CN110452972A

CN110452972A - 一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法

Info

Publication number: CN110452972A
Application number: CN201810429363.5A
Authority: CN
Inventors: 高静; 代有来; 蔡亦梅; 范东雨; 张瑜; 李洁昆; 任鲁风
Original assignee: Beijing Central Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Integrated Biosystems Co ltd; Beijing Linke Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-05-08
Filing date: 2018-05-08
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2038-05-08
Also published as: CN110452972B

Abstract

本发明公开了一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法。冻干微球包括冻干保护剂、缓冲液、酶反应液和特异性核酸扩增反应试剂。冻干微球的制备方法包括以下步骤：核酸扩增反应体系与冻干保护剂混合均匀后，滴入液氮中冷冻成微球，然后将微球在真空冷冻干燥机中冷冻干燥。冻干试剂微球生物活性较好，操作简单，便于常温保存和运输。冻干微球用于实时荧光定量PCR、普通PCR，与全自动核酸检测仪配套使用，利于现场化快速检测。

Description

一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法。

背景技术

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一种体外扩增特定核酸序列的分子生物学技术。核酸扩增技术包括常规PCR、实时荧光定量PCR、等温核酸扩增技术等。常规PCR是基于DNA或者RNA的PCR技术，被广泛用于基因克隆和鉴定，疾病诊断和基因突变检测。实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中，加入荧光染料或者荧光标记的探针，通过荧光信号的累积实时检测PCR反应进程，利用标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、反应快速等特点，被用于临床疾病诊断、动物微生物疾病检测、食品安全等方面。

PCR反应检测结果的准确性决定于核酸扩增试剂的活性及正确使用。核酸扩增试剂包括各种酶、缓冲液，盐离子、镁离子、寡核苷酸等，进行PCR反应时需要混合所有成分。单个反应体系的多种成分是痕量，操作时会导致一定的实验误差，无法保证实验结果的重复性。在实验过程中，痕量试剂的使用比较容易出现外源性污染。

核酸扩增试剂尤其是酶制剂受温度的影响较大，一般需要低温（-20℃）或者4℃保存，需要干冰运输，且反复冻融会降低酶的活性。在现场化应急性快速检测应用时，常规的冷冻保存实验试剂难以满足实用需求，必须实现对温度敏感的酶试剂进行常温保存。

冻干保护剂具有填充、赋形、稳定的作用，在冷冻和干燥过程中，保护核酸扩增试剂的结构，保持其生物活性。真空冷冻干燥技术可将试剂溶液在较低的温度下冻结成固态，在真空条件下使其中的固态水升华为气态，待升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水。低温条件下干燥可减少热敏性酶试剂的降解失活，冷冻干燥试剂微球（Bead）具有较好的形态和最佳的含水量，操作简便，在常温长期保存下具有生物活性，适合常温运输。核酸扩增试剂冻干微球可应用于临床床边体外诊断、突发传染病的应急处理、检验检疫现场化快速检测等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是核酸扩增反应试剂的常温保存，提供一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种核酸扩增反应试剂的冻干微球，其包括：冻干保护剂、缓冲液、酶反应液和特异性核酸扩增反应试剂。

所述的冻干保护剂包括海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、牛血清白蛋白、表面活性剂、消泡剂。海藻糖的浓度为2~30%；甘露醇的浓度为1~20%；右旋糖苷为Dextran 10，Dextran 40或Dextran 70，浓度为0.4~10%；牛血清白蛋白的浓度为0.1~5mg/ml；表面活性剂为Tween20，Tween80或者Triton X-100，浓度为0.2~5%；消泡剂的浓度为0.03~1.2%。

所述的缓冲液包括以下一种或者几种成分：Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、氯化钾、氯化镁、甘氨酸、硫酸铵、氯化铵、硫酸镁、脱氧核糖核酸三磷酸。

所述的酶反应液包括以下一种或者几种试剂：DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、RNA逆转录酶、RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、ATP硫酸化酶、单链结合蛋白、无机焦磷酸酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、拓扑异构酶、解旋酶、RNA酶。

所述的特异性核酸扩增反应试剂包括以下一种或多种试剂：引物、模板、探针、荧光染料。

所述冻干微球的粒径为0.1~5mm。

所述冻干微球的核酸扩增体系为1~200μL。

所述冻干微球用于实时荧光定量PCR、数字PCR、特异性核酸片段扩增、RNA逆转录。

一种核酸扩增反应试剂的冻干微球制备方法，其包括以下步骤：

1)配制核酸扩增反应试剂混合液；

2)将混合液利用精确分液系统控制液滴，滴入液氮中，在液氮中冷却后形成微球；

3)将冷冻微球在-80~-50℃预冷冻1~24小时，转入真空冷冻干燥机中冷冻干燥。

本发明的有益效果在于：

本发明的冻干保护剂既可保持试冻干后微球的形状，又可保持试剂的生物活性，冻干微球使核酸扩增反应试剂操作简单，减少实验误差，避免污染。冻干微球稳定性较好，灵敏度较高，制备方法比较简单。冻干微球可常温保存，便于运输，利于现场化快速检测应用，方便与全自动核酸检测仪配套使用。

附图说明

图1是本发明冻干微球制备流程的示意图。

图2是本发明实施例1中PCR反应试剂冻干微球的外观。

图3是本发明实施例1中PCR反应试剂冻干微球稳定性检测结果（其中条带M为DNAMarker，条带1，3，4，5分别为45℃放置20天，室温放置3个月，37℃放置1个月，55℃放置7天后Beads的PCR结果，条带2为对照未冻干试剂的PCR结果）。

图4是本发明实施例2中实时荧光定量PCR反应试剂微球的灵敏度检测扩增曲线结果（三次重复）。

具体实施方式

结合实施例对本发明进一步说明，但并不仅限于此。如无特别说明，本发明中的试剂均为分子生物学级别，“%”均指质量百分比。

实施例1 PCR反应试剂冻干微球的制备。

一、PCR反应试剂混合溶液的配制

1) 配制混合溶液4mL，其中10×Buffer成分为: Tris-HCl (pH8.3) 100mM，KCl 500mM, MgCl₂ 20mM;

2) 将配制好的混合溶液混匀置于冰上。

二、PCR反应试剂微球的形成

1) 利用IVEK Digispense 3009系统，将6μL混合溶液滴入存于杜瓦瓶的液氮中冷冻成微球；

2) 将微球用液氮预冻的小勺取出，装入-80℃预冻的西林瓶中。

三、微球的真空冷冻干燥

将西林瓶放入真空冷冻干燥机中冻干，程序如下：

。

四、冻干微球的形态学检测

1) 外观检测

Beads为球形，表面较光滑，分散性好，完整性很好。实验结果如图1所示；

2) 冻干微球的直径

利用游标卡尺测得冻干Beads的直径如下表1；

表1

。

五、冻干微球的稳定性检测

1) 在湿度小于30%，将Beads放置室温3个月、37℃1个月、45℃20天、55℃7天;

2) 以M5 HiPer pTOPO-T载体为模板，扩增2kb目的片段，引物序列为：上游引物F-2k（5'-3'）：TAGCTGTTTCCTGTCCATAG，下游引物R-2k（5'-3'） CTGGCCGTCGTTTTACACAA，如下配制检测溶液:

3)配制阳性对照:

4) 将混合好的检测溶液取30μL加入含有Bead的PCR管中;

5) 混合均匀后，离心，放入PCR仪，设置反应条件为98℃ 5min；30cycles（98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 2min10s）；72℃ 10min；

6) 反应结束后，取5μl上样，1%琼脂糖凝胶电泳。实验结果如图2所示。

图2 PCR结果显示，在室温到55℃条件下保存，冻干微球的活性受温度影响较大，随温度的升高而降低。室温条件下保存3个月，与未冻干试剂比较，冻干微球具有较好的生物活性。

实施例2 实时荧光定量PCR反应试剂冻干微球的制备。

一、实时荧光定量PCR反应试剂混合溶液的配制

1) 设计引物序列为：上游引物Forward Primer（5'-3'）：CAGACTAAACTGGCTGACGGAAT，下游引物Reverse Primer R（5'-3'）： CAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT；配制混合溶液4mL，其中10×Buffer成分为： Tris-HCl（pH8.3）100mM，KCl 500mM , MgCl₂ 20mM；

2) 将配制好的混合溶液置于冰上。

二、实时荧光定量PCR反应试剂微球的形成

方法如实施例1步骤二。

三、微球的真空冷冻干燥

将西林瓶放入真空冷冻干燥机中冻干，程序如实施例1步骤三。

四、冻干微球的形态学检测

1) 外观检测

Beads为球形，表面较光滑，分散性好，完整性很好；

2) 冻干微球的直径

利用游标卡尺测得冻干Beads的直径如下表2；

表2

。

五、冻干微球的灵敏度检测

1) 将Beads室温放置2个月；

2) 以pET-30a载体为模板，扩增100bp目的片段，Taqman 探针T（5'-3'）：TGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATC，10μM探针T 10μL，超纯水490μL配制混合溶液；

3) 将混匀的溶液29μL加入含有bead的PCR管中；

4) 分别加含pET-30a 1.8×10³、1.8×10⁴、1.8×10⁵ 、1.8×10⁶、1.8×10⁷ 1μL模板溶液至含bead的PCR管中，每个模板梯度设置三个重复；

5) 混合均匀后，离心，ABI 7500进行荧光定量PCR，设置反应条件95℃ 5min；40cycles（95℃ 10s，60℃ 45s）；

6) 实时荧光定量PCR的Ct值如表3，扩增曲线结果如图3所示；

表3

。

表3和图3结果显示，室温保存2个月后，冻干微球的荧光定量Ct值重复性较好，灵敏度也比较高。

Claims

1.一种核酸扩增反应试剂的冻干微球，其特征在于，包括：冻干保护剂、缓冲液、酶反应液和特异性核酸扩增反应试剂。

2.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，所述冻干保护剂包括海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、牛血清白蛋白、表面活性剂、消泡剂；海藻糖的浓度为2~30%；甘露醇的浓度为1~20%；右旋糖苷为Dextran 10，Dextran 40或Dextran 70，浓度为0.4~10%；牛血清白蛋白的浓度为0.1~5mg/ml；表面活性剂为Tween20，Tween80或者Triton X-100，浓度为0.2~5%；消泡剂的浓度为0.03~1.2%。

3.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，所述缓冲液包括以下一种或者几种成分：Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、氯化钾、氯化镁、甘氨酸、硫酸铵、氯化铵、硫酸镁、脱氧核糖核酸三磷酸。

4.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，所述酶反应液包括以下一种或者几种试剂：DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、RNA逆转录酶、RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、ATP硫酸化酶、单链结合蛋白、无机焦磷酸酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、拓扑异构酶、解旋酶、RNA酶。

5.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，所述特异性核酸扩增反应试剂包括以下一种或多种试剂：引物、模板、探针、荧光染料。

6.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，冻干微球的粒径为0.1~5mm。

7.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，冻干微球的核酸扩增体系为1~200μL。

8.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，所述微球用于实时荧光定量PCR、数字PCR、特异性核酸片段扩增、RNA逆转录。

9.一种核酸扩增反应试剂的冻干微球制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）配制核酸扩增反应试剂混合液；

2）将混合液利用精确分液系统控制液滴，滴入液氮中，在液氮中冷却后形成微球；

3）将冷冻微球转入真空冷冻干燥机中冷冻干燥。

10.根据权利要求9所述的冻干微球制备方法，其特征在于，步骤3）冷冻微球在-80~-50℃预冷冻1~24小时。