CN113484258A - 一种c-反应蛋白检测试剂冻干微球及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及冻干微球制备领域，公开了一种C‑反应蛋白检测试剂冻干微球，检测试剂中含有标记抗人CRP抗体的胶体金颗粒，胶体金颗粒的粒径为20nm～60nm，抗人CRP抗体与胶体金溶液的添加比为5～20μg/mL。微球的制备方法，包括S1：胶体金的制备；S2：标记抗人CRP抗体胶体金颗粒的制备，加入胶体金溶液，调节pH值后加抗人CRP抗体，混合反应后加入封闭剂，而后离心并去掉上清液，再用重悬液悬浮沉淀即得胶体金‑抗人CRP抗体复合物；S3：配制检测试剂并冻干，按比例配制检测试剂后分液滴珠并冷冻干燥，制备成的冻干微球为2ul‑10ul/滴。本发明的C‑反应蛋白检测试剂冻干微球具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、抗干扰能力强、操作简便等优点，非常适合即时检测技术(POCT)应用。

Description

一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球及制备方法
技术领域
本发明涉及冻干微球制备领域，具体涉及一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球及制备方法。
背景技术
C-反应蛋白(C-reaction protein，CRP)是一种结构为正五聚体的急性时相蛋白，机体在各种炎症过程、组织坏死与组织损伤时(如外科手术后)，炎性细胞因子如IL-6释放CRP致使血清中浓度升高。由于C-反应蛋白通常在细菌感染后增高，而病毒感染时不增高，具有很好的稳定性及精确性，是炎症和组织损伤的非特异性标志物。人类的CRP由5个相同的非糖基化多肽亚基组成，每个亚基包含206个氨基酸残基和两个钙离子结合位点所以常用来作为鉴别细菌和病毒感染的一个首选指标。
目前C-反应蛋白常用检测方法有免疫层析法、胶乳凝集法、胶乳增强免疫比浊法和发光法。这些方法的原理是利用抗原抗体产生免疫应答反应，产生聚集、凝集和沉淀等，借助其他方式产生或放大这种变化达到检测的目的。其中，胶体金免疫层析法直接目测颜色深浅或灰度扫描，操作简单检测快速，而且不需要仪器或仅需简单仪器，适合现场检测。但免疫层析法灵敏度较低，检测范围一般为10～200mg/L，在正常范围内低程度炎症反应(如心血管事件)的预测不够灵敏。而胶乳凝集法和胶乳增强免疫比浊法灵敏度较高且已实现了自动化，利用血清中得C-反应蛋白与结合在胶乳颗粒表面的抗人C-反应蛋白抗体结合，产生抗原抗体反应，使胶乳颗粒形成凝集。自动生化仪监测此凝集反应在600nm处的吸光度，对照标准曲线可求出C-反应蛋白的含量。胶乳增强免疫比浊法自动化程度高，检测准确度高，但是需要专业化仪器设备和专业人员，专业实验室操作，所需样品量大及维护成本高等问题，因此亟需提供一种操作简单、稳定性好且检测效率高的C-反应蛋白及时检测方法。
发明内容
本发明意在提供一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球及制备方法，以解决现有的C-反应蛋白检测方法中存在的所需样品量大及维护成本高的问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球，检测试剂中含有标记抗人CRP抗体的胶体金颗粒，胶体金颗粒的粒径为20nm～60nm，所述抗人CRP抗体与胶体金溶液的添加比为5～20μg/mL。
本技术方案还提供一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球及制备方法，包括如下步骤：
S1：胶体金的制备，将氯金酸溶液加入到去离子水或超纯水中，加热搅拌后加入新配制的二水合柠檬酸三钠，待溶液由浅黄变为无色再变为酒红色后，继续加热搅拌10min，冷却至室温至室温后4℃保存备用；
S2：标记抗人CRP抗体胶体金颗粒的制备，加入胶体金溶液，用碳酸钾调节pH值后加抗人CRP抗体，混合反应后加入封闭剂进行封闭，而后离心并去掉上清液，再用重悬液悬浮沉淀即得胶体金-抗人CRP抗体复合物；所述重悬液包括如下质量份的原料：缓冲液5～200mmol/L、封闭剂0.01％～2％、稳定剂1％～20％和防腐剂0.01％-0.1％；
S3：配制检测试剂并冻干，按比例配制检测试剂后进行分液滴珠并冷冻干燥处理，所述冷冻干燥处理包括预冻、升华干燥和解析干燥，预冻的条件为：-35℃、1h；升华干燥的条件为：-30℃、60min；-20℃、60min；-10℃、60min；0℃、60min依次进行；解析干燥的条件为：5℃、60min；15℃、60min依次进行；制备成的冻干微球为2ul-10ul/滴。
本方案的原理及优点是：实际应用时，本技术方案中，利用胶体金来偶联抗体或抗原，形成金颗粒与抗体/抗原的结合物(溶胶颗粒)。当与抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，检测仪器散射或透射光吸光度发生变化，从而达到定量检测的目的。出于特异性与线性的考虑，本方案对胶体金颗粒的粒径进行了优化，在其他条件一定的情况下，颗粒太大特异性差易聚沉，颗粒太小会使线性范围较窄。本发明克服了传统的胶乳增强免疫比浊法成本高，操作繁琐，以及反应产生沉淀不利于仪器清洗等问题。此外，本发明将液体检测试剂冻干成微球，提高了试剂的稳定性和便携性；而且本发明的检测试剂是一次性使用产品，减少了环境污染和后续仪器使用与维护成本。本发明CRP冻干微球具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、抗干扰能力强、操作简便等优点，非常适合即时检测技术(POCT)的应用。
优选的，作为一种改进，检测试剂的组成为：标记抗人CRP抗体的胶体金颗粒0.01％～0.05％、促凝剂0.5％～2％、底物保护剂0.5％～2％、表面活性剂0.1％～1％、冻干稳定剂0.05％～0.5％、防腐剂0.01％～0.1％、缓冲液5～200mmol/L。
本技术方案中，促凝剂、冻干稳定剂太少会导致冻干微球出现萎缩或不成型等问题，表面活性剂太少导致微球溶解性差，上述的添加比例为经过试验验证的合适比例。
优选的，作为一种改进，缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、碳酸盐缓冲液或PBS缓冲液的一种。
本技术方案中，缓冲液用于维持实验体系的酸碱度，溶液体系pH值的变化会影响抗原抗体反应或导致酶活性下降；此外，缓冲液中的某种离子对反应也会产生影响。
优选的，作为一种改进，促凝剂为PEG8000、PEG20000或聚乙二醇中的一种或多种。
本技术方案中，促凝剂的选择对冻干微球的成型有重要影响，促凝剂选择不当会导致微球萎缩，上述的促凝剂均有助于冻干微球的成型。
优选的，作为一种改进，抗人CRP抗体为多克隆抗体或单克隆抗体的一种或两种混合。
本技术方案中，可以根据实际需要对抗人CRP抗体进行选择。
优选的，作为一种改进，底物保护剂为PEG4000、PEG8000、PEG20000或聚乙二醇中的一种或多种。
本技术方案中，底物保护剂的选择对冻干微球的成型有重要影响，底物保护剂选择不当同样会导致微球萎缩。
优选的，作为一种改进，表面活性剂为吐温-20、吐温-40、吐温-80，TritonX-100或聚氧乙烯月桂醚Brij35中的一种或多种。
本技术方案中，表面活性剂具有乳化和增加亲水性的作用，且具有提高溶解性、复性抗原的作用，进而可提高特异性的识别能力。上述的表面活性剂为经过试验验证的最优选择。
优选的，作为一种改进，冻干稳定剂为海藻糖、蔗糖、乳糖或BSA中的一种或多种。
本技术方案中，冻干稳定剂具有增加产品浓度和赋予产品形态的作用，上述的冻干稳定剂为经过试验验证的最优组合，具有较好的产品赋性效果。
优选的，作为一种改进，防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、山梨酸钾、Proclin-300中的一种或多种。
本技术方案中，防腐剂的添加能够抑制细菌的生长，能够延长试剂的有效期，同时不会对试剂产生不良影响。
附图说明
图1为本发明CRP检测试剂冻干微球的形态图。
图2为本发明实施例1中胶体金全波长扫描图。
图3本发明实施例1中CRP冻干微球检测结果线性图。
图4为发明实施例2中CRP冻干微球检测结果线性图。
图5为发明实施例3中CRP冻干微球检测结果线性图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1
一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球及制备方法，包括如下步骤：
S1：胶体金的制备，在洁净的250mL烧杯中加入100mL纯化水，由于胶体金对水质的要求很高，因此，本实施例中的纯化水为电阻率达到18.2Ω的去离子水或超纯水。用磁力加热套加热并快速搅拌纯化水，并加入1％的氯金酸溶液1mL，待溶液微沸时，迅速加入新配制的1％的二水合柠檬酸三钠1mL，待溶液由浅黄变为无色，再变成酒红，继续搅拌加热10min后停止加热，待冷却至室温后4℃保存备用。用分光光度计对上述胶体金进行全波长扫描，如图2所示，其在525～550nm处有单一吸收峰；目测观察胶体金液面无油状漂浮物，底部无黑色颗粒凝集。
S2：标记人抗CRP抗体胶体金颗粒的制备：在1.5mL离心管中，加入1mL胶体金溶液，用0.1M碳酸钾调节pH值至6.5，加入终浓度6μg/mL CRP抗体，混合均匀并反应30min，再加入终浓度0.1％PEG-20000封闭剂，搅拌混匀30min；10000rpm离心30min，去掉上清液，再用1/10原体积重悬液悬浮沉淀即可制备胶体金-抗人CRP抗体复合物。本实施例中的重悬液包括：10mmol/L Tris-cl(pH 7.4)缓冲液、0.1％PEG-2000封闭剂和0.02％Proclin-300防腐剂。
S3：配制C-反应蛋白检测试剂，其组成如下表所示：
表1
Figure BDA0003141490460000041
Figure BDA0003141490460000051
将上述组分混合均匀后即得C-反应蛋白检测试剂，利用可精确定量的分液系统，将检测试剂以10ul/滴滴入液氮中，经液氮冷却后形成冷冻试剂微球，再将冷冻试剂微球转入冻干机中进行冷冻干燥处理，冷冻干燥处理后即得C-反应蛋白检测试剂冻干微球(如图1所示)。本实施例中冷冻干燥包括预冻程序、升华干燥程序和解析程序，预冻程序的条件为-35℃、1h；升华干燥程序的条件为-30℃、60min；-20℃、60min；-10℃、60min；0℃、60min依次进行；解析干燥程序的条件为5℃、60min；15℃、60min依次进行。
检测程序
检测程序中，检测仪器为生化分析仪，检测温度为37℃，比色皿为100ul，主波长为546nm，检测方法为两点终点法。分别设置空白对照组、标准品组和样本组。其中，标准品为朗道C-反应蛋白校准品cp2179，样品为血液中添加CPR抗原的样本，各个处理组的设置如下：
表2
处理组 超纯水 标准品 样本 检测试剂冻干微球
空白组 10ul / / 10ul/个
标准品组 / 10ul / 10ul/个
样本组 / / 10ul 10ul/个
将上述各处理组充分混匀，在37℃的条件下孵育1min，读取A1；5min后读取A2。吸光度变化ΔA＝A1-A2。结果计算：
血清C-反应蛋白浓度(mg/L)＝ΔA测定/ΔA标准x C-反应蛋白标准液浓度(mg/L)
检测结果如图3所示，图3中横坐标为CPR标准品理论值，纵坐标为CPR检测吸光光度值(OD值)，本实施例中检测吸光光度值与理论值之间具有良好的线性相关性，且R2为0.9786，拟合效果较好。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例中，在胶体金的制备过程中，二水合柠檬酸三钠的添加量为1.5mL；在标记抗人CRP抗体胶体金颗粒的制备过程中，离心转速为11000rpm，离心后用1/5原体积重悬液悬浮沉淀，且使用的缓冲液为PBS(pH 7.4)缓冲液。配制C-反应蛋白检测试剂时，其组成如下表所示：
表3
组分 具体组分 浓度
缓冲液 PBS(pH 7.4) 10mmol/L
标记抗人CRP抗体胶体金颗粒 标记抗人CRP抗体胶体金颗粒 0.05％
底物保护剂 PEG20000 1％
底物保护剂 PEG8000 1％
表面活性剂 TritonX-100 0.1％
冻干稳定剂 海藻糖 0.05％
防腐剂 Proclin-300 0.02％
在C-反应蛋白检测试剂制备完成后，利用可精确定量的分液系统，将检测试剂以5ul/滴滴入液氮中，经液氮冷却后形成冷冻试剂微球，再将冷冻试剂微球转入冻干机中进行冷冻干燥处理。检测程序与实施例1的分组及检测方法相同。
检测结果如图4所示，图4中横坐标为CPR标准品理论值，纵坐标为CPR检测值，本实施例中检测值与理论值之间具有良好的线性相关性，且R2为0.9985，拟合效果较好。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例中，在胶体金的制备过程中，二水合柠檬酸三钠的添加量为2mL；在标记抗人CRP抗体胶体金颗粒的制备过程中，离心转速为12000rpm，离心后用1/2原体积重悬液悬浮沉淀，且使用的缓冲液为PBS(pH 7.4)缓冲液。配制C-反应蛋白检测试剂时，其组成如下表所示：
表4
组分 具体组分 浓度
缓冲液 PBS(pH 7.4) 10mmol/L
标记抗人CRP抗体胶体金颗粒 标记抗人CRP抗体胶体金颗粒 0.02％
底物保护剂 PEG20000 1％
底物保护剂 PEG8000 1％
表面活性剂 TritonX-100 0.1％
冻干稳定剂 海藻糖 0.05％
防腐剂 Proclin-300 0.02％
在C-反应蛋白检测试剂制备完成后，利用可精确定量的分液系统，将检测试剂以3ul/滴滴入液氮中，经液氮冷却后形成冷冻试剂微球，再将冷冻试剂微球转入冻干机中进行冷冻干燥处理。检测程序与实施例1的分组及检测方法相同。
检测结果如图5所示，图5中横坐标为CPR标准品理论值，纵坐标为CPR检测值，本实施例中检测值与理论值之间具有良好的线性相关性，且R2为0.9967，拟合效果较好。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球，其特征在于：检测试剂中含有标记抗人CRP抗体的胶体金颗粒，所述胶体金颗粒的粒径为20nm～60nm，所述抗人CRP抗体与胶体金溶液的添加比为5～20μg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球，其特征在于，所述检测试剂的组成为：标记抗人CRP抗体的胶体金颗粒0.01％～0.05％、促凝剂0.5％～2％、底物保护剂0.5％～2％、表面活性剂0.1％～1％、冻干稳定剂0.05％～0.5％、防腐剂0.01％～0.1％、缓冲液5～200mmol/L。
3.根据权利要求2所述的一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、碳酸盐缓冲液或PBS缓冲液的一种。
4.根据权利要求3所述的一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球，其特征在于：所述促凝剂为PEG8000、PEG20000或聚乙二醇中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球，其特征在于：所述抗人CRP抗体为多克隆抗体或单克隆抗体的一种或两种混合。
6.根据权利要求5所述的一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球，其特征在于：所述底物保护剂为PEG4000、PEG8000、PEG20000或聚乙二醇中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球，其特征在于：所述表面活性剂为吐温-20、吐温-40、吐温-80，TritonX-100或聚氧乙烯月桂醚Brij35中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球，其特征在于：所述冻干稳定剂为海藻糖、蔗糖、乳糖或BSA中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球，其特征在于：所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、山梨酸钾、Proclin-300中的一种或多种。
10.一种C-反应蛋白检测试剂冻干微球及制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：胶体金的制备，将氯金酸溶液加入到去离子水或超纯水中，加热搅拌后加入新配制的二水合柠檬酸三钠，待溶液由浅黄变为无色再变为酒红色后，继续加热搅拌10min，冷却至室温至室温后4℃保存备用；
S2：标记抗人CRP抗体胶体金颗粒的制备，加入胶体金溶液，用碳酸钾调节pH后加抗人CRP抗体，混合反应后加入封闭剂进行封闭，而后离心并去掉上清液，再用重悬液悬浮沉淀即得胶体金-抗人CRP抗体复合物；所述重悬液包括如下质量份的原料：缓冲液5～200mmol/L、封闭剂0.01％～2％、稳定剂1％～20％和防腐剂0.01％～0.1％；
S3：配制检测试剂并冻干，按比例配制检测试剂后进行分液滴珠并冷冻干燥处理，所述冷冻干燥处理包括预冻、升华干燥和解析干燥，预冻的条件为：-35℃、1h；升华干燥的条件为：-30℃、60min；-20℃、60min；-10℃、60min；0℃、60min依次进行；解析干燥的条件为：5℃、60min；15℃、60min依次进行；制备成的冻干微球为2ul-10ul/滴。
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