CN104714010A - 一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，将活化后的羧基磁珠与辛酸硫酸铵纯化的荧光假单胞菌多克隆抗体相偶联，得到荧光假单胞菌免疫磁珠，建立免疫磁珠富集结合酶联免疫检测法，将该检测方法与普通的ELISA快速检测方法进行比较，从而得到一种快速、有效的荧光假单胞菌检测方法。结果表明，本发明建立的荧光假单胞菌免疫磁珠-ELISA检测方法，板内板间重复性良好，与单增李斯特菌、大肠杆菌、粪肠球菌CR均小于0.1%，且对于荧光假单胞菌的检测平均回收率为100.6%，是一种快速准确检测牛奶等食品中荧光假单胞菌污染的有效方法。

Description

一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法。

背景技术

嗜冷菌（psychrophile）是一类菌的总称，这类菌一般是在-15-20℃之间最适宜生长，由于这个温度段与其它菌最适宜生长的温度段相比要冷许多，故此得名嗜冷菌。随着乳品加工规模的扩大，企业对生奶的需求也逐渐增多，低温保藏和运送原料奶已成为保持其新鲜度必不可少的条件并被广泛应用，这也就导致生奶中在7℃以下能生长的嗜冷菌成为影响产品质量的重要危害因素。研究报道，嗜冷菌主要可以分为两种：那些只能生活在低温且最高生长温度不超过20℃，最适生长温度等于或小于15℃，在0℃及0℃以下都可以繁殖生长的嗜冷菌为专性嗜冷菌；将最高生长温度可以超过20℃，在0-5℃的环境中可以生长，一般生长温度范围在0-35℃的嗜冷菌定义为兼性嗜冷菌。

目前从原料奶中分离到的嗜冷菌如假单胞菌属、产碱杆菌属、无色杆菌属、黄杆菌属和克雷伯氏杆菌属、微球菌（G+）等，多数均能产生热稳定性胞外降解酶类，主要是蛋白酶、脂肪酶和碱性磷酸脂酶。在牛乳中发现的最常见的嗜冷菌为G^—假单胞菌属（Pseudomonas），而其中的荧光假单胞菌（P.Fluorescens），为最主要的产酶来源。

荧光假单胞菌又名荧光菌，之所以称之为荧光菌是因为当其存活于缺铁的环境中，菌体会生成钳铁化合物（siderophore）-荧光色素，故得此名。荧光假单胞菌为革兰氏阴性杆状菌，它在自然界分布很广，是一种环境污染菌，营养要求低，不需要生长因子，在4℃时繁殖速度很快，因此它是奶类、蛋类在低温条件下保存导致腐败变质的主要细菌之一。

国外对嗜冷菌检测的标准方法有很多，这些方法在不断地改进，检测时间也在不断地缩短。国际乳品联合会检测标准（IDF 标准）中，对嗜冷菌的检测主要采用营养平板倾注法：一种IDF Standard 101A，该方法中嗜冷菌培养温度为4℃-6℃，培养时间为10d；另一种IDF Standard 132A嗜冷菌的培养温度为(21±5) ℃，培养时间为(24±1)h。可以看出这些方法耗时长，难以达到工厂快速检测的需要。随着科技的进步，研究者不断对嗜冷菌的检测方法进行研究和改进，主要包括以下几种方法：直接荧光过滤法（DEFT），电阻抗方法，聚合酶链式扩增等检测手段。

这些方法均存在着一定的缺点，如检测前需要预先进行增菌培养以提高目标检测量，从而提高检测的精确度，可是往往需要23-48h增菌过程，而且需要特定的仪器，对操作的要求性较高等。因此急需研究出一种快速，高效，适于在一般企业推广开来的荧光假单胞菌检测手段。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明将免疫磁性分离技术与ELISA有效的结合起来，通过免疫磁珠的吸附技术，对样品中待检菌进行快速分离，从而建立一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法。

所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于按以下工艺步骤：

1）辛酸-硫酸铵法纯化多克隆抗体：血清和醋酸缓冲液按体积比1:2混合，用1mol/L HCL 调节pH至4.8，逐滴加入辛酸至其终浓度为25μL/mL，4℃静置2h后离心，弃沉淀，加入1/10体积的PBS缓冲液，用1 mol/LNaOH 调节pH至7.2，加入饱和NH₄(SO₄)₂至其终浓度为45%，4℃反应30min后离心，弃上清，PBS重悬沉淀，悬浮液用100倍体积PBS透析过夜，透析物离心后，取上清于零下20℃保存备用；

2）磁珠的活化：羧基磁珠经200w条件下超声处理10min后取200μL于离心管中，在样品混合仪上震荡，将离心管置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附后弃掉上清，加入1mL MES缓冲液重悬磁珠，再加入100μL EDC溶液，室温条件下，在样品混合仪上活化30min，得活化后的磁珠；

3）磁珠的包被：用1mL MES缓冲液洗涤活化后的磁珠2遍，加入500μL纯化后的多克隆血清抗体，室温反应过夜，即得到免疫磁珠，用1mL MES缓冲液洗涤封闭后的磁珠2遍，用1mL含牛血清蛋白的PBS重悬磁珠，保存于4℃冰箱待用；

4）效价的测定：采用间接ELISA 进行效价测定；

5）最佳工作浓度的确定：选用效价最高的血清，用方阵滴定法，分别稀释抗体和抗原包被物，按步骤4）所述方法进行测定，最终选择OD450≈1的抗体和抗原包被物的稀释度作为最佳工作浓度；

6）标准曲线的建立：选择最佳工作浓度的抗原包被，采用步骤4）所述的方法制作标准曲线，不同之处是加抗血清步骤中，每孔加入最佳工作浓度的抗血清或免疫磁珠-抗体蛋白90μL，同时分别加入不同稀释倍数的抗原10μL，混匀，使混合液中抗原的最终浓度依次0，10²cfu/mL，10³cfu/mL，10⁴cfu/mL，10⁵cfu/mL，10⁶cfu/mL，10⁷cfu/mL，10⁸cfu/mL，竞争抑制率（%）=各浓度孔的吸光值/阳性对照孔的吸光值×100%；

7）特异性检测：用上述建立的ELISA方法分别检测单增李斯特菌，大肠杆菌，粪肠球菌，结果观察荧光假单胞菌的抗性血清是否会与其它细菌有交叉反应；

8）重复性试验

板内重复性试验：应用已经建立的间接ELISA方法，使用同样的荧光假单胞菌阳性血清或免疫磁珠-抗体蛋白偶联物分别进行检测，样品中银光假单胞菌菌落浓度依次为10⁵cfu/mL，10⁶cfu/mL，10⁷cfu/mL，每份样品重复10孔，同时设立与抗原并列的阴性对照孔和空白对照孔，计算每份血清的OD值的平均值与标准差，进而计算每份血清的板内变异系数；

板间重复性试验：按照已经建立的间接ELISA方法对同样的荧光假单胞菌阳性血清或免疫磁珠-抗体蛋白分别在3块酶标板上进行检测，每板每份血清重复10孔，同时设立与抗原并列的阴性对照空和空白对照空，测定OD值，计算每份血清的板间变异系数；

9）样品检测：分别配置浓度依次为10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶,10⁷ cfu/mL的荧光假单胞菌液体，作为样品，每0.1mL样品同偶联好的0.9 mL免疫磁珠混合，震荡孵育时间是45 min, 磁分离时间是3min,捕获样品中的荧光假单胞菌，分别用已建立的IC-ELISA方法以及免疫磁珠-酶联免疫试剂盒检测并计算回收率。

所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于步骤1）中醋酸缓冲液的pH值为5.0，浓度为0.06 mol/L，离心时间为30min，转速为10000rpm。

所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于步骤2）中超声处理时间为10min，混合仪上震荡时间为30min，EMS缓冲液的PH值为6.0，EDC溶液的浓度为10mg/mL。

所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于步骤3）中MES缓冲液的PH值为6.0，PBS中牛血清蛋白的含量为0.1%。

所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于ELISA按以下步骤进行测定：

1）包被：将抗原用CBS至最佳工作浓度，即10⁵cfu/mL,每孔100μL加入96孔酶标板，盖上保鲜膜，37℃孵育2h；

2）洗板：迅速倒去孔中液体，用PBST洗涤3遍,每次洗3min；

3）封闭：每孔加入200μL封闭液，置于37℃恒温培养箱封闭 2h；接着用 PBST洗涤3遍后拍干；

4）加入一抗：按1:100-1:51200梯度稀释抗血清或免疫磁珠-抗体蛋白，加入酶标孔中，每样至少重复一次，每孔加100μL,37℃孵育半小时，倒空，洗涤3遍，每遍3分钟，拍干；

5）加入二抗：将HRP酶标山羊抗兔IgG稀释1000倍，每孔加50μL，37℃孵育60min，倒空，洗涤3遍，每遍3分钟，拍干；

6）加入TMB显色剂显色：每孔100μL，37℃避光放置10-15min；

7）终止反应,每孔加入100μL终止液结束反应，在结束反应后20min内测定结果；

8）酶标仪检测：TMB 反应后酶标仪450nm波长读取OD450。设空白及阴性对照，分别为 PBS 溶液和免疫前采集的阴性血清。

    酶联免疫吸附技术（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是将抗原（或抗体）吸附于固相载体上并保持其免疫活性，再加入酶标抗体在载体上进行免疫酶染色，底物显色后，通过分析有色产物量即可确定样品中待测物质的含量。ELISA根据操作的不同，可分为双抗体夹心法、间接法和竞争法。ELISA技术主要是利用酶促反应来放大显示初级免疫学反应，具有特异性高和敏感性高等优点，几乎所有可溶性的抗原抗体反应均可检测，灵敏度能达到纳克甚至皮克水平。

免疫磁性分离技术(immunomagentic bead-based separation，IMS)，又称为免疫磁珠法，是以特异的抗原抗体反应为基础的一种分离技术，具体操作是将免疫磁珠（immunomagentic beads，IMBs）与特定的待测菌抗体结合，以得到被待测菌抗体包被的超顺磁性粒子，再将待测样品与免疫磁珠混合，则待测菌抗原就能与包在磁珠上的抗体发生特异性结合而被吸附在磁珠上，然后通过磁场的作用吸附着待测菌的磁珠向磁极移动，从而使待测菌得到有效地富集和分离。以上步骤可取代增菌肉汤的增菌过程，能有效地收集浓缩大量样品中的少量病原菌，可使采样和检测的时间减少1天。该方法具有分离样品快速、特异性强、操作简单和仪器设备简单等特点，已经广泛应用于细胞分离、病原体检测等领域。

本发明主要是将免疫磁性分离技术与ELISA有效的结合起来，通过免疫磁珠的吸附技术，对样品中待检菌进行快速分离，从而建立免疫磁珠与ELISA相结合的快速检测方法，与传统的ELISA检测效率进行比较，以提高实际生产中荧光假单胞菌的快速有效性。

附图说明

图1为磁珠偶联多克隆抗体前后的红外光谱图

图2为间接竞争ELISA标准曲线图。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

本发明使用的菌种：荧光假单胞菌菌株，单增李斯特菌菌株，大肠杆菌O157菌株，粪肠球菌菌株均来自实验室保存菌株。

本发明使用的试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自杭州兰堡生物公司；酶标山羊抗兔IgG购自上海生工公司；单组份TMB显色液购自阿拉丁试剂公司；羧基磁珠购自河南惠尔纳米科技有限公司； 2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）购于杭州米克生物技术有限公司；其他试剂均为实验室常规试剂，分析纯。

实施例

辛酸-硫酸铵法纯化多克隆抗体：血清和pH5.0、0.06 mol/L的醋酸缓冲液体积比1:2混合，用1mol/L HCL 调节pH至4.8，逐滴加入辛酸至其终浓度为25 μL/mL，4℃静置2 h 后10000 rpm离心30 min，弃沉淀，加入1/10 体积的PBS 缓冲液，用1mol/L NaOH 调节pH至7.2，加入饱和NH₄(SO₄)₂至其终浓度为 45%，4℃ 反应30 min后， 10000 rpm离心30 min，弃上清，PBS 重悬沉淀，悬浮液用100倍体积PBS透析过夜，透析物10000 rpm离心30min，取上清于-20℃保存备用。结果见图1。

由图1可以看出，A线表示的曲线是未连抗体的磁珠，B线表示的曲线是连接抗体后的纳米磁珠；A线中2930cm^-1、1647cm^-1、1557cm^-1、1402cm^-1和1070cm^-1处的特征峰表明羧基磁珠和血清抗体蛋白偶联形成酰胺官能团。

免疫磁珠的活化：免疫磁珠经超声处理（200w，10min）后取200 μL羧基磁珠于离心管中，在样品混合仪上震荡30min，将离心管置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，弃掉上清，加入1mL pH6.0的MES缓冲液重悬磁珠，再加入100 μL(10mg/mL)的EDC溶液，室温条件下，在样品混合仪上活化30min。

免疫磁珠的包被：用1mL pH6.0的MES缓冲液洗涤活化后的磁珠2遍，加入500 μL纯化后的抗体蛋白，室温反应过夜，即可得到免疫磁珠，用1 mL的MES缓冲液洗涤封闭后的磁珠2遍，用1 mL含0.1%的牛血清蛋白的PBS重悬磁珠，保存于4℃冰箱待用。

    效价的测定：效价是指能产生阳性反应的血清的最大稀释倍数，当阴性血清的吸光值小于0.2且阳性血清的吸光值大于阴性对照的 2.1倍时，此时的血清稀释倍数就是该抗血清的效价。采用间接ELISA 进行测定。 ELISA操作步骤为：

1）包被：将抗原用CBS 稀释至10³cfu/mL-10¹⁰cfu/mL，每孔 100μL加入96孔酶标板，盖上保鲜膜，37℃孵育2 h；

    2）洗板：迅速倒去孔中液体，用 PBST 洗涤3遍,每次洗 3min；

    3）封闭：每孔加入 200μL 封闭液，置于 37℃恒温培养箱封闭 2 h；接着用 PBST 洗涤3遍后拍干；

4）加入一抗：按 1:100-1:51200梯度稀释抗血清或免疫磁珠-抗体蛋白，加入酶标孔中，每样至少重复一次，每孔加100μL,  37℃孵育半小时，倒空，洗涤3遍，每遍3分钟，拍干；

    5）加入二抗：将 HRP 酶标山羊抗兔 IgG 稀释 1000 倍，每孔加 50μL， 37℃孵育60min，倒空，洗涤3遍，每遍 3分钟，拍干；

6）加入TMB显色剂显色：每孔100μL，37℃避光放置10-15min；

7）终止反应：每孔加入100μL终止液结束反应，在结束反应后20min 内测定结果；

8）酶标仪检测：TMB 反应后酶标仪 450nm 波长读取 OD450。设空白及阴性对照，分别为 PBS 溶液和免疫前采集的阴性兔血清。

最佳工作浓度的确定：选用效价最高的血清，用方阵滴定法。分别稀释抗体和抗原包被物，按照ELISA操作步骤进行测定。最终选择OD450≈1的抗体和抗原包被物的稀释度作为最佳工作浓度。

标准曲线的建立：选择最佳工作浓度的抗原包被，采用ELISA操作步骤制作标准曲线。不同之处是加抗血清步骤中，每孔加入最佳工作浓度的抗血清（或免疫磁珠-抗体蛋白）90 μL，同时分别加入不同稀释倍数的抗原10 μL，混匀，使混合液中抗原的最终浓度依次0，10²cfu/mL，10³cfu/mL，10⁴cfu/mL，10⁵cfu/mL，10⁶cfu/mL，10⁷cfu/mL，10⁸cfu/mL。

[竞争抑制率（%）=各浓度孔的吸光值/阳性对照孔的吸光值×100%]

特异性检测：用上述建立的ELISA方法分别检测单增李斯特菌，大肠杆菌，粪肠球菌。结果观察荧光假单胞菌的抗性血清是否会与其它细菌有交叉反应。

重复性试验

板内重复性试验：应用已经建立的间接ELISA方法，使用同样的荧光假单胞菌阳性血清或免疫磁珠-抗体蛋白偶联物分别进行检测。样品中荧光假单胞菌菌落浓度依次为10⁵cfu/mL，10⁶cfu/mL，10⁷cfu/mL，每份样品重复10孔。同时设立与抗原并列的阴性对照孔和空白对照孔。计算每份血清的OD值的平均值与标准差，进而计算每份血清的板内变异系数。

板间重复性试验：按照已经建立的间接ELISA方法对同样的荧光假单胞菌阳性血清或免疫磁珠-抗体蛋白分别在3块酶标板上进行检测，每板每份血清重复10孔，同时设立与抗原并列的阴性对照空和空白对照空，测定OD值，计算每份血清的板间变异系数。

样品检测：分别配置浓度依次为10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶ ,10⁷cfu/mL的荧光假单胞菌液体，作为样品，每0.1 mL样品同偶联好的0.9 mL免疫磁珠混合，震荡孵育时间是45 min, 磁分离时间是3 min,捕获样品中的荧光假单胞菌，分别用已建立的IC-ELISA方法以及免疫磁珠-酶联免疫试剂盒检测并计算回收率。

实验结果

抗血清效价的测定：采用ELISA操作步骤，对血清效价进行测定。选择阴性血清OD值0.2左右且对应包被浓度下，P/N=阳性血清OD值/阴性血清OD值≈2.1时的抗原稀释倍数即为其效价。当包被抗原浓度为10⁶cfu/mL，多克隆血清抗体稀释倍数为128000时，阴性血清OD值为0.214，阳性血清OD值为0.436，此时P/N=2.06；

最佳工作浓度的确定：采用ELISA操作步骤，分别使用不同浓度的抗原包被后进行方阵滴定，确立最佳工作浓度。当OD值=1.041时，包被原浓度为10⁵ cfu/mL、血清稀释倍数1:800，为直接使用抗血清时ELISA方法的最佳工作浓度。

重复上述操作步骤，不同之处是将抗血清换成免疫磁珠-抗体蛋白偶联物，经方阵滴定后可知，当OD值=1.021 时，包被原浓度为10⁵ cfu/mL、免疫磁珠-抗体蛋白偶联物稀释800倍，即为ELISA方法的最佳工作浓度。

标准曲线的建立：根据上述ELISA最佳工作浓度，一抗稀释800倍，包被原浓度为10⁵ cfu/mL时，进行方阵交叉反应，最终可得标准曲线如图2所示。从图2中可以看出，当直接使用抗血清时，标准曲线所得线性方程为y=-7.448x+112.8，其中R²=0.949；当使用免疫磁珠-抗体蛋白偶联物进行ELISA时，标准曲线所得线性方程为y=-9.5655x+105.76，其中R2=0.9606。

特异性检测：用间接ELISA方法检测不同浓度的单增李斯特菌，大肠杆菌，粪肠球菌。其不同之处只是将与抗体混合的荧光假单胞菌菌液改为其他病原菌，以用来研究荧光假单胞菌的抗体是否会与其它病原细菌产生交叉反应。

[交叉反应率CR=IC₅₀（荧光假单胞菌）/IC ₅₀(其他病原菌)]

研究发现，两种不同抗体（抗血清或者免疫磁珠-抗体蛋白偶联物）操作下，单增李斯特菌、大肠杆菌、粪肠球菌CR均小于0.1%，因此说明荧光假单胞菌的抗体与其他病原菌之间不存在交叉反应。

重复性实验

板内重复性实验：结果见表1，当使用抗血清进行ELISA操作时，分别测定3种不同菌落浓度下（10⁵cfu/mL，10⁶cfu/mL，10⁷cfu/mL），荧光假单胞菌阳性血清的OD值的板内变异系数分别为8.09％、4.24％和2.34％；当使用免疫磁珠-抗体蛋白的偶联物作为一抗，进行ELISA操作时，测定3种不同菌落浓度下（10⁵cfu/mL，10⁶cfu/mL，10⁷cfu/mL），荧光假单胞菌板内变异系数分别为7.25%、0.69%和2.88%。可发现，两种不同操作下，板内变异系数CR均小于10％，说明同一样品在同一批试验中变异程度很小，具有较好的重复性。与直接使用抗血清相比，免疫磁珠-抗体蛋白偶联物测定结果中，板内变异系数优于前者，因此在荧光假单胞菌检测中具有较好的应用前景。

表1  荧光假单胞菌板内重复试验（a:抗血清；b:免疫磁珠-抗体蛋白）

菌落浓度（cfu/mL）	变异系数a（%）	变异系数b（%）
			105	8.09	7.25
106	4.24	0.69
			107	2.34	2.88

板间重复性实验：板间重复试验试验结果经统计学处理，显示当直接使用抗血清时，荧光假单胞菌阳性血清的OD值的板间变异系数为2.82％；当使用免疫磁珠-抗体蛋白偶联物时，板间变异系数为1.96％。两种测定方法中，板间变异系数均小于10％，说明同一样品在不同批次试验中变异程度很小，具有较好的重复性。两者比较也可发现，在ELISA方法中，与直接使用抗血清相比，使用免疫磁珠-抗体蛋白偶联物板间重复性更好。见表2。

表2  荧光假单胞菌ELISA试剂盒板间重复试验

	板 1 OD450	板2 OD450	板 3 OD450	变异系数CV%
					抗血清	0.519	0.514	0.492	2.82
免疫磁珠-抗体蛋白	0.579	0.595	0.601	1.96

样品检测：采用上述建立的IC-ELISA方法，对已知浓度的样品进行检测，并计算样品回收率，结果如表3所示。由结果可知，当样品中荧光假单胞菌浓度为10¹ cfu/mL以上时，使用抗血清作为一抗时，其平均回收率为92.2%；使用免疫磁珠-抗体蛋白作为一抗时，其平均回收率为100.6%，此时样品回收率高于直接使用抗血清。基本满足实际生产中的需求。

表3 样品回收率的测定

表中，回收率1为直接使用抗血清作为一抗时，ELISA检测荧光假单胞菌后的回收率；回收率2为使用免疫磁珠-抗体蛋白偶联物作为一抗时，ELISA检测荧光假单胞菌后的回收率。

针对食品中荧光假单胞菌的检测，本发明建立了以免疫磁珠富集，结合酶联免疫快速检测方法。与直接使用抗血清作为一抗相比，经免疫磁珠富集后的ELISA操作中，样品平均加标回收率为100.6%，优于直接使用抗血清的ELISA操作，且板内、板间变异系数也均有所降低。直接使用抗血清时，标准线性方程为y=-7.448x+112.8，其中R²=0.949，此时可求得IC50为10^8.3 cfu/mL；当使用免疫磁珠-抗体蛋白偶联物进行ELISA时，标准曲线所得线性方程为y = -9.5655x + 105.76，其中R2 = 0.9606，此时可求得IC50为10^5.8 cfu/mL。

因此，本发明建立的免疫磁珠富集结合ELISA方法检测食品中荧光假单胞菌，检测效果较好，是一种快速、有效的检测方法。

与传统的增菌培养法检测相比，免疫磁珠抗体蛋白偶联物可快速富集目标菌液，且分离效率高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备，捕获目标菌的免疫磁珠不用与目标菌进行分离，可直接用于后续实验，在实验操作中，也不会影响被分离生物的生物学性状和功能，因此免疫磁珠富集结合酶联免疫检测技术在微生物检测方面具有很大的发展前景。

Claims (5)

1.一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于按以下工艺步骤：

1）辛酸-硫酸铵法纯化多克隆抗体：血清和醋酸缓冲液按体积比1:2混合，用1mol/L HCL 调节pH至4.8，逐滴加入辛酸至其终浓度为25μL/mL，4℃静置2h后离心，弃沉淀，加入1/10体积的PBS缓冲液，用1mol/L NaOH 调节pH至7.2，加入饱和NH₄(SO₄)₂至其终浓度为45%，4℃反应30min后离心，弃上清，PBS重悬沉淀，悬浮液用100倍体积PBS透析过夜，透析物离心后，取上清于零下20℃保存备用；

2）磁珠的活化：取200μL经200w条件下超声处理10min的羧基磁珠于离心管中在样品混合仪上震荡，将离心管置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附后弃掉上清，加入1mL MES缓冲液重悬磁珠，再加入100μL EDC溶液，室温条件下在样品混合仪上活化30min，得活化后的磁珠；

3）磁珠的包被：用1mL MES缓冲液洗涤活化后的磁珠2遍，加入500μL纯化后的多克隆血清抗体蛋白，室温反应过夜，即得到免疫磁珠；用1mL MES缓冲液洗涤封闭后免疫磁珠2遍，用1mL含牛血清蛋白的PBS重悬免疫磁珠，保存于4℃冰箱待用；

4）效价的测定：采用间接ELISA 进行效价测定；

5）最佳工作浓度的确定：选用效价最高的血清，用方阵滴定法，分别稀释抗体和抗原包被物，按步骤4）所述方法进行测定，最终选择OD450 ≈1的抗体和抗原包被物的稀释度作为最佳工作浓度；

6）标准曲线的建立：选择最佳工作浓度的抗原包被，采用步骤4）所述的方法制作标准曲线，不同之处是加抗血清步骤中，每孔加入最佳工作浓度的抗血清或免疫磁珠-抗体蛋白90μL，同时分别加入不同稀释倍数的抗原10μL，混匀，使混合液中抗原的最终浓度依次0，10²cfu/mL，10³cfu/mL，10⁴cfu/mL，10⁵cfu/mL，10⁶cfu/mL，10⁷cfu/mL，10⁸cfu/mL，竞争抑制率（%）=各浓度孔的吸光值/阳性对照孔的吸光值×100%；

7）特异性检测：用上述建立的ELISA方法分别检测单增李斯特菌，大肠杆菌，粪肠球菌，结果观察荧光假单胞菌的抗性血清是否会与其它细菌有交叉反应；

8）重复性试验

板内重复性试验：应用已经建立的间接ELISA方法，使用同样的荧光假单胞菌阳性血清或免疫磁珠-抗体蛋白偶联物分别进行检测，样品中荧光假单胞菌菌落浓度依次为10⁵cfu/mL，10⁶cfu/mL，10⁷cfu/mL，每份样品重复10孔，同时设立与抗原并列的阴性对照孔和空白对照孔，计算每份血清的OD值的平均值与标准差，进而计算每份血清的板内变异系数；

板间重复性试验：按照已经建立的间接ELISA方法对同样的荧光假单胞菌阳性血清或免疫磁珠-抗体蛋白分别在3块酶标板上进行检测，每板每份血清重复10孔，同时设立与抗原并列的阴性对照空和空白对照孔，测定OD值，计算每份血清的板间变异系数；

9）样品检测：分别配制浓度依次为10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶,10⁷cfu/mL的荧光假单胞菌液体作为样品，每0.1mL样品同偶联好的0.9 mL免疫磁珠混合，震荡孵育时间是45 min, 磁分离时间是3min,捕获样品中的荧光假单胞菌，分别用已建立的IC-ELISA方法以及免疫磁珠-酶联免疫试剂盒检测并计算回收率。

2.根据权利要求1所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于步骤1）中醋酸缓冲液的pH值为5.0，浓度为0.06 mol/L，离心时间为30min，转速为10000rpm。

3.根据权利要求1所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于步骤2）中超声处理时间为10min，混合仪上震荡时间为30min，EMS缓冲液的pH值为6.0，EDC溶液的浓度为10mg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于步骤3）中MES缓冲液的pH值为6.0，PBS中牛血清蛋白的含量为0.1%。

5.根据权利要求1所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于ELISA按以下步骤进行测定：

1）包被：将抗原用CBS稀释至最佳工作浓度，即10⁵cfu/mL,每孔100μL加入96孔酶标板，盖上保鲜膜，37℃孵育2h；

2）洗板：迅速倒去孔中液体，用PBST洗涤3遍,每次洗3min；

3）封闭：每孔加入200μL封闭液，置于37℃恒温培养箱封闭 2h；接着用 PBST洗涤3遍后拍干；

4）加入一抗：按1:100-1:51200梯度稀释抗血清或免疫磁珠-抗体蛋白，加入酶标孔中，每样至少重复一次，每孔加100μL,  37℃孵育半小时，倒空，洗涤3遍，每遍3分钟，拍干；

5）加入二抗：将HRP酶标山羊抗兔IgG稀释1000倍，每孔加50μL，37℃孵育60min，倒空，洗涤3遍，每遍3分钟，拍干；

6）加入TMB显色剂显色：每孔100μL，37℃避光放置10-15min；

7）终止反应,每孔加入100μL终止液结束反应，在结束反应后20min内测定结果；

8）酶标仪检测：TMB 反应后酶标仪450nm波长读取OD450。