KR102145618B1 - 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출용 조성물 및 방법 - Google Patents

면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출용 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 축산물 또는 축산가공품에 존재하는 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 동시에 고감도로 단시간 내에 검출할 수 있는 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출용 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출용 조성물 및 방법{Composition and method for simultaneous detection of foodborne pathogens using immunomagnetic particle}
본 발명은 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 축산물 또는 축산가공품에 존재하는 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 동시에 고감도로 단시간 내에 검출할 수 있는 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
식중독균은 급성위장염증상을 일으키는 세균을 말한다. 식중독균으로는 식품 안에서 증식할 때 독소를 생성하여 식중독을 야기하는 독소형 식중독세균인 황색포도당구균 및 보튤리누스(botulinus)균과, 생균의 형태로 섭취되어 그 증식이 식중독을 야기하는 감염형 식중독세균인 비브리오, 살모넬라, 및 설사 거인성 대장균 등이 알려져 있다.
특히 장관출혈성 대장균 O157 : H7은 독소의 생산을 통하여 용혈성 요독증 증후군(HUS) 등 특히 중태에 가까운 증상을 야기하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 축산식품 내에 살모넬라, 황색포도상구균, 장염 비브리오, 클로스트리디움 퍼프린젠스, 리스테리아 모노사이토제네스, 장출혈성 대장균 등 식중독균이 음성이여야 하며, 다만 황색포도상구균과 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대해서는 정량적 허용한계치가 규정되어 있다. 즉, 황색포도상구균은 생햄 및 발효소시지에서 n=5, c=2, m=10, M=100이어야 하고, 가열 햄류 및 소시지류에서는 n=5, c=1, m=10, M=100이어야 하고, 클로스트리디움 퍼프린젠스는 생햄 및 발효소시지에서 n=5, c=2, m=10, M=100이어야 하고, 가열 햄류 및 소시지류에서 n=5, c=1, m=10, M=100이어야 한다.
축산물의 식중독균은 주로 축산물의 가공기준 및 성분규격(Ⅲ. 일반시험법 9. 미생물시험법 다. 세균수 (1). 일반세균수)에 규정된 햄 세균수 측정법에 따라 시료를 인산염완충희석액(Butterfield's phosphate buffered dilution water, BPD)를 이용하여 희석한 후 표준한천평판배지에 배양 후 즉시 집락 계산기를 사용하여 생성된 집락수를 계산하고 있다.
그러나 이러한 검출방법은 검출민감도가 낮고 배양을 위한 시간이 필요하여 현장 진단에 적용이 어렵고, 다양한 식중독균을 동시에 검출할 수 없는 문제점이 있다.
한편, 미생물을 분리 및 검출하기 위한 면역 자성 입자 분리법을 이용하려는 시도가 있다. 면역 자성 입자 분리법은 표적 미생물만을 포집하는 단백질을 결합시킨 자성 입자를 이용하여 표적 미생물을 분리 및 검출하는 방법이다.
본 발명의 배경기술로 한국 등록 특허 제10-0206159호에 자성입자 및 그것을 사용한 면역측정법이 기재되어 있다.
그러나 현재까지 축산물 또는 축산가공품에 존재하는 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 포함하는 식중독균을 동시에 고감도로 검출할 수 있는 면역 자성 분리법이 알려진 바는 없다.
축산물의 경우 지방이나 결체 조직 등 복잡하고 다양한 매트릭스로 구성되어 있으며, 축산가공품의 경우 다양한 식품첨가물이 식중독균의 검출의 방해요인이 될 수 있다.
따라서 본 발명의 목적은 축산물 또는 축산가공품에 존재하는 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 포함하는 식중독균을 동시에 고감도로 검출할 수 있는 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 축산물 또는 축산가공품에 존재하는 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 포함하는 식중독균의 검출 및 진단 시간을 단축할 수 있는 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 축산물 또는 축산가공품에 존재하는 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 동시에 고감도로 단시간 내에 검출할 수 있는 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
일 측면에 의하면, 축산물 또는 축산가공품 시료를 완충희석액으로 희석하고 균질화하여 균질화된 시료를 준비하는 단계; 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균 검출용 항체를 포함하는 면역 자성 입자를 준비하는 단계; 상기 균질화된 시료에 면역 자성 입자를 접촉시켜 반응시키는 단계; 자성을 인가하여 상기 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 동시에 분리 및 농축하는 단계; 및 상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 검출하는 단계를 포함하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 방법이 제공된다.
일 실시예에 의하면, 상기 방법에서 시료는 햄, 소고기, 달걀, 또는 치즈일 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 방법에서 균질화된 시료를 준비하는 단계는 시료를 0.5 : 9.5 - 1.5 : 8.5로 희석할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 방법에서 균질화된 시료를 준비하는 단계는 110 - 130초 동안 균질화할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 방법에서 상기 대장균군은 혈청형 O157:H7 (ATCC 43890), O104:H4 (NCCP 15656), O26 (NCCP 14539), O111 (NCCP 14540), 및 O103:H2 (NCCP 15957)에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 방법에서 상기 살모넬라균은 혈청형 티피뮤리움(Typhimurium, ATCC 19585), 뉴포트(Newport, ATCC 6962), 버지니아(Virginia, CCARM 8206), 엔터리티디스(Enteritidis, CCARM 8200), 및 콜레라수이스(Choleraesuis, KCCM 40763)에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 방법에서 상기 황색포도상구균은 균주(strain) ATCC 11778, KCCM 41291, KCCM 12214, CCARM 3A011, 및 ATCC 12113에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 방법에서 상기 면역 자성 입자를 준비하는 단계는 상기 면역 자성 입자 1mg당 항체 0.5 ㎍ 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 방법에서 상기 균질화된 시료에 면역 자성 입자를 접촉시켜 반응시키는 단계는 10분 이상 반응시킬 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 방법에서 상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 검출하는 단계는 상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 배지에 배양하여 검출할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 방법에서 상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 검출하는 단계는 광선을 조사하여 흡광도를 측정하여 검출할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 방법에서 상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 검출하는 단계는 상기 검출 전 불순물을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 측면에 의하면, 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균 검출용 항체를 포함하는 면역 자성 입자를 포함하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출용 조성물이 제공된다.
일 실시예에 의하면, 상기 조성물에서 상기 대장균군은 혈청형 O157:H7 (ATCC 43890), O104:H4 (NCCP 15656), O26 (NCCP 14539), O111 (NCCP 14540), 및 O103:H2 (NCCP 15957)에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 조성물에서 상기 살모넬라균은 혈청형 티피뮤리움(Typhimurium, ATCC 19585), 뉴포트(Newport, ATCC 6962), 버지니아(Virginia, CCARM 8206), 엔터리티디스(Enteritidis, CCARM 8200), 및 콜레라수이스(Choleraesuis, KCCM 40763)에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 조성물에서 상기 황색포도상구균은 균주(strain) ATCC 11778, KCCM 41291, KCCM 12214, CCARM 3A011, 및 ATCC 12113에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 조성물에서 상기 면역 자성 입자 1mg당 항체 0.5 ㎍ 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 조성물에서 식중독균의 검출한계가 10 cfu/g일 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 조성물에서 축산물 또는 축산가공품의 식중독균을 검출할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 조성물에서 상기 면역 자성 입자는 자성 입자 표면에 프로테인-G 및 다클론 항체를 포함할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 조성물에서 상기 면역 자성 입자는 형광물질을 포함할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 복잡하고 다양한 매트릭스로 구성된 축산물 또는 다양한 식품첨가물이 포함된 축산가공품에 존재하는 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 포함하는 식중독균을 동시에 고감도로 검출할 수 있다.
일 실시예에 의하면 축산물 또는 축산가공품에 존재하는 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 포함하는 식중독균의 검출 및 진단 시간을 단축할 수 있다.
따라서, 식중독균 발생을 사전에 차단하고 경제적 손실을 절감할 수 있고, 식품의 안전성을 확보하여 안전 축산물 생산 유통을 통한 소비자 신뢰 제고 및 국민 보건증진에 기여할 수 있다.
도 1a은 일 실시예에 의한 면역 자성 비드와 식중독균의 결합 방식을 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 1b는 일 실시예에 의한 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 방법을 개략적으로 보여주는 도면이다.
도 2는 면역 자성 입자의 사용 농도 및 분석 시간에 따른 장출혈성 대장균의 검출 효율을 나타내는 그래프이다.
도 3은 대장균군 항체-자성입자 복합체(A), 황색포도상구균 항체-자성입자 복합체(B), 및 살모넬라균 항체-자성입자 복합체(C)의 검출 특이성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 오염된 축산물 및 축산가공품 내의 대장균군, 황색포도상구균, 및 살모넬라균의 혼합물의 회수율을 나타내는 그래프이다.
본 개시의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되는 이하의 상세한 설명과 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이다.
이에 앞서 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이고 사전적인 의미로 해석되어서는 아니 되며, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 개시의 기술적 사상에 부합되는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 명세서에서, 층, 부분, 또는 기판과 같은 구성요소가 다른 구성요소 "위에", "연결되어", 또는 "결합되어" 있는 것으로 기재되어 있는 경우, 이는 직접적으로 다른 구성요소 "위에", "연결되어", 또는 "결합되어" 있는 것일 수 있고, 또한 양 구성요소 사이에 하나 이상의 다른 구성요소를 개재하여 있을 수 있다. 대조적으로, 구성요소가 다른 구성요소 "직접적으로 위에", "직접적으로 연결되어", 또는 "직접적으로 결합되어" 있는 것으로 기재되어 있는 경우, 양 구성요소 사이에는 다른 구성요소가 개재되어 있을 수 없다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 개시를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 명세서에서, '포함하다' 또는 '가지다' 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서 전체에서, "상에"라 함은 대상 부분의 위 또는 아래에 위치함을 의미하는 것이며, 반드시 중력 방향을 기준으로 상 측에 위치하는 것을 의미하는 것이 아니다.
본 개시는 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예들을 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 개시를 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 개시의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 개시의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다.
이하, 본 개시의 실시예를 첨부도면을 참조하여 상세히 설명하기로 하며, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 동일하거나 대응하는 구성 요소는 동일한 도면번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
도 1a은 일 실시예에 의한 면역 자성 비드와 식중독균의 결합 방식을 모식적으로 나타낸 도면이고, 도 1b는 일 실시예에 의한 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 방법을 개략적으로 보여주는 도면이다.
도 1a 및 도 1b를 참조하면, 본원의 일측면에 의하면, 축산물 또는 축산가공품 시료를 완충희석액으로 희석하고 균질화하여 균질화된 시료를 준비하는 단계; 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균 검출용 항체를 포함하는 면역 자성 입자를 준비하는 단계; 상기 균질화된 시료에 면역 자성 입자를 접촉시켜 반응시키는 단계; 자성을 인가하여 상기 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 동시에 분리 및 농축하는 단계; 및 상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 검출하는 단계를 포함하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 방법을 제공한다.
또한, 본원의 다른 측면에 의하면, 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균 검출용 항체를 포함하는 면역 자성 입자를 포함하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출용 조성물을 제공한다.
본원에서 축산물 또는 축산가공품 시료는 특별한 제한이 없으나, 축산식품을 포함한다. 본원에서 축산물은 가축, 가금이 생산하는 우유, 고기, 달걀, 털, 가죽을 총칭한다. 본원에서 축산가공품은 고기, 우유, 달걀 등 축산물을 가공한 식품을 의미한다. 이에 한정되는 것은 아니나 시료는 햄, 소고기, 달걀, 또는 치즈일 수 있다.
본원에 의한 식중독균 동시검출 방법 및 조성물에 의하면, 복잡하고 다양한 매트릭스로 구성된 축산물 또는 다양한 식품첨가물이 포함된 축산가공품에 존재하는 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 포함하는 식중독균을 동시에 고감도로 검출할 수 있다.
본원에서 완충희석액은 공지의 완충희석액을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니나 PBS(phosphate-buffered saline; pH 7.6)가 적합할 수 있다.
본원의 식중독균 동시검출 방법에서 균질화된 시료를 준비하는 단계는 시료를 0.5 : 9.5 - 1.5 : 8.5로 희석하는 것이 검출 효율을 높이는 데 적합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원의 식중독균 동시검출 방법에서 균질화된 시료를 준비하는 단계는 시료를 110 - 130초 동안 균질화하는 것이 검출 효율을 높이는 데 적합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 균질화는 스토마커 블렌더와 같은 공지의 균질화 기구 및 장치를 이용할 수 있다.
본원에서 상기 대장균군은 혈청형 O157:H7 (ATCC 43890), O104:H4 (NCCP 15656), O26 (NCCP 14539), O111 (NCCP 14540), 및 O103:H2 (NCCP 15957)에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 대장균 혈청형은 식중독의 주요 원인균으로 본원의 식중독균 동시검출 방법에서는 상기 대장균 혈청형을 특이적으로 고감도로 신속하게 검출할 수 있다.
본원에서 상기 살모넬라균은 혈청형 티피뮤리움(Typhimurium, ATCC 19585), 뉴포트(Newport, ATCC 6962), 버지니아(Virginia, CCARM 8206), 엔터리티디스(Enteritidis, CCARM 8200), 및 콜레라수이스(Choleraesuis, KCCM 40763)에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 살모넬라균 혈청형은 식중독의 주요 원인균으로 본원의 식중독균 동시검출 방법에서는 상기 살모넬라균 혈청형을 특이적으로 고감도로 신속하게 검출할 수 있다.
본원에서 상기 황색포도상구균은 균주(strain) ATCC 11778, KCCM 41291, KCCM 12214, CCARM 3A011, 및 ATCC 12113에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 황색포도상구균 균주는 식중독의 주요 원인균으로 본원의 식중독균 동시검출 방법에서는 상기 황색포도상구균 균주를 특이적으로 고감도로 신속하게 검출할 수 있다.
본원에서는 상기 면역 자성 입자 1mg당 항체 0.5 ㎍ 이상을 포함하는 것이 적합할 수 있고, 상기 면역 자성 입자 1mg당 0.5 ㎍ - 1.0 ㎍이 더 적합할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 면역 자성 입자 1mg당 항체 0.5 ㎍ 미만이면 식중독균 검출 효율이 낮고, 1.0 ㎍을 초과하여도 검출 효율이 향상되지 않을 수 있다.
본원에서는 전장 항체가 이용될 수 있다. 전장 항체는 다클론 또는 단일클론 항체를 포함한다. 세포의 특정 표면 분자에 결합하는 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J Mol Biol, 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E and Lane, D, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc, Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 다클론 항체는 항원으로서의 세포 표면 분자를 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
본원의 상기 면역 자성 입자는 자성물질을 포함하는 코어 및 금을 포함하는 쉘로 이루어진 금 나노입자 등 공지의 면역 자성 입자를 이용할 수 있으며, 자성 입자 표면에 프로테인-G 및 다클론 항체를 포함하는 것이 적합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 프로테인-G는 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질로 알려져 있는데 자성 입자와 항체의 결합을 유도할 수 있다.
본원의 상기 면역 자성 입자는 공지의 형광 물질을 포함하여, 식중독균의 검출 효율을 향상시킬 수 있다.
본원의 식중독균 동시검출 방법에서 상기 균질화된 시료에 면역 자성 입자를 접촉시켜 반응시키는 단계는 10분 이상 반응시키는 것이 적합할 수 있고, 10 - 20 분 반응시키는 것이 더 적합할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 반응시간이 10분 미만이면 식중독균 검출 효율이 낮고, 상기 반응시간이 20분을 초과하여도 검출 효율이 향상되지 않을 수 있다.
본원의 식중독균 동시검출 방법에서 자성을 인가하여 상기 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 동시에 분리 및 농축하는 단계는 영구자석 또는 전자석에 의해 이루어질 수 있다. 본원의 면역 나노 입자는 식중독균과의 복합체 형태로 자성하에서 분리되어 농축될 수 있다.
상기 방법에서 상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 검출하는 단계는 상기 검출 전 불순물을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본원의 식중독균 동시검출 방법에서 상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 검출하는 단계는 상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 배지에 배양하여 검출할 수 있다. 상기와 같이 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균의 선택 배지에 배양하여 식중독균을 고감도로 동시에 용이하게 검출할 수 있다. 특히 본원에 의하면, 다양한 식중독균의 다양한 혈청형을 혼합하여도 식중독균 간 및 혈청형 간에 간섭이 일어나지 않아 동시검출이 가능하다.
이에 한정되는 것은 아니나, 본원에서는 IMS 분석이 대장균 O157:H7에 대해 99.6%의 CE를 보여주었을 뿐만 아니라, 실험된 다른 식중독균에 대해 80% 초과하는 CE를 보여주었다. 따라서, 본원은 신속하고, 면역학적으로 특이적인 식중독균 검출로 추정적 동정이 가능할 수 있다.
또한, 이에 한정되는 것은 아니나, 본원에 의한 IMS 분석은 모든 경우에서 10 CFU/mL의 낮은 농도의 대장균 O157:H7, 황색포도상구균, 및 살모넬라를 검출하였고, 축산식품의 4개의 형태에서 평균 검출 농도는 대장균 O157:H7은 7.4 CFU/mL이었고, 황색포도상구균은 12.4 CFU/mL였고, 살모넬라균은 8.4 CFU/mL였다. 이들 3종의 식중독균에 대한 최고 CE 값(8.5% - 28.4%)은 102 - 104 CFU/mL의 접종 농도에서 관찰되었다.
따라서, 본원에 의하면 종래 식중독균의 검출방법에 비해 검출한계를 10-100 배 향상시킬 수 있고, 사전 증식 과정 없이 축산물 또는 축산가공품의 식중독균을 고감도로 신속하게 검출할 수 있다.
본원의 식중독균 동시검출 방법에서 상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 검출하는 단계는 광선을 조사하여 흡광도를 측정할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 흡광도 측정은 시료가 담긴 컬럼에 가시광선을 조사하고 연결된 스펙트로포토미터를 이용하여 식중독균의 검출 및 정량 분석이 가능하다. 본원에서 정량 분석은 자성하에서 캡처된 식중독균-자성 입자 복합체에 대한 가시광선 영역의 광을 조사하여 흡광도의 변화를 측정하고 상기 흡광도의 변화를 식중독균의 수로 환산함으로써 이루어질 수 있다.
실시예
재료 및 방법
1) 박테리아 배양(Bacterial cultures)
하기 세균들을 18시간 동안, 37℃에서 TSB(tryptic soy broth; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 배양하였다: 대장균(E. coli) 혈청형(serotypes) O157:H7 (ATCC 43890), O104:H4 (NCCP 15656), O26 (NCCP 14539), O111 (NCCP 14540), 및 O103:H2 (NCCP 15957); 살모넬라 엔터리카 혈청형 티피뮤리움(Salmonella enterica serovars Typhimurium, ATCC 19585), 뉴포트(Newport, ATCC 6962), 버지니아(Virginia, CCARM 8206), 엔터리티디스(Enteritidis, CCARM 8200), 및 콜레라수이스(Choleraesuis, KCCM 40763); 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 균주(strains) ATCC 11778, KCCM 41291, KCCM 12214, CCARM 3A011, 및 ATCC 12113; Shigella sonnei (KCCM 11903); 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes , CCARM 0019); 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens, KCCM 12098).
2) 면역 자성 비드의 준비(Preparation of immunomagnetic beads)
면역 자성 비드(immunomagnetic beads, IMBs)를 제조하기 위해, 항-대장균 혈청형 O/K (rabbit/IgG), 항-살모넬라 (rabbit/IgG), 및 항-황색포도구균 (rabbit/IgG) 다클론 항체 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)가 제조자의 매뉴얼에 따라 Dynabeads Protein G (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)와 함께 배양되었다.
3) 식품 시료의 준비(Preparation of food samples)
시료로 햄, 간 소고기, 계란, 및 리코타 치즈가 상이한 조직 및 조성 때문에 선택되었다.
시료에 마이크로플로라(microflora)가 없다는 것이 다양한 미생물 선택적 아가 배지 [Baird-Parker agar (BPA), eosin methylene blue (EMB), xylose lysine deoxycholate (XLD), Oxford, and tryptose sulfite cycloserine (TSC) media]로 사전 평가되었다. 계란 성분(contents)을 수집하기 위해, 계란은 10초 동안 75% 알코올 내의 Lugol’s solution (iodine/potassium iodide solution)에서 표면-살균되었고, 10분 동안 멸균 챔버 내에서 대기 건조되었다. 계란 성분, 햄, 간 소고기, 및 리코타 치즈 시료(각 10g)는 병원균의 연속적 희석농도(100 내지 106 CFU/mL)로 접종되었다. 각 접종된 식품 시료는 90mL의 PBS(phosphate-buffered saline; pH 7.6)로 희석되었고, 스토마커 블렌더(stomacher blender; Bag Mixer 400, Interscience, St Nom la
Figure 112018123573879-pat00001
France)로 2분 동안 균질화 되었다.
4) 식중독균의 면역 자성 비드 ( IMB ) 분리
식품 시료(10mL)는 다클론 항체와 결합된 15mg (50μL)의 Dynabeads와 혼합되었고, 15rpm 회전속도로 10분 동안 실온에서 배양되었다. 분리 후, 상등액은 버리고, 세포가 부착된 IMB는 200μL의 PBS에서 현탁되었다. 그런 다음, IMB는 적절한 희석 후 집락 계산을 위해 선택적 평판배지 상에 도말되었고, 37℃에서 밤새 배양되었다. 회수율(capture efficiency, CE)을 측정하기 위해, IMB는 TSA 상에 회수된 집락수에 의해 확인되었다.
CE는 하기 식에 의해 계산되었다:
CE (%)=(B/A)×100,
여기서 A는 시료 내에 존재하는 전체 세포 수(CFU/mL)이고, B는 IMB-결합 세포 수(CFU/mL)이다.
5) 특이성 평가(Specificity assessment)
표적이 아닌 박테리아(S. sonnei, L. monocytogenes , 및 C. perfringens)와 함께, 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균 각 5종의 균주가 18시간 동안, 37℃에서 TSB에서 배양되었고, 103 CFU/mL까지 연속 희석되었다. 혼합된 배양물은 IMB-결합 표적 박테리아 및 표적이 아닌 박테리아용 선택적 아가 배지 상에 도말되었다. 상술한 바와 같이, CE는 계산되었다.
6) 식중독균의 동시 검출(Simultaneous detection of foodborne pathogens)
대장균 혈청형 혼합물, 황색포도구균 균주 혼합물, 및 살로넬라 혈청형 혼합물은 103 CFU/mL의 최종 농도까지 준비되었다. 혼합 배양물은 햄, 간 소고기, 계란, 및 리코타 치즈 시료(각각 10g)에 접종되었다. 3개의 표적 박테리아 각각에 특이적 IMB 혼합물(총 4.5mg)이 3개의 박테리아를 함유하는 식품 시료에 첨가되고 혼합되었다. 박테리아-부착 IMB는 각 타입의 선택배지에 도말되었고, CE는 상술한 바와 같이 계산되었다.
7) 통계 분석(Statistical analysis)
본원에서는 3 반복 실험되었다. 데이터는 평균±SD로서 표현되었다. 통계 분석은 SPSS version 12.0(SPSS Inc, Chicago, IL, USA)로 수행되었다. 데이터의 정규분포 분석을 한 후, 독립적인 시료 t-test 또는 변수 (ANOVA)-Tukey test 분석은 각각 2 이상의 대조군과의 통계적 차이를 결정하기 위하여 이용되었다. 차이는 p<0.05에서 통계학적 유의성이 고려되었다.
결과 분석
1) 면역 자성 분리법의 최적화(Optimization of the immunomagnetic separation (IMS) assay)
식중독균 분리를 위한 IMB의 최적의 양 및 면역반응 시간을 결정하기 위해, E. coli O157:H7에 대한 CE 분석이 다양한 자성 비드의 농도 및 배양시간으로 수행되었다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 94.3% (5.6×104 CFU/mL)의 최고의 CE는 0.15 mg의 IMBs (10×107 자성 입자에 대응하는) 및 10분의 면역반응 시간으로 얻어졌다. 면역반응 시간 또는 IMB 농도가 증가하여도 CE의 유의적인 증가는 없었다(모두 p>0.05임). 실제, IMB의 농도가 0.15mg에서 0.3mg으로 증가하여도 CE는 약간 감소하는 것으로 나타났다(도 2). 박테리아 회수는 강력한 자장에서 용이하게 일어나지만, 과도한 IMB는 비드에 결합하는 박테리아 표면상에 항원 사이트를 유도하여 박테리아를 손상시켜 CE를 감소시킬 수 있다 (Zhang et al., 2016). 따라서, 0.15mg IMB 및 10분간의 면역반응 시간이 이후 실험에서 최적 조건으로 이용되었다.
계산 방법의 차이로 인해 CE가 저평가될 수 있다. Varshney et al. (2005)는 IMS 분석에서 CE를 계산하는 2가지 방법을 비교하여, 자성 비드에 결합한 세포의 CE (bound cell-based calculations)가 결합하지 않은 세포 CE(unbound cell-based calculations)보다 낮은 것을 발견하였다. 미생물의 초기 농도를 알고 있는 경우라면, 결합하지 않은 세포-기반 계산이 MS 분석에서 정량 결과를 측정하는 데 더 적합할 수 있다. 그러나 상기 방법은 함유된 세포 농도를 모르는 오염된 식품에 직접적으로 사용하기에 적합하지 않다. 따라서, 식품 산업 현장과 동일하게, 본원에서는 이후 실험에 대해 실제 식품 샘플로부터 수득된 결합된 세포-기반 계산방법을 이용하였다.
2) CE 및 IMS의 특이성 분석(CE and specificity of the IMS assay)
분석에서의 표적 항체의 CE 및 특이성이 3종의 혼합 배양물에서 실험되었다(도 3). 살모넬라 다클론 항체는 실험된 모든 살모넬라 혈청형에 대해 높은 민감도를 나타냈고(92.5% - 100.4%의 CE) 및 황색포도상구균의 5종의 균주의 검출에서도 IMS 분석에서 높은 CE 값(87.0%-97.8%)을 나타내었다. 항-대장균 혈청형 O/K와 IMB의 결합은 실험된 대장균 5가지 혈청형에서 81.1%-99.6%로 나타났다. 분석에서 이용된 대장균, 황색포도상구균, 및 살모넬라 균주에 대한 다클론 항체는 표적이 아닌 박테리아의 10% 미만의 회수율과 비교해서 표적 박테리아에 대해 높은 특이성을 나타내었다(도 3). 이들 결과는 IMS 분석이 표적 식중독균과 최소 교차-반응성을 가지는 다른 박테리아를 효율적으로 구별할 수 있다는 것을 나타낸다.
대장균 0157:H7에 대한 다클론 항체-코팅 IMS의 높은 특이적 결합에 대해 다른 연구자들(Aydin et al, 2014; Herzig et al, 2016; Luciani et al, 2016)에 의해 보고된 적이 있지만, 대장균의 다양한 항원성 혈청형을 검출하기 위해 IMS를 이용한 연구는 거의 없다. 본원에서는 IMS 분석이 대장균 O157:H7에 대해 99.6%의 CE를 보여주었을 뿐만 아니라, 실험된 다른 대장균 혈청형에 대해 80% 초과하는 CE를 보여주었다. 따라서, 본원은 높은 특이성을 갖는 IMB-기반 분석이 신속하고, 면역학적이고, 추정적인 동정이 가능하다는 것을 제시한다.
3) IMS 분석을 이용한 식중독균 검출(Detection of foodborne pathogens in foods using the IMS assay)
인위적으로 오염된 축산식품으로부터 회수된 3종의 식중독균 세포의 수는 종래의 증식 단계 없이 IMB-기반 분석을 이용하여 계산되었고, 종래의 방법을 이용한 결과와 비교되었다. IMB-기반 방법을 이용하였을 때, 대장균 O157:H7, 황색포도상구균, 및 살모넬라의 평균 CE를 표 1 - 3에 나타내었다. IMS 분석은 모든 경우에서 10 CFU/mL의 낮은 농도의 대장균 O157:H7, 황색포도상구균, 및 살모넬라를 검출하였고, 축산식품의 4개의 형태에서 평균 검출 농도는 대장균 O157:H7은 7.4 CFU/mL이었고, 황색포도상구균은 12.4 CFU/mL였고, 살모넬라균은 8.4 CFU/mL였다. 이들 3종의 식중독균에 대한 최고 CE 값(8.5%-28.4%)은 102 - 104 CFU/mL의 접종 농도에서 관찰되었고, 106 CFU/mL의 접종농도에서는 회수율(36% - 98%)은 오히려 감소하였다. 이는 높은 접종 농도에서 IMB의 농도가 상대적으로 낮기 때문에 더 적은 세포가 IMB에 결합하기 때문이다.
시료 혼합물에서의 동시검출은 개별 검출과 비교해서 유사한 CE를 나타냈다. 대장균 혈청형 혼합물, 황색포도상구균 균주의 혼합물, 및 살모넬라 혈청형 혼합물의 CE는 햄의 경우 26.3 - 29.4%, 소고기의 경우 28.7 - 30.8%, 계란의 경우 16.5 - 21.4%, 및 리코타 치즈의 경우 26.8 - 29.0%여서, 박테리아의 다양한 혈청형을 혼합하여도 혈청형 간에 간섭이 일어나지는 않는다는 것으로 나타낸다.
Figure 112018123573879-pat00002
Figure 112018123573879-pat00003
Figure 112018123573879-pat00004
본원에 의하면, IMS 분석은 대장균, 살모넬라균, 및 황색포도상구균의 동시 검출이 가능하고, 4시간의 사전 증식 및/또는 PCR 과정 없이도 4가지의 다른 축산물 또는 축산가공품의 식중독균을 검출할 수 있다.
또한, 본원에 의하면, 대장균 및 살모넬라균의 각각의 5가지 혈청형 및 호황색포도상구균의 5종의 균주를 10CFU/g의 검출한계로 검출할 수 있어, 종래 방법에 비해 검출한계를 10 - 100배 향상시킬 수 있다.
나아가, 본원에 의하면, 식중독균 검출을 표준 실험실에서 간단히 수행할 수 있고 복잡한 기술 또는 장비가 필요하지 않아 식품 가공 산업에서 쉽게 적용될 수 있다.
이상, 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리 범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims (21)

  1. 하기의 단계를 포함하는 식중독균 동시검출 효율 증진방법으로서,
    축산물 또는 축산가공품 시료를 완충희석액으로 희석하고 균질화하여 균질화된 시료를 준비하는 단계;
    대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균 검출용 항체를 포함하는 0.15mg 이하의 면역 자성 입자를 준비하는 단계;
    상기 균질화된 시료에 면역 자성 입자를 10분 내지 20분 동안 접촉시켜 반응시키는 단계;
    자성을 인가하여 상기 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 동시에 분리 및 농축하는 단계; 및
    상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 면역 자성 입자는 자성 입자 1mg 당 상기 검출용 항체를 0.5 내지 1.0㎍ 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 햄, 소고기, 달걀, 또는 치즈인, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균질화된 시료를 준비하는 단계는 시료를 0.5 : 9.5 - 1.5 : 8.5로 희석하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균질화된 시료를 준비하는 단계는 110 - 130초 동안 균질화하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 대장균군은 혈청형 O157:H7 (ATCC 43890), O104:H4 (NCCP 15656), O26 (NCCP 14539), O111 (NCCP 14540), 및 O103:H2 (NCCP 15957)에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 살모넬라균은 혈청형 티피뮤리움(Typhimurium, ATCC 19585), 뉴포트(Newport, ATCC 6962), 버지니아(Virginia, CCARM 8206), 엔터리티디스(Enteritidis, CCARM 8200), 및 콜레라수이스(Choleraesuis, KCCM 40763)에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 황색포도상구균은 균주(strain) ATCC 11778, KCCM 41291, KCCM 12214, CCARM 3A011, 및 ATCC 12113에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 검출하는 단계는 상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 배지에 배양하여 검출하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 검출하는 단계는 광선을 조사하여 흡광도를 측정하여 검출하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 농축된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균을 검출하는 단계는 상기 검출 전 불순물을 제거하는 단계를 더 포함하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진방법.
  13. 식중독균 동시검출 효율 증진용 조성물로서,
    상기 조성물은 자성 입자 및 상기 자성 입자와 결합된 대장균군, 살모넬라균, 및 황색포도상구균 검출용 항체를 포함하는 면역 자성 입자를 포함하되,
    상기 면역 자성 입자는 0.15mg 이하로 포함되고,
    상기 면역 자성 입자는 상기 자성 입자 1mg 당 상기 검출용 항체를 0.5 내지 1.0㎍ 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 대장균군은 혈청형 O157:H7 (ATCC 43890), O104:H4 (NCCP 15656), O26 (NCCP 14539), O111 (NCCP 14540), 및 O103:H2 (NCCP 15957)에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진용 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 살모넬라균은 혈청형 티피뮤리움(Typhimurium, ATCC 19585), 뉴포트(Newport, ATCC 6962), 버지니아(Virginia, CCARM 8206), 엔터리티디스(Enteritidis, CCARM 8200), 및 콜레라수이스(Choleraesuis, KCCM 40763)에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진용 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 황색포도상구균은 균주(strain) ATCC 11778, KCCM 41291, KCCM 12214, CCARM 3A011, 및 ATCC 12113에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진용 조성물.
  17. 삭제
  18. 제13항에 있어서,
    식중독균의 검출한계가 10 cfu/g인, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진용 조성물.
  19. 제13항에 있어서,
    축산물 또는 축산가공품의 식중독균을 검출하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진용 조성물.
  20. 제13항에 있어서,
    상기 면역 자성 입자는 자성 입자 표면에 프로테인-G 및 다클론 항체를 포함하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진용 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 면역 자성 입자는 형광물질을 포함하는, 면역 자성 입자를 이용한 식중독균 동시검출 효율 증진용 조성물.
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