CN116640756A - 肝素酶ⅰ保护剂及其在血栓弹力图肝素检测试剂盒中的应用 - Google Patents

肝素酶ⅰ保护剂及其在血栓弹力图肝素检测试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及肝素酶Ⅰ保护剂及其在血栓弹力图肝素检测试剂盒中的应用。本发明提供了包括缓冲液、冻干保护剂和防腐剂的保护剂，以及采用该保护剂制备的肝素酶试剂。由于保护剂中使用抗氧化表面活性剂与糖类、氨基酸类、蛋白质类或醇类保护剂的组合作为冻干保护剂，可以大大减少肝素酶的酶活损失，提高肝素酶试剂的稳定性，并可获得肝素酶试剂冻干成品的良好赋形。本发明提供的肝素酶试剂稳定性好、灵敏度高、保质期佳、中和肝素能力强且检测成本低，适合推广应用。

Description

肝素酶Ⅰ保护剂及其在血栓弹力图肝素检测试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及肝素酶Ⅰ保护剂及其在血栓弹力图肝素检测试剂盒中的应用。
背景技术
肝素(Heparin)是一种由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，首先在肝脏中发现，是一种天然的抗凝物质。其抗凝作用主要是与抗凝血酶Ⅲ结合形成复合物，加速抗凝血酶Ⅲ的抗凝作用；还有直接抑制凝血酶的生成从而抑制凝血因子和血小板的促凝功能。肝素作为抗凝剂在临床上应用广泛，是迅速发挥抗凝作用的首选药物，但其剂量的使用需要准确把控，剂量过小或过量，会影响临床治疗的效果或有出血的风险。因此，在围术期对患者体内的肝素含量进行检测可以判断患者体内的凝血功能，对预防输血后出血有着十分重要的意义。
肝素酶(Heparinase，Hpa)是一类能够特异性降解肝素和类肝素的多糖裂解酶，广泛存在于真核生物和原核生物中，目前已从肝素黄杆菌中分离得到三种肝素酶：肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ，其中肝素酶Ⅰ在消除体外循环血液中肝素抗凝剂、制备低分子和超低分子肝素(Low molecular weight heparin，LMWHs)以及制备抗肿瘤药物等方面有着重要的应用。在血栓弹力图检测中，使用高岭土激活剂搭配肝素酶试剂，中和肝素，消除肝素对凝血状态的影响，其检测结果与未搭配肝素酶试剂的高岭土激活剂的检测结果进行比较，从而判断患者体内是否有肝素残留。
德国科学家Harter于1948年发明了血栓弹力图仪，应用于临床指导手术输血，后被我国引入，广泛应用于输血科、妇产科、创伤科、重症监护室等，是临床上检测凝血功能的重要手段之一。血栓弹力图肝素检测试剂相较于传统的检测手段具有可反应凝血全貌、对肝素类药物的检测灵敏度高、可检测低分子肝素等优势，被临床医生应用于肝素类药物治疗的监测中，能够根据检测结果及时调整治疗方案，提高治疗的成功率。
但肝素酶I对温度极为敏感，稳定性差，在25℃下半衰期不到2个小时，4℃放置16个小时后酶活损失达70％左右，稳定性无法满足作为诊断试剂长期存放的要求；现有技术中，经过冻干工艺将肝素酶I制作成冻干粉剂，获得保质期好的检测试剂盒，但是冻干后的酶活性损失较大，冻干保护剂的选择有待优化。因此在肝素酶试剂生产过程中如何保持酶的活性，降低酶活损失，同时保证对肝素的检测灵敏度高以及生产成本低成为重要的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供肝素酶Ⅰ保护剂及其在血栓弹力图肝素检测试剂盒中的应用，本发明提供肝素酶保护剂制备的肝素酶试剂稳定性好、灵敏度高、保质期佳、中和肝素能力强且检测成本低。
抗氧化表面活性剂在制备肝素酶保护剂中的应用，其中，
所述抗氧化表面活性剂包括蔗糖辛酸酯、蔗糖月桂酸酯、海藻糖肉蔻酸酯、海藻糖棕榈酸酯和抗坏血酸棕榈酸酯中的至少一种。
相比较现有技术中其他组分在制备肝素酶保护剂中的应用，本发明首次使用的抗氧化表面活性剂具有糖基团头部和烷基链，能够代替水分子提供给蛋白质有效的支持结构，提高崩解温度，在冻干的冷冻与脱水步骤中极大的保存酶活，从而获得更准确的技术效果。
本发明提供了保护剂，包括抗氧化表面活性剂、缓冲液和防腐剂，其中，
所述抗氧化表面活性剂包括蔗糖辛酸酯、蔗糖月桂酸酯、海藻糖肉蔻酸酯、海藻糖棕榈酸酯和抗坏血酸棕榈酸酯中的至少一种；
所述缓冲液包括缓冲盐和其他盐类，所述缓冲盐包括Tris-HCl、磷酸盐和乙酸盐中的至少一种，所述其他盐类包括氯化钠和/或氯化钙；
所述防腐剂包括Proclin 300、丙酸钙和硫酸庆大霉素中的至少一种。
相比较其他组分的选择，本发明提供的所述缓冲液可以为肝素酶I提供更适宜的缓冲环境并将pH稳定在7.5附近；所述冻干保护剂中抗氧化表面活性剂在冻干的冷冻与脱水步骤中极大的保存酶活；所述防腐剂可以延长肝素酶I的贮存时间。以上保护剂中各组分相互配合，共同为制备肝素酶试剂提供了更加稳定的冻干体系，能够最大程度的保护肝素酶I的活性，从而维持冻干前后的稳定性。
在一些具体实施例中，所述抗氧化表面活性剂为蔗糖辛酸酯或海藻糖棕榈酸酯；
所述缓冲液包括Tris-HCl、氯化钠和氯化钙；
所述防腐剂为硫酸庆大霉素。
上述各组分之间相互配合紧密，兼容性强，能够更有效的配合冻干肝素酶I产品的制备，从而获得更准确的技术效果。
进一步的，所述保护剂还包括糖类、氨基酸类、蛋白质类和醇类保护剂，所述糖类保护剂包括葡萄糖和/或蔗糖，所述氨基酸类保护剂包括甘氨酸，所述蛋白质类保护剂包括牛血清白蛋白，所述醇类保护剂包括甘露醇。
糖类、氨基酸类、蛋白质类和醇类保护剂可以同时作为填充物或赋形物对肝素酶I起到保护作用，从而获得更准确的技术效果。
优选的，所述保护剂由水、1～50mM Tris-HCl、50～200mM氯化钠、1～200mM氯化钙、0.001％～0.5％(w/v)抗氧化表面活性剂、0.5～5％(w/v)糖类、0.1％～10％(w/v)甘氨酸、0.5～10％(w/v)牛血清白蛋白、0.5～10％(w/v)甘露醇和0.001％～0.5％(w/v)硫酸庆大霉素组成；其中，
所述糖类为葡萄糖或蔗糖；
所述抗氧化表面活性剂为蔗糖辛酸酯、海藻糖棕榈酸酯或抗坏血酸棕榈酸酯。
采用上述组分及浓度范围的保护剂制备的肝素酶试剂与市售产品进行对比实验，在此浓度范围内，本发明提供的肝素酶试剂灵敏度高、保质期佳、中和肝素能力强且检测成本低，冻干前后肝素酶I的酶活损失低，肝素酶试剂的稳定性好，从而获得更准确的技术效果。
在一些具体实施例中，所述保护剂由水、20mM Tris-HCl、100mM氯化钠、10mM氯化钙、0.01％(w/v)蔗糖辛酸酯、5％(w/v)葡萄糖、2％(w/v)甘氨酸、1％(w/v)牛血清白蛋白、2％(w/v)甘露醇和0.005％(w/v)硫酸庆大霉素组成。
在一些具体实施例中，所述保护剂由水、20mM Tris-HCl、100mM氯化钠、10mM氯化钙、0.05％(w/v)海藻糖棕榈酸酯、5％(w/v)蔗糖、1％(w/v)甘氨酸、2％(w/v)牛血清白蛋白、5％(w/v)甘露醇和0.005％(w/v)硫酸庆大霉素组成。
在一些具体实施例中，所述保护剂由水、20mM Tris-HCl、100mM氯化钠、10mM氯化钙、0.002％(w/v)抗坏血酸棕榈酸酯、3％(w/v)葡萄糖、5％(w/v)甘氨酸、5％(w/v)牛血清白蛋白、1％(w/v)甘露醇和0.005％(w/v)硫酸庆大霉素组成。
实验表明，用以上三种保护剂制备的冻干肝素酶试剂稳定性更好、灵敏度更高、保质期更长、中和肝素能力更强且检测成本更低，从而获得更准确的技术效果。
本发明还提供了所述的保护剂在制备肝素酶试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供了肝素酶试剂或试剂盒，包括肝素酶I和所述的保护剂。
进一步的，所述肝素酶I的工作浓度为2IU/mL。
本发明提供了所述的肝素酶试剂或试剂盒在制备凝血检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供了包括缓冲液、冻干保护剂和防腐剂的保护剂，以及采用该保护剂制备的肝素酶试剂。由于保护剂中使用抗氧化表面活性剂与糖类、氨基酸类、蛋白质类或醇类的组合作为冻干保护剂，可以大大减少肝素酶I的酶活损失，提高肝素酶试剂的稳定性并拥有好的冻干赋形。本发明提供的肝素酶试剂稳定性好、灵敏度高、保质期佳、中和肝素能力强且检测成本低。经实验验证，与现有参比试剂或对比例相比，本发明提供的肝素酶试剂检测重复性变异系数更小，检测稳定性好，灵敏度高能够有效检测血液中残留肝素含量，最低可检测到0.02IU/mL的肝素钠，最高可中和14IU/mL的肝素，冻干后肝素酶I的酶活收率大于85％，储存期大于18个月，适合推广应用。
附图说明
图1示制备例1与制备例6的冻干成品图。
具体实施方式
本发明提供了肝素酶Ⅰ保护剂及其在血栓弹力图肝素检测试剂盒中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
肝素酶I选取New England Biolabs(NEB)生产的埃氏拟杆菌肝素酶I，浓度在1～1000IU/mL。IU是酶的国际单位。
为了延长肝素酶I的保存期限，本发明试剂盒采用冻干型。在冻干过程中，为了保护肝素酶I的活性，在肝素酶I中加入冻干保护剂，包括抗氧化表面活性剂、糖类、氨基酸类、蛋白类和醇类。其中抗氧化表面活性剂具有糖基团头部和烷基链，能够代替水分子提供给蛋白质有效的支持结构，提高崩解温度，在冻干的冷冻与脱水步骤中极大的保存酶活，抗氧化表面活性剂为冻干保护剂中的必须组成；糖类、氨基酸类、蛋白质类和醇类保护剂可以同时作为填充物或赋形物对产品起到保护和赋形作用。
缓冲液可以为肝素酶I提供适宜的缓冲环境，提供稳定的pH，从而保护肝素酶I的活性。缓冲液的组成有缓冲盐和其他盐类。其中缓冲盐包括三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、磷酸盐、乙酸盐中的一种或者几种，缓冲盐浓度在1～50mM，优选浓度20mM；其他盐类包括氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)中的一种或几种，NaCl浓度在50～200mM，优选浓度100mM；CaCl2浓度在1～200mM，优选浓度10mM；缓冲剂的pH 7.0～8.5，优选7.5。钙离子是肝素酶I酶活的催化剂，能够提高肝素酶I的活性。
在具体的冻干保护剂的使用中，抗氧化表面活性剂有蔗糖辛酸酯，蔗糖月桂酸酯，海藻糖肉蔻酸酯，海藻糖棕榈酸酯以及抗坏血酸棕榈酸酯；糖类保护剂有葡萄糖、蔗糖；氨基酸类保护剂有甘氨酸；蛋白质类保护剂有牛血清白蛋白(BSA)；醇类保护剂有甘露醇。保护剂的组合是抗氧化表面活性剂中的至少一种以及其他各类别保护剂中的至少一种。具体来说，蔗糖辛酸酯，蔗糖月桂酸酯浓度在0.001％～0.5％(w/v)，优选浓度0.01％；海藻糖肉蔻酸酯，海藻糖棕榈酸酯浓度在0.001％～0.5％(w/v)，优选浓度0.05％；抗坏血酸棕榈酸酯浓度在0.001％～0.5％(w/v)，优选浓度0.002％；葡萄糖或蔗糖浓度在0.5％-5％(w/v)，优选浓度5％；甘氨酸浓度在0.1％～10％(w/v)，优选浓度2％；BSA浓度在0.5％～10％(w/v)，优选浓度1％；甘露醇浓度在0.5％～10％(w/v)，优选浓度2％。
为了延长贮存时间，可以加入一些防腐剂，防腐剂包含Proclin 300、丙酸钙、硫酸庆大霉素中的一种或几种，防腐剂浓度在0.001％～0.5％(w/v)，优选浓度0.005％。
将肝素酶I、缓冲剂、保护剂、防腐剂按照一定浓度配制成工作液分装。分装好的肝素酶试剂置于冷冻干燥机内，冷冻干燥。利用本发明制备的肝素酶试剂酶活损失低，在2℃～8℃下至少可以保存18个月以上。
本发明采用的试剂与材料皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
按照下述制备例1～6中的步骤制备肝素酶I溶液，经过冻干得到肝素酶试剂。
制备例1
将肝素酶试剂按照2IU/mL肝素酶I、20mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01％蔗糖辛酸酯、5％葡萄糖、2％甘氨酸、1％ BSA、2％甘露醇、0.005％硫酸庆大霉素配制，pH 7.5。
制备例2
将肝素酶试剂按照2IU/mL肝素酶I、20mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.05％海藻糖棕榈酸酯、5％蔗糖、1％甘氨酸、2％ BSA、5％甘露醇、0.005％硫酸庆大霉素配制，pH 7.5。
制备例3
将肝素酶试剂按照2IU/mL肝素酶I、20mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.002％抗坏血酸棕榈酸酯、3％葡萄糖、5％甘氨酸、5％ BSA、1％甘露醇、0.005％硫酸庆大霉素配制，pH 7.5。
制备例4
将肝素酶试剂按照2IU/mL肝素酶I、20mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM CaCl2、5％葡萄糖、2％甘氨酸、1％ BSA、2％甘露醇、0.005％硫酸庆大霉素配制，pH 7.5。
制备例5
将肝素酶试剂按照2IU/mL肝素酶I、20mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM CaCl2、5％蔗糖、1％甘氨酸、2％ BSA、5％甘露醇、0.005％硫酸庆大霉素配制，pH 7.5。
制备例6
将肝素酶试剂按照2IU/mL肝素酶I、20mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM CaCl2、3％葡萄糖、5％甘氨酸、5％ BSA、1％甘露醇、0.005％硫酸庆大霉素配制，pH 7.5。
本实验将制备例1～6与参比试剂(主要原料中含有肝素酶I)对同一来源的含肝素血样进行检测，检测结果如表1。
表1制备例1～6与参比试剂检测性能的比较
试验组 R(min) K(min) Angle(deg) MA(mm)
制备例1 6.6 1.9 63.1 57.6
制备例2 6.5 1.8 63.0 56.9
制备例3 6.9 2.0 62.9 57.2
制备例4 12.4 2.6 55.6 53.0
制备例5 12.0 2.8 54.8 58.1
制备例6 13.1 3.1 49.0 51.0
参比试剂 6.6 1.8 63.6 57.3
正常范围 2-10 1-3 53-78 50-70
由表1的数据可知，肝素酶试剂制备例1～3各项检测指标均与市售试剂盒相近，可用于血栓弹力图仪对含肝素血样的检测。肝素酶试剂制备例4～6未使用抗氧化表面活性剂，各项检测指标尤其是R值与参比试剂差异大，且超过正常范围上限值，作为效果不佳案例供对比。经实验验证，抗氧化表面活性剂可选自蔗糖辛酸酯、蔗糖月桂酸酯、海藻糖肉蔻酸酯、海藻糖棕榈酸酯和抗坏血酸棕榈酸酯中的任意一种或多种，且均有较佳的肝素酶冻干保护效果，其中蔗糖辛酸酯的效果更好。
将制备例1～6与参比试剂放置在20℃进行加速处理4周，分别于第0、7、14、28天取试剂检测酶活，对同一批含肝素的质控品进行检测，检测结果如表2。
表2制备例1～6与参比试剂加速处理后检测性能的比较
由表2可知，制备例1～3的各变异系数都小于参比试剂的对应变异系数，其中制备例1的变异系数最小。制备例4～6的各变异系数都大于参比试剂的对应变异系数。
实施例2
使用制备例1～6制备的肝素酶试剂进行有效性检测。
使用肝素酶试剂搭配本公司生产的高岭土激活剂(肝素检测)或者仅使用本公司生产的高岭土激活剂(活化凝血检测)，对含肝素的新鲜血液进行检测，与参比试剂进行对比，结果见表3。
表3自制肝素酶试剂检测有效性
由表3可知，活化凝血检测凝血时间R值大于正常范围(2～10min)上限值，活化凝血检测与肝素检测的凝血时间差值(ΔR)大于2min，表示血液中存在肝素残留并且肝素酶试剂能够发挥中和肝素的作用。制备例1～3的ΔR值比参比试剂的ΔR值更高，表示制备的肝素酶试剂中和血液中肝素的有效性比参比试剂更好。制备例4-5的ΔR值比参比试剂的ΔR值更低，表示制备的肝素酶试剂中和血液中肝素的有效性比参比试剂更差。
实施例3
利用制备例1～6制备的肝素酶试剂进行灵敏度检测。
将肝素酶试剂搭配本公司生产的高岭土激活剂(肝素检测)或者仅使用本公司生产的高岭土激活剂(活化凝血检测)，分别对含0.02IU/mL肝素和14IU/mL肝素的血液进行检测，与参比试剂进行对比，结果分别见表4和表5。
表4.对含0.02IU/mL肝素血液的检测结果
由表4可知，参比试剂与制备例1～6在检测含0.02IU/mL肝素血液时，ΔR值都大于2min，说明都能够检测到低至0.02IU/mL的肝素，都有较好灵敏度。
表5对含14IU/mL肝素血液的检测结果
注：*表示未检测到凝集。
由表5可知，对高浓度的肝素血样，参比试剂和制备例4-6无法检测出值，制备例1～3的肝素检测组可检测出值，因此制备例1～3的肝素酶试剂中和肝素的能力比参比试剂更强。
实施例4
根据UV232吸光值检测法对制备例1～6的肝素酶试剂进行冻干前后酶活检测，取三瓶进行试验，结果见表6。
表6自制肝素酶试剂冻干前后酶活检测及酶活收率
注：酶活收率＝冻干后的酶活/冻干前的酶活*100％
由表6可知，制备例4-6的酶活收率比制备例1～3的酶活收率低40％左右，效果不佳。制备例1～3在冻干过程中极大地保护了肝素酶I的酶活，酶活收率≥85％，比现有技术报道的酶活收率(75％)要高，说明本专利采用的肝素酶配方的保护性能更加好。
实施例5
将三批肝素酶试剂盒放置于2～8℃储存，根据UV232吸光值检测法对制备例1～6的肝素酶试剂进行长期稳定性检测，取三批进行试验，结果见表7.1～表7.6。
表7.1制备例1肝素酶长期稳定性检测
注：绝对偏差＝第n月酶活-第0个月酶活。相对偏差＝绝对偏差/第0个月酶活*100％。
表7.2制备例2肝素酶长期稳定性检测
注：绝对偏差＝第n月酶活-第0个月酶活。相对偏差＝绝对偏差/第0个月酶活*100％。
表7.3制备例3肝素酶长期稳定性检测
注：绝对偏差＝第n月酶活-第0个月酶活。相对偏差＝绝对偏差/第0个月酶活*100％。
表7.4制备例4肝素酶长期稳定性检测
注：绝对偏差＝第n月酶活-第0个月酶活。相对偏差＝绝对偏差/第0个月酶活*100％。
表7.5制备例5肝素酶长期稳定性检测
注：绝对偏差＝第n月酶活-第0个月酶活。相对偏差＝绝对偏差/第0个月酶活*100％。
表7.6制备例6肝素酶长期稳定性检测
注：绝对偏差＝第n月酶活-第0个月酶活。相对偏差＝绝对偏差/第0个月酶活*100％。
由表7.1～7.6可知，制备例1～3研制的肝素酶试剂在2～8℃中18个月保质期内酶活的相对偏差均≤10％，第20个月的酶活相对偏差也在10％左右，说明肝素酶试剂稳定性好，在2～8℃环境中储存期长，具备良好的长期稳定性。制备例4～6中没有使用抗氧化表面活性剂类冻干保护剂，第20个月的酶活相对偏差在50％左右，长期稳定性显著比制备例1～3差。
实施例6
对冻干成品赋形好的制备例1以及冻干成品赋形不好的制备例6提供冻干成品图片(如图1所示)，展示冻干赋形的对比。
制备例1冻干成品呈白色疏松饼状固体，冻干赋形美观。制备例6冻干成品呈不均匀分布的白色固体，固含量低，冻干赋形差。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.抗氧化表面活性剂在制备肝素酶保护剂中的应用，其中，
所述抗氧化表面活性剂包括蔗糖辛酸酯、蔗糖月桂酸酯、海藻糖肉蔻酸酯、海藻糖棕榈酸酯和抗坏血酸棕榈酸酯中的至少一种。
2.保护剂，其特征在于，包括抗氧化表面活性剂、缓冲液和防腐剂，其中，
所述抗氧化表面活性剂包括蔗糖辛酸酯、蔗糖月桂酸酯、海藻糖肉蔻酸酯、海藻糖棕榈酸酯和抗坏血酸棕榈酸酯中的至少一种；
所述缓冲液包括缓冲盐和其他盐类，所述缓冲盐包括Tris-HCl、磷酸盐和乙酸盐中的至少一种，所述其他盐类包括氯化钠和/或氯化钙；
所述防腐剂包括Proclin 300、丙酸钙和硫酸庆大霉素中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的保护剂，其特征在于，
所述抗氧化表面活性剂为蔗糖辛酸酯或海藻糖棕榈酸酯；
所述缓冲液包括Tris-HCl、氯化钠和氯化钙；
所述防腐剂为硫酸庆大霉素。
4.根据权利要求2或3所述的保护剂，其特征在于，还包括糖类、氨基酸类、蛋白质类和醇类保护剂，所述糖类保护剂包括葡萄糖和/或蔗糖，所述氨基酸类保护剂包括甘氨酸，所述蛋白质类保护剂包括牛血清白蛋白，所述醇类保护剂包括甘露醇。
5.根据权利要求2～4任一项所述的保护剂，其特征在于，所述保护剂由水、1～50mMTris-HCl、50～200mM氯化钠、1～200mM氯化钙、0.001％～0.5％(w/v)抗氧化表面活性剂、0.5～5％(w/v)糖类、0.1％～10％(w/v)甘氨酸、0.5～10％(w/v)牛血清白蛋白、0.5～10％(w/v)甘露醇和0.001％～0.5％(w/v)硫酸庆大霉素组成；其中，
所述糖类为葡萄糖或蔗糖；
所述抗氧化表面活性剂为蔗糖辛酸酯、海藻糖棕榈酸酯或抗坏血酸棕榈酸酯。
6.根据权利要求5所述的保护剂，其特征在于，所述保护剂由水、20mM Tris-HCl、100mM氯化钠、10mM氯化钙、0.01％(w/v)蔗糖辛酸酯、5％(w/v)葡萄糖、2％(w/v)甘氨酸、1％(w/v)牛血清白蛋白、2％(w/v)甘露醇和0.005％(w/v)硫酸庆大霉素组成；或
所述保护剂由水、20mM Tris-HCl、100mM氯化钠、10mM氯化钙、0.05％(w/v)海藻糖棕榈酸酯、5％(w/v)蔗糖、1％(w/v)甘氨酸、2％(w/v)牛血清白蛋白、5％(w/v)甘露醇和0.005％(w/v)硫酸庆大霉素组成；或
所述保护剂由水、20mM Tris-HCl、100mM氯化钠、10mM氯化钙、0.002％(w/v)抗坏血酸棕榈酸酯、3％(w/v)葡萄糖、5％(w/v)甘氨酸、5％(w/v)牛血清白蛋白、1％(w/v)甘露醇和0.005％(w/v)硫酸庆大霉素组成。
7.权利要求2～6任一项所述的保护剂在制备肝素酶试剂或试剂盒中的应用。
8.肝素酶试剂或试剂盒，其特征在于，由肝素酶I和权利要求2～7任一项所述的保护剂制得。
9.根据权利要求8所述的肝素酶试剂或试剂盒，其特征在于，所述肝素酶I的工作浓度为2IU/mL。
10.权利要求8或9所述的肝素酶试剂或试剂盒在制备凝血检测试剂或试剂盒中的应用。
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CN117405474A (zh) * 2023-12-13 2024-01-16 迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司 一种复合质控品及其制备方法和应用
CN117737193A (zh) * 2023-12-08 2024-03-22 普迈德（北京）科技有限公司 一种血栓弹力图肝素酶杯、及制备方法和应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117737193A (zh) * 2023-12-08 2024-03-22 普迈德（北京）科技有限公司 一种血栓弹力图肝素酶杯、及制备方法和应用
CN117737193B (zh) * 2023-12-08 2024-07-30 普迈德（北京）科技有限公司 一种血栓弹力图肝素酶杯、及制备方法和应用
CN117405474A (zh) * 2023-12-13 2024-01-16 迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司 一种复合质控品及其制备方法和应用
CN117405474B (zh) * 2023-12-13 2024-03-08 迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司 一种复合质控品及其制备方法和应用

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