CN117248000B

CN117248000B - 一种用于多重荧光pcr的冻干保护剂、冻干反应体系和包含其的试剂盒及用途

Info

Publication number: CN117248000B
Application number: CN202311541550.XA
Authority: CN
Inventors: 许嘉婉; 周巧妮; 李明汝; 贺思宇; 朱宏基; 杨波; 莫秋华; 陈智英; 付辉
Original assignee: Shenzhen Love Doctor Biotechnology Co ltd; SHENZHEN BIOEASY BIOTECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: Shenzhen Love Doctor Biotechnology Co ltd; SHENZHEN BIOEASY BIOTECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2023-11-20
Filing date: 2023-11-20
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2043-11-20
Also published as: CN117248000A

Abstract

本发明提供了一种用于多重荧光PCR的冻干保护剂、冻干反应体系和包含其的试剂盒及用途，所述冻干保护剂包含5 mM至25 mM KCl、4%至6%（w/v）PEG10000、以及4%至10%（w/v）葡聚糖‑70，其既能解决多重荧光PCR反应体系中低荧光值检测项目冻干前后的荧光值偏低的问题，也能减少多重荧光PCR反应冻干体系中的非特异性扩增的问题。

Description

一种用于多重荧光PCR的冻干保护剂、冻干反应体系和包含其的试剂盒及用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种用于多重荧光PCR的冻干保护剂、冻干反应体系和包含其的试剂盒及用途，以及该试剂盒用于牛乳房炎病原菌检测的用途。

背景技术

奶牛乳房炎是一种由多种因素导致的奶牛乳腺组织发生炎症的综合性复杂疾病。该疾病常导致奶牛产奶量下降，乳汁理化性质和细菌学性质发生改变，甚至致使奶牛失去泌乳能力，具有难治愈、易传播等特点。其中，隐性牛乳房炎又因隐匿性强，给临床诊断增加了难度。患病奶牛常常需要被淘汰，这给奶牛养殖业造成了巨大损失。

奶牛乳房炎的重要致病因素是病原菌感染，临床上可对奶牛乳汁或乳区拭子样本中的微生物进行检测，从而达到对该疾病的监控，以及给临床诊断提供重要依据。

临床上对于病原菌的检测可以使用实时荧光PCR技术，即针对病原菌特异性基因位点，设计引物及探针，然后通过体外扩增目的基因并对扩增产物进行检测，从而达到对样本中病原菌检测的目的。

多重荧光PCR法，即通过设计不同荧光通道的探针，可使多组引物探针于同一管反应液中同时反应，实现对多个项目同时检测的目的，极大地提高检测效率。

由于液态型多重荧光PCR反应液难以在室温条件下稳定保存，增加了运输和储存成本，且由于运输过程中的诸多不确定因素，容易对试剂质量产生不良影响。故将液态试剂转化成冻干粉剂型可以很好地解决上述问题。

但是由于多重荧光PCR反应液中含有多个荧光通道探针，其不同通道探针之间的荧光信号有时会相互干扰，低荧光值检测项目有时会受到高荧光值检测项目影响，荧光值变得更低，冻干粉试剂制备时需要额外添加赋形剂等，可能对扩增体系造成影响，上述因素均会影响低荧光值检测项目的检测灵敏性和准确性。

同时，多重荧光PCR中含有多组引物，添加了冻干保护剂后引物与引物之间可能发生错配而引起非特异性扩增，增加了检测的假阳性结果。由于各引物设计软件的算法存在差异，在引物设计阶段即使对各组引物进行比对，但与实际实验结果仍存在差异，且引起引物非特异性扩增因素较为复杂，在引物设计阶段难以彻底解决该问题。

因此，亟需一种合适的用于多重荧光PCR的冻干保护剂，其既能解决多重荧光PCR反应体系中低荧光值检测项目冻干前后的荧光值偏低的问题，也能减少多重荧光PCR反应冻干体系中的非特异性扩增。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于多重荧光PCR的冻干保护剂、用于多重荧光PCR的冻干反应体系和包含其的试剂盒及用途。

在第一方面，本发明提供了一种用于多重荧光PCR反应体系的冻干保护剂，所述冻干保护剂包含5 mM至25 mM KCl、4%至6%（w/v）PEG10000、以及4%至10%（w/v）葡聚糖-70。

在第二方面，本发明提供了一种用于多重荧光PCR的冻干反应体系，所述冻干反应体系是通过将本发明第一方面的多重荧光PCR冻干保护剂和多重荧光PCR反应体系混合并冻干获得的，所述多重荧光PCR反应体系包括至少2对PCR引物、至少两种荧光探针、Taq酶、dNTPs、镁离子和缓冲液。

在第三方面，本发明提供了一种用于多重荧光PCR的试剂盒，其中所述试剂盒包括本发明第二方面的冻干反应体系、以及使用说明书。

在第四方面，本发明提供了本发明第二方面的冻干反应体系在制备用于诊断奶牛乳房炎的诊断剂中的用途。

本发明的有益效果在于以下一个或者多个：

本发明提供的保护剂解决了多重荧光PCR反应体系中低荧光值检测项目冻干前后的荧光值偏低的问题，并且还解决了多重荧光PCR反应冻干体系中由引物引起的非特异性扩增的问题。

另外，由于本发明的试剂盒是冻干型试剂，不仅解决了室温运输与保存的问题，同时因其可直接用样本经提取后的核酸洗脱液进行复溶，增大复溶体积即可增大检测样本量，从而提高了试剂盒的检测灵敏度。

附图说明

图1示出了克雷伯氏菌（FAM通道）、无乳链球菌（HEX通道）和金黄色葡萄球菌（ROX通道）在各个冻干体系中的荧光值比较。

图2示出了克雷伯氏菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌在冻干体系1中的阴性扩增情况。

图3示出了克雷伯氏菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌在冻干体系2中的阴性扩增情况。

图4示出了克雷伯氏菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌在冻干体系3中的阴性扩增情况。

图5示出了克雷伯氏菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌在冻干体系4中的阴性扩增情况。

图6示出了各冻干体系的冻干粉形态。

图7示出了不同浓度KCl反应体系的对比情况。

具体实施方式

下面对本发明进行详细的描述。应当理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明技术方案进行修改。

如上所述，本领域亟需一种合适的用于多重荧光PCR的冻干保护剂，希望它能够解决多重荧光PCR反应体系中低荧光值检测项目冻干前后的荧光值偏低的问题，同时能够减少多重荧光PCR反应冻干体系中由引物引起的非特异性扩增。

在一个实施方案中，所述冻干保护剂包含10 mM KCl、5%（w/v）PEG10000、以及6%（w/v）葡聚糖-70。

在第二方面，本发明提供了一种用于多重荧光PCR的冻干反应体系，所述冻干反应体系是通过将本发明第一方面的冻干保护剂和多重荧光PCR反应体系混合并冻干获得的，所述多重荧光PCR反应体系包括至少2对PCR引物、至少两种荧光探针、Taq酶、dNTPs、镁离子和缓冲液。

如本文所用，术语“荧光探针”是指一种将生物、化学事件等信息转化为可被分析的荧光信号的“分子器件”，其带有荧光基团，在不同的激发波长下显示出不同的颜色，以指示相关信号。常用于PCR反应的荧光探针中所带有的荧光基团包括FAM、TET、JOE、HEX、ROX、CY3、CY5等。在多重荧光PCR反应体系中，通常包括带有不同荧光基团的多个荧光探针，以指示多种信号。例如，在一个实施方案中，一种探针用FAM标记，一种探针用HEX标记，另一种探针用ROX标记。

在一个实施方案中，所述多重荧光PCR反应体系包括：各0.25 μM的至少2对PCR引物、各0.15 μM的至少两种探针、5U Taq酶、0.5 mM dNTPs、以及2.5 mM 镁离子。

在一个实施方案中，所述多重荧光PCR反应体系还包括0.4U UDG酶。尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶）又称尿嘧啶-N-糖基化酶，可水解含尿嘧啶的单链和双链DNA释放出游离尿嘧啶，而对RNA无活性，可用于建立成PCR防污染体系。

在一个实施方案中，所述冻干反应体系用于检测包括克雷伯氏菌、无乳链球菌、和金黄色葡萄球菌的牛乳房炎病原菌，克雷伯氏菌引物对和荧光探针分别如SEQ ID NO:1-3所示，无乳链球菌引物对和荧光探针分别如SEQ ID NO:4-6所示，葡萄球菌引物对和荧光探针分别如SEQ ID NO:7-9所示。

在一个实施方案中，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。

在一个实施方案中，所述诊断奶牛乳房炎通过检测包括克雷伯氏菌、无乳链球菌、和金黄色葡萄球菌的牛乳房炎病原菌来进行。

实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅是说明性的，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：不同组合的保护剂对牛乳房炎多重qPCR反应体系的影响

选用不同组合的保护剂体系实验组和不加保护剂对照组进行比较。

1.配制各组反应体系

按照下表1分别配制无保护剂体系和冻干体系1-4。

表1.各组反应体系的配方

上表中各引物和探针的序列如下：

SEQ ID NO:1：AGCGCAGAACTTTGAAGCCGTG；

SEQ ID NO:2：TTGACCAGGTCTTCGCTTCC；

SEQ ID NO:3：TTCGACTTTGGCCTGCGTCCGTCCC，该荧光探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为BHQ1；

SEQ ID NO:4：TGGTGCATCACCAGAGCATG；

SEQ ID NO:5：TGTGCTACCGGAACGCTCTTAAC；

SEQ ID NO:6：AGCTCCAGCAGTTCCTGTGACTACG，该荧光探针的5’端标记的荧光报告基团为HEX，3’端标记的淬灭基团为BHQ1；

SEQ ID NO:7：CGTCAAGGCTTGGCTAAAGT；

SEQ ID NO:8：AGCGTTGTCTTCGCTCCAAAT；

SEQ ID NO:9：ACCTAACAATACACATGAACAACT，该荧光探针的5’端标记的荧光报告基团为ROX，3’端标记的淬灭基团为BHQ2。

2.冻干

2.1配制好以上各组反应体系后，将冻干体系1-4以20 μL/管的体积分装到0.2 mL的八联管中。

2.2将分装好的反应体系放入冻干机中，盖上玻璃罩，启动冻干机，将冻干机预冷至-56℃之后，保持3小时。

2.3将各组反应体系于-56℃冷冻3小时后启动真空泵，持续干燥18小时。

2.4打开除湿机，待环境湿度降至30%以下后，关闭真空泵，插入排气管，待真空状态解除后，取出各组反应体系，盖紧管盖，并将八联管装入铝箔袋进行密封保存。

3.复融冻干粉

分别取500 μL和100 μL阴性对照（灭菌水）复溶阳性对照冻干粉（包含克雷伯氏菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌的扩增序列的重组质粒冻干粉）并涡旋混匀，以配制1×阳性对照和5×阳性对照，向各组冻干粉分别加入配制好的1×阳性对照，每管25 μL，空白对照组则用阴性对照复溶，每管25 μL，每组冻干粉点样顺序分别为4个阳性对照，4个阴性对照。盖紧管盖，上下颠倒混匀，离心30秒，立即进行扩增反应。

4.对照组分装

实验对照组为无添加保护剂液态组，将配好的反应液分装至8联管中，每管20 μL，并分别加入配制好的5×阳性对照5 μL和阴性对照5 μL，点样顺序分别为4个阳性对照，4个阴性对照。盖紧管盖，上下颠倒混匀，离心30秒，立即进行扩增反应。

5.PCR扩增反应

5.1 PCR扩增程序设置

打开扩增设备控制软件，设置PCR扩增反应程序，反应程序为：

第一阶段（去污染）：50℃，3分钟；

第二阶段（预变性）：95℃，3分钟；

第三阶段（扩增）：95℃，10秒，60℃，30秒，共45个循环，并于60℃处采集荧光。

5.2荧光信号采集设置

克雷伯氏菌的报告荧光为FAM,淬灭基团为None；无乳链球菌的报告荧光为HEX,淬灭基团为None；金黄色葡萄球菌的报告荧光为ROX,淬灭基团为None。

5.3 PCR扩增和信号采集

扩增程序及荧光信号采集设置完毕后，将各组8联管放入扩增仪中，启动程序进行扩增和信号采集。待实验结束后，及时保存实验数据。

6.实验结果

6.1图1示出了各组的扩增曲线。从这些图中可以看到，无论对于哪一种致病菌，荧光值由高到低分别是：冻干体系1、冻干体系3、冻干体系2、冻干体系4、无保护剂组。以上结果表明，保护剂有效地提高了整个体系的荧光值，故即使对于荧光值较低的致病菌，其荧光值也得到了提高。

6.2图2-图5示出了冻干保护剂的添加对多重引物组合引起的非特异性扩增的影响。从这些图中可以看出，对于克雷伯氏菌而言，在冻干体系1的阴性对照中无非特异性扩增，在冻干体系2-4的阴性对照中均出现了非特异性扩增，其中在冻干体系2和4的阴性对照中仅出现少量非特异性扩增，而在冻干体系3的阴性对照中出现较为明显的非特异性扩增；而对于另外两种致病菌即无乳链球菌、金黄色葡萄球菌，则在冻干体系1-4的阴性对照中均没有出现非特异性扩增。

6.3图6示出了从各组冻干粉的形态。从图中可以看出，冻干体系1和4的形态较为接近，均为干燥饱满，不粘壁或较少粘壁，冻干体系2的孔洞较多且塌缩，冻干体系3的粘壁情况较严重。

7.结果分析

从各个实验结果可知，冻干体系1（即保护剂体系为：10 mM KCl、4.5%(w/v)PEG10000、6%(w/v)葡聚糖-70）从扩增体系的性能到冻干粉形态来说均为最优。又由于冻干粉可直接用样本复溶，增加了样本量，因此提高了检测灵敏性。

实施例2：不同保护剂组分浓度对牛乳房炎多重qPCR反应体系的影响

1.配制2xPCR预混液

将PCR反应所需的成分按下表2配制成2xPCR预混液备用。

表2

2.按下表3配制不同浓度的KCl反应体系。

表3

3.按下表4配制不同浓度的PEG10000反应体系。

表4

4.按下表5配制不同浓度的葡聚糖-70反应体系。

表5

5.冻干

5.1将表2中的2xPCR预混液与表3中的KCl反应体系、表4中的PEG10000反应体系或表5中的葡聚糖-70反应体系按照1:1的比例进行混合，由此配制好各组反应体系后，然后将各组反应体系以20 μL/管的体积分装到0.2 mL的八联管中。

5.2将分装好的反应体系放入冻干机中，盖上玻璃罩，启动冻干机，将冻干机预冷至-56℃之后，保持3小时。

5.3将各组反应体系于-56℃冷冻3小时后启动真空泵，持续干燥18小时。

5.4打开除湿机，待环境湿度降至30%以下后，关闭真空泵，插入排气管，待真空状态解除后，取出各组反应体系，盖紧管盖，并将八联管装入铝箔袋进行密封保存。

6.复融冻干粉

取500 μL阴性对照（灭菌水）复溶阳性对照冻干粉（包含克雷伯氏菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌的扩增序列的重组质粒冻干粉）并涡旋混匀以配制1×阳性对照，向各组冻干粉分别加入配制好的1×阳性对照，每管25 μL，空白对照组则用阴性对照复溶，每管25 μL，每组冻干粉点样顺序分别为3个阳性对照，3个阴性对照。盖紧管盖，上下颠倒混匀，离心30秒，立即进行扩增反应。

7.PCR扩增反应

7.1 PCR扩增程序设置

第一阶段（去污染）：50℃，3分钟；

第二阶段（预变性）：95℃，3分钟；

7.2荧光信号采集设置

克雷伯氏菌报告荧光为FAM,淬灭基团为None；无乳链球菌报告荧光为HEX,淬灭基团为None；金黄色葡萄球菌报告荧光为ROX,淬灭基团为None。

7.3 PCR扩增和信号采集

8.实验结果

8.1在所验证的5-30 mM的浓度范围内，当KCl浓度高于25 mM时，体系扩增效率受到抑制，结果如图7所示。

8.2在所验证的2%至8%的浓度范围内，当PEG10000浓度低于4%时，克雷伯式菌阴性出现非特异扩增曲线，当PEG10000浓度高于6%时（即组别4），CT值较其余组别滞后2个CT值左右，即扩增产物相差约4倍，表明扩增反应受到了抑制，而在所有测试范围内的PEG1000浓度对于致病菌即无乳链球菌、金黄色葡萄球菌的核酸序列扩增均没有出现非特异性扩增，如表6所示。另外，在PEG10000浓度高于6%的情况下，冻干粉的冻干形态较差，出现较严重沾壁现象（未示出）。

表6.不同浓度PEG10000反应体系实验结果

注：PC：阳性对照；NC：阴性对照。

8.3在所验证的4%至12%的范围内，当葡聚糖-70浓度高于10%时，克雷伯氏菌阴性对照出现非特异扩增，而在所有测试范围内的葡聚糖-70浓度对于致病菌即无乳链球菌、金黄色葡萄球菌的核酸序列扩增均没有出现非特异性扩增，结果如表7所示。

表7.不同浓度葡聚糖-70反应体系实验结果

注：PC：阳性对照；NC：阴性对照。

9.结果分析

综合上述实验结果可知，在本实验范围内，本发明的冻干体系的最佳范围为：5 mM至25mM KCl、4%至6%（w/v）PEG10000、4%至10%（w/v）葡聚糖-70。

Claims

1.一种用于多重荧光PCR的冻干反应体系，所述冻干反应体系是通过将冻干保护剂和多重荧光PCR反应体系混合并冻干获得的，所述多重荧光PCR反应体系包括至少2对PCR引物、至少两种荧光探针、Taq酶、dNTPs、镁离子和缓冲液，所述冻干保护剂包含5 mM至25 mMKCl、按质量/体积计4%至6%的PEG10000、以及按质量/体积计4%至10%的葡聚糖-70，所述冻干反应体系用于检测克雷伯氏菌、无乳链球菌、和金黄色葡萄球菌，其中克雷伯氏菌引物对和荧光探针分别如SEQ ID NO:1-3所示，无乳链球菌引物对和荧光探针分别如SEQ ID NO:4-6所示，金黄色葡萄球菌引物对和荧光探针分别如SEQ ID NO:7-9所示。

2. 根据权利要求1所述的冻干反应体系，其中所述冻干保护剂包含10 mM KCl、按质量/体积计5%的PEG10000、以及按质量/体积计6%的葡聚糖-70。

3.根据权利要求1或2所述的冻干反应体系，其中所述多重荧光PCR反应体系包括：各0.25 μM的至少2对PCR引物、各0.15 μM的至少两种探针、5U Taq酶、0.5 mM dNTPs、以及2.5mM 镁离子。

4.根据权利要求1或2所述的冻干反应体系，其中所述多重荧光PCR反应体系还包括0.4U UDG酶。

5.一种用于多重荧光PCR的试剂盒，其中所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的冻干反应体系、以及使用说明书。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。

7.权利要求1-4中任一项所述的冻干反应体系在制备用于诊断奶牛乳房炎的诊断剂中的用途，其中所述诊断奶牛乳房炎通过检测克雷伯氏菌、无乳链球菌、和金黄色葡萄球菌来进行。