CN103383394A

CN103383394A - 果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-elisa检测方法

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Publication number: CN103383394A
Application number: CN2013102541479A
Authority: CN
Inventors: 岳田利; 王周利; 袁亚宏; 蔡瑞; 牛晨; 郭彩霞
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2033-06-24
Also published as: CN103383394B

Abstract

本发明公开了果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法，方法包括：利用脂环酸芽孢杆菌免疫磁微球对果汁样品中的脂环酸芽孢杆菌进行分离富集得到待检测富集样品；利用ELISA检测方法检测待检测富集样品中是否存在脂环酸芽孢杆菌；所用的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球是用胺基化磁性微球包被氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体而得到的。本发明通过抗原-抗体的特异性识别，将脂环酸芽孢杆菌吸附到免疫磁性微球表面，在磁场的作用下分离富集获得脂环酸芽孢杆菌样品，通过ELISA检测体系，对目标菌体进行识别。相对于现有的ELISA检测方法，该方法具有检测限低、时效性和准确性更可靠的特点。

Description

果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法

技术领域

本发明属于食品微生物检测的检测技术领域，具体涉及果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法。

背景技术

现有的果汁中脂环酸芽孢杆菌的ELISA检测方法主要有：

文献1：Zhouli Wang,Tianli Yue,Yahong Yuan,et al.Development of Polyclonal Antibody-Based Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Alicyclobacillus Strains in Apple Juice.Journal of food science,2012,77:M643-M649公开的果汁中脂环酸芽孢杆菌的ELISA检测；以及

文献2：Jianke Li,Kai Xia,Chaozhou Yu.Detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in apple juice concentrate by enzyme-linked immunosorbent assay.Food control,2013,30:251-254.中公开的脂环酸芽孢杆菌的ELISA检测。

上述文献公开的ELISA检测方法的检测限为10⁵CFU/mL，在实际果汁样品的检测中，需要经过富集培养才可以实现对低浓度脂环酸芽孢杆菌的检测，在时效性方面不能满足快速检测的要求，并且因直接用果汁样品检测，果汁样品复杂的背景环境及其他菌体的存在，也会对ELISA检测产生一定的负面影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测限相对较低且检测速度快而准确的果汁中脂环酸芽孢杆菌的ELISA检测方法，以解决现有技术存在的检测限相对较高、时效性和可靠性相对较差的问题。

为此，本发明提供的果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法包括：

利用脂环酸芽孢杆菌免疫磁性微球对果汁样品中的脂环酸芽孢杆菌进行分离富集得到待检测富集样品；

利用ELISA检测方法检测待检测富集样品中是否存在脂环酸芽孢杆菌；

所述的脂环酸芽孢杆菌免疫磁性微球是用胺基化磁性微球包被氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体而得到的；

所述氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的制备方法包括：利用含过硫酸钠的PBS缓冲液对脂环酸芽孢杆菌特异性抗体进行氧化处理，之后收集获得氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。

所述的果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法包括：

将脂环酸芽孢杆菌免疫磁性微球加入果汁样品中对脂环酸芽孢杆菌进行吸附分离，所述果汁样品的可溶性固形物含量小于等于15°Brix；

将吸附有脂环酸芽孢杆菌的脂环酸芽孢杆菌免疫磁性微球用浓度为0.1mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液悬浮得待检测富集样品，且每5mg脂环酸芽孢杆菌免疫磁性微球的PBS缓冲液用量为100-250μL；

利用ELISA检测方法检测待检测富集样品中是否存在脂环酸芽孢杆菌。

所述果汁样品的可溶性固形物含量为10-15°Brix。

进一步，采用Sephadex G-25层析柱收集获得氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。

所述的氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体制备方法还包括：

所述含过硫酸钠的PBS缓冲液中过硫酸钠浓度为10mg/mL，PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L、pH值为7.4；

所述脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为（1-3mg）/mL；所述含过硫酸钠的PBS缓冲液与脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的体积比为（1-3）：1。

所述的胺基化磁性微球的制备方法包括：

（1）80-90℃条件下，Fe₃O₄磁核在硅酸钠溶液中进行硅烷化反应制备硅烷化磁性微球；所述硅酸钠溶液的质量浓度为4%-5%、PH大于11；

（2）调节硅烷化磁性微球的PH呈中性；

（3）80-90℃条件下，将PH呈中性的硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷、去离子水和甘油混合反应制备胺基化磁性微球；所述硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷、去离子水和甘油的用量为：

硅烷化磁性微球：（1-2g）/毫升

甲醇： 150体积，

3-氨丙基三乙氧基硅烷： 10体积，

去离子水： 1体积，

甘油： 150-161体积。

所述的Fe₃O₄磁核的粒径为15-25nm、磁性的饱和磁化强度为（40-80emu）/g。

所述的氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为（1-2mg）/毫升，且每毫升氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体用20mg的胺基化磁性微球包被。

进一步，利用封闭液封闭所述的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球，所述封闭液的组分量为：每100ml浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液中含有1-10克BSA和0.05ml Tween-20。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）本发明通过抗原-抗体的特异性识别，将脂环酸芽孢杆菌吸附到免疫磁性微球表面，在磁场的作用下分离富集获得脂环酸芽孢杆菌样品，通过ELISA检测体系，对目标菌体进行识别。

（2）本发明获得的免疫磁分离-ELSIA检测方法，速度快、成本低，无需特殊试剂和样品前处理即可实现检测样品中目标菌体的分离、富集与即时检测，且样品用量少，操作方便无破坏性，不会影响苹果汁的品质，为生产实践和现场检验提供了更加有效、快速的方法。

（3）本发明提供的检测方法的检测限为10³CFU/mL。

（4）本发明中的胺基化磁性微球具有特异性结合位点，可以实现对抗体的高效及特异性固定化，有效保留了抗体-抗原反应结合位点。

（5）本发明的脂环酸芽孢杆菌特异性抗体氧化处理方法中抗体的Fc区域的糖链羟基部分被氧化为醛基，且保留了抗体的识别位点；处理后的抗体可与磁性微球的胺基部分高效结合，并保留了抗体的Fab活性区域，保证对目标菌体的有效识别和分离。

（6）本发明的制备方法中抗体有效结合到磁性微球表面，并保留了对脂环酸芽孢杆菌高度特异性分离和富集特性。尤其是经封闭处理后的免疫磁性微球可实现脂环酸芽孢杆菌的有效分离。

（7）采用本发明的胺基化磁性微球的制备方法制备的胺基化磁性微球的粒径为45-55nm、磁性的饱和磁化强为（40-60emu）/g。

附图说明

图1为磁性微球的APTES胺基化改性及制备图；

图2为免疫磁性微球的制备流程图；

图3为不同浓度BSA封闭对免疫磁性微球特异性吸附影响（以Fe₃O₄磁核吸附抗体获得的免疫磁珠为对照），该图的横坐标为：封闭液中BSA的质量浓度，纵坐标为菌体分离率；

图4为不同浓度脂环酸芽孢杆菌标准菌株免疫磁分离效果图，该图的横坐标为菌体浓度，纵坐标为菌体分离率。

具体实施方式

免疫磁性微球作为一种材料化学与免疫学技术相结合发展形成的高新技术，通过磁性微球与抗体的表面化学基因或者表面吸附力实现磁性微球与抗体的有效结合。在免疫磁性分离过程中，利用抗原-抗体的高度特异性识别作用，使细胞表面抗原或者某种蛋白与连接有磁性微球的特异性抗体结合，形成固相抗体-抗原的复合物。在外磁场的作用下，利用磁性微球在磁场中的超顺磁性，使磁性微球载抗原-抗体复合物与其他组分分离，从而达到目标菌体分离与富集的目的。由于免疫磁性微球代替其他固相载体用于目标菌体的分离，具有方法简单易行、特异性高、损失小，兼顾免疫分离与富集结合为一体，分离效率远高于常规分离方法。同时，免疫磁分离结合PCR、ELISA及其他检测手段进行微生物检测，具有灵敏度高、时间短等巨大优势。

结合图1和图2，本发明对脂环酸芽孢杆菌特异性抗体进行氧化处理，将抗体可结晶段（Fc区域）糖链部分转化成醛基，并以APTES胺基化处理的磁性微球为载体，实现了脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的定向固定化。通过这种方式，可以使抗体与磁性微球的结合位点远离抗原结合区，从而最大程度保留了抗体的活性位点。

本发明的果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法是先利用相应地脂环酸芽孢杆菌免疫磁性微球对果汁中的脂环酸芽孢杆菌进行分离富集，然后采用常规的ELSIA检测方法对富集样品中的脂环酸芽孢杆菌进行检测。且ELSIA检测的样品是以PBS缓冲液悬浮的其上吸附有脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球的悬浮液。

适用本发明的ELSIA检测方法为常规的ELSIA检测方法，如文献1和文献2公开的果汁中脂环酸芽孢杆菌的ELSIA检测方法。在样品的ELISA检测过程中，每一步操作之间均有充分洗涤的步骤。如果待测样品中不含有脂环酸芽孢杆菌，在检测过程中样品体系、酶标抗体被冲洗掉，底物显色液没有颜色反应，检测结果显示为阴性。当待测样品中含有目标具体且达到ELISA检测浓度，则ELISA检测过程中底物显色并呈阳性结果。

本发明使用的脂环酸芽孢杆菌特异性抗体为文献Zhouli Wang,Tianli Yue,Yahong Yuan,et al.Development of Polyclonal Antibody-Based Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Alicyclobacillus Strains in Apple Juice.Journal of food science,2012,77:M643-M649中公开的脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。具体是将脂环酸芽孢杆菌标准菌株活化，摇瓶培养，取培养18～24h的新鲜菌液，充分、离心后倒掉上清液，加入适量生理盐水，使菌体重新悬浮，最后调整菌液浓度为10⁸CFU/mL-10⁹CFU/mL，灭活，得到免疫原。对免疫原乳化后按照多点注射法对兔子进行免疫，以7天为周期，采血，用ELISA测定获得血清的效价。待抗体效价达到要求后，采血、纯化、分装，最终获得脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。

以下是发明人提供的实施例及相关效果试验，以对本发明的技术方案作进一步解释说明。

以下实施例中所用的菌株及试剂：

Alicyclobacillus acidoterrestris(DSM3922)、Alicyclobacillus acidoterrestris(DSM2498)、Alicyclobacillus pomorum(DSM14955)、Alicyclobacillus fastidiosus(DSM17978)和Alicyclobacillus acidiphilus(DSM14558)购于德国微生物菌种保藏中心；Saccharomyces cerevisiae(CICC-1027)、Bacillus subtilis(CICC10034)、Enterobacter cloacae(CICC10017)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

质量浓度为36.5%的盐酸。

以下实施例中所用主要试剂配制方法：

①磷酸缓冲液1：（0.1mol/L PBS，pH9.6）

NaCl：8.0g；KH₂PO₄：0.24g；KCl：0.2g；Na₂HPO₄·12H₂O：1.44g；用蒸馏水溶解，定容至100mL，调节至所需pH。

②磷酸缓冲液2（0.01mol/L PBS，pH7.4）

准确称取试剂，溶解方式同试剂磷酸缓冲液1，定容至1L，调节至所需pH。

③包被缓冲液（0.05M、pH9.6碳酸盐缓冲液）

Na₂CO₃：1.59g；NaHCO₃：2.93g蒸馏水溶解，定容至1L，调节pH至9.6。

④封闭混合液

称取0.5gBSA，用0.01MPBS（pH7.4）溶解并定容至100mL。

⑤洗涤液（PBS-T）

称取药品同试剂磷酸缓冲液1，用蒸馏水溶解后，加入0.5mL Tween-20，并定容至1L，调节pH至7.4。

⑥抗体稀释液

称取0.1g BSA，用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液溶解并定容至100mL。

⑦底物缓冲液

A液（0.1mol/L）：称取20.141g柠檬酸，用蒸馏水溶解并定容至1L。使用前一天配制，4℃保存。

B液（0.2mol/L）：称取28.4g Na₂HPO₄用蒸馏水溶解并定容至1L。

取A液24.3mL，B液25.7mL混合后，加蒸馏水定容至100mL，调节pH至5.0。

⑧显色液

10mgTMB溶于4mL乙醇，制备成TMB储存液，4℃保存。使用时，取0.4mLTMB储存液，底物缓冲液10mL和30%H₂O₂10μl混合均匀。

⑨终止液（2MH₂SO₄溶液）

移取22.2mL浓硫酸，用蒸馏水稀释，待冷却后定容至200mL。

以下实施例中采用投射电镜扫描检测Fe₃O₄磁核或胺基化磁性微球的粒径；采用振动试样磁力计测定Fe₃O₄磁核或胺基化磁性微球的磁性的饱和磁化强度。

实施例1：

（1）磁性微球的硅烷化反应

将9.5g硅酸钠溶解于200mL去离子水中并用盐酸调整pH值为12-13，向硅酸钠溶液中加入5gFe₃O₄磁核超声处理30min，在80-90℃水浴条件下用盐酸调整反应体系pH值为6-7，磁性分离获得微球并水洗得pH呈中性的硅烷化磁性微球；

（2）磁性微球的胺基化改性

2克硅烷化磁性微球悬浮液、1mL去离子水和10mL APTES加入150mL甲醇中，超声处理30min后加入150mL甘油，85-90℃充分反应3h，磁性分离获得微球，并用甲醇和去离子水分别洗涤三次，冷冻干燥，获得胺基化磁性微球，并且经检测得该胺基化磁性微球的粒径为45-55nm、磁性的饱和磁化强为46.82emu/g；

（3）脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的氧化处理

将1mL浓度为2mg/mL的脂环酸芽孢杆菌特异性抗体溶液加入2ml含有20mg过硫酸钠的PBS缓冲液中（PBS的浓度为0.1mol/L，pH值7.4），37℃条件下反应30min；氧化反应结束后，采用Sephadex G-25层析柱过滤、除盐并分离得到氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体，液体流速为0.5mL/min；

（4）脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球的制备：

将制备获得的2mg胺基化磁性微球与100μL浓度为2mg/mL的氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体于37℃条件下120-180rpm搅拌反应30min，磁性分离并洗涤，得到包被抗体的免疫磁性微球。

实施例2：

该实施例与实施例1不同之处在于，该实施例中所用的Fe₃O₄磁核是采用下述方法制备的：

将3.4g的FeCl₃·6H₂O与1.2g的FeCl₂·4H₂O加入到800mL去离子水中，并加入4gPEG-4000，在氮气保护下充分搅拌溶解，逐滴加入氨水溶液使反应体系pH大于10；之后反应体系在75-85℃水浴中充分熟化20-40min，磁性分离获得微球并水洗获得Fe₃O₄磁核；经检测得该Fe₃O₄磁核粒径为15-25nm、磁性的饱和磁化强度为72.18emu/g。

实施例3：

该实施例与实施例1不同之处在于：该实施例的免疫磁性微球经封闭液封闭处理：以每100ml PBS（0.01M、pH7.4）缓冲液中含有5g BSA和0.05ml Tween-20的混合体系为封闭液，加入吸附抗体的免疫磁性微球于37℃条件下作用60min，然后磁性分离并充分洗涤后得到封闭处理后的免疫磁性微球。

一、利用实施例3制备的免疫磁性微球对脂环酸芽孢杆菌进行分离：

具体操作步骤为：配制表1中所示的浓度梯度样品各10mL，每个样品中加入20mg免疫磁性微球进行目标菌体的分离去除：120-180rpm、反应吸附时间60min；磁性分离吸附菌体的免疫磁性微珠，无菌水洗涤免疫磁性微珠并悬浮于200μL PBS缓冲液中，采用涂布法计算分离前后菌体浓度变化，评价菌体分离效果。结果如表1所示：

表1

菌体浓度（CFU/mL）	10²	10³	10⁴	10⁵	10⁶
						菌体分离率（%）	98.98	96.81	81.37	68.79	35.38

试验结果：结合图4，当细菌的浓度小于10⁴CFU/mL时，微球对细菌的吸附率大于95％；当脂环酸芽孢杆菌的浓度为10⁴CFU/mL，微球对细菌的吸附率大于80％；继续增大细菌浓度（超过10⁴CFU/mL）时，吸附率呈现下降趋势。

二、利用实施例3中制备的免疫磁性微球分离不同来源细菌，研究免疫磁性微球对菌体分离的特异性：

具体操作步骤为：将脂环酸芽孢杆菌标准菌株（DSM3922、DSM2498、DSM14955、DSM17978、DSM14558）与非脂环酸芽孢杆菌标准菌株（CICC1027、CICC10034、CICC10017）培养液分别加入到稀释后的苹果汁样品中（15°Brix），最终样品中菌体浓度约为10⁴CFU/mL。将5mg的免疫磁性微球加入到2mL果汁样品中，吸附反应60min，然后进行菌体分离，洗涤。将吸附菌体的微球重新悬浮于200μL PBS缓冲液中，采用涂布法计算分离前后菌体浓度变化，评价菌体分离效果。结果如表2所示：

表2

表2所示结果表明，获得的免疫磁性微球对脂环酸芽孢杆菌有非常好的特异性，对脂环酸芽孢杆菌的分离率达到80%以上；而对其余三个菌株培养液（CICC-1027、CICC-10034、CICC-10017）分离效果较差，菌体分离率不足10%，说明该实施例制备的免疫磁性微球对脂环酸芽孢杆菌有好的特异性。

三、利用实施例3中制备的免疫磁性微球对不同可溶性固形物浓度的苹果果汁样品中菌体进行免疫分离：

具体操作步骤为：将浓缩苹果汁（68°Brix）梯度稀释，可溶性固形物分别为5°Brix，10°Brix，15°Brix，20°Brix，并加入一定量培养好的脂环酸芽孢杆菌标准菌株培养液，最终样品中菌体浓度约为10⁴CFU/mL。然后将免疫磁性微球加入到各加标果汁样品中（2.5g/L），按照前述条件进行菌体分离，洗涤。将吸附菌体的微球重新悬浮于200μL PBS缓冲液中，采用涂布法计算分离前后菌体浓度变化。结果如表3所示：

表3

可溶性固形物含量（°Brix）	5	10	15	20
					菌体分离率（%）	85.43	87.86	83.17	不能分离

表3所示结果表明，当果汁的可溶性固形物≤15°Brix时，免疫磁性微球对菌体分离效果好，没有显著影响；当可溶性固形物含量为20°Brix时，由于果汁黏度太多，磁性微球在果汁体系中不能有效分离，因而对菌体分离效果差。

实施例4：

该实施例与实施例3不同之处在于，以每100ml PBS中含有1g BSA和0.05ml Tween-20的混合体系为封闭液。

实施例5：

该实施例与实施例3不同之处在于，以每100ml PBS中含有10g BSA和0.05ml Tween-20的混合体系为封闭液。

以下是发明人提供的关于磁性微球胺基化、脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的氧化处理、封闭处理对脂环酸芽孢杆菌免疫磁性微球吸附性能的影响试验研究。

试验方法：

（1）以氧化处理前后的抗体分别与Fe₃O₄磁核、胺基化磁性微球反应，制备获得不同试验样品，分别为：

氧化前抗体与Fe₃O₄磁核反应制备的试验样品标记为IMPs1；

氧化前抗体与胺基化磁性微球反应制备的试验样品标记为IMPs2；

氧化后抗体与Fe₃O₄磁核反应制备的试验样品标记为IMPs3；

氧化后抗体与胺基化微球反应制备的免疫磁性微球标记为IMPs4；

利用IMPs1、IMPs2、IMPs3、IMPs4各试验样品对菌体浓度为10⁴CFU/mL脂环酸芽孢杆菌（DSM3922）培养液中的脂环酸芽孢杆菌进行吸附分离，之后采用涂布法计算各样品分离前后菌体浓度变化，并计算各试验样品对脂环酸芽孢杆菌的吸附率。试验结果如表1所示。

该实验中所用Fe₃O₄磁核为实施例2制备的Fe₃O₄磁核；胺基化磁性微球和氧化抗体为实施例1制备。

（2）利用实施例1、3、4、5制备的免疫磁性微球对菌体浓度为10⁴CFU/mL脂环酸芽孢杆菌（DSM3922）培养液中的脂环酸芽孢杆菌进行吸附分离，之后采用涂布法计算各样品分离前后菌体浓度变化，并计算各试验样品对脂环酸芽孢杆菌的吸附率。试验结果如表1所示。

（3）利用实施例3中所用封闭液，对IMPs1、IMPs2、IMPs3、IMPs4各试验样品进行封闭处理，得到相应的试验样品，之后进行菌体（DSM3922）分离处理并计算各试验样品对脂环酸芽孢杆菌的吸附率。试验结果如表4所示。

表4

微球类型	IMPs1	IMPs2	IMPs3	IMPs4
					封闭前菌体吸附率	32.96%	51.62%	47.18%	86.38%
封闭后菌体吸附率	18.92%	37.29%	23.61%	80.07%
					非特异性吸附率	14.04%	14.33%	23.57%	6.31%

表4中的非特异性吸附率指的是相应磁性微球封闭处理前对菌体的吸附率与封闭后菌体吸附率的差值。

试验结果：研究结果表明，抗体氧化处理后与胺基化磁性微球反应，制备的免疫磁性微球对菌体的吸附率最高；封闭液中BSA含量对菌体的非特异性吸附有显著影响。

（1）抗体氧化前后与胺基化磁性微球反应，制备的免疫磁性微球对菌体的有效吸附率分别为37.29%和80.07%，说明抗体氧化对菌体吸附有重要影响。氧化后抗体与胺基化磁性微球反应过程中，保留了抗体的活性位点，因此有利用菌体的吸附。

（2）Fe₃O₄磁核与氧化后抗体反应制备的免疫磁性微球对菌体的有效吸附率为23.61%，而胺基化磁性微球与氧化后抗体反应制备的免疫磁性微球对菌体的有效吸附率为80.07%。

（3）当封闭液中BSA浓度由1%增大到5%时，免疫磁性微球对菌体的非特异性吸附明显减小。封闭液中BSA质量浓度为5%时，Fe₃O₄磁核和胺基化微球制备的免疫微球的非特异性吸附率为6.31%和23.57%；参考图3，随着BSA浓度继续增大到10%时，封闭效果变化不明显。

实施例6：

该实施例与实施例2不同之处在于：将5mg胺基化磁性微球与250μL浓度为0.4mg/mL的氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体于37℃条件下搅拌反应60min（150rpm），磁性分离并洗涤，得到包被抗体的免疫磁性微球。

实施例7：

该实施例与实施例6不同之处在于：氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为0.8mg/mL。

实施例8：

该实施例与实施例6不同之处在于：氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为1.2mg/mL。

实施例9：

该实施例与实施例6不同之处在于：氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为1.6mg/mL。

实施例10：

该实施例与实施例6不同之处在于：氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为2.0mg/mL。

分别采用BCA试剂盒法测定实施例6至10固定化前后抗体浓度。结果如表5所示：

表5

实施例	实施例6	实施例7	实施例8	实施例9	实施例10
						抗体初始浓度（mg/mL）	0.4	0.8	1.2	1.6	2
抗体固定化量（μg/mg）	19.48	38.76	58.65	71.86	75.6

表5所示结果表明：随着抗体初始浓度的增大，胺基化磁性微球对抗体固定化量增加。在初始浓度为2.0mg/mL时，吸附率为75.6μg/mg。

实施例11：

该实施例的被检测样品为：

对脂环酸芽孢杆菌标准菌株（DSM-3922）培养液离心（6000rpm，10min）、洗涤三次，去掉培养基，并用无菌水调整浓度约10⁸CFU/mL；用无菌水稀释获得不同浓度梯度的菌体悬浮液（10¹CFU/mL-10⁷CFU/mL）。

5mg实施例5制备的免疫磁性微球分别加入2mL不同浓度的不同浓度梯度的菌体悬浮液中，37℃条件下反应吸附30min（150rpm）。

磁性分离各浓度梯度菌体悬浮液中吸附菌体的免疫磁性微珠，分别用无菌水洗涤各浓度梯度对应的免疫磁性微珠并悬浮于相应的200μL PBS缓冲液（PBS的浓度为0.1mol/L，pH值7.4）中，富集获得各浓度梯度对应的待检测富集样品，分别进行如下的ELSIA检测：

①多克隆抗体包被：将稀释后的多克隆抗体加入到96孔酶标板中（1μg/mL，l00μL/孔），用保鲜膜将板面封住放入湿盒内，37℃下振荡孵育1h（60rpm）；倒出孔内液体，每孔加入200μL洗涤液PBS-T，振荡洗涤3次，每次3min，拍干；

②酶标板封闭：每孔加入封闭混合液200μL，37℃温育2h，倒出孔内液体，每孔加入200μL洗涤液PBS-T，振荡洗涤3次，每次3min，拍干，酶标板保存于-20℃冰箱中，备用；

③样品检测：将待检测富集样品加入封闭好的酶标板中，每孔l00μL，37℃温育1h；PBS-T洗涤三次，拍干；

④加入酶标二抗：将稀释后的酶标二抗（1：2000稀释）加入酶标板中，每孔150μL，37℃温育1h，洗涤3次，每次3min，拍干；

⑤加入显色液：将显色液加入样品检测体系中，每孔100μL，37℃条件下温育显色10-20min；

⑥加入终止液：每孔加入终止液50μL；

⑦结果判读：采用450nm及630nm双波长测定反应吸光度，每孔的OD值为OD₄₅₀-OD₆₃₀。

P/N值=(待测孔OD值－空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值－空白孔OD值)

P/N≥2.1为阳性，1.5<P/N≤2.1为可疑，1.5<P/N为阴性。

该实施例的结果如表7所示。

表7

菌体浓度(CFU/mL)	10	10²	10³	10⁴	10⁵	10⁶	10⁷
								IMS-ELSIA检测OD值	0.568	0.736	1.109	1.538	1.865	2.089	2.112

表7所示结果显示，检测限为10³CFU/mL。

实施例12：

该实施例与实施例11的被检测样品相同。

该实施例中不对样品进行富集处理，直接对不同浓度梯度的菌体样品进行ELSIA检测。结果见表8。

表8

菌体浓度(CFU/mL)	10	10²	10³	10⁴	10⁵	10⁶	10⁷
								ELISA检测OD值	0.492	0.566	0.643	0.731	1.158	1.584	1.682

表8所示结果表明，该实施例ELISA的检测限为10⁵CFU/mL。

对比实施例11与实施例12的结果说明免疫磁性微球富集可以显著提高ELISA检测限。

实施例13：

该实施例与实施例11不同之处在于：

该实施例的检测样品为：

用可溶性固形物含量为15°Brix的苹果汁样品配置表9所示脂环酸芽孢杆菌菌体浓度的待检测苹果汁样品。各待检测苹果汁样品取2mL，并分别加入5mg的实施例5制备的免疫磁性微球，进行富集和检测。

该实施例的ELSIA检测结果如表9所示：

表9

菌体浓度(CFU/mL)	10	10²	10³	10⁴	10⁵	10⁶	10⁷
								IMS-ELISA检测OD值	0.568	0.896	1.189	1.638	1.965	2.298	2.312

表9所示结果表明，在苹果汁样品中本发明的检测方法对脂环酸芽孢杆菌检测限为10³CFU/mL。

实施例14：

该实施例与实施例13不同之处在于：该实施例中不对样品进行富集处理，对样品直接进行ELSIA检测。结果如表10所示：

表10

菌体浓度(CFU/mL)	10	10²	10³	10⁴	10⁵	10⁶	10⁷
								ELSIA检测OD值	0.458	0.637	0.796	0.928	1.155	1.298	1.331

表10所示结果表明，在苹果汁样品中ELISA对脂环酸芽孢杆菌检测限为10⁵CFU/mL。

对比实施例13与实施例14的检测结果说明，采用免疫磁性微球对果汁样品进行富集处理可提高ELSIA检测的检测限。

实施例15：

该实施例与实施例13不同之处在于ELSIA检测中的操作步骤①和步骤③调换操作程序。

检测结果如表11所示：

表11

表11所示结果表明，改变操作程序后本发明的检测方法对脂环酸芽孢杆菌培养液的检测限为10³CFU/mL；同时对高浓度菌体检测过程中OD值降低，说明多次洗涤过程中部分菌体被洗脱，对结果有一定的负面影响；实施例11中目标菌体的富集和酶标板的包被、封闭可以同时进行，甚至可以先准备好包被抗体的酶标板，直接用于免疫富集菌体的检测，因此检测时间减小到3-4 h。而实施例15中检测时间为6-7h，检测时间长。

以下是发明人提供的关于“对果汁生产体系中可能威胁果汁品质脂环酸芽孢杆菌及非脂环酸芽孢杆菌标准菌株进行IMS-ELISA检测评价”的试验。

试验方法：用可溶性固形物含量为15°Brix的苹果汁样品配置表12所示菌株菌体浓度为10⁴CFU/mL的待检测苹果汁样品。各待检测苹果汁样品取2mL，并分别加入5mg的实施例3制备的免疫磁性微球，进行富集和检测。

表12

表12中各上标字母分别代表相应菌株的来源信息：

上标字母a代表相应菌株来源于德国微生物菌种保藏中心；

上标字母b代表相应菌株购自日本东京三井诺有限公司食品研究实验室；

上标字母d代表相应菌株来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心；

上标字母e代表相应的菌株购自中国科学院微生物研究所。

表12所示结果表明本发明的检测方法对脂环酸芽孢杆菌的检测具有较好的特异性。

Claims

1.果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法，其特征在于，方法包括：

2.如权利要求1所述的果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法，其特征在于，方法包括：

3.如权利要求2所述的果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法，所述果汁样品的可溶性固形物含量为10-15°Brix。

4.如权利要求1所述的果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法，采用Sephadex G-25层析柱收集获得氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。

5.如权利要求1所述的果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法，所述的氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体制备方法还包括：

6.如权利要求1所述的果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法，所述的胺基化磁性微球的制备方法包括：

（2）调节硅烷化磁性微球的PH呈中性；

硅烷化磁性微球：（1-2g）/毫升

甲醇： 150体积，

3-氨丙基三乙氧基硅烷： 10体积，

去离子水： 1体积，

甘油： 150-161体积。

7.如权利要求6所述的果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法，所述的Fe₃O₄磁核的粒径为15-25nm、磁性的饱和磁化强度为（40-80emu）/g。

8.如权利要求6所述的果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法，所述的氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为（1-2mg）/毫升，且每毫升氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体用20mg的胺基化磁性微球包被。

9.如权利要求1-8任一权利要求所述的果汁中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁分离-ELISA检测方法，利用封闭液封闭所述的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球，所述封闭液的组分量为：每100ml浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液中含有1-10克BSA和0.05ml Tween-20。