CN118225545A - 一种重组人TNF-α蛋白冻干小球及其制备方法和应用 - Google Patents
一种重组人TNF-α蛋白冻干小球及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种重组人TNF‑α蛋白冻干小球及其制备方法和应用，重组人TNF‑α冻干小球由重组人TNF‑α蛋白溶液、冻干保护溶液和聚甘氨酸‑精氨酸混合冻干成球状，冻干保护溶液包括封闭剂、乙二胺四乙酸二钠盐二水、卵磷脂、羟丙基‑β‑环糊精、壳聚糖、海藻糖、山梨醇、磷酸盐缓冲液和L‑丝氨酸。本发明提供重组人TNF‑α蛋白冻干小球的制备方法，制得的重组人TNF‑α蛋白冻干小球的冻干得率更高、复溶后稳定性时间更长，不同冻干小球间保持高度均一性，保存期达8年以上，且复溶后24h内保持稳定；当用于人体血液中分泌的TNF‑α蛋白检测时，空白限可达0.65pg/ml以下，加大实验的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及冻干技术领域，具体涉及一种冻干小球的制备方法，尤其涉及一种重组人TNF-α蛋白冻干小球及其制备方法和应用。
背景技术
TNF-α是一种由157个氨基酸组成的多肽链，其分子量较小，结构较简单，极易降解。同时该蛋白等电点较高，极易吸附于等电点较低的材料上而导致检测异常。
抗原，是指能够刺激机体产生免疫应答或特异性免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应或特异性反应的物质。
重组人TNF-α蛋白通常作为抗原，用于人体血液中分泌的TNF-α蛋白检测的标准品。目前国内市场中抗原蛋白多以液态储存或者冻干成粉末状为主，冻干成小球的较少。液态储存存在以下缺陷：（1）液态多以冻存为主，使用时难以避免反复冻融，这会导致抗原降解，含量下降；（2）运输储存较困难。而冻干成粉末状的抗原蛋白存在以下缺陷：（1）易黏连管壁，复溶时会出现复溶不完全，导致结果测试不准确；（2）多个抗原蛋白混合冻干成粉末状，冻干粉内，每个抗原蛋白的量差异较大，不便于试剂的检测。
为了方便储存、运输及检测过程中更加简便易操作，需要将重组人TNF-α蛋白制备成冻干小球。授权公告号为CN117159480B的中国发明专利中公开了一种重组人IFN-γ 蛋白冻干小球及其制备方法和应用，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述冻干保护溶液包括葡聚糖、海藻糖、甘露醇、维生素E、维生素C、PVP40、磷酸盐缓冲液和胎牛血清；所述封闭剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸和谷氨酸；所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球，能提高检测的准确性、特异性，降低检测空白限，同时不同冻干小球间保持高度均一性，保存期达5年以上，可作为人体血液中分泌的IFN-γ蛋白检测的标准品。
但针对本发明中的重组人TNF-α蛋白，由于重组人TNF-α蛋白极易降解，同时该蛋白等电点较高，在7.5左右，这导致该蛋白在PH值为中性或弱酸性的环境中极易吸附于等电点较低的材料上，如玻璃材质，其等电点在3左右，这样会导致检测异常。当采用前述专利中提及的制备方法将重组人TNF-α蛋白制备成重组人TNF-α蛋白冻干小球时，在冻干过程中容易出现不同小球间生物活性差异大、不均衡、不稳定，从而严重影响后续检测过程的准确性。
因此急需找到一种重组人TNF-α蛋白冻干小球的制备方法，以克服重组人TNF-α蛋白极易降解、不稳定，导致含量下降的问题，同时消除粉末制剂黏连管壁、复溶不完全、多抗原混合不均匀的缺陷，进一步提高重组人TNF-α蛋白冻干小球中的重组人TNF-α 蛋白含量检测的准确性、灵敏度和特异性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组人TNF-α蛋白冻干小球及其制备方法和应用，本发明的重组人TNF-α冻干小球，由重组人TNF-α蛋白溶液、冻干保护溶液和聚甘氨酸-精氨酸混合冻干成球状，通过在重组人TNF-α蛋白溶液与冻干保护溶液直接混合的过程中，加入聚甘氨酸-精氨酸，在解决重组人TNF-α蛋白因等电点高而极易吸附问题的同时，还将两步混合优化为一步混合，大大提高了实验效率，同时还明显提高了制得的TNF-α蛋白冻干小球的性能；通过在冻干保护溶液中添加封闭剂（牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清），有效阻断后续使用时冻干小球中的某些成分与试剂盒抗体之间的非特异性反应，以及避免了冻干保护溶液中其他多种不同成分的加入，对重组人TNF-α蛋白冻干小球检测结果的影响，提高检测的准确性、特异性与灵敏度；通过添加抗氧化剂乙二胺四乙酸二钠盐二水、卵磷脂和表面活性剂羟丙基-β-环糊精，有效解决重组人TNF-α蛋白冻干过程中容易降解且分布不均匀的问题；同时还改进了冻干保护溶液中的糖类、多元醇、缓冲液、氨基酸等的配方，并提高重组人TNF-α蛋白的稳定性，从而制得冻干得率高、稳定性好，不同冻干小球间保持高度均一性，保存期可达8年以上的重组人TNF-α蛋白冻干小球，可用于人体血液中分泌的TNF-α蛋白检测的标准品。
本发明的重组人TNF-α蛋白冻干小球作为标准品使用，因此需严格保证其含量的准确性、稳定性与操作过程的准确性。在保证重组人TNF-α蛋白冻干小球中重组人TNF-α蛋白的稳定性的基础上，更为重要的是，能够实现对重组人TNF-α蛋白冻干小球中重组人TNF-α蛋白的含量进行精确检测。
因为随着冻干小球中多种不同成分的加入，将有可能导致最终产生交叉影响、背景或噪声增大的问题，影响检测结果。因此，在本发明中，需检测加入不同成分后的空白限，严格控制其在限度以下，从而提高本发明重组人TNF-α蛋白冻干小球作为标准品使用时，检测冻干小球中重组人TNF-α蛋白含量的准确性与稳定性。
一方面，本发明提供了一种重组人TNF-α蛋白冻干小球，所述重组人TNF-α蛋白冻干小球由重组人TNF-α蛋白溶液、冻干保护溶液和聚甘氨酸-精氨酸混合冻干成球状；所述重组人TNF-α蛋白溶液的pH值为8.2±0.2；所述冻干保护溶液包括封闭剂，所述封闭剂由牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清组成；所述冻干保护溶液还包括抗氧化剂、表面活性剂、糖类、多元醇、缓冲液和氨基酸；所述冻干保护溶液的pH值为7.8-8.8；所述抗氧化剂为乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的组合；所述表面活性剂为羟丙基-β-环糊精。
本发明最初采用与重组人IFN-γ蛋白冻干小球同样的制备方法，来制备重组人TNF-α蛋白冻干小球，但在制备过程中，发现重组人TNF-α蛋白极易降解，同时该蛋白等电点较高，极易吸附于等电点较低的材料上而导致检测异常，因此在使用重组人IFN-γ蛋白冻干小球的制备方法，制备本发明重组人TNF-α蛋白冻干小球时，在冻干过程中仍会出现小球间差异很大的问题，同时各个重组人TNF-α蛋白冻干小球之间极易发生粘连，稳定性差，且检测时空白限也明显增大。因此本发明针对上述存在的问题，最初是从重组人TNF-α蛋白溶液的配制中着手，对溶液的pH值进行调整，结果发现，当pH值在8~9的范围内时，重组人TNF-α蛋白的易吸附的性质得到明显改善，同时冻干得率也发生明显提高，且在进一步实验确定pH最佳范围时发现，当重组人TNF-α蛋白溶液的pH值为8.2±0.2时，此时冻干得率均可达到90%以上，而当重组人TNF-α蛋白溶液的pH值为8.2时，此时最终冻干得率可达到95.12%，因此首先确定了重组人TNF-α蛋白溶液的最佳pH值范围为8.2±0.2，且最佳pH值为8.2。
同时又考虑在重组人TNF-α蛋白溶液的配制过程中，进一步加入改善重组人TNF-α蛋白极易吸附问题的L-抗坏血酸。实验结果表明，当加入L-抗坏血酸时，可解决重组人TNF-α蛋白由于等电点高而极易吸附于等电点较低的材料上的问题。但在后续实验中发现，一方面先调节重组人TNF-α蛋白溶液的pH，再加入L-抗坏血酸配制重组人TNF-α蛋白溶液的混合溶液，最后再与冻干保护溶液混合，加大了操作的复杂性和繁琐性，易使结果出现误差；另一方面，发现加入的L-抗坏血酸会和冻干保护溶液中的某些成分发生反应，从而影响最终冻干小球的制备。因此，发明人进一步进行了优化实验，在大量筛选后，最终发现，当将L-抗坏血酸替换为聚甘氨酸-精氨酸后，在解决重组人TNF-α蛋白由于等电点高而极易吸附于等电点较低的材料上的问题的基础上，一方面所述重组人TNF-α蛋白溶液可直接与冻干保护溶液混合，在混合过程中同时加入聚甘氨酸-精氨酸，而无需先配制重组人TNF-α蛋白溶液与聚甘氨酸-精氨酸的混合溶液，再与冻干保护溶液混合，明显减少了实验的繁琐性；同时，在直接混合的过程中，聚甘氨酸-精氨酸不会与冻干保护溶液中的某些成分发生反应，反而还会明显提升冻干小球的冻干得率和稳定性。
在一些实施方式中，重组人TNF-α蛋白被制备成冻干小球后，需要通过检测重组人TNF-α蛋白冻干小球中的重组人TNF-α蛋白，从而评估冻干小球的稳定性和生物活性，但是实验结果发现，冻干保护溶液对重组人TNF-α蛋白的检测存在明显的干扰作用，导致检测结果存在假阳性，难以准确检测其中的重组人TNF-α蛋白含量。
本发明经研究证明，封闭剂的添加与否、封闭剂的加入顺序以及封闭剂的配方，均对重组人TNF-α蛋白冻干小球中TNF-α蛋白的含量存在极大影响。额外添加由牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清制备的封闭剂：在冻干保护溶液的配制过程中，直接加入所述封闭剂，混合均匀后，再与重组人TNF-α蛋白溶液的混合溶液制成重组人TNF-α蛋白冻干原溶液，所述最终制得的重组人TNF-α蛋白冻干小球，既能保证重组人TNF-α蛋白的稳定性，又能防止检测结果出现假阳性。
由牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清组成的封闭剂，具有封闭作用，一方面能有效阻断后续使用时冻干小球中的某些成分与试剂盒抗体之间的非特异性反应，具有减小实验误差、避免产生假阳性的作用，可显著提高检测的准确性、特异性与灵敏度；另一方面也有效阻断了冻干保护溶液中其他多种不同成分的加入，对重组人TNF-α蛋白冻干小球检测结果的影响；而且该封闭剂不会影响重组人TNF-α蛋白冻干小球的稳定性，使其可长期储存，且复溶后也能在一定期限内保持较好的稳定性。
进一步地，所述抗氧化剂中，乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的质量比为（1-8）：（2-9）。
优选地，所述抗氧化剂中，乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的质量比为3:7。
进一步地，所述糖类为壳聚糖和海藻糖的组合，所述壳聚糖和海藻糖的质量比为40：（40-100）。
优选地，所述糖类中，壳聚糖和海藻糖的质量比为40：70。
进一步地，所述多元醇包括山梨醇或丙三醇。
进一步地，所述缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液、磷酸盐缓冲液中的任意一种或多种。
进一步地，所述氨基酸包括L-精氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、肌氨酸、D-丝氨酸、DL-丝氨酸、L-高丝氨酸、D-丙氨酸、β-丙氨酸、肌氨酸-水化合物中的任意一种或多种。
进一步地，所述多元醇为山梨醇，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述氨基酸为L-丝氨酸。
理论上，每颗重组人TNF-α蛋白冻干小球中抗原蛋白含量应该是一致的，因此在使用过程中，只需每次取出一颗或数颗进行使用，无需额外检测每颗重组人TNF-α蛋白冻干小球中的抗原蛋白含量，即可实现对抗体的精确检测，检测过程非常方便。
但由于重组人TNF-α蛋白极不稳定，在制备成冻干小球过程中非常容易降解，从而导致在冻干过程容易出现小球间差异很大的问题，严重影响重组人TNF-α蛋白的后续应用。
本发明通过在重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干保护溶液中，添加抗氧化剂乙二胺四乙酸二钠盐二水、卵磷脂和表面活性剂羟丙基-β-环糊精，能够较好地解决重组人TNF-α蛋白冻干过程中容易降解且分布不均匀的问题。其中，乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂使重组人TNF-α蛋白在冻干过程中保持稳定，不容易发生降解；羟丙基-β-环糊精能够促使重组人TNF-α蛋白分子分散，从而在冻干小球中均匀分布。因此，本发明制备的重组人TNF-α蛋白冻干小球中重组人TNF-α蛋白的冻干得率更高，稳定性更好，且小球间保持很好的均一性。
另外，重组人TNF-α蛋白制备的冻干小球在放置一段时间后还会存在粘连的情况，本发明通过在重组人TNF-α蛋白冻干小球中添加抗氧化剂乙二胺四乙酸二钠盐二水、卵磷脂和表面活性剂羟丙基-β-环糊精还具有防止小球之间粘连的效果。
同时，重组人TNF-α蛋白的低温耐受能力也相对较弱，本发明通过在冻干保护溶液中添加壳聚糖和海藻糖，并适当提高海藻糖的含量，从而提高重组人TNF-α蛋白的抗冻能力。
所述冻干保护溶液中的山梨醇主要起到填充剂的作用，也有助于提高重组人TNF-α蛋白的稳定性，可长期储存，且复溶后也能在一定期限内保持较好的稳定性。
所述冻干保护溶液中的磷酸盐缓冲液能帮助维持酸碱平衡，使重组人TNF-α蛋白在更合适的pH条件下冻干，有助于提高重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率和稳定性。
所述冻干保护溶液中的氨基酸具有酸、碱两性，因此能够在生物制品的低温保存和冷冻干燥过程中能抑制溶液的pH变化，从而达到保护活性组分的目的。同时，氨基酸的构型也会影响重组人TNF-α蛋白制备冻干小球的稳定性及均一性，结果表明，L型氨基酸结果要好于D型氨基酸以及其它的一些构型，其中L型丝氨酸效果最佳。这可能是因为相比于D型氨基酸，L型氨基酸能够更显著地调节蛋白质的稳定性与活力，当与冻干保护溶液中的成分相结合时，显著提高重组人TNF-α蛋白在溶液中的稳定性和活力，从而使得最终制得的重组人TNF-α蛋白冻干小球的稳定性发生极明显的提升。
进一步地，所述冻干保护溶液包括壳聚糖40g/L，海藻糖70g/L，山梨醇40g/L，卵磷脂7g/L，乙二胺四乙酸二钠盐二水3g/L，羟丙基-β-环糊精40g/L，L-丝氨酸20g/L，磷酸盐缓冲液0.01mol/L，pH值为8.0-8.4。
进一步地，所述封闭剂包括牛血清白蛋白30g/L、酪蛋白钠盐30g/L、人血清10ml/L。
另一方面，本发明提供一种如上技术方案中任一项所述的重组人TNF-α蛋白冻干小球的制备方法，包括以下步骤：
（1）配制冻干保护溶液：取乙二胺四乙酸二钠盐二水、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精、壳聚糖、海藻糖、山梨醇、磷酸盐缓冲液、L-丝氨酸、牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清，配制成pH值为8.0-8.4的冻干保护溶液；
（2）取冻干保护溶液、重组人TNF-α蛋白溶液和聚甘氨酸-精氨酸混合，制备得到重组人TNF-α蛋白冻干原溶液；
（3）通过滴珠设备将重组人TNF-α蛋白冻干原溶液滴至液氮中，使液滴状的重组人TNF-α蛋白冻干原溶液在液氮中冻结形成球体状结构的重组人TNF-α蛋白冻珠；
（4）通过冷冻干燥工艺将重组人TNF-α蛋白冻珠制备成重组人TNF-α蛋白冻干小球。
进一步地，所述步骤（2）中，冻干保护溶液和重组人TNF-α蛋白溶液的体积比为1：1，所述聚甘氨酸-精氨酸的加入量为总体积的2%。
再一方面，本发明提供一种重组人TNF-α蛋白冻干小球在制备降低重组人TNF-α蛋白冻干小球中的重组人TNF-α蛋白含量检测的空白限的制剂中的应用，所述重组人TNF-α蛋白冻干小球由重组人TNF-α蛋白溶液、冻干保护溶液和聚甘氨酸-精氨酸混合冻干成球状；所述重组人TNF-α蛋白溶液的pH值为8.2±0.2；所述冻干保护溶液包括封闭剂，所述封闭剂由牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清组成；所述冻干保护溶液还包括抗氧化剂、表面活性剂、糖类、多元醇、缓冲液和氨基酸；所述冻干保护溶液的pH值为7.8-8.8；所述抗氧化剂为乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的组合；所述表面活性剂为羟丙基-β-环糊精。
再一方面，本发明提供一种重组人TNF-α蛋白冻干小球在制备提高重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率和复溶稳定性的制剂中的应用，所述重组人TNF-α蛋白冻干小球由重组人TNF-α蛋白溶液、冻干保护溶液和聚甘氨酸-精氨酸混合冻干成球状；所述重组人TNF-α蛋白溶液的pH值为8.2±0.2；所述冻干保护溶液包括封闭剂，所述封闭剂由牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清组成；所述冻干保护溶液还包括抗氧化剂、表面活性剂、糖类、多元醇、缓冲液和氨基酸；所述冻干保护溶液的pH值为7.8-8.8；所述抗氧化剂为乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的组合；所述表面活性剂为羟丙基-β-环糊精。
再一方面，本发明提供一种冻干保护溶液在制备提高重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率和复溶稳定性的制剂中的应用，所述重组人TNF-α蛋白冻干小球由重组人TNF-α蛋白溶液、冻干保护溶液和聚甘氨酸-精氨酸混合冻干成球状；所述重组人TNF-α蛋白溶液的pH值为8.2±0.2；所述冻干保护溶液包括封闭剂，所述封闭剂由牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清组成；所述冻干保护溶液还包括抗氧化剂、表面活性剂、糖类、多元醇、缓冲液和氨基酸；所述冻干保护溶液的pH值为7.8-8.8；所述抗氧化剂为乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的组合；所述表面活性剂为羟丙基-β-环糊精。
再一方面，本发明提供一种封闭剂在制备降低重组人TNF-α蛋白冻干小球中的重组人TNF-α蛋白含量检测的空白限的制剂中的应用，所述重组人TNF-α蛋白冻干小球由重组人TNF-α蛋白溶液、冻干保护溶液和聚甘氨酸-精氨酸混合冻干成球状；所述重组人TNF-α蛋白溶液的pH值为8.2±0.2；所述冻干保护溶液包括封闭剂，所述封闭剂由牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清组成；所述冻干保护溶液还包括抗氧化剂、表面活性剂、糖类、多元醇、缓冲液和氨基酸；所述冻干保护溶液的pH值为7.8-8.8；所述抗氧化剂为乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的组合；所述表面活性剂为羟丙基-β-环糊精。
再一方面，本发明提供一种重组人TNF-α蛋白冻干小球在制备提高重组人TNF-α蛋白检测灵敏度的制剂中的应用，所述重组人TNF-α蛋白冻干小球由重组人TNF-α蛋白溶液、冻干保护溶液和聚甘氨酸-精氨酸混合冻干成球状；所述重组人TNF-α蛋白溶液的pH值为8.2±0.2；所述冻干保护溶液包括封闭剂，所述封闭剂由牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清组成；所述冻干保护溶液还包括抗氧化剂、表面活性剂、糖类、多元醇、缓冲液和氨基酸；所述冻干保护溶液的pH值为7.8-8.8；所述抗氧化剂为乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的组合；所述表面活性剂为羟丙基-β-环糊精。
再一方面，本发明提供一种冻干保护溶液在制备防止重组人TNF-α蛋白冻干小球粘连的制剂中的应用，所述重组人TNF-α蛋白冻干小球由重组人TNF-α蛋白溶液、冻干保护溶液和聚甘氨酸-精氨酸混合冻干成球状；所述重组人TNF-α蛋白溶液的pH值为8.2±0.2；所述冻干保护溶液包括封闭剂，所述封闭剂由牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清组成；所述冻干保护溶液还包括抗氧化剂、表面活性剂、糖类、多元醇、缓冲液和氨基酸；所述冻干保护溶液的pH值为7.8-8.8；所述抗氧化剂为乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的组合；所述表面活性剂为羟丙基-β-环糊精。
再一方面，本发明提供一种冻干保护溶液在制备降低重组人TNF-α蛋白冻干小球中的重组人TNF-α蛋白含量检测的空白限的制剂中的应用，所述重组人TNF-α蛋白冻干小球由重组人TNF-α蛋白溶液、冻干保护溶液和聚甘氨酸-精氨酸混合冻干成球状；所述重组人TNF-α蛋白溶液的pH值为8.2±0.2；所述冻干保护溶液包括封闭剂，所述封闭剂由牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清组成；所述冻干保护溶液还包括抗氧化剂、表面活性剂、糖类、多元醇、缓冲液和氨基酸；所述冻干保护溶液的pH值为7.8-8.8；所述抗氧化剂为乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的组合；所述表面活性剂为羟丙基-β-环糊精。
本发明取得的有益效果：
1、通过在重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干保护溶液中，直接加入封闭剂，一方面能有效阻断后续使用时冻干小球中的某些成分与试剂盒抗体之间的非特异性反应，具有减小实验误差、避免产生假阳性的作用，可显著提高检测的准确性、特异性与灵敏度；另一方面也有效阻断了冻干保护溶液中其他多种不同成分的加入，对重组人TNF-α蛋白冻干小球检测结果的影响；而且该封闭剂不会影响重组人TNF-α蛋白冻干小球的稳定性，使其可长期储存，且复溶后也能在一定期限内保持较好的稳定性；
2、通过在重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干保护溶液中，添加抗氧化剂乙二胺四乙酸二钠盐二水、卵磷脂和表面活性剂羟丙基-β-环糊精，能够较好地解决重组人TNF-α蛋白冻干过程中容易降解且分布不均匀的问题。其中，乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂使重组人TNF-α蛋白在冻干过程中保持稳定，不容易发生降解；羟丙基-β-环糊精能够促使重组人TNF-α蛋白分子分散，从而在冻干小球中均匀分布，从而使本发明制备的重组人TNF-α蛋白冻干小球中重组人TNF-α蛋白的冻干得率更高，稳定性更好，且小球间保持很好的均一性；
3、通过在重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干保护溶液中添加壳聚糖和海藻糖，并适当提高海藻糖的含量，从而进一步提高重组人TNF-α蛋白的抗冻能力；
4、通过改进了冻干保护溶液中的多元醇、缓冲液、氨基酸的配方，起到更好的帮助维持重组人TNF-α蛋白稳定的作用，提高重组人TNF-α蛋白冻干小球的均一性；
5、通过在重组人TNF-α蛋白溶液与冻干保护溶液直接混合的过程中，加入聚甘氨酸-精氨酸时，可明显改善重组人TNF-α蛋白的极易吸附的性质，从而解决重组人TNF-α蛋白极易吸附于等电点较低的材料上而导致最终制得的冻干小球检测异常的问题，还将两步混合优化为一步混合，大大提高了实验效率，同时显著提高最终制备得到的冻干小球的冻干得率和稳定性；
6、本发明制得的重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率更高、复溶后稳定性时间更长，不同冻干小球之间保持高度均一性，保存期可达8年以上，且复溶后24h内保持稳定；同时当用于人体血液中分泌的TNF-α蛋白检测时，空白限可达到0.65pg/ml以下，加大了实验的准确性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的的通常意义。本实施例中使用的试剂，除特别声明外，均为已知产品，通过购买市售产品获得。
本发明中所述封闭剂不仅包含了普通封闭剂的作用，可以避免重组人TNF-α蛋白冻干小球中的某些成分与试剂盒中的抗体发生非特异性反应，造成检测结果出现假阳性。还可有效避免冻干保护溶液中其他多种不同成分的加入，对重组人TNF-α蛋白冻干小球检测结果的影响；同时，还可以消除检测过程中的基质效应，显著降低检测的空白限。
实施例1 本发明提供的重组人TNF-α蛋白冻干小球
一、本实施例提供的重组人TNF-α蛋白冻干小球的制备方法，包括以下步骤：
1、配制冻干保护溶液：
取壳聚糖40g、海藻糖70g、山梨醇40g、卵磷脂7g、乙二胺四乙酸二钠盐二水3g、羟丙基-β-环糊精40g、L-丝氨酸20g、封闭剂（包括牛血清白蛋白30g、酪蛋白钠盐30g、人血清10ml），向其中加入磷酸盐缓冲液（浓度为0.01mol/L）配制成1L的冻干保护溶液，并采用0.01mol/L的盐酸溶液或0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节冻干保护溶液的pH值为8.0-8.4（本实施例优选为8.2）；所述壳聚糖购自中国医药集团有限公司，货号为69047438；所述海藻糖购自上海麦克林生化科技股份有限公司，货号为D818474-500g；所述山梨醇购自中国医药集团有限公司，货号为63011034；所述卵磷脂购自中国医药集团有限公司，货号为XW80024352；所述乙二胺四乙酸二钠盐二水购自中国医药集团有限公司，货号为10009717；所述羟丙基-β-环糊精购自中国医药集团有限公司，货号为C297565000；所述L-丝氨酸购自上海麦克林生化科技股份有限公司，货号为L796594-25g；所述牛血清白蛋白购自sigma，货号为V900933-1KG；所述酪蛋白钠盐购自sigma，货号为c8654-500G；所述人血清购自深圳市柏雷丁生物有限公司，货号为BAS100；所述磷酸盐缓冲液为自配，其配方为8g氯化钠、0.2g氯化钾、0.6g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾加入纯化水定容至1L；所述氯化钠购自中国医药集团有限公司，货号为10019318；所述氯化钾购自中国医药集团有限公司，货号为10016318；所述磷酸氢二钠购自中国医药集团有限公司，货号为20040618；所述磷酸二氢钾购自中国医药集团有限公司，货号为10017608；
2、配制重组人TNF-α蛋白冻干原溶液：
采用采购的重组人TNF-α蛋白（重组人TNF-α蛋白名称：Recombinant Human TNF-α(carrier-free)；厂家：biolegend；货号：570106；浓度：1mg/ml），用蛋白稀释液（0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH值调节至8.2±0.2，含3%牛血清白蛋白）稀释500倍，配制成浓度为2μg/ml的重组人TNF-α蛋白溶液；
取冻干保护溶液与重组人TNF-α蛋白溶液按照体积比1:1混合，同时加入2%聚甘氨酸-精氨酸，制得重组人TNF-α蛋白冻干原溶液。
3、通过滴珠设备将重组人TNF-α蛋白冻干原溶液滴至液氮中，使液滴状的重组人TNF-α蛋白冻干原溶液在液氮中冻结形成球体状结构的重组人TNF-α蛋白冻珠；滴珠设备的参数设置为：液滴体积为13μL（即每滴液滴的体积为13μL）。
4、通过冷冻干燥工艺将重组人TNF-α蛋白冻珠制备成重组人TNF-α蛋白冻干小球，具体步骤为：
（1）开启冷冻干燥机，并对冷冻干燥机预冷至预冷温度（小于-20℃，本实施例优选为-35℃）后将重组人TNF-α蛋白冻珠置于冷冻干燥机中；
（2）设置冷冻干燥机中的搁板的温度以进行第一阶段干燥，具体步骤为：
①将搁板的温度设置为-45℃，并保持该温度4h；
②将搁板的温度设置为-35℃，并对冷冻干燥机抽真空（真空度小于20 pa，本实施例优选为10 pa）后保持该温度8-12h。其有益效果在于：避免破坏抗原蛋白的性能，有利于保障抗原蛋白的稳定性。
（3）调节搁板的温度以进行第二阶段干燥，具体步骤为：
①将搁板的温度设置为-30℃，并保持该温度8-12h；
②将搁板的温度设置为-25℃，并保持该温度8-12h；
③将搁板的温度设置为-20℃，并保持该温度1-2h；
④将搁板的温度设置为-10℃，并保持该温度1-2h；
⑤将搁板的温度设置为0℃，并保持该温度1-8h；
（4）调节搁板的温度以进行第三阶段干燥，具体步骤为：
①将搁板的温度设置为10℃，并保持该温度1-2h；
②将搁板的温度设置为25℃，并保持该温度2-8h。
制备得到的重组人TNF-α蛋白冻干小球均表面洁白，光滑平整，大小一致，且各个重组人TNF-α蛋白冻干小球之间不发生粘连。检测重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率、复溶稳定性以及热加速稳定性，以及用于检测时的灵敏度测试。
冻干得率测试方法：将重组人TNF-α蛋白冻干小球取3个加入稀释液溶解并测试，即重组人TNF-α蛋白冻干小球测试值（ng/球），同时，测试抗原蛋白冻干前的含量，计算重组人TNF-α蛋白冻干后相对冻干前的比值，即为冻干得率，因在长时间的存储中不可避免会存在一定的蛋白损失，因此满足冻干得率大于90%即可认为符合要求。其中重组人TNF-α蛋白活性的测试方法为：采用江西赛基生物技术有限公司生产的细胞因子联合检测试剂盒（十二联检）对其含量进行测试，同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV（变异系数），来考察重组人TNF-α蛋白冻干小球之间的差异性，变异系数值越小，说明冻干小球之间差异性越小，均一性越高。
复溶稳定性试验方法：将重组人TNF-α蛋白冻干小球取3个加入稀释液溶解，分别在溶解后的0h、1h、2h、4h、6h、12h、24h检测并记录检测结果，即冻干小球测试值（ng/球）。计算各个时间点相对于0h的相对偏差，24h相对偏差满足小于等于±15%即满足要求。同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV，来考察重组人TNF-α蛋白冻干小球之间的差异性。
热加速稳定性试验方法：将重组人TNF-α蛋白冻干小球取3个进行检测，并记录检测结果，即重组人TNF-α蛋白冻干小球测试值（ng/球）。然后将重组人TNF-α蛋白冻干小球取15个放入37℃恒温箱中。然后在第3天、第10天、第17天、第24天、第31天分别从37℃恒温箱中取3个进行检测，并记录检测结果。计算各个时间点相对于0天的相对偏差，31天相对偏差满足小于等于±15%即满足要求。同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV，来考察重组人TNF-α蛋白冻干小球之间的差异性。
空白限的测试方法：采用江西赛基生物技术有限公司生产的细胞因子联合检测试剂盒（免疫荧光法，型号：十二联检）将重组人TNF-α蛋白取3份作为标准品，绘制3条标准曲线，同时重复测试20例空白样本（冻干保护溶液）并记录检测结果，计算20次反应测得的均值（X）和标准差（SD），以X+2SD计算出相应的浓度，即为检测的空白限。
本发明的重组人TNF-α蛋白冻干小球作为标准品使用，因此需保证其含量的准确性、稳定性与操作过程的准确性，防止其他不同成分的加入导致最终产生交叉影响、背景或噪声增大的问题，因此，在下述实施例中，对空白限的检测也作为本发明的一个检测指标，在抗氧化剂和表面活性剂的组合、抗氧化剂、表面活性剂、糖类、多元醇、缓冲液、氨基酸和封闭剂的筛选中，均对空白限进行检测，从而提高最终检测结果的准确性。
经检测，本实施例制备的重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率、复溶稳定性、热加速稳定性以及空白限检测结果分别如表1~表4所示。
表1、冻干得率检测结果
表2、复溶稳定性
表3、热加速稳定性
表4、检测空白限
根据表1~表4，本实施例制备的重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率为98.18%，复溶稳定性在24h相对于0h的相对偏差为-7.54%，热加速稳定性在第31天相对于0天的相对偏差为-6.45%，且不同重组人TNF-α蛋白冻干小球之间的差异非常小，均一性非常高，无粘连情况发生。用于检测时的空白限可达到0.65pg/ml以下，空白限发生明显降低，检测的灵敏度较高。经长期跟踪研究发现，本实施例制备的重组人TNF-α蛋白冻干小球的保存期可长达8年，保存条件为干燥环境，2-8℃，8年后重组人TNF-α蛋白冻干小球中的重组人TNF-α蛋白活性为9.51ng，相对偏差为-12.2%（本实施例中，还在40℃高温加速条件环境中放置2年，实验结果表明，仍可达到优益效果，结果不产生显著差异，此条件相当于保存条件为2-8℃，干燥环境下的8年）。
实施例2 添加L-抗坏血酸、茶多酚、聚脯氨酸-精氨酸、聚甘氨酸-精氨酸对重组人TNF-α蛋白易吸附性质或冻干小球性能的影响
由于重组人TNF-α蛋白极易降解，同时该蛋白等电点较高，在7.5左右，这导致该蛋白在pH值为中性或弱酸性的环境中极易吸附于等电点较低的材料上，如玻璃材质，其等电点在3左右，这样会导致检测异常。因此，本发明中，最初是从重组人TNF-α蛋白溶液的配制中着手，对溶液的pH值进行调整，结果发现，当pH值在8~9的范围内时，重组人TNF-α蛋白的易吸附的性质得到明显改善，同时冻干得率也发生明显提高，且在进一步实验确定pH最佳范围时发现，当重组人TNF-α蛋白溶液的pH值为8.2±0.2时，此时冻干得率均可达到90%以上，而当重组人TNF-α蛋白溶液的pH值为8.2时，此时最终冻干得率可达到95.12%，因此本实施例中首先确定了重组人TNF-α蛋白溶液的最佳pH值范围为8.2±0.2，且最佳pH值为8.2（其余未提及的条件均为实施例1中最佳制备条件）。
同时又考虑在重组人TNF-α蛋白溶液的配制过程中，进一步加入改善重组人TNF-α蛋白极易吸附问题的L-抗坏血酸。实验结果表明，当加入L-抗坏血酸时，可解决重组人TNF-α蛋白由于等电点高而极易吸附于等电点较低的材料上的问题。但在后续实验中发现，一方面先调节重组人TNF-α蛋白溶液的pH，再加入L-抗坏血酸配制重组人TNF-α蛋白溶液的混合溶液，静置5min后，然后再与冻干保护溶液混合，加大了操作的复杂性和繁琐性，易使结果出现误差；另一方面，发现加入的L-抗坏血酸会和冻干保护溶液中的某些成分发生反应，从而影响最终冻干小球的制备。
因此，发明人进一步进行了优化实验，在大量筛选后，最终发现，当将L-抗坏血酸替换为聚甘氨酸-精氨酸后，在解决重组人TNF-α蛋白由于等电点高而极易吸附于等电点较低的材料上的问题的基础上，一方面所述重组人TNF-α蛋白溶液可“直接与冻干保护溶液混合，在混合过程中同时加入聚甘氨酸-精氨酸”，而无需“先配制重组人TNF-α蛋白溶液与聚甘氨酸-精氨酸的混合溶液，静置一段时间后，再与冻干保护溶液混合”，明显减少了实验的繁琐性；同时，在直接混合的过程中，聚甘氨酸-精氨酸不会与冻干保护溶液中的某些成分发生反应，反而还会明显提升冻干小球的冻干得率和稳定性。具体结果如表5所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致；同时，本实施例中，除配制过程中加入的物质不同，其余条件均为实施例1中最佳条件）。
表5、在不同配制过程中加入的不同物质对重组人TNF-α蛋白易吸附性质和制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
注：1）满足冻干得率在90%~105%的范围认为符合要求；2）每次检测结果之间存在一定偏差为正常结果，并非每次测定结果都为相同，只要不存在显著差异（当存在显著差异时，p＜0.05），即可认为是在合理范围内的偏差。
根据表5可以看出，在重组人TNF-α蛋白溶液与冻干保护溶液直接混合的过程中（重组人TNF-α蛋白冻干原溶液的配制过程中），加入L-抗坏血酸或茶多酚或聚脯氨酸-精氨酸虽可基本解决重组人TNF-α蛋白极易吸附的问题，但对最终冻干小球的制备结果均存在明显影响，使最终制得的冻干小球冻干得率和稳定性均明显下降。这可能是由于加入的解决重组人TNF-α蛋白极易吸附的问题的物质均会和冻干保护溶液中的某些成分产生反应，从而导致影响最终制得的冻干小球的性能。而当在重组人TNF-α蛋白溶液与冻干保护溶液直接混合的过程中，优选加入聚甘氨酸-精氨酸时，此时一方面重组人TNF-α蛋白可完全溶解，不产生吸附问题；另一方面，最终制得的冻干小球的性能均良好，冻干得率可达到97.36%；同时从两步混合缩减为一步混合，且无需静置，大大减少了步骤的繁琐性，提高了实验效率。
因此，当优选在重组人TNF-α蛋白溶液与冻干保护溶液直接混合的过程中，加入聚甘氨酸-精氨酸时，与冻干保护溶液相互配合，在解决重组人TNF-α蛋白因等电点高而极易吸附问题的同时，还将两步混合优化为一步混合，大大提高了实验效率，同时还明显提高了制得的TNF-α蛋白冻干小球的性能。
实施例3 添加不同封闭剂对重组人TNF-α蛋白冻干小球用于降低检测时空白限的影响
由于本发明重组人TNF-α蛋白极易降解，使得在使用重组人IFN-γ蛋白冻干小球的制备方法，制备本发明重组人TNF-α蛋白冻干小球时，在冻干过程中仍会出现小球间差异很大的问题，同时各个重组人TNF-α蛋白冻干小球之间极易发生粘连，稳定性差，且检测时空白限也明显增大，因此针对目前存在的问题，本实施例中，进一步从冻干保护溶液着手，分别改进封闭剂、抗氧化剂、表面活性剂、糖类、多元醇、缓冲液和氨基酸的配方，并优化制备方法，希望能得到进一步改善。
一、是否添加封闭剂与封闭剂的加入顺序对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
本实施例中从冻干保护溶液中的封闭剂着手，按照实施例1提供的方法制备重组人TNF-α蛋白冻干小球，其中在配制冻干保护溶液时，分别考察了封闭剂的添加与否与封闭剂的加入顺序对制备的重组人TNF-α蛋白冻干小球用于降低检测时空白限的影响（详见表6），从而制备得到不同的重组人TNF-α蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）以及热加速稳定性（37℃高温加速31天），并测试其在检测时的空白限，空白限的测试方法为：采用江西赛基生物技术有限公司生产的细胞因子联合检测试剂盒（十二联检），将重组人TNF-α蛋白取3份作为标准品，绘制3条标准曲线，同时重复测试20例空白样本（冻干保护溶液）并记录检测结果，计算20次反应测得的均值（X）和标准差（SD），以X+2SD计算出相应的浓度，即为检测的空白限。
表6、封闭剂对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
注：1）所述TNF-α蛋白冻干后含量指刚刚制备完成的蛋白冻干小球，未经过长时间冷冻储藏，因此不会发生明显的蛋白含量损失；2）满足冻干得率在90%~110%的范围认为符合要求；3）此处封闭剂为实施例1中封闭剂的最佳配方：牛血清白蛋白+酪蛋白钠盐+人血清，组分浓度分别为30g/L、30g/L、10mL/L。
根据表6中可以看出，是否添加封闭剂以及封闭剂的添加顺序均对重组人TNF-α蛋白冻干小球中TNF-α蛋白的含量存在极大影响：（1）当不添加冻干保护溶液时，TNF-α蛋白冻干后对其进行检测，发现其中TNF-α蛋白的含量发生了明显的下降，冻干得率仅为51.24%；这可能是因为当不添加冻干保护溶液时，在制备过程中即会有部分蛋白发生损失，从而导致蛋白含量发生明显的下降；（2）当添加不含封闭剂的冻干保护溶液时，在TNF-α蛋白冻干前后分别对其进行检测，发现在冻干前TNF-α蛋白的含量已经发生了明显的上升，而冻干后TNF-α蛋白的含量在其基础上继续发生明显的上升，最终冻干得率达到123.78%；这可能是因为蛋白冻干小球中的某些成分和试剂盒中的抗体发生了非特异性结合，使检测得到的TNF-α蛋白含量偏高，最终检测到假阳性结果；（3）当先加入封闭剂，再加入不含封闭剂的冻干保护溶液时，发现冻干后TNF-α蛋白的含量也发生了明显的下降，冻干得率仅为72.95%；这可能是因为先加入封闭剂对TNF-α蛋白进行封闭，使得冻干保护溶液中的成分无法最大化发挥其作用，从而导致在制备过程中仍有一部分蛋白发生损失，导致最终蛋白含量发生下降；（4）当先加入不含封闭剂的冻干保护溶液，再加入封闭剂时，仍发现在冻干前TNF-α蛋白的含量已经发生了上升，最终使得冻干得率达到118.96%；这可能是因为一方面蛋白冻干小球中的某些成分和冻干保护溶液中的某些成分也会发生非特异性结合，使检测得到的TNF-α蛋白含量偏高，最终检测到假阳性结果；另一方面随着冻干小球中多种不同成分的加入，将有可能导致最终产生交叉影响、背景或噪声增大的问题，从而影响检测结果；（5）而只有当直接添加含封闭剂的冻干保护溶液时，最终蛋白冻干小球的冻干得率才符合要求。
由此可知，对于不同的蛋白冻干小球，封闭剂的加入与否以及封闭剂的加入顺序均对其存在显著影响。本发明中，对于重组人TNF-α蛋白冻干小球，只有当先配制含封闭剂的冻干保护溶液，再将冻干保护溶液加入重组人TNF-α蛋白溶液中时，才可使TNF-α蛋白基本不发生损失，同时蛋白冻干小球中的某些成分也不会与其他成分发生非特异性结合。从而使最终检测得到的TNF-α蛋白含量与冻干前相近，极大地提高了检测的准确性与特异性。
二、添加不同封闭剂对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
同时，本实施例中，也对选择不同封闭剂对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响进行了对比筛选，具体结果如表7所示（除冻干保护溶液中的封闭剂的配方不同，其余条件均为实施例1中最佳条件）：
表7、封闭剂的选择对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
注：1）所述TNF-α蛋白冻干后含量指刚刚制备完成的蛋白冻干小球，未经过长时间冷冻储藏，因此不会发生明显的蛋白含量损失；2）满足冻干得率在90%~105%的范围认为符合要求；3）上述封闭剂浓度脱脂奶粉、牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐以及明胶均为30g/L，各血清浓度均为10ml/L；4）每次检测结果之间存在一定偏差为正常结果，并非每次测定结果都为相同，只要不存在显著差异（当存在显著差异时，p＜0.05），即可认为是在合理范围内的偏差。
根据表7可以看出，添加不同的封闭剂对重组人TNF-α蛋白冻干小球存在极大影响，当优选加入封闭剂为牛血清白蛋白+酪蛋白钠盐+人血清时（其中牛血清白蛋白以及酪蛋白钠盐浓度均为30g/L，人血清为10ml/L），制得的重组人TNF-α蛋白冻干小球冻干得率为99.48%，TNF-α蛋白含量与冻干前的TNF-α蛋白含量最接近，不同重组人TNF-α蛋白冻干小球之间的差异性更小，均一性更好，而且复溶后24h内都能保持高度稳定，经37℃高温储存31天，重组人TNF-α蛋白活性没有明显下降，同时检测的空白限达到0.68pg/ml，显著提高了检测的准确性、特异性，同时降低了检测的空白限，提高检测灵敏度。而当选择其他封闭剂配方时，其冻干得率等测定结果反而产生更大的偏差，检测的空白限相较于最佳封闭剂组合也显著增大，因此，本实施例中，优选封闭剂为牛血清白蛋白+酪蛋白钠盐+人血清的组合，其中牛血清白蛋白以及酪蛋白钠盐浓度均为30g/L，人血清为10ml/L。
实施例4 抗氧化剂和表面活性剂的组合对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
为进一步提高本发明重组人TNF-α蛋白冻干小球的稳定性和均一性，从而提高检测结果的准确性与灵敏度，本实施例中从冻干保护溶液中抗氧化剂和表面活性剂的组合着手，按照实施例1提供的方法制备重组人TNF-α蛋白冻干小球。其中在配制冻干保护溶液时，分别按照表8所述方式添加抗氧化剂和表面活性剂，从而制备得到不同的重组人TNF-α蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率，考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%，同时测试其在检测时的空白限；将20个重组人TNF-α蛋白冻干小球在37℃放置15天，观察是否存在粘连的情况。计算检测结果如表8所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致；同时，本实施例中，除抗氧化剂和表面活性剂的组合不同，其余条件均为实施例1中最佳条件）。
表8、不同抗氧化剂和表面活性剂的组合的筛选（按照实施例1所示比例关系添加）
根据表8可以看出，采用不同的抗氧化剂和表面活性剂的组合制备重组人TNF-α蛋白冻干小球时，对冻干得率、均一性与粘连情况都有着完全不同的影响。
相比于单独添加抗氧化剂或单独添加表面活性剂的情况，同时添加抗氧化剂和表面活性剂能更有效改善重组人TNF-α蛋白在冻干过程中极易降解且均一性差的问题，对于冻干小球之间的粘连问题也能有效解决，同时对于重组人TNF-α蛋白的检测空白限显著降低，达到0.52pg/ml。
不同的抗氧化剂和表面活性剂的组合对提高重组人TNF-α蛋白冻干小球的稳定性效果也完全不同，经多次实验发现，采用乙二胺四乙酸二钠盐二水、卵磷脂和表面活性剂羟丙基-β-环糊精组合制备的重组人TNF-α蛋白冻干小球稳定性更好，冻干得率更高，制备的小球之间差异性也更小，均一性更好，而且还不容易发生粘连情况，同时对人体TNF-α蛋白的检测空白限也显著降低，说明检测灵敏度显著提升。
实施例5 抗氧化剂对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
一、抗氧化剂的选择
为进一步提高本发明重组人TNF-α蛋白冻干小球的稳定性和均一性，从而提高检测结果的准确性与灵敏度，本实施例中从冻干保护溶液中的抗氧化剂着手，按照实施例1提供的方法制备重组人TNF-α蛋白冻干小球。其中在配制冻干保护溶液时，分别考察未添加抗氧化剂，以及添加不同抗氧化剂配制成同浓度的冻干保护溶液（详见表9），从而制备得到不同的重组人TNF-α蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）以及热加速稳定性（37℃高温加速31天），计算检测结果如表9所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致；同时，本实施例中，除抗氧化剂不同，其余条件均为实施例1中最佳条件）。
表9、抗氧化剂对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
根据表9可以看出，重组人TNF-α蛋白在制备冻干小球过程中很不稳定，易出现降解的情况，且批间差异很大，在制备成冻干小球后，复溶后或是高温储存也都会出现重组人TNF-α蛋白活性明显下降的情况；而当在冻干保护溶液中加入抗氧化剂，能明显提高重组人TNF-α蛋白的稳定性，还能显著改善冻干小球之间的差异性问题。
同时，添加不同抗氧化剂，对提高重组人TNF-α蛋白的稳定性也存在不同的影响。实验证明，相比于其他抗氧化剂，添加维生素E、维生素C、乙二胺四乙酸二钠盐二水作为抗氧化剂，可有效改善重组人TNF-α蛋白在制备冻干小球过程中的稳定性，但其结果依然不尽如人意。
因此本实施例进一步尝试将多种抗氧化剂组合，发现采用乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂组合作为抗氧化剂，可显著改善重组人TNF-α蛋白在制备冻干小球过程中的稳定性，冻干得率能达到97%以上，不同冻干小球之间均一性非常好，而且制备的冻干小球经复溶后24h内都能保持高度稳定，经37℃高温储存31天也依然没有明显活性下降的情况，稳定性显著提高，其原因可能是乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂组合后更有助于改善重组人TNF-α蛋白在冻干过程中易降解的性能。
2、乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂添加量的优化
本实施例选择乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的组合作为抗氧化剂，继续考察了不同乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的添加量对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响，具体按照表10所示的方案制备冻干保护溶液。
表10、乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂添加量的优化
根据表10，乙二胺四乙酸二钠盐二水+卵磷脂的添加量不同，制备的重组人TNF-α蛋白冻干小球的稳定性存在较大差异，最优选的添加量为3g/L乙二胺四乙酸二钠盐二水+7g/L卵磷脂，此时的重组人TNF-α蛋白冻干小球冻干得率最高，复溶稳定性最好，热加速稳定性也为最高。
实施例6 表面活性剂对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
为进一步提高本发明重组人TNF-α蛋白冻干小球的稳定性和均一性，从而提高检测结果的准确性与灵敏度，本实施例中从冻干保护溶液中的表面活性剂着手，按照实施例1提供的方法制备重组人TNF-α蛋白冻干小球，以乙二胺四乙酸二钠盐二水+卵磷脂（3g/L+7g/L）作为抗氧化剂，其中在配制冻干保护溶液时，分别考察未添加表面活性剂，以及添加7种不同表面活性剂配制成同浓度的冻干保护溶液（详见表11），从而制备得到7组不同的重组人TNF-α蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）以及热加速稳定性（37℃高温加速31天），并测试其在检测时的空白限，检测结果如表11所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致；同时，本实施例中，除表面活性剂不同，其余条件均为实施例1中最佳条件）。
表11、表面活性剂对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
根据表11可以看出，添加表面活性剂可以显著改善重组人TNF-α蛋白冻干小球的稳定性问题，并且能帮助消除不同重组人TNF-α蛋白冻干小球之间的差异性，其原因可能是由于表面活性剂能帮助重组人TNF-α蛋白分子在冻干保护溶液中均匀分散，从而改善重组人TNF-α蛋白冻干小球之间的均一性，提高稳定性。但是不同表面活性剂，对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球存在着明显不同的效果，这可能是重组人TNF-α蛋白与不同表面活性剂本身性质或是相容性有关。实验结果证明，表面活性剂羟丙基-β-环糊精可以显著改善重组人TNF-α蛋白冻干小球在制备冻干小球过程中的稳定性，不同冻干小球之间均一性也明显改善，而且制备的冻干小球经复溶后24h内都能保持高度稳定，经37℃高温储存31天也依然没有明显活性下降的情况，稳定性显著提高，还有助于降低空白限，提高冻干小球中重组人TNF-α蛋白含量检测的准确性与灵敏度。
实施例7 糖类对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
为进一步提高本发明重组人TNF-α蛋白冻干小球的稳定性和均一性，从而提高检测结果的准确性与灵敏度，本实施例中从冻干保护溶液中的糖类着手，按照实施例1提供的方法制备重组人TNF-α蛋白冻干小球，其中在配制冻干保护溶液时，分别考察了添加不同糖类对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响（详见表12），从而制备得到不同的重组人TNF-α蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）以及热加速稳定性（37℃高温加速31天），计算检测结果如表12所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致；同时，本实施例中，除糖类不同，其余条件均为实施例1中最佳条件）。
表12、糖类的选择对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
根据表12可以看出，糖类的选择对于制备重组人TNF-α蛋白也有着非常重要的作用，相比之下，蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、海藻糖、果糖、壳聚糖，半乳糖、乳糖、麦芽糖等糖类，在制备重组人TNF-α蛋白冻干小球方面更有利。
多次实验证明，相比于采用一种糖，采用两种糖类组合能显著提高重组人TNF-α蛋白在冻干过程中的抗冻能力，尤其是采用壳聚糖和海藻糖的组合，能明显提高重组人TNF-α蛋白的稳定性，还能显著改善冻干小球之间的差异性问题，同时制备的冻干小球经复溶后24h内都能保持高度稳定，经37℃高温储存31天也依然没有明显活性下降的情况。
本实施例还进一步优化了壳聚糖和海藻糖的组合中的比例关系，发现提高海藻糖的含量还能明显提高重组人TNF-α蛋白在制备冻干小球过程中的耐低温能力，制备的重组人TNF-α蛋白冻干小球稳定性更好，复溶及高温储存的稳定性也更高，具体实验结果详见表13。
表13、海藻糖含量对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
根据表13可以看出，最合适的糖类组合为壳聚糖（40g/L）+海藻糖（70g/L），制备得到的重组人TNF-α蛋白冻干小球性能更加优异。
实施例8 多元醇对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
为进一步提高本发明重组人TNF-α蛋白冻干小球的稳定性和均一性，从而提高检测结果的准确性与灵敏度，本实施例中从冻干保护溶液中的多元醇着手，本实施例按照实施例1提供的方法制备重组人TNF-α蛋白冻干小球，其中在配制冻干保护溶液时，分别考察了添加不同多元醇对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响（详见表14），从而制备得到不同的重组人TNF-α蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）以及热加速稳定性（37℃高温加速31天），计算检测结果如表14所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致；同时，本实施例中，除多元醇不同，其余条件均为实施例1中最佳条件）。
表14、多元醇的选择对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
根据表14可以看出，最优选的多元醇为山梨醇，制备的重组人TNF-α蛋白冻干小球方面稳定性更高，不同重组人TNF-α蛋白冻干小球之间的差异性更小，均一性更好，复溶后24h内都能保持高度稳定，同时经37℃高温储存31天，重组人TNF-α蛋白活性也不会下降。
实施例9 氨基酸的种类及其不同构型或相似物对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
为进一步提高本发明重组人TNF-α蛋白冻干小球的稳定性和均一性，从而提高检测结果的准确性与灵敏度，本实施例中从冻干保护溶液中的氨基酸着手，本实施例按照实施例1提供的方法制备重组人TNF-α蛋白冻干小球，其中在配制冻干保护溶液时，分别考察了不同氨基酸对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响（详见表15），从而制备得到不同的重组人TNF-α蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）、热加速稳定性（37℃高温加速31天）以及对人体TNF-α蛋白的检测空白限，计算检测结果如表15所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致；同时，本实施例中，除缓冲液不同，其余条件均为实施例1中最佳条件）。
表15、氨基酸的选择对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
根据表15可以看出，氨基酸也会影响重组人TNF-α蛋白制备冻干小球的稳定性及均一性，其中满足预期要求的有L-精氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、肌氨酸，其冻干得率均超过90%，且CV，复溶稳定性以及热加速稳定性较好，且当优选氨基酸为L-丝氨酸时，其冻干得率达到98.11%，同时对于重组人TNF-α蛋白的检测空白限也显著降低，达到0.53pg/ml。
同时考虑氨基酸有不同的构型以及相似物或衍生物，针对L-精氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、肌氨酸这几种氨基酸验证其不同构型以及不同的相似物或衍生物对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响。
表16、氨基酸的不同构型及相似物的选择对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
根据表16可以看出，氨基酸的构型也会影响重组人TNF-α蛋白制备冻干小球的稳定性及均一性，L型氨基酸结果要稍好于D型氨基酸以及其它的一些构型，其中L型丝氨酸效果最佳。这可能是因为相比于D型氨基酸，L型氨基酸能够调节蛋白质的稳定性与活力，当与冻干保护溶液中的成分相结合时，对重组人TNF-α蛋白的结构稳定性会产生更好的效果，从而使得最终制得的重组人TNF-α蛋白冻干小球的稳定性发生极明显的提升。
实施例10 缓冲液的筛选对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
为进一步提高本发明重组人TNF-α蛋白冻干小球的稳定性和均一性，从而提高检测结果的准确性与灵敏度，本实施例中从冻干保护溶液中的缓冲液着手，本实施例按照实施例1提供的方法制备重组人TNF-α蛋白冻干小球，其中在配制冻干保护溶液时，分别考察了不同缓冲液对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响（详见表17），从而制备得到不同的重组人TNF-α蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）、热加速稳定性（37℃高温加速31天），计算检测结果如表17所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致；同时，本实施例中，除缓冲液不同，其余条件均为实施例1中最佳条件）。
表17、缓冲液的选择对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
根据表17可以看出，缓冲液也会影响重组人TNF-α蛋白制备冻干小球的稳定性及均一性，最优选的缓冲液为磷酸盐缓冲液，制备的重组人TNF-α蛋白冻干小球方面稳定性更高，不同重组人TNF-α蛋白冻干小球之间的差异性更小，均一性更好，而且复溶后24h内都能保持高度稳定，经37℃高温储存31天，重组人TNF-α蛋白活性没有明显下降，同时检测空白限也显著降低。
实施例11 冻干保护溶液的pH值对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
本实施例中从冻干保护溶液中的pH值着手，本实施例按照实施例1提供的方法制备重组人TNF-α蛋白冻干小球，其中在配制冻干保护溶液时，分别考察了不同pH值对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响（详见表18），从而制备得到不同的重组人TNF-α蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人TNF-α蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）、热加速稳定性（37℃高温加速31天），计算检测结果如表18所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致；同时，本实施例中，除pH值不同，其余条件均为实施例1中最佳条件）。
表18、冻干保护溶液的pH值对制备重组人TNF-α蛋白冻干小球的影响
根据表18可以看出，冻干保护溶液的pH值也会影响重组人TNF-α蛋白制备冻干小球的稳定性及均一性，最优选的pH值为8.0-8.4，制备的重组人TNF-α蛋白冻干小球方面稳定性更高，冻干得率均可达到95%以上，不同重组人TNF-α蛋白冻干小球之间的差异性更小，均一性更好，而且复溶后24h内都能保持高度稳定，经37℃高温储存31天，重组人TNF-α蛋白活性没有明显下降，且当优选pH值为8.2时，此时制得的冻干小球性能最佳。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (10)
1.一种重组人TNF-α蛋白冻干小球，其特征在于，所述重组人TNF-α蛋白冻干小球由重组人TNF-α蛋白溶液、冻干保护溶液和聚甘氨酸-精氨酸混合冻干成球状；所述重组人TNF-α蛋白溶液的pH值为8.2±0.2；所述冻干保护溶液包括封闭剂，所述封闭剂由牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清组成；所述冻干保护溶液还包括抗氧化剂、表面活性剂、糖类、多元醇、缓冲液和氨基酸；所述冻干保护溶液的pH值为7.8-8.8；所述抗氧化剂为乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的组合；所述表面活性剂为羟丙基-β-环糊精。
2.如权利要求1所述的重组人TNF-α蛋白冻干小球，其特征在于，所述抗氧化剂中，乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的质量比为（1-8）：（2-9）。
3.如权利要求2所述的重组人TNF-α蛋白冻干小球，其特征在于，所述糖类为壳聚糖和海藻糖的组合，所述壳聚糖和海藻糖的质量比为40：（40-100）。
4.如权利要求3所述的重组人TNF-α蛋白冻干小球，其特征在于，所述多元醇包括山梨醇或丙三醇。
5.如权利要求4所述的重组人TNF-α蛋白冻干小球，其特征在于，所述缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液、磷酸盐缓冲液中的任意一种或多种。
6.如权利要求5所述的重组人TNF-α蛋白冻干小球，其特征在于，所述氨基酸包括L-精氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、肌氨酸、D-丝氨酸、DL-丝氨酸、L-高丝氨酸、D-丙氨酸、β-丙氨酸、肌氨酸-水化合物中的任意一种或多种。
7.如权利要求6所述的重组人TNF-α蛋白冻干小球，其特征在于，所述多元醇为山梨醇，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述氨基酸为L-丝氨酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的重组人TNF-α蛋白冻干小球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配制冻干保护溶液：取乙二胺四乙酸二钠盐二水、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精、壳聚糖、海藻糖、山梨醇、磷酸盐缓冲液、L-丝氨酸、牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清，配制成pH值为8.0-8.4的冻干保护溶液；
（2）取冻干保护溶液、重组人TNF-α蛋白溶液和聚甘氨酸-精氨酸混合，制备得到重组人TNF-α蛋白冻干原溶液；
（3）通过滴珠设备将重组人TNF-α蛋白冻干原溶液滴至液氮中，使液滴状的重组人TNF-α蛋白冻干原溶液在液氮中冻结形成球体状结构的重组人TNF-α蛋白冻珠；
（4）通过冷冻干燥工艺将重组人TNF-α蛋白冻珠制备成重组人TNF-α蛋白冻干小球。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，冻干保护溶液和重组人TNF-α蛋白溶液的体积比为1：1，所述聚甘氨酸-精氨酸的加入量为总体积的2%。
10.一种重组人TNF-α蛋白冻干小球在制备降低重组人TNF-α蛋白冻干小球中的重组人TNF-α蛋白含量检测的空白限的制剂中的应用，其特征在于，所述重组人TNF-α蛋白冻干小球由重组人TNF-α蛋白溶液、冻干保护溶液和聚甘氨酸-精氨酸混合冻干成球状；所述重组人TNF-α蛋白溶液的pH值为8.2±0.2；所述冻干保护溶液包括封闭剂，所述封闭剂由牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐和人血清组成；所述冻干保护溶液还包括抗氧化剂、表面活性剂、糖类、多元醇、缓冲液和氨基酸；所述冻干保护溶液的pH值为7.8-8.8；所述抗氧化剂为乙二胺四乙酸二钠盐二水和卵磷脂的组合；所述表面活性剂为羟丙基-β-环糊精。
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 王明丽, 张咏南, 龚蕴贞: "用巨细胞病毒抗原致敏的冻干血球作间接血凝试验", 病毒学报, no. 03, 30 September 1988 (1988-09-30) * |
Also Published As
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