CN114277097A

CN114277097A - 核酸保护试剂及应用

Info

Publication number: CN114277097A
Application number: CN202111652359.3A
Authority: CN
Inventors: 杜军; 姚家成; 曹文刚; 肖晓文
Original assignee: Hubei Qingke Biotechnology Co ltd; Tsingke Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hubei Qingke Biotechnology Co ltd; Tsingke Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明涉及一种核酸保护试剂及应用，具体公开了糖醇和牛血清白蛋白联合使用在制备核酸保护试剂中的应用。本发明的核酸保护试剂通过糖醇和牛血清白蛋白联合使用的协同作用，降低核酸酶对核酸标准品的降解，对于低拷贝数的核酸标准品，也能起到稳定核酸的作用，对于核酸标准品的保存效果稳定性好，满足核酸标准品的保存需求，并且不会对PCR反应和PCR产物的检测产生影响。

Description

核酸保护试剂及应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种核酸保护试剂及应用。

背景技术

基因检测前常常需要对试剂盒的灵敏度进行检测，为保证检测灵敏度的准确性，通常要将核酸标准品从较高拷贝数(10¹³copies/mL)稀释至不同拷贝数梯度的核酸标准品，操作过程繁琐，检测前准备时间长。

其中，低拷贝数核酸是重要的临床无创分子标志物，随着基因诊断技术的发展，低拷贝数核酸具有极大的临床应用价值，在疾病早期诊断、分期、治疗监测、预后判断以及产前基因诊断和病原体感染基因检测等方面具有重要意义。

目前，在核酸的使用过程中，并没有有效的核酸保护剂能保存核酸标准品，尤其是低拷贝数的核酸标准品。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的第一目的在于提供糖醇和牛血清白蛋白联合使用在制备核酸保护试剂中的应用，能够用于保存核酸标准品，解决低拷贝数核酸标准品易降解的问题。

本发明的一种实现方式中，糖醇在核酸保护试剂中的质量体积分数为1～3％，牛血清白蛋白在核酸保护试剂中的质量体积分数为0.05～1％。

本发明的一种实现方式中，糖醇包括甘露醇和木糖醇中的至少一种。

本发明的第二目的在于提供一种核酸保护试剂，核酸保护试剂包括糖醇和牛血清白蛋白。

本发明的一种实现方式中，核酸保护试剂包括质量体积分数为1～3％的糖醇以及0.05～1％的牛血清白蛋白。

本发明的一种实现方式中，核酸保护试剂还包括海藻糖、甘氨酸、Tris-HCl缓冲液、EDTA和氯化钠中的至少一种。

本发明的一种实现方式中，海藻糖的质量体积百分数为1～5％；

甘氨酸的质量体积百分数为1～5％；

Tris-HCl缓冲液的摩尔浓度为10～25mmol/L；

EDTA螯合剂的摩尔浓度为1～2.5mmol/L；

氯化钠的摩尔浓度为10～100mmol/L。

本发明的一种实现方式中，核酸保护试剂的pH值为7.8～8.0。

本发明的第三目的在于提供上述核酸保护试剂在制备用于核酸检测的试剂盒中的应用。

本发明地第四目的在于提供一种用于核酸检测的试剂盒，包括核酸标准品，核酸标准品保存于上述核酸保护试剂中。

本发明地第五目的在于提供一种核酸保护试剂的使用方法，其特征在于，将核酸保护试剂和核酸标准品混合保存。

本发明的一种实现方式中，核酸保护试剂和核酸标准品混合保存的温度为-80～37℃。

本发明的一种实现方式中，所述核酸标准品包括质粒标准品和基因组DNA标准品中的至少一种。

本发明的一种实现方式中，质粒标准品的拷贝数为不超过10⁹copies/mL；

所述基因组DNA标准品浓度不超过10^-3ng/μL；或者

所述核酸标准品中核酸的拷贝数为不超过10⁶copies/mL；

基因组DNA浓度不超过10^-4ng/μL。

本发明公开的糖醇和牛血清白蛋白联合使用在制备核酸保护试剂的应用，通过糖醇和牛血清白蛋白联合使用的协同作用，降低核酸酶对核酸标准品的降解，对于低拷贝数的核酸标准品，也能起到稳定核酸的作用，对于核酸标准品的保存效果稳定性好，满足核酸标准品的保存需求。

附图说明

图1为本发明实施例2提供的核酸保护试剂保存核酸50天后的PCR实验结果图；

图2为本发明实施例2提供的核酸保护试剂保存核酸47天的qPCR验证实验结果图；

图3为本发明实施例3提供的核酸保护试剂保存10⁵copies/mL的核酸的qPCR实验结果图；

图4为本发明实施例3提供的核酸保护试剂保存10⁴copies/mL的核酸的qPCR实验结果图；

图5为实施例4提供的核酸保护试剂在不同保存温度下保存HMPV模板的qPCR实验结果图。

图6为实施例4提供的核酸保护试剂不同保存温度下保存MEV模板的qPCR实验结果图；

图7为实施例4提供的核酸保护试剂在不同保存时间下保存MEV模板的qPCR实验结果图；

图8为实施例4提供的核酸保护试剂保存不同类型的模板的qPCR实验结果图；

图9为实施例4提供的核酸保护试剂在37℃加速条件下保存MeV、229E模板的qPCR实验结果图；

图10为实施例4提供的核酸保护试剂保存大肠杆菌gDNA和质粒DNA反复冻融后的qPCR实验结果图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

目前，在核酸的保存过程中，低拷贝数的核酸极易发生降解，而大部分保护试剂一般用于保护核酸样本，如血浆样本等，其保护的对象是生物样本中的核酸，其中的一些核酸保护试剂含有核酸裂解物质如EDTA、胍盐、柠檬酸钠等会对PCR反应造成抑制作用，无法直接用于PCR检测，必须经过核酸提取步骤才能进行PCR检测。

对于核酸标准品，由于其对核酸浓度要求很精确，且保存时间和稳定性要求也较高，现有核酸保护试剂无法也满足其保存要求，例如既能起到保护核酸的作用，又不影响PCR反应和检测，因而没有有效的核酸保护剂能保存核酸标准品，尤其是保护低拷贝数核酸标准品，低拷贝数核酸易降解，进而也限制了低拷贝数核酸在基因检测试剂盒中的应用。

为了至少部分解决上述技术问题的至少一个，本发明的第一方面提供了糖醇和牛血清白蛋白联合使用在制备核酸保护试剂中的应用，以用于保存核酸标准品，并解决核酸标准品无法保存的问题，尤其是低拷贝数或者低浓度的核酸标准品易降解而无法保存的问题。

本发明公开的糖醇和牛血清白蛋白联合使用在制备核酸保护试剂的应用，通过糖醇和牛血清白蛋白联合使用的协同作用，降低核酸酶对核酸标准品的降解，对于低拷贝数的核酸标准品，也能起到稳定核酸的作用，对于核酸标准品的保存效果稳定性好，满足核酸标准品的保存需求。具体地，BSA对可降解核酸的核酸酶有封闭作用，使核酸酶活性降低；核酸酶在发挥作用时一般需要金属阳离子的参加，糖醇可作为金属离子螯合剂，螯合金属离子，进一步抑制核酸酶的活性，糖醇和BSA可加强对核酸酶的抑制作用，对核酸保护有更明显的促进作用，并且糖醇为有机小分子，使用时不会对PCR反应和PCR产物的检测产生影响；此外，糖醇类物质性能稳定，能够在高温、高寒的环境中保持稳定的结构，同时在核酸的表面形成一种特殊的保护膜，保护核酸生物分子结构的完整性。

一些实施方案中，糖醇包括甘露醇和木糖醇中的至少一种。

本发明的第二方面提供了一种核酸保护试剂，核酸保护试剂包括糖醇和牛血清白蛋白组。

一些实施方案中，糖醇在核酸保护试剂中的质量体积分数为1～3％的糖醇以及牛血清白蛋白在核酸保护试剂中的质量体积分数为0.05～1％，进一步包括糖醇的质量体积分数为2～3％的，牛血清白蛋白的质量体积分数为0.1～1％。

一些实施方案中，核酸保护试剂还包括的海藻糖、甘氨酸中、Tris-HCl缓冲液、EDTA螯合剂和氯化钠中的至少一种。

一些实施方案中，海藻糖的质量体积百分数为1～5％，进一步为2～5％；

甘氨酸的质量体积百分数为1～5％，进一步为2～5％；

Tris-HCl缓冲液的摩尔浓度为10～25mmol/L，进一步为10～20mmol/L；

EDTA螯合剂的摩尔浓度为1～10mmol/L，进一步为1～5mmol/L；

氯化钠的摩尔浓度为10～100mmol/L，进一步为10～75mmol/L。

一些实施方案中，核酸保护试剂的pH值为7.8～8.0，进一步可以为7.9～8.0。

本发明的第三目的在于提供上述核酸保护试剂在制备用于核酸检测的试剂盒中的应用，能够用于保护试剂盒中的核酸标准品。

本发明地第四方面提供了一种用于核酸检测的试剂盒，包括核酸标准品，核酸标准品保存于上述核酸保护试剂中。

本发明地第五方面提供了一种核酸保护试剂的使用方法，将核酸保护试剂和核酸标准品混合保存，从而减少核酸标准品的降解，尤其是低拷贝数核酸标准品的降解，对试剂盒的灵敏度进行检测时，可以直接使用配制好的核酸标准品而不需要再现配，从而简化灵敏度检测的操作步骤，缩短灵敏度检测的周期。

一些实施方案中，核酸保护试剂和核酸标准品混合保存的温度为-80～37℃，进一步可以为4～37℃。

一些实施方案中，核酸标准品中核酸的拷贝数不超过10⁹copies/mL，具体地，可以为10⁸copies/mL，10⁷copies/mL，进一步不超过10⁶copies/mL，具体地，可以为10⁴copies/mL，10⁵copies/mL。基因组DNA的浓度不超过10^-3ng/μL，具体地，可以为10^-4ng/μL。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

本实施例涉及的仪器设备包括超净工作台、漩涡震荡器、可制冷孔板/冰盒、掌式离心机、锡箔纸、避光试管架&储存盒、无菌无酶的离心管(1.5、15mL)、带滤芯的无菌无酶吸头(0.1～10μL、10～100μL、20～200μL、100～1000μL)、移液器(0.1～10μL、10～100μL、20～200μL、100～1000μL)、自封袋、计时器、75％酒精喷壶、96孔板、96孔板专用封膜、荧光定量检测系统、手套等。

本实施例涉及的试剂包括酶试剂、引物、探针、Nuclease-Free Water，糖醇(SIGMA)、牛血清白蛋白BSA(SIGMA)、Trima base(VETEC)、海藻糖(沪试)、乙二胺四乙酸二钾盐EDTA(沪试)、氯化钠(沪试)、甘氨酸Glycine(VWR)等。

本实施例涉及的基因组DNA包括人(全血)、小鼠(肾脏)番茄、油菜、小麦、玉米、大肠杆菌等。

本实施例涉及的质粒标准品包括猪瘟病毒ASFV、呼吸道病毒PIV1、虫媒病毒A、冠状病毒MeV和HMPV等。

本实施例涉及的基因组DNA为大肠杆菌基因组DNA。

实施例1

本实施例分别按照表1、表2、表3、表4、表5配制方案1、方案2、方案3、方案4、方案5各1000mL，用0.22μm过滤器过滤后分别将其分装至50mL/管，置于4℃冰箱保存备用。

以非洲猪瘟(ASFV1)病毒质粒作为模板，以1×TE缓冲液稀释后保存的模板作为对照，使用方案1、方案2、方案3、方案4和方案5分别稀释至1×10⁸、1×10⁶copies/mL，分装成13μL/管，分别保存至37℃；

将实验组和对照组模板进行PCR扩增，每个反应做一个重复。

表1

试剂名称	工作液浓度
		Tris-HCl	10mmol/L
EDTA	1mmol/L
		ddH<sub>2</sub>O	补齐1L

表2

试剂名称	工作液浓度
		Tris-HCl	10mmol/L
EDTA	1mmol/L
		氯化钠	100mmol/L
海藻糖	2％
		甘氨酸	2％
ddH<sub>2</sub>O	补齐1L

表3

试剂名称	工作液浓度
		Tris-HCl	10mmol/L
EDTA	1mmol/L
		氯化钠	100mmol/L
海藻糖	2％
		甘氨酸	2％
BSA	1％
		ddH<sub>2</sub>O	补齐1L

表4

表5

试剂名称	工作液浓度
		Tris-HCl	10mmol/L
EDTA	1mmol/L
		氯化钠	100mmol/L
海藻糖	2％
		甘氨酸	2％
BSA	1％
		糖醇	2％
ddH<sub>2</sub>O	补齐1L

PCR反应实验步骤具体如下：

1.在试剂准备区进行PCR试剂操作；

2.取出-20℃保存的PCR扩增试剂置于可制冷孔板或冰上；

3.按照表6配制PCR反应体系Master Mix；

表6

试剂	体积(μL)
		2xPCR buffer	10.0
Nuclease-Free Water	2.0
		酶混合物	1.0
特异性引物	1.0
		荧光探针	1.0
模板	5
		总体积	20

4.取15μL Master Mix于可制冷孔板或冰上预冷的96孔板中，盖紧封膜；

5.把步骤4中的加有Master Mix的96孔板连同可制冷孔板一起转移到模板加样区；

6.确保模板加样区、移液器等无污染；

7.取出待检测核酸样品，混匀样品，离心；

8.取5μL样品加入相应PCR反应管中，混匀样品；

9.把混匀好的96孔板置于荧光PCR检测仪上，按照表7所示的PCR循环条件运行PCR程序；

表7

10.反应完成后，扩增产物可-20℃短期保存，长期保存应转移至-80℃冰箱中。

表8

表9

其中，表8表示1×10⁸copies/mL核酸保存效果的qPCR检测结果，表9表示1×10⁶copies/mL核酸保存效果的qPCR检测结果，根据表8和表9的检测结果可知，方案5比其他4个方案对核酸保护效果更好。

方案2与方案1的保存效果相比，2％海藻糖对核酸保护有促进作用。具体地，海藻糖是典型应激代谢物，能够在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在生物分子表面形成独特的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持核酸分子生物结构特征，故2％海藻糖在方案2中对核酸保护有促进作用。

对核酸的保护效果从高到低依次排序，可知方案5、方案3、方案4、方案2的保护效果依次降低，说明方案5也即本发明的核酸保护试剂中BSA和糖醇组合使用比二者分别单独加入到方案2时，对核酸保护有促进作用。

实施例2核酸保护试剂的可行性验证

本实施例采用实施例1中方案5的配方作为核酸保护试剂，分别对其在短期和长期的保存效果进行可行性验证。

1.核酸保护试剂保存效果的PCR验证

以冠状病毒质粒(HMPV)、非洲猪瘟病毒质粒(ASFV1)为模板，以1×TE缓冲液稀释后保存的模板作为对照，使用1×TE缓冲液和核酸保护试剂稀释HMPV、ASFV1质粒模板至1×10⁸copies/mL、1×10⁶copies/mL，13μL/管分装，分别保存至4℃、37℃、-20℃；将保存至4℃、37℃、-20℃的模板分别进行PCR扩增。每个反应做一个重复。

其中，PCR反应实验步骤与实施例1相同。

具体地，在37℃条件下保存一个月后，采用TE缓冲液和核酸保护试剂保存的模板PCR扩增结果如表10所示，1×TE保存的模板扩增不出条带，而本实施例的核酸保护试剂保存的模板能扩增出目的条带，初步说明本实施例的核酸保护试剂具有一定的核酸保护效果。

表10

如图1所示，其中，图1中“1”、“2”、“5”和“6”指示的是TE缓冲液在37℃温度下保存核酸模板50天后，TE保存的模板已扩增不出条带，图1中“3”、“4”、“7”和“8”指示的是本实施例核酸保护试剂保存的模板依旧能稳定扩增出目的条带，说明本实施例的核酸保护试剂对质粒模板在较长时间内具有良好的保护作用。

(2)核酸保护试剂保存效果的qPCR验证

以冠状病毒质粒(MEV)为模板，使用1×TE缓冲液(对照)和方案5进行稀释至1×10⁸copies/mL、1×10⁶copies/mL，13μL/管分装，分别保存至4℃、37℃、-20℃，至少保存30天，将模板分别进行qPCR扩增。每个反应做一个重复。

其中，PCR反应实验步骤与实施例1相同。

在4℃、-20℃和37℃条件下保存47天后的使用TE和核酸保护试剂进行稀释的模板进行了浓度差异对比，qPCR结果显示，浓度为1×10⁸copies/mL时，在4℃保存温度下，核酸保护试剂保存的模板Ct值比TE缓冲液低5个Ct值，在37℃温度下，核算保护试剂保存的模板Ct值比TE缓冲液低13个Ct值；同时发现浓度为1×10⁶copies/mL时，TE保存的模板已几乎检测不到Ct值，具体如图2所示，说明本发明中核酸保护试剂具有良好的可行性。

实施例3核酸保护试剂对低拷贝数核酸保存效果

本实施例采用上述方案5的配方进行低拷贝数核酸保存效果实验。

将10¹¹copies/mL的质粒DNA分别用TE缓冲液和核酸保护试剂进行梯度稀释至10⁵copies/mL、10⁴copies/mL，分别保存至4℃、-20℃、37℃，在不同的保存天数进行qPCR检测，检测结果如图3和图4所示。

其中，PCR反应实验步骤与实施例1相同。

根据PCR结果，与TE缓冲液相比，核酸保护试剂对低拷贝数核酸的保存效果更佳，在核酸浓度为10⁵copies/mL、10⁴copies/mL，保存温度为37℃时，保存至38天时Ct值的CV值均在2％左右，需要说明的是，37℃相当于是4℃的加速实验环境，37℃保存38天相当于在4℃条件下保存266天，故认为其对10⁴copies/mL的核酸有很好的保护作用。

实施例4核酸保护试剂的性能测定

本实施例采用实施例1中方案5的配方作为核酸保护试剂，以对核酸保护试剂的性能进行测定。

1.核酸保护试剂的保存温度对保存效果的影响

以冠状病毒质粒(MEV)为模板，使用1×TE缓冲液和核酸保护试剂稀释模板，分别稀释至1×10⁸cpoies/mL、1×10⁶copies/mL，13μL/管分装，分别保存至4℃、37℃、-20℃和-80℃；分别在相隔一段时间将模板分别进行qPCR扩增。每个反应做一个重复。

其中，PCR反应实验步骤与实施例1相同。

以冠状病毒质粒(HMPV、MEV)作为模板，将其进行梯度稀释后分别保存至4℃、37℃、-20℃和-80℃。实验时，以1×TE缓冲液稀释的模板作为对照组，以核酸保护试剂稀释的模板作为实验组，通过qPCR我们发现，当使用HMPV作为模板时，在1×10⁸cpoies/mL、1×10⁶copies/mL浓度时，核酸保护试剂保存于4℃、-80℃的模板Ct值均低于1×TE稀释后保存的模板Ct值；核酸保护试剂在4℃条件下的Ct值低于核酸保护试剂-80℃条件下的Ct值，如图5所示。

同时，随着时间的推移，在4℃、37℃、-20℃条件下，MEV模板在1×10⁸cpoies/mL、1×10⁶cpoies/mL浓度时其Ct值并没有发生明显的变化；其CV值分别为1.28％、1.95％、2.62％，与37℃和-20℃条件相比，4℃保存更为稳定，说明在4℃时核酸保护试剂的保护效果更好，如图6所示。

2.核酸保护试剂的保存时间对保存效果的影响

以冠状病毒质粒(MEV)为模板，使用1×TE缓冲液和核酸保护试剂稀释模板，稀释至1×10⁶copies/mL，13μL/管分装，分别保存至4℃、37℃、-20℃；分别在相隔一段时间将模板分别进行qPCR扩增。每个反应做一个重复。

其中，PCR反应实验步骤与实施例1相同。

以冠状病毒质粒(MEV)作为模板，以1×TE缓冲液稀释的模板作为对照，使用核酸保护试剂将其稀释至1×10⁶copies/mL浓度，分别保存至4℃、37℃、-20℃。qPCR结果显示，随着时间的推移，MEV模板在4℃、37℃、-20℃条件下，核酸保护试剂稀释保存的模板，保存至第67天时，Ct值并没有发生明显的变化，均在1个Ct内变化，如图7所示，说明在4℃条件下核酸保护剂能稳定保存核酸物质。需要说明的是，37℃相当于是4℃的加速实验环境，37℃保存67天相当于在4℃条件下保存469天。

3.核酸保护试剂的稳定性验证

本实施例采用不同模板对核酸保护试剂的保存效果的影响、37℃加速条件对核酸保护试剂的保存效果的影响以及反复冻融对核酸保护试剂的保存效果的影响来评估核酸保护试剂保存效果的稳定性，核酸保护试剂的稳定性通过模板的qPCR检测结果(Ct值)的变异系数来表示，其中，变异系数，又称“离散系数”(英文：coefficient of variation)，是概率分布离散程度的一个归一化量度，其定义为标准差与平均值之比，本发明通过CV值表示变异系数的大小，CV值越小，表明核酸保护试剂保护效果的稳定性越好。

(1)不同模板对核酸保护试剂保存效果的影响

以大肠杆菌gDNA和质粒DNA作为模板，分别使用核酸保护试剂进行稀释至10^-4ng/μL，10⁶copies/mL，13μL/管分装，保存至37℃，通过qPCR扩增检测，每个反应做一个重复。

其中，PCR反应实验步骤与实施例1相同。

以大肠杆菌gDNA和质粒DNA作为模板，分别使用核酸保护试剂进行稀释至10^-4ng/μL，10⁶copies/mL，在37℃保存52天，根据检测结果，大肠杆菌gDNA和质粒DNA的Ct值的CV值分别为1.2％和1.5％，如图8所示，说明核酸保护剂能够防止不同DNA被降解，对不同的模板具有良好保护效果。需要说明的是，37℃相当于是4℃的加速实验环境，37℃保存52天相当于在4℃条件下保存364天。

(2)37℃加速条件对核酸保护试剂保存效果的影响

为了能更快的了解核酸保护试剂在4℃保存条件下的稳定性，根据相关文献指出在37℃条件下保存1天相当于在4℃条件下保存一周，本实施例利用37℃模拟4℃加速环境观察核酸保护试剂的稳定性。

以冠状病毒质粒作为模板，使用核酸保护试剂进行稀释至1×10⁸copies/mL、1×10⁶copies/mL，13μL/管分装，保存至37℃。每隔3～7天将模板进行qPCR检测，每个反应做一个重复。

其中，PCR反应实验步骤与实施例1相同。

根据PCR结果可知，在37℃条件下，与1×TE缓冲液相比，浓度1×10⁸、1×10⁶copies/mL时，HMPV模板保存50天后仍能较好地扩增出目的条带，而1×TE缓冲液保存的模板几乎扩增不出，如图1所示。同时，qPCR结果显示，MeV、229E模板浓度为1×10⁸copies/mL，在37℃保存条件下，保存至43天，其Ct值变化的CV值分别为1.8％、2.78％；MeV、229E模板浓度为1×10⁶copies/mL，在37℃保存条件下保存至50天时，其Ct值变化的CV值分别为1.59％、1.16％，如图9所示，说明本发明的核酸保护试剂能稳定保存质粒模板。

(3)反复冻融对核酸保护试剂保存效果的影响

将1×10^-3ng/μL的大肠杆菌基因组DNA和10⁸copies/mL的质粒DNA作为模板，500μL/管分装，保存至-80℃；将反复冻融的模板进行qPCR检测，每个反应做一个重复。

其中，PCR反应实验步骤与实施例1相同。

将1×10^-3ng/μL的大肠杆菌基因组DNA(E.coli gDNA)和10⁸copies/mL的质粒DNA保存至-80℃，每天反复冻融5次，qPCR结果显示，在-80℃条件下，大肠杆菌基因组DNA和质粒DNA模板在反复冻融100次后，如图10所示，其Ct值无明显变化，CV值均在2％内，说明核酸保护剂保护核酸的稳定性较好。

4.核酸保护试剂的批间精密性

(1)分别配制1，2两个不同批次的核酸保护试剂

(2)以冠状病毒质粒为模板，分别使用两个不同批次的核酸保护试剂将模板稀释至1×10⁸cpoies/mL、1×10⁶copies/mL，13μL/管分装，分别保存至4℃、37℃、-20℃，至少保存67天；

每隔3～7天将不同批次保存的模板进行qPCR扩增检测，每个反应做一个重复。

其中，PCR反应实验步骤与实施例1相同。

表11

根据qPCR结果可知，模板浓度为1×10⁸cpoies/mL、1×10⁶cpoies/mL时，在4℃、37℃、-20℃条件下，用不同批次的核酸保护试剂保存至第67天时，MeV模板的Ct值在不同批次下并无明显变化，如表11所示，其Ct值的CV值均在2％内，说明在不同批次之间的核酸保护剂保护核酸的稳定性较好。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.糖醇和牛血清白蛋白联合使用在制备核酸保护试剂中的应用。

2.一种核酸保护试剂，其特征在于，所述核酸保护试剂包括糖醇和牛血清白蛋白。

3.根据权利要求1所述的应用，或者权利要求2所述的核酸保护试剂，其特征在于，所述糖醇在所述核酸保护试剂中的质量体积分数为1～3％，所述牛血清白蛋白在所述核酸保护试剂中的质量体积分数为0.05～1％；和/或

所述糖醇包括甘露醇和木糖醇中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的核酸保护试剂，其特征在于，所述核酸保护试剂还包括海藻糖、甘氨酸、Tris-HCl缓冲液、EDTA螯合剂和氯化钠中的至少一种；和/或

所述核酸保护试剂的pH值为7.8～8.0。

5.根据权利要求4所述的核酸保护试剂，其特征在于，所述海藻糖的质量体积百分数为1～5％；

所述甘氨酸的质量体积百分数为1％～5％；

所述Tris-HCl缓冲液的摩尔浓度为10～25mmol/L；

所述EDTA螯合剂的摩尔浓度为1～2.5mmol/L；

所述氯化钠的摩尔浓度为10～100mmol/L。

6.根据权利要求2～5任一项所述的核酸保护试剂在制备用于核酸检测的试剂盒中的应用。

7.一种用于核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括核酸标准品，所述核酸标准品保存于如权利要求2～5任一项所述的核酸保护试剂中。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸标准品包括质粒标准品和基因组DNA标准品中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸标准品中核酸的拷贝数为不超过10⁹copies/mL；

所述基因组DNA标准品浓度不超过10^-3ng/μL；或者

所述核酸标准品中核酸的拷贝数为不超过10⁶copies/mL；

基因组DNA浓度不超过10^-4ng/μL。

10.一种核酸保护方法，其特征在于，将如权利要求2～5任一项所述的核酸保护试剂和核酸标准品混合保存。