反応により誘導体
化されるであろう。この目的のためには、スルホランが
特に適用される。比較的温和な状態が用いられ、そして
ベンゼンは種々の物質、たとえばニトロ(アミノに還元
され得る)、ハロメチル(アミノを形成するために使用
され得る)、ヒドロキシル又はチオール基、又は置換さ
れたN−ヒドロキシメチルアセトアミド(該置換基は活
性ハロゲン又は偽ハロゲンである)により誘導体化され
得る。反応の説明は、EPA 88−304516・3に見出され得
る。
ゼン環の置換により、特にポリスチレンを軟化又は溶解
しない溶媒中におけるFriedel−Craft反応により誘導体
化されるであろう。この目的のためには、スルホランが
特に適用される。比較的温和な状態が用いられ、そして
ベンゼンは種々の物質、たとえばニトロ(アミノに還元
され得る)、ハロメチル(アミノを形成するために使用
され得る)、ヒドロキシル又はチオール基、又は置換さ
れたN−ヒドロキシメチルアセトアミド(該置換基は活
性ハロゲン又は偽ハロゲンである)により誘導体化され
得る。反応の説明は、EPA 88−304516・3に見出され得
る。
次に、誘導体化されたポリスチレン表面は、受容体と
反応せしめられる。誘導体化の条件下で、高い割合のベ
ンゼンが表面で誘導体化され、その結果、その表面で高
密度の受容体を得ることができることが見出される。
反応せしめられる。誘導体化の条件下で、高い割合のベ
ンゼンが表面で誘導体化され、その結果、その表面で高
密度の受容体を得ることができることが見出される。
受容体の性質に依存して、種々の反応が、表面に受容
体を結合するために行なわれる。表面へのタンパク質の
結合が特に興味の対象である。タンパク質は、完全な反
応のために十分な時間、温和な条件下で、活性イロゲ
ン、活性化されたカルボキシ基、たとえばエステル、又
は同様のものを有する官能化された表面と水性培地中の
タンパク質とを接触せしめることによって結合され得
る。残存する未反応官能基は、適切な小さな分子阻止剤
を用いることによって阻止され得る。たとえば、活性ハ
ロゲンは、脂肪族アミンにより、チオールはメレイミド
により、又は同様のように阻止される。ある情況におい
ては、過剰の反応性基を阻止する必要はない。なぜなら
ば、それらは工程における続の段階を妨げないあろうか
らである。次に、表面は、非特異的に結合された受容体
を除くために洗浄され、そして適切な受容体結合が生じ
たことを確認するために評価される。
体を結合するために行なわれる。表面へのタンパク質の
結合が特に興味の対象である。タンパク質は、完全な反
応のために十分な時間、温和な条件下で、活性イロゲ
ン、活性化されたカルボキシ基、たとえばエステル、又
は同様のものを有する官能化された表面と水性培地中の
タンパク質とを接触せしめることによって結合され得
る。残存する未反応官能基は、適切な小さな分子阻止剤
を用いることによって阻止され得る。たとえば、活性ハ
ロゲンは、脂肪族アミンにより、チオールはメレイミド
により、又は同様のように阻止される。ある情況におい
ては、過剰の反応性基を阻止する必要はない。なぜなら
ば、それらは工程における続の段階を妨げないあろうか
らである。次に、表面は、非特異的に結合された受容体
を除くために洗浄され、そして適切な受容体結合が生じ
たことを確認するために評価される。
収集装置の性質に依存して、細胞を含む培地との接触
は変更されるであろう。たとえば、ローラーボトルに関
しては、ローラーボトル中に培地を導入し、そして次
に、細胞が結合するようになる十分な時間にわたってそ
のボトルをゆっくりと回転せしめる。T−フラスコ又は
プレート−イン−バック/ボックス(plate−in−a−b
ag/box)形態に関しては、装置を同じ高さの表面上に置
き又は振盪用プラットフォーム上でわずかに攪拌され、
続いてその装置をひっくり返し、そしてこの工程を他方
でもくり返す。同様の技法が、他のタイプ容器によって
も使用され得る。さらに、装置は、接触表面に標的細胞
を押しつけるために遠心分離され得る。
は変更されるであろう。たとえば、ローラーボトルに関
しては、ローラーボトル中に培地を導入し、そして次
に、細胞が結合するようになる十分な時間にわたってそ
のボトルをゆっくりと回転せしめる。T−フラスコ又は
プレート−イン−バック/ボックス(plate−in−a−b
ag/box)形態に関しては、装置を同じ高さの表面上に置
き又は振盪用プラットフォーム上でわずかに攪拌され、
続いてその装置をひっくり返し、そしてこの工程を他方
でもくり返す。同様の技法が、他のタイプ容器によって
も使用され得る。さらに、装置は、接触表面に標的細胞
を押しつけるために遠心分離され得る。
収集バック/ボックスとして言及される装置が、特に
興味の対象である。そのバック/ボックスは、1つのシ
ート上に他のシートを重ねられ又は積層され、そしてシ
ートの間の流れを可能にするためにお互いに分離されて
いる、ポリスチレンシートを含む硬い又は柔軟な壁の容
器であろう。濃縮、たとえばグラジェント密度遠心分離
又は遠心分離の結果としての充填された細胞は、水平位
置で維持されているバック/ボックス中への流れを可能
にされる。細胞分散液は、バック/ボックス中における
受容体被覆されたポリスチレン表面の実質的にすべてと
接触するように、バック/ボックスじゅうに広げられる
であろう。細胞が結合する十分な時間の後、そのバック
/ボックスは、表面の有効な利用を提供するために、ま
だ分散され又は解放されている細胞(フィルム表面の下
に存在する)のフィルム表面への沈降を可能にするため
に引っくり返され得る。他方、そのバック/ボックス
は、接触表面に細胞を押しつけるために、個々の側で1
度、遠心分離され得る。
興味の対象である。そのバック/ボックスは、1つのシ
ート上に他のシートを重ねられ又は積層され、そしてシ
ートの間の流れを可能にするためにお互いに分離されて
いる、ポリスチレンシートを含む硬い又は柔軟な壁の容
器であろう。濃縮、たとえばグラジェント密度遠心分離
又は遠心分離の結果としての充填された細胞は、水平位
置で維持されているバック/ボックス中への流れを可能
にされる。細胞分散液は、バック/ボックス中における
受容体被覆されたポリスチレン表面の実質的にすべてと
接触するように、バック/ボックスじゅうに広げられる
であろう。細胞が結合する十分な時間の後、そのバック
/ボックスは、表面の有効な利用を提供するために、ま
だ分散され又は解放されている細胞(フィルム表面の下
に存在する)のフィルム表面への沈降を可能にするため
に引っくり返され得る。他方、そのバック/ボックス
は、接触表面に細胞を押しつけるために、個々の側で1
度、遠心分離され得る。
接触時間は、細胞表面上のリガンドの濃度、受容体の
結合親和性、培地中の細胞の濃度、収集装置の性質及び
同様のものに依存して、広く異なるであろう。通常、接
触時間は、少なくとも約5分〜約120分、普通約15〜60
分であろう。
結合親和性、培地中の細胞の濃度、収集装置の性質及び
同様のものに依存して、広く異なるであろう。通常、接
触時間は、少なくとも約5分〜約120分、普通約15〜60
分であろう。
細胞分散液は、いづれか便利な手段により収集装置を
通して移動され得る。圧力差異が、ポンプ輸送の手段に
より収集装置を通して達成され得る。他方、重力的流れ
が、適切な流速を付与することができる。細胞の生存性
に有意に影響を与えないで表面への結合を可能にする細
胞の流速をもたらすいずれか便利な技法が、使用され得
る。
通して移動され得る。圧力差異が、ポンプ輸送の手段に
より収集装置を通して達成され得る。他方、重力的流れ
が、適切な流速を付与することができる。細胞の生存性
に有意に影響を与えないで表面への結合を可能にする細
胞の流速をもたらすいずれか便利な技法が、使用され得
る。
本発明の装置は、収集装置の性質に悪影響を与えない
で、γ放射線又は電子ビーム放射線を用いて殺菌され得
る。すなわち、受容体の活性が保持され、同時に、表面
へのその結合の共有性質が保持されている。従って、そ
の収集装置が使用される場合、表面に結合される受容体
は実質的にほとんど失われない。
で、γ放射線又は電子ビーム放射線を用いて殺菌され得
る。すなわち、受容体の活性が保持され、同時に、表面
へのその結合の共有性質が保持されている。従って、そ
の収集装置が使用される場合、表面に結合される受容体
は実質的にほとんど失われない。
細胞が表面に結合されるようになった後、すぐに、そ
の収集装置は、広範囲の種類の処理にゆだねられ得る。
激しい洗浄が非付着性細胞を除くために使用される。な
ぜならば、付着性細胞は、多くの接触で表面に堅く結合
されるからである。洗浄媒体は、ポンプで出し入れされ
得、装置を通して流れるリガンドを使用することもで
き、又は比較的激しい攪拌の他の手段を使用することも
できる。洗浄溶液は、脱イオン水、食塩水、リ酸緩衝溶
液、栄養媒体又は同様のものであり得る。使用される特
定の洗浄溶液は、通常、細胞がいかにして使用されるか
に依存するであろう。
の収集装置は、広範囲の種類の処理にゆだねられ得る。
激しい洗浄が非付着性細胞を除くために使用される。な
ぜならば、付着性細胞は、多くの接触で表面に堅く結合
されるからである。洗浄媒体は、ポンプで出し入れされ
得、装置を通して流れるリガンドを使用することもで
き、又は比較的激しい攪拌の他の手段を使用することも
できる。洗浄溶液は、脱イオン水、食塩水、リ酸緩衝溶
液、栄養媒体又は同様のものであり得る。使用される特
定の洗浄溶液は、通常、細胞がいかにして使用されるか
に依存するであろう。
細胞分離が、細胞集団からの細胞の除去に関与する場
合(細胞消耗)、捕獲された細胞は捨てられ、そしてそ
の消耗された細胞集団が収穫され、いづれか追加の処理
にゆだねられ、そして次にその意図される目的のために
使用される。
合(細胞消耗)、捕獲された細胞は捨てられ、そしてそ
の消耗された細胞集団が収穫され、いづれか追加の処理
にゆだねられ、そして次にその意図される目的のために
使用される。
大部分、本発明は、続いての使用のために単離された
細胞のために特に適用される。意図される使用及び細胞
の性質に依存して、細胞は広範囲の種類の処理にゆだね
られ得る。特に、リンパ求又は骨髄系統に関与される場
合、それらの細胞は、特定の細胞のセット又はサブセッ
トの活性を拡張又は変性するために処理され得る。従っ
て、細胞の増殖、細胞の活性化、1又は複数の表面膜タ
ンパク質の増強又は減少及び同様のものをもたらす種々
の因子が添加され得る。処理の間、結合されるすべての
細胞を有することを所望するか、または有利細胞の形成
を所望するかのいづれかに依存して、容器中における結
合された細胞に対する受容体の適切な割合が付与され得
る。初めに結合された細胞に比べて多数の受容体を有す
ることによって、いづれかの前駆体がまだ結合されるよ
うになり、そして表面上に保持されるようになるであろ
う。これは、追加の解決法として作用することができ
る。なぜならば、これまで存在し、そして拡張されて来
た他の細胞が結合されなくなり、そして収集容器から除
去され得るからである。
細胞のために特に適用される。意図される使用及び細胞
の性質に依存して、細胞は広範囲の種類の処理にゆだね
られ得る。特に、リンパ求又は骨髄系統に関与される場
合、それらの細胞は、特定の細胞のセット又はサブセッ
トの活性を拡張又は変性するために処理され得る。従っ
て、細胞の増殖、細胞の活性化、1又は複数の表面膜タ
ンパク質の増強又は減少及び同様のものをもたらす種々
の因子が添加され得る。処理の間、結合されるすべての
細胞を有することを所望するか、または有利細胞の形成
を所望するかのいづれかに依存して、容器中における結
合された細胞に対する受容体の適切な割合が付与され得
る。初めに結合された細胞に比べて多数の受容体を有す
ることによって、いづれかの前駆体がまだ結合されるよ
うになり、そして表面上に保持されるようになるであろ
う。これは、追加の解決法として作用することができ
る。なぜならば、これまで存在し、そして拡張されて来
た他の細胞が結合されなくなり、そして収集容器から除
去され得るからである。
大部分、対象の細胞は、血液、骨髄、固形腫瘍及びリ
ンパ様組織から得られるであろう。これらの細胞は、リ
ンパ系統及び骨髄系統に分けられ得る。考慮されるべき
第1の系統は、リンパ系統であろう。この系統は、さら
にB−細胞及びT−細胞のカテゴリーに分けられ得る。
B−細胞は、表面マーカーとしてsIgを有し、そして免
疫グロブリン座で転位された生殖系DNAを有することに
よって同定される。T−細胞は、大部分、表面マーカー
としてCD2及び/又はCD5を有し、そしてT−細胞受容体
座で転位された生殖系DNAを有する。多能性幹細胞は別
に論議されるであろうけれども、B−及びT−細胞はま
た特定の前駆体細胞を含み、そしてB−細胞の場合、血
漿細胞もまた含まれる。
ンパ様組織から得られるであろう。これらの細胞は、リ
ンパ系統及び骨髄系統に分けられ得る。考慮されるべき
第1の系統は、リンパ系統であろう。この系統は、さら
にB−細胞及びT−細胞のカテゴリーに分けられ得る。
B−細胞は、表面マーカーとしてsIgを有し、そして免
疫グロブリン座で転位された生殖系DNAを有することに
よって同定される。T−細胞は、大部分、表面マーカー
としてCD2及び/又はCD5を有し、そしてT−細胞受容体
座で転位された生殖系DNAを有する。多能性幹細胞は別
に論議されるであろうけれども、B−及びT−細胞はま
た特定の前駆体細胞を含み、そしてB−細胞の場合、血
漿細胞もまた含まれる。
マーカーにより単離され得る他の特殊化されたリンパ
様細胞は、次のものを包含する。:リンホカイン活性化
キラー(LAK)細胞、天然のキラー(NK)細胞、腫瘍浸
潤性リンパ球(TIL)、抗体依存性細胞毒性細胞(ADC
C)、細胞毒性Tリンパ球(CTL)、等。
様細胞は、次のものを包含する。:リンホカイン活性化
キラー(LAK)細胞、天然のキラー(NK)細胞、腫瘍浸
潤性リンパ球(TIL)、抗体依存性細胞毒性細胞(ADC
C)、細胞毒性Tリンパ球(CTL)、等。
骨髄系統においては、単球、マクロファージ、好酸
球、好塩基球、多形核白血球、樹枝状細胞、等を単離す
ることに興味がある。
球、好塩基球、多形核白血球、樹枝状細胞、等を単離す
ることに興味がある。
B−細胞は、インターロイキン1〜7又は他のもの、
特にIL−1,−2,−3又は同様のものによる処理により拡
張され得る。B−細胞は、表面結合抗原、表面マーカー
(たとえばCD20)又は可溶性抗原への特異的結合により
選択され得、ここでそのような抗原が細胞に添加される
場合、抗原を認識する表面免疫グロブリンを有するそれ
らの細胞が、エンドサイトースされ、そして処理される
複合体を形成するために抗原を結合するであろう。次
に、細胞のMHC抗原を有する抗原のフラグメントが表さ
れるであろう。B−細胞により制限される媒体にT−細
胞を添加することによって、その抗原フラグメントを認
識するT−細胞がリンホカインを分泌し、そしてB−細
胞の増殖をもたらすであろう。固体表面上に過剰の受容
体を付与することによって又は第2収集装置において細
胞集団を分離するB−細胞の開放の後、対象の抗原を認
識するB−細胞及び血漿細胞の数を実質的に増大するこ
とができる。
特にIL−1,−2,−3又は同様のものによる処理により拡
張され得る。B−細胞は、表面結合抗原、表面マーカー
(たとえばCD20)又は可溶性抗原への特異的結合により
選択され得、ここでそのような抗原が細胞に添加される
場合、抗原を認識する表面免疫グロブリンを有するそれ
らの細胞が、エンドサイトースされ、そして処理される
複合体を形成するために抗原を結合するであろう。次
に、細胞のMHC抗原を有する抗原のフラグメントが表さ
れるであろう。B−細胞により制限される媒体にT−細
胞を添加することによって、その抗原フラグメントを認
識するT−細胞がリンホカインを分泌し、そしてB−細
胞の増殖をもたらすであろう。固体表面上に過剰の受容
体を付与することによって又は第2収集装置において細
胞集団を分離するB−細胞の開放の後、対象の抗原を認
識するB−細胞及び血漿細胞の数を実質的に増大するこ
とができる。
他方、B−細胞融合パートナー(ハイブリドーマ細
胞)又はいづれかの源からの他のB−細胞は、共有結合
される抗原を担持するポリスチレン表面に結合すること
によって選択され得る。ポリスチレンに結合される抗原
と反応性の所望するハイブリドーマ又はsIgを担持する
他のB−細胞は、ポリスチレン表面上に捕獲され、特定
のハイブリドーマ又は他のB−細胞の抗原特異的選択を
可能にする。次に、捕獲された細胞は、本発明の方法に
従って回収され、そして拡張され得る。他方、特定の表
面受容体を含むT−細胞又はいづれかの細胞は、前記ポ
リスチレン表面が前記共有結合される抗原を含む場合、
そのポリスチレン表面により捕獲され得る。
胞)又はいづれかの源からの他のB−細胞は、共有結合
される抗原を担持するポリスチレン表面に結合すること
によって選択され得る。ポリスチレンに結合される抗原
と反応性の所望するハイブリドーマ又はsIgを担持する
他のB−細胞は、ポリスチレン表面上に捕獲され、特定
のハイブリドーマ又は他のB−細胞の抗原特異的選択を
可能にする。次に、捕獲された細胞は、本発明の方法に
従って回収され、そして拡張され得る。他方、特定の表
面受容体を含むT−細胞又はいづれかの細胞は、前記ポ
リスチレン表面が前記共有結合される抗原を含む場合、
そのポリスチレン表面により捕獲され得る。
特定のB−細胞のサブセットを使い尽くしたい場合毒
素に接合される抗原を添加することができ、すなわち表
面免疫グロブリン及び補体に対して特異的な抗体又は他
の選択的細胞毒性能力を使用することができる。この方
法においては、特定の抗原に応答する細胞を選択的に減
じることができる。他方、抗原又はB−細胞マーカー
(たとえばCD20)は、ポリスチレンに固定され、そして
標的B−細胞集団はその表面上に捕獲される。特に、記
憶細胞が存在する場合、特定の抗原に対するその記憶細
胞集団を実質的に使い尽くすことによって体液性応答を
減じることができる。
素に接合される抗原を添加することができ、すなわち表
面免疫グロブリン及び補体に対して特異的な抗体又は他
の選択的細胞毒性能力を使用することができる。この方
法においては、特定の抗原に応答する細胞を選択的に減
じることができる。他方、抗原又はB−細胞マーカー
(たとえばCD20)は、ポリスチレンに固定され、そして
標的B−細胞集団はその表面上に捕獲される。特に、記
憶細胞が存在する場合、特定の抗原に対するその記憶細
胞集団を実質的に使い尽くすことによって体液性応答を
減じることができる。
T−細胞集団は、機能的にB−細胞集団よりも異な
る。成熟T−細胞集団は、CD4 MHC Class II制限性細胞
毒性ヘルパー又はサプレッサー細胞及びCD8 MHC Class
I制限性細胞毒性サプレッサーに分けられ、ここでそれ
らの細胞は異なった機能を有し、そしてそれらの拡張及
び消耗が興味の対象である。
る。成熟T−細胞集団は、CD4 MHC Class II制限性細胞
毒性ヘルパー又はサプレッサー細胞及びCD8 MHC Class
I制限性細胞毒性サプレッサーに分けられ、ここでそれ
らの細胞は異なった機能を有し、そしてそれらの拡張及
び消耗が興味の対象である。
いづれかのT−細胞集団(CD4又はCD8)のためには、
特異的抗原を認識するT−細胞を活性化することが所望
される。多くの方法が、この目的のために使用され得
る。特定の抗原に対して特異的なB−細胞は、その抗原
に暴露され、そして次に特定の抗原により制限されたT
−細胞サブセットを活性化するために抗原存在細胞とし
て使用され得る。他方、単球又はマクロファージは、抗
原存在細胞として使用され得る。マクロファージは、特
定の抗原に対するB−細胞の特異性を有さないので、好
ましい。従って、抗原により付随的に前処理又は処理さ
れた単球及び/又はマクロファージを、結合されたT−
細胞に導入し、MHCに関連してその単球/マクロファー
ジにより示される場合、抗原フラグメントを認識するこ
れらのT−細胞の拡張を提供することができる。
特異的抗原を認識するT−細胞を活性化することが所望
される。多くの方法が、この目的のために使用され得
る。特定の抗原に対して特異的なB−細胞は、その抗原
に暴露され、そして次に特定の抗原により制限されたT
−細胞サブセットを活性化するために抗原存在細胞とし
て使用され得る。他方、単球又はマクロファージは、抗
原存在細胞として使用され得る。マクロファージは、特
定の抗原に対するB−細胞の特異性を有さないので、好
ましい。従って、抗原により付随的に前処理又は処理さ
れた単球及び/又はマクロファージを、結合されたT−
細胞に導入し、MHCに関連してその単球/マクロファー
ジにより示される場合、抗原フラグメントを認識するこ
れらのT−細胞の拡張を提供することができる。
細胞の生物学的活性化は、特定の可溶性又は固定され
たリンホカイン、たとえばIL−2の結果として、又は特
異的結合化合物、たとえば抗体の使用により達成され得
る。たとえば、T−細胞は、抗−T−細胞(たとえばCD
−5)表面を用いて選択され得る。次に、CD−5+捕獲細
胞が放され、そして活性化する抗−CD3表面上に又はリ
ンホカインが共有結合されている表面に導入される。そ
の細胞は結合し、そして活性化するようになるであろ
う。活性化の後、その細胞は音波処理、機械的攪拌又は
他の便利な手段により開放され、そして収穫され得る。
たリンホカイン、たとえばIL−2の結果として、又は特
異的結合化合物、たとえば抗体の使用により達成され得
る。たとえば、T−細胞は、抗−T−細胞(たとえばCD
−5)表面を用いて選択され得る。次に、CD−5+捕獲細
胞が放され、そして活性化する抗−CD3表面上に又はリ
ンホカインが共有結合されている表面に導入される。そ
の細胞は結合し、そして活性化するようになるであろ
う。活性化の後、その細胞は音波処理、機械的攪拌又は
他の便利な手段により開放され、そして収穫され得る。
骨髄又は末梢血液から得られる幹細胞に特別な興味が
ある。これらの幹細胞は、1又は複類の血液細胞系の前
駆体として作用することができる。この幹細胞の単離
は、消耗(負の選択)及び/又は正の選択の両者の結果
として存在することができる。従って、初めに受容体が
培地からの細胞の除去(負の選択)のために所望としな
い細胞に結合するであろう一連の装置を供給することが
できる。次に、末結合細胞が単離され、捕獲された細胞
から開放され、そして細胞の結合集団を残して、幹細胞
に関連する種々のマーカーを有する細胞についてさらに
選択され(正の選択)、次にこれは、幹細胞を含む集団
に対して特異的なマーカーについてさらに正の選択が行
なわれ得る。この場合、類似する最終マーカーを有する
他の細胞は、前の工程段階により除去され得る。
ある。これらの幹細胞は、1又は複類の血液細胞系の前
駆体として作用することができる。この幹細胞の単離
は、消耗(負の選択)及び/又は正の選択の両者の結果
として存在することができる。従って、初めに受容体が
培地からの細胞の除去(負の選択)のために所望としな
い細胞に結合するであろう一連の装置を供給することが
できる。次に、末結合細胞が単離され、捕獲された細胞
から開放され、そして細胞の結合集団を残して、幹細胞
に関連する種々のマーカーを有する細胞についてさらに
選択され(正の選択)、次にこれは、幹細胞を含む集団
に対して特異的なマーカーについてさらに正の選択が行
なわれ得る。この場合、類似する最終マーカーを有する
他の細胞は、前の工程段階により除去され得る。
血液細胞以外の細胞が関与する場合、単離のための対
象の細胞は、ランゲルハンス島、グリア細胞、アストロ
グリア、ニューロン、内皮細胞、上皮様細胞、基質細
胞、幹細胞、麟状細胞又は同様のものを包含する。
象の細胞は、ランゲルハンス島、グリア細胞、アストロ
グリア、ニューロン、内皮細胞、上皮様細胞、基質細
胞、幹細胞、麟状細胞又は同様のものを包含する。
細胞が静止状態又は活性化状態にある場合、約95%以
上、通常98%の実質的に均等の細胞集団が達成され得
る。細胞組成物は、固定された受容体により認識される
表面マーカー(リガンド)を表わすいづれかの細胞集団
を含むことができる。そのような組成物は、CD(クラス
ター名称シリーズ)の認識された白血球抗原のいづれか
又は特定の細胞表面リガンドに対するモノクローナル抗
体により認識される他のものを担持する細胞を含む。そ
のような組成物は、他の血液細胞、腫瘍細胞、細菌、ウ
ィルス又は通常の表面マーカーを同じように共有する寄
生体を含むことができる。実際、すべての細胞集団(こ
の膜は固定された受容体により認識される表面リガンド
を共有する)は、そのような細胞組成物を構成すること
ができる。
上、通常98%の実質的に均等の細胞集団が達成され得
る。細胞組成物は、固定された受容体により認識される
表面マーカー(リガンド)を表わすいづれかの細胞集団
を含むことができる。そのような組成物は、CD(クラス
ター名称シリーズ)の認識された白血球抗原のいづれか
又は特定の細胞表面リガンドに対するモノクローナル抗
体により認識される他のものを担持する細胞を含む。そ
のような組成物は、他の血液細胞、腫瘍細胞、細菌、ウ
ィルス又は通常の表面マーカーを同じように共有する寄
生体を含むことができる。実際、すべての細胞集団(こ
の膜は固定された受容体により認識される表面リガンド
を共有する)は、そのような細胞組成物を構成すること
ができる。
多くの種類の自己免疫、腫瘍性、感染性、代謝性、血
液学的及び免疫学的疾患及び状態(疾病分野)が、本発
明に従って処理され得る。自己免疫疾患の中には、糖尿
病、紅斑性狼瘡及びリウマチ様関節炎がある。感染症疾
患の中には、グラム陽性球菌、グラム陰性球菌、グラム
陰性杆菌、嫌気性細胞、マイコバクテリウム、菌類、ウ
ィルス、原生動物、等による局部性及び全身性感染があ
る。腫瘍性疾患の中には、すべての固形及び血液悪性が
ある。代謝性疾患の中には、アテローム硬化症及び敗血
性ショックがある。血液学的疾患の中には、鎌状細胞貧
血症及び家族性高コレステロール血症がある。免疫学的
疾患の中には、器官移植及び免疫欠損症がある。
液学的及び免疫学的疾患及び状態(疾病分野)が、本発
明に従って処理され得る。自己免疫疾患の中には、糖尿
病、紅斑性狼瘡及びリウマチ様関節炎がある。感染症疾
患の中には、グラム陽性球菌、グラム陰性球菌、グラム
陰性杆菌、嫌気性細胞、マイコバクテリウム、菌類、ウ
ィルス、原生動物、等による局部性及び全身性感染があ
る。腫瘍性疾患の中には、すべての固形及び血液悪性が
ある。代謝性疾患の中には、アテローム硬化症及び敗血
性ショックがある。血液学的疾患の中には、鎌状細胞貧
血症及び家族性高コレステロール血症がある。免疫学的
疾患の中には、器官移植及び免疫欠損症がある。
これらの及び他の疾患又は状態は、次の通りに本発明
の方法により説明される。他の方法によれば、自己免
疫、感染性又は腫瘍性疾患に関連する免疫複合体を単離
することができる(1988年9月13日に出願された同時継
続出願第243,786号)。上記のように、特定の抗原によ
り活性化されるB−及びT−細胞の両者を選択するため
に、その複合体から得られる抗原を使用することができ
る。従って、自己免疫又は腫瘍性疾患を有する宿主から
血液を除くことができ、そしてその疾患に関連するB−
及び/又はT−細胞を選択的に消耗せしめ、又は自己免
疫疾患を抑制し又は腫瘍細胞を検出し、そして排除する
ためにT−又はB−細胞を活性化することができる。こ
の場合、緩解傾向、疾病の進行の停止又は同様のことが
ある。
の方法により説明される。他の方法によれば、自己免
疫、感染性又は腫瘍性疾患に関連する免疫複合体を単離
することができる(1988年9月13日に出願された同時継
続出願第243,786号)。上記のように、特定の抗原によ
り活性化されるB−及びT−細胞の両者を選択するため
に、その複合体から得られる抗原を使用することができ
る。従って、自己免疫又は腫瘍性疾患を有する宿主から
血液を除くことができ、そしてその疾患に関連するB−
及び/又はT−細胞を選択的に消耗せしめ、又は自己免
疫疾患を抑制し又は腫瘍細胞を検出し、そして排除する
ためにT−又はB−細胞を活性化することができる。こ
の場合、緩解傾向、疾病の進行の停止又は同様のことが
ある。
他方、感染性、自己免疫又は腫瘍性疾患の場合、特定
の病原体又は疾病抗原と反応性のB−及びT−細胞の選
択を付与することができる。この場合、免疫防御に関連
するB−及びT−細胞の濃度を高めることが所望され
る。従って、病原体、自己免疫又は腫瘍性疾患、又は病
原体、自己反応性又は腫瘍性細胞自体に関連する複合体
又は抗原を用いて、それらの疾病に対する防御に関連す
るリンパ様細胞集団を高めることができる。本発明の装
置を用いて、病原体、自己反応性又は腫瘍性細胞を単離
することができ、そしてその単離された病原体又は細胞
を、疾病に対する防御において活性的な適切なT−又は
B−細胞を捕獲するために上記に定義されたように、免
疫原又は受容体として使用することができる。従って、
選択されたこれらの細胞を、起原の患者への続く返還の
ために上記のようにして回収し、拡張し、活性化するこ
とができる。この技法は、ウィルス、たとえばAIDS,HTL
V−I又はII、細菌、原生動物、菌類、蠕虫及び同様の
ものに関連する広範囲の種類の疾病に使用され得る。
の病原体又は疾病抗原と反応性のB−及びT−細胞の選
択を付与することができる。この場合、免疫防御に関連
するB−及びT−細胞の濃度を高めることが所望され
る。従って、病原体、自己免疫又は腫瘍性疾患、又は病
原体、自己反応性又は腫瘍性細胞自体に関連する複合体
又は抗原を用いて、それらの疾病に対する防御に関連す
るリンパ様細胞集団を高めることができる。本発明の装
置を用いて、病原体、自己反応性又は腫瘍性細胞を単離
することができ、そしてその単離された病原体又は細胞
を、疾病に対する防御において活性的な適切なT−又は
B−細胞を捕獲するために上記に定義されたように、免
疫原又は受容体として使用することができる。従って、
選択されたこれらの細胞を、起原の患者への続く返還の
ために上記のようにして回収し、拡張し、活性化するこ
とができる。この技法は、ウィルス、たとえばAIDS,HTL
V−I又はII、細菌、原生動物、菌類、蠕虫及び同様の
ものに関連する広範囲の種類の疾病に使用され得る。
さらに、本発明の方法は、病気の予防及び診断目的の
ためにも使用され得る。本発明の方法はまた、B−及び
T−細胞応答を検出し、免疫応答を調査し、自己免疫疾
患に関連するエピトープを同定するために研究にも使用
され、そして究極的には、遺伝子療法のためにも使用さ
れるであろう。
ためにも使用され得る。本発明の方法はまた、B−及び
T−細胞応答を検出し、免疫応答を調査し、自己免疫疾
患に関連するエピトープを同定するために研究にも使用
され、そして究極的には、遺伝子療法のためにも使用さ
れるであろう。
B−細胞を活性化し、次にそのB−細胞を不滅化し、
通常適切な融合パートナーと融合することによって、モ
ノクローナル抗体を生成するための本発明の装置をまた
使用することができる。この場合、抗原に対してヒトリ
ンパ球を免疫化することができ、ヒト宿主に通常投与す
ることができず、そして二重選択、初めにB−細胞のた
めの選択、一般的に続いて、抗原に結合することができ
るそれらの特異的B−細胞のための選択を付与する。従
って、抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を得る
可能性をひじょうに高めるために、抗原に対して特異的
なB−細胞をひじょうに濃縮することができる。
通常適切な融合パートナーと融合することによって、モ
ノクローナル抗体を生成するための本発明の装置をまた
使用することができる。この場合、抗原に対してヒトリ
ンパ球を免疫化することができ、ヒト宿主に通常投与す
ることができず、そして二重選択、初めにB−細胞のた
めの選択、一般的に続いて、抗原に結合することができ
るそれらの特異的B−細胞のための選択を付与する。従
って、抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を得る
可能性をひじょうに高めるために、抗原に対して特異的
なB−細胞をひじょうに濃縮することができる。
細胞は、種々の方法により収集装置から単離され得
る。分裂促進剤、たとえば植物凝集素(PHA)及び増殖
因子様活性を有する化合物、たとえばインターロイキン
又は増殖因子、たとえばインターロイキン−2(IL−
2),GM−CSF:、等(受容体に結合される細胞表面上に
リガンドを付与することによって細胞の開放をもたら
す)の使用が特に興味の対象である。培地は、約20〜10
00単位/mlのIL−2及び約0.1〜5.0μg/mlの植物凝集素
を含む標準の組織培養培地であり得る。他方、細胞は、
物理的な方法、たとえば機械的な破壊、特に剪断、たと
えば振動、活発なピペット処理、又は超音波処理器を用
いての音波処理及び水浴中への収集装置の配置により開
放され得る。便利には、Crest超音波処理器が使用され
る。Menssen,など.,J.Immunol.Methods(1987)104:1〜
6を参照のこと。
る。分裂促進剤、たとえば植物凝集素(PHA)及び増殖
因子様活性を有する化合物、たとえばインターロイキン
又は増殖因子、たとえばインターロイキン−2(IL−
2),GM−CSF:、等(受容体に結合される細胞表面上に
リガンドを付与することによって細胞の開放をもたら
す)の使用が特に興味の対象である。培地は、約20〜10
00単位/mlのIL−2及び約0.1〜5.0μg/mlの植物凝集素
を含む標準の組織培養培地であり得る。他方、細胞は、
物理的な方法、たとえば機械的な破壊、特に剪断、たと
えば振動、活発なピペット処理、又は超音波処理器を用
いての音波処理及び水浴中への収集装置の配置により開
放され得る。便利には、Crest超音波処理器が使用され
る。Menssen,など.,J.Immunol.Methods(1987)104:1〜
6を参照のこと。
本発明をさらに理解するために、図面が添付される。
第1図は、標的細胞の源として血液を用いての本発明の
方法の図的なフローチャートである。この図面は、赤血
球細胞及び血小板が上清液を得るために除去される分離
容器10を含む第1段階を包含する。次に、上清液には、
管14を有する遠心分離機に移され、ここで上清液12が管
16の標的細胞20を濃縮するために遠心分離される。次
に、その標的細胞が、弁24を通して細胞捕獲装置26中に
標的細胞を供給する供給容器22に移される。この方法
は、引用される例により制限されない。赤血球細胞、血
小板及び血漿を除去するための通常使用される方法は、
末梢血液又は骨髄から標的細胞集団20を得るために使用
され得る。他方、固形組織は、標的細胞集団20を得るた
めに酵素的又は物理的手段により分解される。
第1図は、標的細胞の源として血液を用いての本発明の
方法の図的なフローチャートである。この図面は、赤血
球細胞及び血小板が上清液を得るために除去される分離
容器10を含む第1段階を包含する。次に、上清液には、
管14を有する遠心分離機に移され、ここで上清液12が管
16の標的細胞20を濃縮するために遠心分離される。次
に、その標的細胞が、弁24を通して細胞捕獲装置26中に
標的細胞を供給する供給容器22に移される。この方法
は、引用される例により制限されない。赤血球細胞、血
小板及び血漿を除去するための通常使用される方法は、
末梢血液又は骨髄から標的細胞集団20を得るために使用
され得る。他方、固形組織は、標的細胞集団20を得るた
めに酵素的又は物理的手段により分解される。
細胞捕獲装置26は、支持体32により分離される多くの
ポリスチレンフィルム又はシート30を有する。上方のフ
ィルム又はシート30上に、Rとして命名された受容体34
の存在が示される。受容体34は、数枚のフィルム又はシ
ート上に単に示されており、そして受容体はフィルム又
はシートの両側上に存在することが示されているが、し
かしフィルム又はシートのすべてが受容体により両側上
に被覆されていることが理解されるべきである。他方、
細胞捕獲装置は、T−フラスコ、マイクロタイタープレ
ート、マルチウェルプレート、ローラーボトル、細胞フ
ァーム又は他のいづれかのポリスチレン容器(これらの
内部ポリスチレン表面のすべて又は一部は、それに固定
された受容体を有する)であり得る。
ポリスチレンフィルム又はシート30を有する。上方のフ
ィルム又はシート30上に、Rとして命名された受容体34
の存在が示される。受容体34は、数枚のフィルム又はシ
ート上に単に示されており、そして受容体はフィルム又
はシートの両側上に存在することが示されているが、し
かしフィルム又はシートのすべてが受容体により両側上
に被覆されていることが理解されるべきである。他方、
細胞捕獲装置は、T−フラスコ、マイクロタイタープレ
ート、マルチウェルプレート、ローラーボトル、細胞フ
ァーム又は他のいづれかのポリスチレン容器(これらの
内部ポリスチレン表面のすべて又は一部は、それに固定
された受容体を有する)であり得る。
細胞は、ダクト36を通して細胞捕獲装置26に入いる。
細胞捕獲装置26が実質的に一杯である場合、それは、細
胞が沈降するのに十分な時間静置され、そして液体層下
のフィルム又はシート上への受容体の接解を可能にされ
る。細胞が沈降し、そして接触されるようになる十分な
時間の後、次に細胞捕獲装置26は、特異的に結合されな
かった細胞が、フィルム又はシート30の反対側上に沈降
し、そしてその側上の受容体に結合されるようになるよ
うに、ひっくり返えされる。次に、細胞捕獲装置は、ダ
クト36を通して洗浄溶液を導入し、そしてそれをダクト
40を通して出すことによって洗浄され、非特異的に結合
される細胞が除去される。
細胞捕獲装置26が実質的に一杯である場合、それは、細
胞が沈降するのに十分な時間静置され、そして液体層下
のフィルム又はシート上への受容体の接解を可能にされ
る。細胞が沈降し、そして接触されるようになる十分な
時間の後、次に細胞捕獲装置26は、特異的に結合されな
かった細胞が、フィルム又はシート30の反対側上に沈降
し、そしてその側上の受容体に結合されるようになるよ
うに、ひっくり返えされる。次に、細胞捕獲装置は、ダ
クト36を通して洗浄溶液を導入し、そしてそれをダクト
40を通して出すことによって洗浄され、非特異的に結合
される細胞が除去される。
次に、1又は複数の処理溶液又は細胞懸濁液が、捕獲
された細胞の数を拡張し、その細胞を活性化し、捕獲さ
れた細胞のサブセットを消耗せしめ、捕獲された細胞中
の外因性遺伝子を導入し、又は同様のことを行なうため
に導入され得る。その処理が完結した後、容器は、処理
溶液、細胞残骸物又は同様のものを除去するために再び
洗浄され、そして適切な培地が、結合された細胞の生存
性を保持するために導入される。次に、細胞が、インタ
ーロイキン−2及び分裂促進剤を含む培置を添加するこ
とによって、又は細胞捕獲装置26を取り、そしてそれを
超音波槽中に導入し又はそれを機械的振動又は活発なピ
ペット処理にゆだねることによって開放される。そのよ
うな物理的処理又は比較的穏やかな音波振動下での短期
間の後、捕獲された細胞は開放され、そして収穫され得
る。
された細胞の数を拡張し、その細胞を活性化し、捕獲さ
れた細胞のサブセットを消耗せしめ、捕獲された細胞中
の外因性遺伝子を導入し、又は同様のことを行なうため
に導入され得る。その処理が完結した後、容器は、処理
溶液、細胞残骸物又は同様のものを除去するために再び
洗浄され、そして適切な培地が、結合された細胞の生存
性を保持するために導入される。次に、細胞が、インタ
ーロイキン−2及び分裂促進剤を含む培置を添加するこ
とによって、又は細胞捕獲装置26を取り、そしてそれを
超音波槽中に導入し又はそれを機械的振動又は活発なピ
ペット処理にゆだねることによって開放される。そのよ
うな物理的処理又は比較的穏やかな音波振動下での短期
間の後、捕獲された細胞は開放され、そして収穫され得
る。
次の例は、例示的であって、限定するものではない。
実 験 I.装置及び方法の確認 A.N−(ヒドロキシメチル)−2−ブロモアセトアミド
(HMBA)の合成及びブロモアセトアミポリスチレン表面
(BA−PS)9の生成 HMBAを、ホルコリンの存在下でpH10で、市販の2−ブ
ロモアセトアミドから従来の方法〔Leonardなど.,J.Or
g.Chem3.50:2480(198)〕により合成し、これは、出発
反応体、N−(ヒドロキシメチル)2−ブロモアセトア
ミド(HMBA)の93%収率を付与する。
(HMBA)の合成及びブロモアセトアミポリスチレン表面
(BA−PS)9の生成 HMBAを、ホルコリンの存在下でpH10で、市販の2−ブ
ロモアセトアミドから従来の方法〔Leonardなど.,J.Or
g.Chem3.50:2480(198)〕により合成し、これは、出発
反応体、N−(ヒドロキシメチル)2−ブロモアセトア
ミド(HMBA)の93%収率を付与する。
第2段階は、ブロモアセトアミドポリスチレン表面
(BA−PS)の生成を包含する。この段階においては、2M
のトリフリル酸及び0.2MのHMBA〔両者ともラハラメチレ
ンスルホン(スルホラン)中における〕が、活性化され
ているポリスチレン容器の内表面を被覆するのに十分な
体積で1:1で混合される。その反応は、27℃で3時間、
行なわれる。反応溶液が排水され、装置を水により洗浄
し、続いてエタノールにより洗浄し、そして活性化され
たポリスチレンチャンバーが空気乾燥せしめられる。得
られたブロモアセトアミドポリスチレン表面を、6ヵ月
間室部で安定している。
(BA−PS)の生成を包含する。この段階においては、2M
のトリフリル酸及び0.2MのHMBA〔両者ともラハラメチレ
ンスルホン(スルホラン)中における〕が、活性化され
ているポリスチレン容器の内表面を被覆するのに十分な
体積で1:1で混合される。その反応は、27℃で3時間、
行なわれる。反応溶液が排水され、装置を水により洗浄
し、続いてエタノールにより洗浄し、そして活性化され
たポリスチレンチャンバーが空気乾燥せしめられる。得
られたブロモアセトアミドポリスチレン表面を、6ヵ月
間室部で安定している。
B.細胞捕獲表面の調製、安定化及び殺菌 次の段階は、受容体捕獲である(モノクローナル抗体
がブロモアセトアミド−ポリスチレン表面に共有結合さ
れる)。対象のモノクローナル抗体を、リン酸緩衝溶液
(pH7.4)中で約0.01〜0.05mg/mlに希釈する。希釈され
たモノクローナル抗体の適切な体積を、ポリスチレンチ
ャンバー中に導入し、そしてその反応を、回転しなが
ら、約2〜20、好ましくは約2〜4時間、27℃で進行せ
しめる。その反応の後、残存する抗体がデカントされ、
そして続く被膜反応において10回まで再利用され得る。
がブロモアセトアミド−ポリスチレン表面に共有結合さ
れる)。対象のモノクローナル抗体を、リン酸緩衝溶液
(pH7.4)中で約0.01〜0.05mg/mlに希釈する。希釈され
たモノクローナル抗体の適切な体積を、ポリスチレンチ
ャンバー中に導入し、そしてその反応を、回転しなが
ら、約2〜20、好ましくは約2〜4時間、27℃で進行せ
しめる。その反応の後、残存する抗体がデカントされ、
そして続く被膜反応において10回まで再利用され得る。
次に、抗体結合装置を、リン酸緩衝溶液(PBS)(pH
7.4)により10回清浄し、そして次に、その表面を、2
%スクロース/0.2%ヒト血清アルブミン(HSA)(医薬
器種)を個々の装置に添加することにより安定化せしめ
る。スクロース/アルブミン溶液は、その表面の被覆を
可能にされ、この後、過剰のスクロース/HSA溶液がデカ
ントされ、そして安定化されたポリスチレンチャンバー
が25℃で真空(<0.10トル)下で24〜96時間乾燥せしめ
られる。乾燥の後、真空が乾燥窒素により開放され、そ
して装置が不活性乾燥ガスによりフラッシュされ、そし
てきつくキャップをされる。装置を密封し、そして次に
殺菌する。殺菌は、2.7±0.2メガラドの電子ビーム又は
γ放射線による照射により達成される。殺菌試験は、フ
ラスコが、14日間の現場培地のインキュベーションの
後、無菌状態であったことを示した。
7.4)により10回清浄し、そして次に、その表面を、2
%スクロース/0.2%ヒト血清アルブミン(HSA)(医薬
器種)を個々の装置に添加することにより安定化せしめ
る。スクロース/アルブミン溶液は、その表面の被覆を
可能にされ、この後、過剰のスクロース/HSA溶液がデカ
ントされ、そして安定化されたポリスチレンチャンバー
が25℃で真空(<0.10トル)下で24〜96時間乾燥せしめ
られる。乾燥の後、真空が乾燥窒素により開放され、そ
して装置が不活性乾燥ガスによりフラッシュされ、そし
てきつくキャップをされる。装置を密封し、そして次に
殺菌する。殺菌は、2.7±0.2メガラドの電子ビーム又は
γ放射線による照射により達成される。殺菌試験は、フ
ラスコが、14日間の現場培地のインキュベーションの
後、無菌状態であったことを示した。
C.細胞捕獲表面の受容体の密度 種々の表面官能化基を用い、そしてその表面への抗体
の結合の安定性について試験した、ポリスチレンを、N
−(ヒドロキシメチル)−2−ハロアセトアミド(ここ
でハロ基はクロロ、ブロモ又はヨート;ジアゾニウム及
びスルホニウムである)を用いて官能化した。これらの
表面を用いてのモノクローナル抗体の付着の後、フラス
コを、それぞれPBSにより10度洗浄し、そして55℃で14
時間、1%SDSにより1度洗浄した。次に、プラスチッ
ク表面を、ラベルされたモノクローナル抗体の放射性に
ついてアッセイし、そしてその結果を、モノクローナル
抗体のための表面密度として、ng/cm2で表わした。ブロ
モアセトアミドは、約250ng/cm2の抗体の表面密度を有
し、これはImmulon−2TM(Dynatek)表面上への吸着に
より達成されるよりも2.5倍以上高かった。ブロモアセ
トアミドは最高の表面密度を提供するが、他の官能性に
ついての表面密度は、200〜約240ng/cm2に低下した。
の結合の安定性について試験した、ポリスチレンを、N
−(ヒドロキシメチル)−2−ハロアセトアミド(ここ
でハロ基はクロロ、ブロモ又はヨート;ジアゾニウム及
びスルホニウムである)を用いて官能化した。これらの
表面を用いてのモノクローナル抗体の付着の後、フラス
コを、それぞれPBSにより10度洗浄し、そして55℃で14
時間、1%SDSにより1度洗浄した。次に、プラスチッ
ク表面を、ラベルされたモノクローナル抗体の放射性に
ついてアッセイし、そしてその結果を、モノクローナル
抗体のための表面密度として、ng/cm2で表わした。ブロ
モアセトアミドは、約250ng/cm2の抗体の表面密度を有
し、これはImmulon−2TM(Dynatek)表面上への吸着に
より達成されるよりも2.5倍以上高かった。ブロモアセ
トアミドは最高の表面密度を提供するが、他の官能性に
ついての表面密度は、200〜約240ng/cm2に低下した。
D.捕獲表面受容体の安定性 抗体結合の安定性を、0.02mg/mlの(35S)ヒトIgGに
より表面を被覆することによって決定した。フラスコ
を、硼酸塩−カーボネート緩衝液により5度、硼酸塩−
カーボネート緩衝液により1度(8時間)及び硼酸塩−
カーボネート緩衝液により2度(一晩)洗浄した。個々
の洗浄物のアリコートを保存し、そして放射性について
アッセイした。2回目の洗浄の後、いづれの抗体の浸出
も確認されなかった。表面に結合される抗体についての
ELISAアッセイを用いて第2研究において、その観察さ
れた結果は、抽出可能な抗体の量は、アッセイの検出限
界よりも低かった(7.7ng/ml)ことを示した。
より表面を被覆することによって決定した。フラスコ
を、硼酸塩−カーボネート緩衝液により5度、硼酸塩−
カーボネート緩衝液により1度(8時間)及び硼酸塩−
カーボネート緩衝液により2度(一晩)洗浄した。個々
の洗浄物のアリコートを保存し、そして放射性について
アッセイした。2回目の洗浄の後、いづれの抗体の浸出
も確認されなかった。表面に結合される抗体についての
ELISAアッセイを用いて第2研究において、その観察さ
れた結果は、抽出可能な抗体の量は、アッセイの検出限
界よりも低かった(7.7ng/ml)ことを示した。
E.誘導体化されたポリスチレン表面による細胞捕獲の密
度 受容体−誘導体化されたポリスチレン表面は、その光
学的鮮明度を保持するので、誘導体化されたポリスチレ
ンの単位面積当たりの捕獲された細胞の密度は、直接的
に顕微鏡により計算され得る。ほとんどの細胞捕獲用途
に関して、結合された細胞の密度は、単層上での球体の
最っとも接近した充填率に近づく。マウス又はヒト起原
のリンパ球に関して、その結合密度は、0.5×106個の細
胞/cm2〜1×106個の細胞/cm2である。投入細胞懸濁液
中の標的細胞の頻度及び大きさに依存して、結合された
細胞の密度は、広く異なり、すなわち、大きな、数少な
い標的細胞のためには1×103個の細胞/cm2〜小さな多
くの細胞又は粒子、たとえば細胞又はウィルスのために
は1010以上の細胞/cm2である。
度 受容体−誘導体化されたポリスチレン表面は、その光
学的鮮明度を保持するので、誘導体化されたポリスチレ
ンの単位面積当たりの捕獲された細胞の密度は、直接的
に顕微鏡により計算され得る。ほとんどの細胞捕獲用途
に関して、結合された細胞の密度は、単層上での球体の
最っとも接近した充填率に近づく。マウス又はヒト起原
のリンパ球に関して、その結合密度は、0.5×106個の細
胞/cm2〜1×106個の細胞/cm2である。投入細胞懸濁液
中の標的細胞の頻度及び大きさに依存して、結合された
細胞の密度は、広く異なり、すなわち、大きな、数少な
い標的細胞のためには1×103個の細胞/cm2〜小さな多
くの細胞又は粒子、たとえば細胞又はウィルスのために
は1010以上の細胞/cm2である。
F.誘導体化されたポリスチレン表面により細胞捕獲の特
異性 官能化されたポリスチレン表面への細胞結合は、ポリ
スチレンに結合される受容体により特異的に決定され
る。次の実験は、細胞結合の特異的を示す。単核細胞
を、標準の組織学的遠心分離により末梢血液から調製
し、そして3×106個の細胞/PBS1mlに希釈した。その投
入物のアリコートを、流動細胞計測法による表現型の分
析のために保存した。細胞懸濁液を、次のものをそれら
の内部底面上に含むT−25フラスコに添加した:Thy 1.2
(ネズミT−細胞マーカー)、(2)CD5、(3)CD8又
はCD8及びCD5抗体(ヒトT−細胞マーカー)の等モル混
合物のいづれかに対する特異性を有する、本発明の方法
により共有結合された精製モノクローナル抗体。細胞を
30分間インキュベートし、次に少々振動せしめ、そして
さらに30分間、沈降せしめた。非付着性細胞(フラスコ
表面に付着しない細胞)を、デカントすることにより回
収し、そしてそのアリコートをまた、流動細胞計測法に
より分析される表現型組成物のために保存した。すべて
の場合(但し、Thy1.2を除く)、すなわち細胞のフラス
コへの結合が見られないフラスコの場合、フラスコの顕
微鏡的試験は、0.5×106個の細胞/cm2の密度での集密的
細胞結合を示した。流動細胞計測法を、マーカーCD5,CD
8(ヒトT−細胞)、CD14(ヒト単球)、CD16(ヒトNK
−細胞)及びCD20(ヒトB−細胞)についてすべての投
入及び流出(非付着性)細胞集団に対して行ない、そし
て投入及び流出液におけるこれらのマーカーの相対的頻
度を、個々のフラスコについて比較した。その結果は、
Thy1.2フラスコに関して、投入及び流出液間に差異が存
在しないことを示す。CD5及びCD8フラスコはそれぞれ、
流出液におけCD5及びCD8細胞の98%以上の消耗を示し、
そしてCD5/8フラスコは、単一特異性CD5又はCD8フラス
コのいづれかの程度に等しい程度へのCD5及びCD8細胞の
消耗を示した。単球及びNK−細胞並びにB−細胞のため
マーカーは、それらがフラスコにより捕獲されない場
合、流出液中に比較的富んでいることを示した。これら
のデータは、(1)細胞が細胞捕獲装置により量的に及
び特異的に捕獲され、(2)官能化された表面が非特異
的細胞結合を示さず、そして(3)1以上の細胞の表現
型が二回誘導化されたポリスチレン表面により同時に捕
獲され得ることを示す。
異性 官能化されたポリスチレン表面への細胞結合は、ポリ
スチレンに結合される受容体により特異的に決定され
る。次の実験は、細胞結合の特異的を示す。単核細胞
を、標準の組織学的遠心分離により末梢血液から調製
し、そして3×106個の細胞/PBS1mlに希釈した。その投
入物のアリコートを、流動細胞計測法による表現型の分
析のために保存した。細胞懸濁液を、次のものをそれら
の内部底面上に含むT−25フラスコに添加した:Thy 1.2
(ネズミT−細胞マーカー)、(2)CD5、(3)CD8又
はCD8及びCD5抗体(ヒトT−細胞マーカー)の等モル混
合物のいづれかに対する特異性を有する、本発明の方法
により共有結合された精製モノクローナル抗体。細胞を
30分間インキュベートし、次に少々振動せしめ、そして
さらに30分間、沈降せしめた。非付着性細胞(フラスコ
表面に付着しない細胞)を、デカントすることにより回
収し、そしてそのアリコートをまた、流動細胞計測法に
より分析される表現型組成物のために保存した。すべて
の場合(但し、Thy1.2を除く)、すなわち細胞のフラス
コへの結合が見られないフラスコの場合、フラスコの顕
微鏡的試験は、0.5×106個の細胞/cm2の密度での集密的
細胞結合を示した。流動細胞計測法を、マーカーCD5,CD
8(ヒトT−細胞)、CD14(ヒト単球)、CD16(ヒトNK
−細胞)及びCD20(ヒトB−細胞)についてすべての投
入及び流出(非付着性)細胞集団に対して行ない、そし
て投入及び流出液におけるこれらのマーカーの相対的頻
度を、個々のフラスコについて比較した。その結果は、
Thy1.2フラスコに関して、投入及び流出液間に差異が存
在しないことを示す。CD5及びCD8フラスコはそれぞれ、
流出液におけCD5及びCD8細胞の98%以上の消耗を示し、
そしてCD5/8フラスコは、単一特異性CD5又はCD8フラス
コのいづれかの程度に等しい程度へのCD5及びCD8細胞の
消耗を示した。単球及びNK−細胞並びにB−細胞のため
マーカーは、それらがフラスコにより捕獲されない場
合、流出液中に比較的富んでいることを示した。これら
のデータは、(1)細胞が細胞捕獲装置により量的に及
び特異的に捕獲され、(2)官能化された表面が非特異
的細胞結合を示さず、そして(3)1以上の細胞の表現
型が二回誘導化されたポリスチレン表面により同時に捕
獲され得ることを示す。
G.捕獲装置からの細胞回収のための方法 2種の技法を用いて、捕獲装置から細胞を回収した。
両者は、定量的細胞回収、良好な生存性、回収された細
胞の表上でのモノクローナル抗体の不在及び複製及び機
能の両者のための十分な生物学的活性を示す。リンホカ
イン開放と呼ばれる第1の方法は、上記本発明の方法に
従って、正常なヒト末梢血液から捕獲されたCD8+細胞毒
性T−細胞により試験された。非付着性細胞をデカント
し及び顕微鏡観察により集密的結合を確認した後、組換
え体IL−2(300単位/ml)(通常20〜1000単位/mlの
間)及び植物凝集素(PHA:Gibco 0.1mg/ml)(通常、0.
1〜5.0mg/mlの間)により補足された標準の組織培養倍
地を添加した。培養の48〜72時間後、捕獲されたCD8+細
胞がフラスコから自発的に分離し、ポリスチレン表面に
共有結合されたモノクローナル抗体のすべてが残った。
両者は、定量的細胞回収、良好な生存性、回収された細
胞の表上でのモノクローナル抗体の不在及び複製及び機
能の両者のための十分な生物学的活性を示す。リンホカ
イン開放と呼ばれる第1の方法は、上記本発明の方法に
従って、正常なヒト末梢血液から捕獲されたCD8+細胞毒
性T−細胞により試験された。非付着性細胞をデカント
し及び顕微鏡観察により集密的結合を確認した後、組換
え体IL−2(300単位/ml)(通常20〜1000単位/mlの
間)及び植物凝集素(PHA:Gibco 0.1mg/ml)(通常、0.
1〜5.0mg/mlの間)により補足された標準の組織培養倍
地を添加した。培養の48〜72時間後、捕獲されたCD8+細
胞がフラスコから自発的に分離し、ポリスチレン表面に
共有結合されたモノクローナル抗体のすべてが残った。
捕獲されたCD8細胞は、螢光化された抗−マウス抗体
を用いての流動細胞計測法により表面結合モノクローナ
ル抗体を有さないことが示された。さらに、フラスコ
は、捕獲表面を再生する、4MのMgClを含むPBSによる洗
浄により細胞捕獲のために再使用され得る。そのような
再使用フラスコは、4〜6循環の間、確実に作用し、そ
の後、反復された洗浄は結合される抗体活性を減じる。
さらにポリスチレン表面による抗体の保持の証明は、ポ
リスチレンブロット研究によりその場で提供され、ここ
で放射性ラベルされた抗−マウス抗体は誘導体化された
ポリスチレンと反応せしめられ、激しく洗浄され、そし
てその表面がオートラジオグラフ法又は直接的なシンチ
レーション計数法のいづれかによりアッセイされる。両
セットの実験において、ポリスチレン表面は、結合され
たモノクローナル抗体により十分に飽和され、そしてこ
れは、装置におけるその抗体の保持を示している。
を用いての流動細胞計測法により表面結合モノクローナ
ル抗体を有さないことが示された。さらに、フラスコ
は、捕獲表面を再生する、4MのMgClを含むPBSによる洗
浄により細胞捕獲のために再使用され得る。そのような
再使用フラスコは、4〜6循環の間、確実に作用し、そ
の後、反復された洗浄は結合される抗体活性を減じる。
さらにポリスチレン表面による抗体の保持の証明は、ポ
リスチレンブロット研究によりその場で提供され、ここ
で放射性ラベルされた抗−マウス抗体は誘導体化された
ポリスチレンと反応せしめられ、激しく洗浄され、そし
てその表面がオートラジオグラフ法又は直接的なシンチ
レーション計数法のいづれかによりアッセイされる。両
セットの実験において、ポリスチレン表面は、結合され
たモノクローナル抗体により十分に飽和され、そしてこ
れは、装置におけるその抗体の保持を示している。
デカントにより回収された、その分離された細胞を、
IL−2及び植物凝集素により補足された標準組織培養チ
ャンバー中で数的に拡張することができる。トリパンブ
ルー排除試験による生存率は、98%以上であることが示
され、そして回収された均質細胞集団は約10日間にわた
って2倍に拡張され得る。
IL−2及び植物凝集素により補足された標準組織培養チ
ャンバー中で数的に拡張することができる。トリパンブ
ルー排除試験による生存率は、98%以上であることが示
され、そして回収された均質細胞集団は約10日間にわた
って2倍に拡張され得る。
超音波開放と呼ばれる、細胞回収のための第2の方法
は、Crest Vibra−棒により水浴を均等に分配されてい
る超音波浴(Crest Ultrusonicsモデル#H−4HT−1014
−6)を用いる。電力供給は40〜90KHzで500ワットであ
る。超音波浴は、流体6ガロンの体積を保持する。10×
14インチの浸漬タンクを有し、この流体の1(タンク
底から0.5インチ)が本発明の研究における音波処理の
ために含まれる。種々の大きさの浸漬タンクが市販され
ている。結合細胞を含む捕獲装置を、超音波浴において
1の流体中に浸漬し、そして電力供給及び電力適用時
間を実験的に決定する。細胞表現型に依存して、時間及
び電力は異なる:たとえばCD4+T−細胞:78%の最大電
力、17秒;CD8+T−細胞:30%の最大電力、20秒;Leu19細
胞:75%の最大電力、10秒、等。
は、Crest Vibra−棒により水浴を均等に分配されてい
る超音波浴(Crest Ultrusonicsモデル#H−4HT−1014
−6)を用いる。電力供給は40〜90KHzで500ワットであ
る。超音波浴は、流体6ガロンの体積を保持する。10×
14インチの浸漬タンクを有し、この流体の1(タンク
底から0.5インチ)が本発明の研究における音波処理の
ために含まれる。種々の大きさの浸漬タンクが市販され
ている。結合細胞を含む捕獲装置を、超音波浴において
1の流体中に浸漬し、そして電力供給及び電力適用時
間を実験的に決定する。細胞表現型に依存して、時間及
び電力は異なる:たとえばCD4+T−細胞:78%の最大電
力、17秒;CD8+T−細胞:30%の最大電力、20秒;Leu19細
胞:75%の最大電力、10秒、等。
音波処理により回収された細胞がなお生存し、そして
それらの生理学的活性を保持することを示すために、CD
16+NK−細胞を、最大電力での15〜20秒間の音波処理に
より回収した。音波処理により回収された細胞は、
(1)トリパンブルー排除試験により85%以上の生存率
があり、そして(2)NK−細胞活性を定量化するために
通常使用される溶解アッセイにおいてひじょうに活性的
であった。音波処理により回収された細胞は、マイトジ
ェン/リンホカイン誘導の上記方法により回収された細
胞と同じように、モノクローナル抗体を有さないことが
誘導細胞計測法を用いて示された。従って、両方法によ
り回収された細胞において、抗体は、細胞が回収される
場合、細胞上に残存せず、モノクローナル抗体を有さな
い生存する均質の十分に官能的な細胞が付与される。
それらの生理学的活性を保持することを示すために、CD
16+NK−細胞を、最大電力での15〜20秒間の音波処理に
より回収した。音波処理により回収された細胞は、
(1)トリパンブルー排除試験により85%以上の生存率
があり、そして(2)NK−細胞活性を定量化するために
通常使用される溶解アッセイにおいてひじょうに活性的
であった。音波処理により回収された細胞は、マイトジ
ェン/リンホカイン誘導の上記方法により回収された細
胞と同じように、モノクローナル抗体を有さないことが
誘導細胞計測法を用いて示された。従って、両方法によ
り回収された細胞において、抗体は、細胞が回収される
場合、細胞上に残存せず、モノクローナル抗体を有さな
い生存する均質の十分に官能的な細胞が付与される。
H.開放された細胞の表現型均質性 投入及び流出(捕獲されなかった)細胞の表現型の前
記(セクションF)分析は、細胞捕獲装置により結合す
る細胞がその装置表面に共有結合されるモノクローナル
抗体により特定されることを示した。このセクションに
おいて、データは、リンホカイン開放により装置から回
収された細胞の流動細胞計測法による分析によりこれら
の発見を確証し、そして拡張することが示される。正常
なヒトの末梢血液からの単核細胞を上記のようにして標
準のヒストオパーク遠心分離により調製し、そして内表
面に共有結合されるCD8又はCD4モノクローナル抗体のい
づれかを含む細胞捕獲装置中に、3×106個の細胞/ml P
BSの濃度で導入した。標準のインキュベーション及び結
合されない細胞のデカントの後、捕獲された細胞を、セ
クションGに記載のようにしてIL−2及びPHAと共に48
時間のインキュベーションにより回収した。次に、回収
された細胞を、流動細胞計数法により表現型決定し、そ
してIL−2及びPHAにより補充された標準培養培地中で
培養した。細胞のアリコートを、流動細胞計数法のため
に培養物中から6〜25日間にわたって定期的にサンプル
として採取した。そのデータは、時間ゼロ(装置から回
収の後すぐ)で、それぞれCD4及びCD8装置からの回収さ
れた細胞上のCD4+及びCD8+表面マーカーについて95以上
の均等性を示す。より重要なことには、回収された細胞
が培養物中で対数増殖する場合、それらの表現型の均等
性は保持され、そして培養物は、6〜25日間の培養期間
にわたってそれぞれCD4及びCD8マーカーについて95%以
上の純度を保持した。従って、開放された細胞は表現型
で均等であり、そしてそれらの均等性は、イン ビトロ
での対数増殖の間、維持される。
記(セクションF)分析は、細胞捕獲装置により結合す
る細胞がその装置表面に共有結合されるモノクローナル
抗体により特定されることを示した。このセクションに
おいて、データは、リンホカイン開放により装置から回
収された細胞の流動細胞計測法による分析によりこれら
の発見を確証し、そして拡張することが示される。正常
なヒトの末梢血液からの単核細胞を上記のようにして標
準のヒストオパーク遠心分離により調製し、そして内表
面に共有結合されるCD8又はCD4モノクローナル抗体のい
づれかを含む細胞捕獲装置中に、3×106個の細胞/ml P
BSの濃度で導入した。標準のインキュベーション及び結
合されない細胞のデカントの後、捕獲された細胞を、セ
クションGに記載のようにしてIL−2及びPHAと共に48
時間のインキュベーションにより回収した。次に、回収
された細胞を、流動細胞計数法により表現型決定し、そ
してIL−2及びPHAにより補充された標準培養培地中で
培養した。細胞のアリコートを、流動細胞計数法のため
に培養物中から6〜25日間にわたって定期的にサンプル
として採取した。そのデータは、時間ゼロ(装置から回
収の後すぐ)で、それぞれCD4及びCD8装置からの回収さ
れた細胞上のCD4+及びCD8+表面マーカーについて95以上
の均等性を示す。より重要なことには、回収された細胞
が培養物中で対数増殖する場合、それらの表現型の均等
性は保持され、そして培養物は、6〜25日間の培養期間
にわたってそれぞれCD4及びCD8マーカーについて95%以
上の純度を保持した。従って、開放された細胞は表現型
で均等であり、そしてそれらの均等性は、イン ビトロ
での対数増殖の間、維持される。
I.開放された細胞の数的な拡張 6人の異なった個人からのヒト末梢血液単核細胞を用
いてのCD8捕獲装置からのリンホカイン力により回収さ
れたCD8+細胞を、湿潤されたインキュベーター中におけ
る標準培養容器中で、IL−2及びPHA(それぞれ300単位
/ml及び0.1μg/ml)により補充された標準培養培地にお
いて37℃で培養した。細胞を、トリパンブルー排除法に
よる生存性及び血球計数器による細胞数についての研究
のために、培養の25日間にわたって定期的に採取した。
それぞれの個々の細胞は、他とは分離して維持された。
そのデータは、95%以上の細胞生存率及び20日間にわた
っての細胞数の2対数上昇を示す。これらのデータは、
標準組織培養における捕獲装置から回収された細胞の数
の指数的に上昇する能力を示す。
いてのCD8捕獲装置からのリンホカイン力により回収さ
れたCD8+細胞を、湿潤されたインキュベーター中におけ
る標準培養容器中で、IL−2及びPHA(それぞれ300単位
/ml及び0.1μg/ml)により補充された標準培養培地にお
いて37℃で培養した。細胞を、トリパンブルー排除法に
よる生存性及び血球計数器による細胞数についての研究
のために、培養の25日間にわたって定期的に採取した。
それぞれの個々の細胞は、他とは分離して維持された。
そのデータは、95%以上の細胞生存率及び20日間にわた
っての細胞数の2対数上昇を示す。これらのデータは、
標準組織培養における捕獲装置から回収された細胞の数
の指数的に上昇する能力を示す。
J.固定化されたCD3モノクローナル抗体による回収され
た細胞の増殖の誘発 この研究においては、正常なヒトの末梢血液から回収
されたCD8+細胞を、CD8+抗体を含む本発明の装置により
捕獲し、そしてリンホカイン力により回収した。次に回
収された細胞を、組換えIL−2及びPHAにより補充され
た標準組織培養培地を用いて標準組織培養フラスコ中で
培養し、又は組換えIL−2又はPHAのいづれよりも補充
されていない標準培地を用いて、共有結合された抗−CD
3モノクローナ抗体と共に本発明の装置中で培養した。
抗−CD3モノクローナル抗体を有する二本のフラスコを
用いた。時間ゼロで、同数の細胞を、フラスコA,B及び
C(A=IL−2/PHA補充培地を有する標準組織培養フラ
スコ;B及びC=IL−2又はPHAを有さないCD3装置)中に
それぞれ充填した。5日間の培養の後、個々の培養物を
2つのアリコートに分け、そして同一の培養条件下で同
一のフラスコ中に再プレートした。次に、細胞を9日
目、再計数し、5日〜9日で次の倍数−拡張をもたらし
た:A:2.7;B:2.55;C:6.75。CD8+細胞がIL−2又はPHA補
充物を有さない標準組織培養容器中で培養されている対
照培養物は、まったく増殖しなかった。従って、細胞拡
張は、標準組織培養フラスコ中でのIL−2/PHA補充培地
と比較して、固定された抗−CD3抗体及び本発明の装置
を用いれば、前記と同じか又は前記よりも複数倍高く達
成された。これらのデータは、本発明の方法に従ってポ
リスチレン表面にT−細胞活性化モノクローナル抗体
(CD3)を固定化することによって、T−細胞活性化/
増殖が、培養培地中において可溶性活性化因子(I−2/
PHA)の不在下で前記固定されたモノクローナル抗体に
より達成され得ることを示す。
た細胞の増殖の誘発 この研究においては、正常なヒトの末梢血液から回収
されたCD8+細胞を、CD8+抗体を含む本発明の装置により
捕獲し、そしてリンホカイン力により回収した。次に回
収された細胞を、組換えIL−2及びPHAにより補充され
た標準組織培養培地を用いて標準組織培養フラスコ中で
培養し、又は組換えIL−2又はPHAのいづれよりも補充
されていない標準培地を用いて、共有結合された抗−CD
3モノクローナ抗体と共に本発明の装置中で培養した。
抗−CD3モノクローナル抗体を有する二本のフラスコを
用いた。時間ゼロで、同数の細胞を、フラスコA,B及び
C(A=IL−2/PHA補充培地を有する標準組織培養フラ
スコ;B及びC=IL−2又はPHAを有さないCD3装置)中に
それぞれ充填した。5日間の培養の後、個々の培養物を
2つのアリコートに分け、そして同一の培養条件下で同
一のフラスコ中に再プレートした。次に、細胞を9日
目、再計数し、5日〜9日で次の倍数−拡張をもたらし
た:A:2.7;B:2.55;C:6.75。CD8+細胞がIL−2又はPHA補
充物を有さない標準組織培養容器中で培養されている対
照培養物は、まったく増殖しなかった。従って、細胞拡
張は、標準組織培養フラスコ中でのIL−2/PHA補充培地
と比較して、固定された抗−CD3抗体及び本発明の装置
を用いれば、前記と同じか又は前記よりも複数倍高く達
成された。これらのデータは、本発明の方法に従ってポ
リスチレン表面にT−細胞活性化モノクローナル抗体
(CD3)を固定化することによって、T−細胞活性化/
増殖が、培養培地中において可溶性活性化因子(I−2/
PHA)の不在下で前記固定されたモノクローナル抗体に
より達成され得ることを示す。
II.特定の例 A.骨髄移植 この第1の例においては、骨髄移植のためのT−細胞
消耗が例示される。データは骨髄物質に存在するCD5+及
びCD8+T−細胞が対宿主移植片疾患を引き起こすことを
示す。上記装置が、CD5及びCD8陽性ヒトT−細胞に対す
るモノクローナル抗体を用いて調製された。正常なヒト
から得られたヒト骨髄のアリコートを、本発明の装置に
導入し、そして細胞を上記のようにしてインキュベート
した。非付着性細胞を回収し、表現型を決定し、そして
断片化されなかった骨髄の投入と比較して、前駆体細胞
のための富化を定量化するためにイン ビトロ培養にゆ
だねた。次の表は、典型的な結果を示す。
消耗が例示される。データは骨髄物質に存在するCD5+及
びCD8+T−細胞が対宿主移植片疾患を引き起こすことを
示す。上記装置が、CD5及びCD8陽性ヒトT−細胞に対す
るモノクローナル抗体を用いて調製された。正常なヒト
から得られたヒト骨髄のアリコートを、本発明の装置に
導入し、そして細胞を上記のようにしてインキュベート
した。非付着性細胞を回収し、表現型を決定し、そして
断片化されなかった骨髄の投入と比較して、前駆体細胞
のための富化を定量化するためにイン ビトロ培養にゆ
だねた。次の表は、典型的な結果を示す。
前記表中のデータは、CD5+及びCD8+細胞の特異的消耗
を示し(CD14+,CD16+細胞は富化され、CD19+は変化を受
けなかった)、そして前駆体細胞のためには2〜6倍の
富化を示す。これらのデータは、所望する前駆体細胞を
富化しながら、対宿主移植片疾患を引き起こす細胞を特
異的に消耗するための本発明の方法の使用を例示する。
を示し(CD14+,CD16+細胞は富化され、CD19+は変化を受
けなかった)、そして前駆体細胞のためには2〜6倍の
富化を示す。これらのデータは、所望する前駆体細胞を
富化しながら、対宿主移植片疾患を引き起こす細胞を特
異的に消耗するための本発明の方法の使用を例示する。
骨髄移植適用の2番目の例においては、骨髄又は末梢
血液からの細胞の混合物中における特定の微量細胞集団
を濃縮する本発明の装置の能力が示される。濃縮される
べき細胞は、ヒト骨髄からの前駆体幹細胞である。この
例において、本発明の装置は、ポリスチレン表面に共有
結合されるCD34モノクローナル抗体を導入する。この例
の第1の場合、ヒト骨髄サンプルがCD34の装置中に導入
され、細胞が上記のようにインキュベートされ、非付着
性細胞がデカントにより回収され、そして捕獲された細
胞が音波処理により回収される。3種の画分、すなわち
投入細胞、非付着性及び付着性細胞を、前駆体細胞のた
めの標準アッセイを用いてCFU-Cについてアッセイし
た。次の表は、その結果を示す: データは、前駆体細胞の15倍の上昇が、本発明の装置
及び音波処理により細胞回収の本発明の方法により達成
されることを示す。
血液からの細胞の混合物中における特定の微量細胞集団
を濃縮する本発明の装置の能力が示される。濃縮される
べき細胞は、ヒト骨髄からの前駆体幹細胞である。この
例において、本発明の装置は、ポリスチレン表面に共有
結合されるCD34モノクローナル抗体を導入する。この例
の第1の場合、ヒト骨髄サンプルがCD34の装置中に導入
され、細胞が上記のようにインキュベートされ、非付着
性細胞がデカントにより回収され、そして捕獲された細
胞が音波処理により回収される。3種の画分、すなわち
投入細胞、非付着性及び付着性細胞を、前駆体細胞のた
めの標準アッセイを用いてCFU-Cについてアッセイし
た。次の表は、その結果を示す: データは、前駆体細胞の15倍の上昇が、本発明の装置
及び音波処理により細胞回収の本発明の方法により達成
されることを示す。
この例の第2の場合、末梢血液単核細胞がもう1つの
CD34装置中に導入された。非付着性細胞を、デカントに
より回収し、付着性細胞を音波処理により再び回収し
た。投入細胞及び付着性細胞のアリコートを、CD34+表
現型について分析した。投入細胞は、CD34+細胞に対し
て0.1%以下陽性であった。音波処理により回収された
付着性細胞は、CD34+に対して15%陽性であり、これ
は、末梢血液から生存する前駆体細胞を回収するための
本発明の装置及び方法の利用性を示す。
CD34装置中に導入された。非付着性細胞を、デカントに
より回収し、付着性細胞を音波処理により再び回収し
た。投入細胞及び付着性細胞のアリコートを、CD34+表
現型について分析した。投入細胞は、CD34+細胞に対し
て0.1%以下陽性であった。音波処理により回収された
付着性細胞は、CD34+に対して15%陽性であり、これ
は、末梢血液から生存する前駆体細胞を回収するための
本発明の装置及び方法の利用性を示す。
B.抗ウィルス細胞療法、たとえばAIDSの治療 次の例においては、ウィルス感染、たとえばAIDSの治
療のための方法が例示される。この技法は、末梢血液単
核細胞からCD8+細胞毒性T−細胞を捕獲することによっ
てCD8+細胞を拡張する。次に、捕獲されたCD8+細胞が、
レクチン及び組換えIL−2(リンホカイン力)を含む培
地中での短い培養により回収され、続いて最終洗浄の
前、14〜28日間、標準の組織培養容器中での分離された
細胞の拡張及び元の患者への再注入のための収集が伴わ
れる。
療のための方法が例示される。この技法は、末梢血液単
核細胞からCD8+細胞毒性T−細胞を捕獲することによっ
てCD8+細胞を拡張する。次に、捕獲されたCD8+細胞が、
レクチン及び組換えIL−2(リンホカイン力)を含む培
地中での短い培養により回収され、続いて最終洗浄の
前、14〜28日間、標準の組織培養容器中での分離された
細胞の拡張及び元の患者への再注入のための収集が伴わ
れる。
特に、Ficoll−Hypaqueにより濃縮された末梢血液ヒ
ト単核細胞(PBMC)を、共有結合された抗−CD8モノク
ローナル抗体を有するT−150ポリスチレンフラスコ中
に導入した。1時間のインキュベーションの後、血液を
デカントし、そして組織培養培地をIL−2(300単位/m
l)及びPHA(0.1μg/ml)により補充した。48〜72時間
の培養の後、CD8+細胞は、流動細胞計数分析により示さ
れるように、ポリスチレンの表面に共有結合される抗体
を残して、フラスコから自発的に分離し、その分離され
た細胞の表面上にモノクローナル抗体の不在を示す。次
に、その分離された細胞を、上記のようにIL−2及びPH
Aにより補充された標準組織培養チャンバー中で拡張す
る。
ト単核細胞(PBMC)を、共有結合された抗−CD8モノク
ローナル抗体を有するT−150ポリスチレンフラスコ中
に導入した。1時間のインキュベーションの後、血液を
デカントし、そして組織培養培地をIL−2(300単位/m
l)及びPHA(0.1μg/ml)により補充した。48〜72時間
の培養の後、CD8+細胞は、流動細胞計数分析により示さ
れるように、ポリスチレンの表面に共有結合される抗体
を残して、フラスコから自発的に分離し、その分離され
た細胞の表面上にモノクローナル抗体の不在を示す。次
に、その分離された細胞を、上記のようにIL−2及びPH
Aにより補充された標準組織培養チャンバー中で拡張す
る。
流動細胞計数法による分析は、CD8細胞表面マーカー
に対して100%陽性である集団及びCD8マーカーに対して
98%陽性である集団を示した。捕獲された細胞の表現型
は、CD8表面マーカーを担持する細胞毒性リンパ球のた
めに報告される記載と一致する。
に対して100%陽性である集団及びCD8マーカーに対して
98%陽性である集団を示した。捕獲された細胞の表現型
は、CD8表面マーカーを担持する細胞毒性リンパ球のた
めに報告される記載と一致する。
6人の健康な供給者からの捕獲されたCD8+細胞は、上
記のようなIL−2及びPHAを含む培地により培養におい
て15〜36日までの間、対数的に増殖することが示され
た。7日、10日、15日及び25日目での増殖の間の細胞の
分析は、CD3+,CD8+表現型が25日間の拡張の間じゅう接
続的であった(98%以上の陽性)ことを示す。コンカナ
バリンA−被覆されたCEM細胞を用いるレクチン依存性
細胞毒性アッセイにおいて、5人の異なった正常な供給
者からの細胞を複合溶解活性が決定された。実質的な溶
解は、標的に対するエフェクターの割合が2.5〜10の範
囲の割合で観察された。拡張の後、これらの同じCD8+細
胞は、健康な供給者からの正常な自己PBMCの溶解性を示
さない。従って、これらの細胞は、適切な標的細胞に対
して正常な細胞毒性活性を有し、ところが自己免疫細胞
毒性活性を欠いている。
記のようなIL−2及びPHAを含む培地により培養におい
て15〜36日までの間、対数的に増殖することが示され
た。7日、10日、15日及び25日目での増殖の間の細胞の
分析は、CD3+,CD8+表現型が25日間の拡張の間じゅう接
続的であった(98%以上の陽性)ことを示す。コンカナ
バリンA−被覆されたCEM細胞を用いるレクチン依存性
細胞毒性アッセイにおいて、5人の異なった正常な供給
者からの細胞を複合溶解活性が決定された。実質的な溶
解は、標的に対するエフェクターの割合が2.5〜10の範
囲の割合で観察された。拡張の後、これらの同じCD8+細
胞は、健康な供給者からの正常な自己PBMCの溶解性を示
さない。従って、これらの細胞は、適切な標的細胞に対
して正常な細胞毒性活性を有し、ところが自己免疫細胞
毒性活性を欠いている。
これらの細胞は、それらが、自己PBMCによる免疫攻撃
を受けやすくする変化を受けたかどうかを決定するため
に調べられた。クロムによりラベルされた自己CD8細胞
及び非自己CD8細胞に対して応答が供給者のPBMCの試験
された、異なった供給者からの2種の実験の結果は、ラ
ベルされていない非自己CD8+細胞によりイン ビトロで
感作した後、溶解は非自己CD8+細胞のためにのみ生じた
ことを示した。従って、CD8+細胞は、元の患者への再注
入の後、それらを自己免疫工程のための標的にする表面
の表現型の変化を受けない。
を受けやすくする変化を受けたかどうかを決定するため
に調べられた。クロムによりラベルされた自己CD8細胞
及び非自己CD8細胞に対して応答が供給者のPBMCの試験
された、異なった供給者からの2種の実験の結果は、ラ
ベルされていない非自己CD8+細胞によりイン ビトロで
感作した後、溶解は非自己CD8+細胞のためにのみ生じた
ことを示した。従って、CD8+細胞は、元の患者への再注
入の後、それらを自己免疫工程のための標的にする表面
の表現型の変化を受けない。
これらの細胞は、単離及び拡張の後、抗原特異性のMH
C制限細胞溶解活性を保持することが示された。CD8+細
胞は、EBV(エプスタイン−バールウィルス)−陽性の
健康な供給者から収穫され、そしてクロムによりラベル
されたEBV−感染性マイトマイシン−C処理された自己
B−細胞に対する特異的な細胞毒性について試験され
た。同時培養の間、減じられた量のIL−2がその培地に
添加され、EBV−感染性MHC制限自己B−細胞に対する特
異的反応性を有するCD8+細胞の選択的拡張を可能にし
た。このアッセイのための方法は、CD8+細胞は増殖され
るが、しかし感作されず、そして次に9日目及びその
後、クロム開放アッセイにゆだねられる対照を包含する
ことであった。この実験は、(1)感作の前、細胞のア
リコートが、日ゼロでクロム開放アッセイにゆだねら
れ、(2)他のアリコートが日ゼロで感作に使用され、
7日目で再び感作に使用され、そして次に、9日目及び
それ以後、クロム開放アッセイにゆだねられることを包
含する。結果は次の通りであった:(1)EBV−形質転
換性自己B−細胞に暴露されなかったCD8+細胞は、溶解
活性を示さず、(2)EBV−血清−陰性の健康な供給者
からのCD8+細胞を利用する対照培養は、感作されても又
は感作されなくても溶解活性をまた示さず、(3)EBV
−活性−陽性供給者からの感作されたCD8+細胞に関し
て、エフェクター:標的の比が3:12.5である比で%特異
性溶解は25〜約45の範囲であった。これらの結果は、冷
培養での14日後、収穫され、そして拡張されたCD8+細胞
が、宿主の抗原周囲に適切な抗原特異性MHC制限細胞毒
性を示すことを示す。
C制限細胞溶解活性を保持することが示された。CD8+細
胞は、EBV(エプスタイン−バールウィルス)−陽性の
健康な供給者から収穫され、そしてクロムによりラベル
されたEBV−感染性マイトマイシン−C処理された自己
B−細胞に対する特異的な細胞毒性について試験され
た。同時培養の間、減じられた量のIL−2がその培地に
添加され、EBV−感染性MHC制限自己B−細胞に対する特
異的反応性を有するCD8+細胞の選択的拡張を可能にし
た。このアッセイのための方法は、CD8+細胞は増殖され
るが、しかし感作されず、そして次に9日目及びその
後、クロム開放アッセイにゆだねられる対照を包含する
ことであった。この実験は、(1)感作の前、細胞のア
リコートが、日ゼロでクロム開放アッセイにゆだねら
れ、(2)他のアリコートが日ゼロで感作に使用され、
7日目で再び感作に使用され、そして次に、9日目及び
それ以後、クロム開放アッセイにゆだねられることを包
含する。結果は次の通りであった:(1)EBV−形質転
換性自己B−細胞に暴露されなかったCD8+細胞は、溶解
活性を示さず、(2)EBV−血清−陰性の健康な供給者
からのCD8+細胞を利用する対照培養は、感作されても又
は感作されなくても溶解活性をまた示さず、(3)EBV
−活性−陽性供給者からの感作されたCD8+細胞に関し
て、エフェクター:標的の比が3:12.5である比で%特異
性溶解は25〜約45の範囲であった。これらの結果は、冷
培養での14日後、収穫され、そして拡張されたCD8+細胞
が、宿主の抗原周囲に適切な抗原特異性MHC制限細胞毒
性を示すことを示す。
次の研究において、CD8+細胞を、HIV−陽性供与体か
ら得た。その細胞を上記のようにして、Ficoll−Hypaqu
e PBMCから収穫し、CD8装置により捕獲し、そして上記
のようにしてリンホカイン開放により回収した。100%
近くの生存率を有する18日間の培養における対数増殖
が、HIV−陽性供与体からのCD8+細胞により達成され
た。CD8+表現型は、イン ビトロでの拡張の間、実質的
に保持された(95%以上の陽性CD8)。これらの細胞
は、レシチン被覆されたCEM細胞に対して適切な細胞毒
性を示し、そしてK562標的に対するNK様溶解活性は示さ
なかった。さらに、CD8+細胞は、B−細胞免疫グロブリ
ン合成アッセイにおいてサプレッサー活性を示さなかっ
た。その細胞は形質転換されず、増殖相で維持するため
には一定のIL−2を必要とする。その細胞はHIVウィル
スを産生せず、そして洗浄の後、リンホカイン、PHA及
びモノクローナル抗体を有さない。
ら得た。その細胞を上記のようにして、Ficoll−Hypaqu
e PBMCから収穫し、CD8装置により捕獲し、そして上記
のようにしてリンホカイン開放により回収した。100%
近くの生存率を有する18日間の培養における対数増殖
が、HIV−陽性供与体からのCD8+細胞により達成され
た。CD8+表現型は、イン ビトロでの拡張の間、実質的
に保持された(95%以上の陽性CD8)。これらの細胞
は、レシチン被覆されたCEM細胞に対して適切な細胞毒
性を示し、そしてK562標的に対するNK様溶解活性は示さ
なかった。さらに、CD8+細胞は、B−細胞免疫グロブリ
ン合成アッセイにおいてサプレッサー活性を示さなかっ
た。その細胞は形質転換されず、増殖相で維持するため
には一定のIL−2を必要とする。その細胞はHIVウィル
スを産生せず、そして洗浄の後、リンホカイン、PHA及
びモノクローナル抗体を有さない。
拡張されたCD8+細胞は、安定した表現型、正常な溶解
活性を示し、他のタイプの細胞のためのマーカーの不在
を維持し、そして適切な標的細胞に対して細胞溶解活性
を有した。最っとも重要なことには、これらのCD8+細胞
は、イン ビトロで自己HIVウィルス複製の阻害を示し
た。これは、自己拡張されたCD8+細胞とHIVにより感染
されたCD4+細胞との組合せにより達成された。HIV複製
の完全な抑制は、7日後、1:0.25(CD4:CD8)のような
低い比で達成された。異なった期間及び異なったCD4:CD
8の比は、異なった供与体により包含されるが、しかし
すべての場合、HIV抑制は自己環境下で完結し、培養に
おいて35日間まで続いた(最長期間が試験された)。
活性を示し、他のタイプの細胞のためのマーカーの不在
を維持し、そして適切な標的細胞に対して細胞溶解活性
を有した。最っとも重要なことには、これらのCD8+細胞
は、イン ビトロで自己HIVウィルス複製の阻害を示し
た。これは、自己拡張されたCD8+細胞とHIVにより感染
されたCD4+細胞との組合せにより達成された。HIV複製
の完全な抑制は、7日後、1:0.25(CD4:CD8)のような
低い比で達成された。異なった期間及び異なったCD4:CD
8の比は、異なった供与体により包含されるが、しかし
すべての場合、HIV抑制は自己環境下で完結し、培養に
おいて35日間まで続いた(最長期間が試験された)。
要約すれば、これらのデータは、本発明の方法により
PBMCから捕獲され、そしてリンホカイン力により回収さ
れたCD8+細胞は、(1)表現型的に純粋であり、(2)
イン ビトロで指数増殖することができ、(3)指数増
殖の間、表現型的に安定しており、(4)可能性ある適
切な細胞毒性活性であることができ、(5)CD8+細胞が
HIV血清陽性供与体から捕獲される場合、自己CD4+細胞
におけるHIV複製を抑制することができ、(6)一般的
にMHC及び抗原制限細胞毒性を示し、(7)自己反応性
を示さず、(8)自己認識を示さず、(9)サプレッサ
ー細胞活性を示さず、(10)形質転換されず、(11)HI
Vウィルスを産生せず、そして(12)洗浄の後、培養過
程に由来する残留生物学的物質を保持しない。これらの
細胞は、種々の治療用途、たとえばAIDS、サイトメガロ
ウィルス感染、EBV感染、トキソプラスマ感染、等のた
めに適切である。さらに、CD8+細胞は、癌患者からの腫
瘍又はリンパ様均質物から本発明の方法により単離され
る場合、次の例に示されるように、実質的な抗−癌活性
を示す。
PBMCから捕獲され、そしてリンホカイン力により回収さ
れたCD8+細胞は、(1)表現型的に純粋であり、(2)
イン ビトロで指数増殖することができ、(3)指数増
殖の間、表現型的に安定しており、(4)可能性ある適
切な細胞毒性活性であることができ、(5)CD8+細胞が
HIV血清陽性供与体から捕獲される場合、自己CD4+細胞
におけるHIV複製を抑制することができ、(6)一般的
にMHC及び抗原制限細胞毒性を示し、(7)自己反応性
を示さず、(8)自己認識を示さず、(9)サプレッサ
ー細胞活性を示さず、(10)形質転換されず、(11)HI
Vウィルスを産生せず、そして(12)洗浄の後、培養過
程に由来する残留生物学的物質を保持しない。これらの
細胞は、種々の治療用途、たとえばAIDS、サイトメガロ
ウィルス感染、EBV感染、トキソプラスマ感染、等のた
めに適切である。さらに、CD8+細胞は、癌患者からの腫
瘍又はリンパ様均質物から本発明の方法により単離され
る場合、次の例に示されるように、実質的な抗−癌活性
を示す。
C.腫瘍湿潤性リンパ球 癌患者からの腫瘍又はリンパ様組織の酵素消化により
得られた細胞懸濁液を、表面に結合されるCD4又はCD8モ
ノクローナル抗体を含む装置中に導入した。CD4+又はCD
8+細胞を捕獲し、そしてそれらを音波処理又はリンホカ
イン力のいづれかにより回収した後、その回収された細
胞は、98%以上生存しており、そして95%以上表現型的
に純粋なCD4+又はCD8+であることが示された。試験され
たすべての場合において、精製されたCD4+又は精製され
たCD8+細胞のいづれかは、分離されていない出発組織懸
濁液と少なくとも同じほど自己腫瘍細胞毒性を示した。
精製された集団は、同種免疫腫瘍の非特異的殺害を示さ
なかった。精製された集団は、対数増殖することがで
き、生存性を維持することができ、表現型的均等性及び
自己腫瘍細胞毒性を示すことができた。細胞毒性細胞の
表現型は、腫瘍型の間で異なり、すなわちCD8+は黒色腫
及び麟状細胞癌のために卓越し、CD4+は腎細胞癌のため
に卓越する。
得られた細胞懸濁液を、表面に結合されるCD4又はCD8モ
ノクローナル抗体を含む装置中に導入した。CD4+又はCD
8+細胞を捕獲し、そしてそれらを音波処理又はリンホカ
イン力のいづれかにより回収した後、その回収された細
胞は、98%以上生存しており、そして95%以上表現型的
に純粋なCD4+又はCD8+であることが示された。試験され
たすべての場合において、精製されたCD4+又は精製され
たCD8+細胞のいづれかは、分離されていない出発組織懸
濁液と少なくとも同じほど自己腫瘍細胞毒性を示した。
精製された集団は、同種免疫腫瘍の非特異的殺害を示さ
なかった。精製された集団は、対数増殖することがで
き、生存性を維持することができ、表現型的均等性及び
自己腫瘍細胞毒性を示すことができた。細胞毒性細胞の
表現型は、腫瘍型の間で異なり、すなわちCD8+は黒色腫
及び麟状細胞癌のために卓越し、CD4+は腎細胞癌のため
に卓越する。
D.リンホカイン活性化キラー細胞(LAK) 次の例においては、抗−CD5、抗−CD14及び抗−CD20
モノクローナル抗体が、NK−細胞についての負の選択に
より富化するためにPBMCを消耗する本発明の装置に使用
された。抗体は、CD5+表現型を約98%以上、CD14+表現
型を50%以上及びCD20+表現型を90%以上消耗すること
ができることが示された。LAK細胞を得るために、1.5×
108個の単核細胞が、CD5モノクローナル抗体を含む収集
装置に添加された。30分間のインキュベーションの後、
非付着性細胞をデカントすることにより回収し、そして
共有結合される抗−CD14抗体を含む装置に移した。イン
キュベーションの後、非付着性細胞をデカントすること
により再び回収し、そして第3装置に移した。この装置
は表面に共有結合されるCD20モノクローナル抗体を含
む。インキュベーションを室温で30分間、再び行なっ
た。次に、第3集団の非付着性細胞を48〜72時間、IL−
2中で培養し、そしてそれらの溶解活性を、NK活性のた
めにはK562及びLAK活性のためにはCOLO−205細胞を用い
て、標準の4時間クロム開放アッセイにより検出した。
標的に対するエフェクターの異なった割合についての%
特異的溶解性を決定し、ここで標的に対するエフェクタ
ーの割合は2.5〜20であった。いくつかの異なった正常
な供与体からの細胞を用いれば、LAK活性の富化は、同
一の条件下で培養された投入細胞よりも50%〜300%異
なった。
モノクローナル抗体が、NK−細胞についての負の選択に
より富化するためにPBMCを消耗する本発明の装置に使用
された。抗体は、CD5+表現型を約98%以上、CD14+表現
型を50%以上及びCD20+表現型を90%以上消耗すること
ができることが示された。LAK細胞を得るために、1.5×
108個の単核細胞が、CD5モノクローナル抗体を含む収集
装置に添加された。30分間のインキュベーションの後、
非付着性細胞をデカントすることにより回収し、そして
共有結合される抗−CD14抗体を含む装置に移した。イン
キュベーションの後、非付着性細胞をデカントすること
により再び回収し、そして第3装置に移した。この装置
は表面に共有結合されるCD20モノクローナル抗体を含
む。インキュベーションを室温で30分間、再び行なっ
た。次に、第3集団の非付着性細胞を48〜72時間、IL−
2中で培養し、そしてそれらの溶解活性を、NK活性のた
めにはK562及びLAK活性のためにはCOLO−205細胞を用い
て、標準の4時間クロム開放アッセイにより検出した。
標的に対するエフェクターの異なった割合についての%
特異的溶解性を決定し、ここで標的に対するエフェクタ
ーの割合は2.5〜20であった。いくつかの異なった正常
な供与体からの細胞を用いれば、LAK活性の富化は、同
一の条件下で培養された投入細胞よりも50%〜300%異
なった。
本発明の装置に由来する細胞集団は、T−及びB−細
胞を実際に有さないLAK前駆体のために実質的に富化さ
れ、そして単球を有意に消耗することが示された。本発
明の装置により精製されたLAK前駆体の表現型は、CD3-,
CD16-及びLeu19+であることが見出された。
胞を実際に有さないLAK前駆体のために実質的に富化さ
れ、そして単球を有意に消耗することが示された。本発
明の装置により精製されたLAK前駆体の表現型は、CD3-,
CD16-及びLeu19+であることが見出された。
次の研究においては、溶解単位活性が、精製されたサ
ンプルにおけるNK細胞の表現型富化と釣り合いを失って
高められるかどうかの問題が論議された。溶解単位を、
106個のNKエフェクター細胞当たりの投入画分及び精製
された画分について計算した。106個のNKエフェクター
細胞当たり溶解単位の2〜50倍の上昇が、前記3段階モ
ノクローナル抗体陰性消耗方法により達成された。これ
は、単球、B−細胞、T−細胞消耗法が、NKエフェクタ
ー細胞当たりに表わされる溶解単位活性を2〜50倍、高
めることを確立した。この上昇は、LAK活性に体して阻
害的影響を直接的又は間接的に及ぼす他の細胞の除去に
より達成される。Nii,など.,Int.J.Cancer(198)41:33
〜40;Hoyerなど.,Cancer Res.(1986)46:2834〜2938を
参照のこと。これらの著者は、活性化された自己単球に
よりヒトリンホカインIL−2活性化キラー細胞活性のダ
ウンレギュレーションを報告する。この方法は、NK活性
化を行なうために必要とされる培養供給源の節約をもた
らす合計細胞数の90%減少を達成し;そして溶解活性に
おける2〜50倍の増加率がNKエフェクター細胞基礎当た
りに表わされた。
ンプルにおけるNK細胞の表現型富化と釣り合いを失って
高められるかどうかの問題が論議された。溶解単位を、
106個のNKエフェクター細胞当たりの投入画分及び精製
された画分について計算した。106個のNKエフェクター
細胞当たり溶解単位の2〜50倍の上昇が、前記3段階モ
ノクローナル抗体陰性消耗方法により達成された。これ
は、単球、B−細胞、T−細胞消耗法が、NKエフェクタ
ー細胞当たりに表わされる溶解単位活性を2〜50倍、高
めることを確立した。この上昇は、LAK活性に体して阻
害的影響を直接的又は間接的に及ぼす他の細胞の除去に
より達成される。Nii,など.,Int.J.Cancer(198)41:33
〜40;Hoyerなど.,Cancer Res.(1986)46:2834〜2938を
参照のこと。これらの著者は、活性化された自己単球に
よりヒトリンホカインIL−2活性化キラー細胞活性のダ
ウンレギュレーションを報告する。この方法は、NK活性
化を行なうために必要とされる培養供給源の節約をもた
らす合計細胞数の90%減少を達成し;そして溶解活性に
おける2〜50倍の増加率がNKエフェクター細胞基礎当た
りに表わされた。
上記データは、本発明の方法が、IL−2/LAK療法の効
力を改良し、治療の費用を低くし、そしてIL−2活性化
の後、再湿潤のために標的とされる合計溶解活性を生成
するために必要な白血球搬出により得られる細胞の合計
数を低めることにより本発明の方法の毒性を減じること
を示す。
力を改良し、治療の費用を低くし、そしてIL−2活性化
の後、再湿潤のために標的とされる合計溶解活性を生成
するために必要な白血球搬出により得られる細胞の合計
数を低めることにより本発明の方法の毒性を減じること
を示す。
E.サプレッサー−インデューサー細胞 前記方法に類似する態様において、サプレッサー/イ
ンデューサー細胞、すなわち特定のサプレッサー細胞を
誘発する細胞に結合するモノクローナル抗体2H4を用い
て、自己免疫疾患を処理するためにサプレッサー/イン
デューサー細胞を収穫し、回収し、活性化し、そして拡
張することができる。サプレッサー/インデューサー細
胞は、PBMCから明確に選択され、音波処理により収集装
置から回収され、拡張され、そして従来の方法に従って
数的に活性化されるであろう。これらの拡張され、そし
て活性化されたサプレッサー/インデューサー細胞は、
問題の自己免疫疾患を有する元の患者に再注入され、こ
れが、患者の病態生理学に対して適切なサプレッサー細
胞活性の誘発をもたらすであろう。
ンデューサー細胞、すなわち特定のサプレッサー細胞を
誘発する細胞に結合するモノクローナル抗体2H4を用い
て、自己免疫疾患を処理するためにサプレッサー/イン
デューサー細胞を収穫し、回収し、活性化し、そして拡
張することができる。サプレッサー/インデューサー細
胞は、PBMCから明確に選択され、音波処理により収集装
置から回収され、拡張され、そして従来の方法に従って
数的に活性化されるであろう。これらの拡張され、そし
て活性化されたサプレッサー/インデューサー細胞は、
問題の自己免疫疾患を有する元の患者に再注入され、こ
れが、患者の病態生理学に対して適切なサプレッサー細
胞活性の誘発をもたらすであろう。
上記結果は、異なった表面マーカーを有する広範囲の
種類の細胞を単離することにおける本発明の装置及び方
法の力を示す。この方法は、研究、診断及び治療に使用
され得る。さらに、この方法は、ひじょうに高い%で細
胞の生存率を保持しながら、細胞の収集、拡張及び活性
化を可能にする。さらに、血液又は組織の抗原性成分、
たとえば免疫複合体又は腫瘍細胞又は正常な組織が患者
から採取され、そして抗原又は細胞に対する特異的応答
を活性化し又は非活性化するために使用される。従っ
て、細胞応答は、広範囲の種類の疾病、たとえば幹細胞
がそれらの表現型を変性するためにトランスフェクトさ
れている遺伝病;サプレッサー細胞が免疫応答を抑制す
るために使用され得る自己免疫疾患;キラー細胞がそれ
らの処理に使用される癌及びウィルス性疾病;及びヘル
パー及びB−細胞が広範囲の種類の病原体に対する保護
に使用され得る病原体由来の疾病に提供され得る。
種類の細胞を単離することにおける本発明の装置及び方
法の力を示す。この方法は、研究、診断及び治療に使用
され得る。さらに、この方法は、ひじょうに高い%で細
胞の生存率を保持しながら、細胞の収集、拡張及び活性
化を可能にする。さらに、血液又は組織の抗原性成分、
たとえば免疫複合体又は腫瘍細胞又は正常な組織が患者
から採取され、そして抗原又は細胞に対する特異的応答
を活性化し又は非活性化するために使用される。従っ
て、細胞応答は、広範囲の種類の疾病、たとえば幹細胞
がそれらの表現型を変性するためにトランスフェクトさ
れている遺伝病;サプレッサー細胞が免疫応答を抑制す
るために使用され得る自己免疫疾患;キラー細胞がそれ
らの処理に使用される癌及びウィルス性疾病;及びヘル
パー及びB−細胞が広範囲の種類の病原体に対する保護
に使用され得る病原体由来の疾病に提供され得る。
本明細書に引用されるすべての出版物及び特許出願
は、引用により本明細書に組込まれる。
は、引用により本明細書に組込まれる。
前述の発明は、明確に理解するために例示的及び例的
にいくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の
範囲内で修飾および変更を行なうことができる。
にいくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の
範囲内で修飾および変更を行なうことができる。
第1図は、本発明の捕獲装置のために末梢血液又は骨髄
から細胞を調製するための方法の図であり;そして 第2図は、細胞捕獲装置の内部の略図である。 図中の主な番号の説明:10:分離容器、12:上清液、14:
管、20:標的細胞、26:細胞捕獲装置、30:ポリスチレン
フィルム又はシート、34:受容体、36:ダクト。
から細胞を調製するための方法の図であり;そして 第2図は、細胞捕獲装置の内部の略図である。 図中の主な番号の説明:10:分離容器、12:上清液、14:
管、20:標的細胞、26:細胞捕獲装置、30:ポリスチレン
フィルム又はシート、34:受容体、36:ダクト。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−113898(JP,A) 特開 平2−150274(JP,A) 特表 昭62−501233(JP,A) 国際公開88/4692(WO,A1)
Claims (28)
- 【請求項1】細胞の少なくとも幾つかに存在する少なく
とも1つのリガンドに対して特異的な受容体が均一な密
度分布で共有結合しているポリスチレン表面を用いて細
胞の混合物の組成を変更する方法であって、 前記リガンドを含有する細胞が前記表面に特異的に結合
するのに十分な時間にわたり、前記表面を前記細胞の混
合物に接触せしめ;そして 特異的に結合した細胞を有意に攪乱することなく特異的
に結合していない細胞を放出させて特異的に結合しない
細胞から実質上成る組成物を得る; ことを含んで成る方法。 - 【請求項2】細胞の少なくとも幾つかに存在する少なく
とも1つのリガンドに対して特異的な受容体が均一な密
度分布で共有結合しているポリスチレン表面を用いて細
胞の混合物の組成を変更する方法において、前記表面は
シート、繊維、又は容器の壁もしくはパーティションで
あり、 前記リガンドを含有する細胞が前記表面に特異的に結合
するのに十分な時間にわたり前記表面を前記細胞の混合
物に接触せしめ;そして 前記特異的に結合した細胞を攪乱することなく特異的に
結合しない細胞を放出させて特異的に結合しない細胞か
ら実質上成る組成物を得る; ことを含んで成る方法。 - 【請求項3】前記繊維が中空繊維である請求項2に記載
の方法。 - 【請求項4】前記特異的に結合していない細胞の放出の
段階の後、受容体を実質的に含有しない特異的に結合し
た細胞を放出させて特異的に結合する細胞の組成物を得
ることをさらに含んで成る、請求項1〜3のいずれか1
項に記載の方法。 - 【請求項5】前記放出が、物理的方法により、あるいは
マイトジエン剤及び/又はイイターロイキン及び/又は
成長因子による処理により行われる、請求項4に記載の
方法。 - 【請求項6】前記細胞が造血系細胞である、請求項1〜
5のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項7】特異的に結合していない細胞、又は特異的
に結合する細胞を伴わない特異的に結合していない細胞
を、活性化剤、抗原、結合した細胞の表面蛋白質に結合
することができる細胞、免疫複合体、マイトジエン剤、
トランスフェクションベクター、活性化抗体又は細胞毒
性剤の少なくとも1つと接触せしめることをさらに含ん
で成る、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項8】特異的に結合しない細胞から実質上成る前
記組成物が対象を処理するため細胞性療法組成物であ
り、前記受容体がモノクローナル抗体を含んで成る、請
求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項9】前記特異的に結合していない細胞を増殖せ
しめることをさらに含んで成る、請求項8に記載の方
法。 - 【請求項10】特異的に結合する細胞から実質上成る前
記組成物が対象を処理するための細胞性療法組成物であ
り、前記受容体がモノクローナル抗体を含んで成る、請
求項4又は5に記載の方法。 - 【請求項11】前記特異的に結合する細胞を増殖せしめ
ることをさらに含んで成る、請求項10に記載の方法。 - 【請求項12】前記細胞性療法組成物が骨髄移植におけ
る使用のために適当なものであり、そして 細胞の混合物が骨髄提供者からの骨髄細胞を含んで成
り、そして 前記モノクローナル抗体がCD8及び/又はCD5に対して特
異的である、 請求項8又は9に記載の方法。 - 【請求項13】前記モノクローナル抗体がCD8及びCD5に
対して特異的である、請求項12に記載の方法。 - 【請求項14】前記細胞性療法組成物が移植における使
用のために適当であり、 前記細胞の混合物は骨髄又は末梢血を含んでなり、そし
て 前記モノクローナル抗体はCD34に対して特異的である請
求項10又は11に記載の方法。 - 【請求項15】前記細胞性療法組成物が遺伝子治療にお
ける使用のために適当であり、 前記細胞の混合物は末梢血又は骨髄を含んで成り、そし
て 前記モノクローナル抗体はCD34に対して特異的である、 請求項10又は11に記載の方法。 - 【請求項16】前記細胞性療法組成物がウイルスに感染
された対象の処理のために適当であり、 前記細胞の混合物が末梢血単核細胞を含んで成り、そし
て 前記モノクローナル抗体がCD8に対して特異的である、 請求項10又は11に記載の方法。 - 【請求項17】前記細胞性療法組成物が新生物を有する
対象の処理のために適当であり、 前記細胞の混合物が、新生物を有する対象からの腫瘍又
はリンパ組織懸濁液を含んで成り、そして 前記モノクローナル抗体がCD8又はCD4に対して特異的で
ある、 請求項10又は11に記載の方法。 - 【請求項18】前記細胞性療法組成物が、リンホカイン
で活性化されたキラー細胞が濃縮された組成物であり、 前記細胞の混合物が末梢血単核細胞であり、そして 前記モノクローナル抗体がCD5,CD14及びCD20に対して特
異的である、 請求項8又は9に記載の方法。 - 【請求項19】前記細胞性療法組成物が自己免疫疾患の
治療のために適当であり、 前記細胞の混合物が末梢血単核細胞を含んで成り、そし
て 前記モノクローナル抗体がサプレッサー−インデューサ
ー細胞に対して特異的である、 請求項10又は11に記載の方法。 - 【請求項20】細胞の少なくとも幾つかに存在する少な
くとも1つのリガンドに対して特異的な受容体が均一な
密度分布で共有結合しているポリスチレン表面を用いて
細胞の混合物の組成を変更する方法であって、 前記リガンドを含有する細胞が前記表面に特異的に結合
するのに十分な時間にわたり、前記表面を前記細胞の混
合物に接触せしめ;そして 特異的に結合した細胞を放出させる; ことを含んで成る方法。 - 【請求項21】前記放出が、音波処理により、あるいは
インターロイキン及び/又は増殖因子及び/又はマイト
ジエン剤による処理によって行われる、請求項20に記載
の方法。 - 【請求項22】前記特異的に結合する細胞を増殖せしめ
ることをさらに含んで成る、請求項20又は21に記載の方
法。 - 【請求項23】前記受容体がモノクローナル抗体を含ん
で成る、請求項20〜22のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項24】前記細胞性療法組成物が移植における使
用のために有用であり、 前記細胞の混合物が骨髄又は末梢血を含んで成り、そし
て 前記モノクローナル抗体がCD34+に対して特異的であ
る、 請求項23に記載の方法。 - 【請求項25】前記細胞性療法組成物が遺伝子治療にお
ける使用のために適当であり、 前記細胞の混合物が末梢血細胞又は骨髄を含んで成り、
そして 前記モノクローナル抗体がCD34+に対して特異的であ
る、 請求項23に記載の方法。 - 【請求項26】前記細胞性療法組成物が、ウイルスに感
染した対象の処理のために適当であり、 前記細胞の混合物が末梢血単核細胞を含んで成り、そし
て 前記モノクローナル抗体がCD8に対して特異的である、 請求項23に記載の方法。 - 【請求項27】前記細胞性療法組成物が、新生物を有す
る対象の処理のために適当であり、 前記細胞の混合物が新生物を有する患者からの腫瘍又は
リンパ組織懸濁液を含んで成り、そして 前記モノクローナル抗体がCD8又はCD4に対して特異的で
ある、 請求項23に記載の方法。 - 【請求項28】前記細胞性療法組成物が自己免疫疾患の
処理のために適当であり、 前記細胞の混合物が末梢血単核細胞を含んで成り、そし
て 前記モノクローナル抗体がサプレッサー−インデューサ
ー細胞に対して特異的である、 請求項23に記載の方法。
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