CN112997967A - 一种凝血酶磁珠及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种凝血酶磁珠及其制备方法。凝血酶磁珠为羧基化磁珠与凝血酶反应形成的带凝血酶的磁珠。凝血酶磁珠的制备方法包括以下步骤:磁珠清洗、磁珠活化、凝血酶与活化磁珠链接、封闭磁珠未连接的羧基、清洗与保存。本发明中的凝血酶磁珠，无需进行开颅后颅内局部注射凝血酶、形成血栓等复杂操作，仅需远端静脉注射凝血酶磁珠，随后在需要形成血栓的局部放置磁铁，从而形成血栓，本发明能够更加方便、精确和高效地在形成体内血栓，提高了形成血栓位置的准确性，本发明的制备方法方便高效，可以很好地将凝血酶与磁珠相互结合。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种凝血酶磁珠及其制备方法。
背景技术
中国脑卒中发病率为世界第一，根据我国第三次国民死因调查结果表明，脑卒中已经升为中国第一位死因。缺血性脑卒中的主要原因为脑血管栓塞，而急性期最有效的治疗方案为溶栓治疗。为了了解溶栓药物对血栓的积极作用和作用机理，需要在动物脑部形成血栓，随后注入溶栓药物，观察溶栓药物的作用效果。
目前动物脑梗死模型血栓的产生方式主要有：1、将血液放置于体外，形成血栓块后，注射入体内产生血栓栓塞血管；2、将凝血酶注射到血管局部，形成血栓。但是局部注射常常引起血管渗漏，无法止血，或者凝血酶被血液冲到远端血管，无法在想要的位置形成栓塞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种凝血酶磁珠，在体内栓塞时，无需进行开颅后颅内局部注射凝血酶、形成血栓等复杂操作，能够更加方便、精确和高效地在形成体内血栓，也能在病理实验中在想要的位置更快形成血栓，本发明还提供一种其制备方法。
本发明提供一种凝血酶磁珠，所述凝血酶磁珠为羧基化磁珠与凝血酶反应形成的带凝血酶的磁珠。
羧基化磁珠中的羧基与凝血酶中的氨基发生反应。
本发明所述凝血酶磁珠的的制备方法包括以下步骤：
S1.磁珠活化：将羧基化磁珠通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐试剂(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺试剂(NHS)混合激活，后放置于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液中，再进行混匀，得到活化后的磁珠；
S2.凝血酶与活化磁珠链接：将步骤S1中得到的活化后的磁珠用2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液清洗，随后加入凝血酶，再进行混匀；
S3.封闭磁珠未连接的羧基：将步骤S2中得到的磁珠放置于磁力架上，移液器弃去上清，同时加入2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液与血清蛋白；
S4.清洗与保存：将步骤S3中得到的磁珠放置于磁力架上，弃去上清，加入磷酸缓冲盐溶液，得到凝血酶磁珠。
优选地，在磁珠活化之前对羧基化磁珠进行清洗，羧基化磁珠清洗的方式为：取羧基化磁珠，用2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液清洗，再放在磁力架上，将羧基化磁珠聚集于试管底部，再用移液器吸弃上清，去除杂质。
优选地，所述2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液的pH值为6.5，浓度为0.05mol/L，清洗过程中所述2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液与所述羧基化磁珠的体积比为5:1。
优选地，步骤S1中所述羧基化磁珠的粒径为100-120nm，浓度为5mg/ml。
优选地，步骤S1中所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐试剂与所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:2，可以高效活化羧基。
优选地，步骤S1中所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐试剂与所述羧基化磁珠的质量比为1:9.8-10.2，优选为1:10；步骤S1中所述混匀的温度为20-25℃，时间为3-5h。
优选地，步骤S2中所述凝血酶与步骤S1中羧基化磁珠的投料比为50-100:200，所述凝血酶以ug计，所述羧基化磁珠以uL计；步骤S2中所述混匀的温度为20-25℃，时间为6-8h。
优选地，步骤S3中所述血清蛋白与步骤S2中凝血酶的质量比为1000:50-100。
优选地，步骤S4中得到凝血酶磁珠在4±0.5℃下放置保存。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述的凝血酶磁珠，无需进行开颅后颅内局部注射凝血酶、形成血栓等复杂操作，仅需远端静脉注射凝血酶磁珠，随后在需要形成血栓的局部放置磁铁，从而形成血栓，本发明能够更加方便、精确和高效地在形成体内血栓，提高了形成血栓位置的准确性。
(2)本发明所述的制备方法方便高效，可以很好地将凝血酶与磁珠相互结合。
(3)本发明所述的凝血酶磁珠，在注射体内之后，利用磁铁引导凝血酶到达相应的位置，可以使得血栓形成药物到达任何想要到达的地方。
附图说明
图1是本发明凝血酶磁珠的合成示意图；
图2是本发明凝血酶磁珠与磁铁吸引的示意图；
图3是本发明凝血酶磁珠的电镜图；
图4是本发明应用案例中凝血酶磁珠的应用过程图；
图5是本发明应用案例中手术过程的血栓形成图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种凝血酶磁珠，所述凝血酶磁珠为羧基化磁珠与凝血酶反应形成带凝血酶的磁珠，合成示意图见图1。
一种凝血酶磁珠的的制备方法包括以下步骤：
S1、磁珠清洗：取200uL羧基化磁珠，用1mL的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液清洗三遍，在磁力架上处理1min，将磁珠聚集于试管底部，用移液器吸弃上清，去除杂质；其中羧基化磁珠的粒径为100nm，浓度为5mg/mL，市售产品，品牌为阿拉丁；
S2、磁珠活化：将清洗后的羧基化磁珠通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐试剂与N-羟基琥珀酰亚胺试剂混合激活，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐试剂与N-羟基琥珀酰亚胺试剂的摩尔比为1:2，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐试剂与步骤S1中羧基化磁珠的质量比为1:10，后放置于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入混匀仪中在25℃下混匀5h，得到活化后的磁珠；
S3、凝血酶与活化磁珠链接：将活化后的磁珠用2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液清洗一遍，随后加入凝血酶80ug，加入混匀仪中在25℃下混匀8h，其中凝血酶为市售产品，品牌为索莱宝；
S4、封闭磁珠未连接的羧基：将S3制备得到的磁珠置于磁力架上，移液器弃去上清，同时加入2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液与1ml血清蛋白，封闭磁珠表面未结合的活性基团。
S5、清洗与保存：将S4制备得到的磁珠放置于磁力架上，弃去上清，加入磷酸缓冲盐溶液，得到凝血酶磁珠，得到凝血酶磁珠在4℃下放置保存，尽快使用。
清洗过程所用的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液的pH为6.5、浓度为0.05mol/L。
实施例2
S1、磁珠清洗：取200uL羧基化磁珠，用1mL的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液清洗三遍，在磁力架上处理1min，将磁珠聚集于试管底部，用移液器吸弃上清，去除杂质；其中羧基化磁珠的粒径为120nm，浓度为5mg/mL，市售产品，品牌为阿拉丁；
S2、磁珠活化：将清洗后的羧基化磁珠通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐试剂与N-羟基琥珀酰亚胺试剂混合激活，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐试剂与N-羟基琥珀酰亚胺试剂的摩尔比为1:2，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐试剂与步骤S1中羧基化磁珠的质量比为1:10，后放置于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入混匀仪中在25℃下混匀3h，得到活化后的磁珠；
S3、凝血酶与活化磁珠链接：将活化后的磁珠用2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液清洗一遍，随后加入凝血酶80ug，加入混匀仪中在25℃下混匀6h，其中凝血酶为市售产品，品牌为索莱宝；
S4、封闭磁珠未连接的羧基：将S3制备得到的磁珠置于磁力架上，移液器弃去上清，同时加入2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液与1ml血清蛋白，封闭磁珠表面未结合的活性基团。
S5、清洗与保存：将S4制备得到的磁珠放置于磁力架上，弃去上清，加入磷酸缓冲盐溶液，得到凝血酶磁珠，得到凝血酶磁珠在4℃下放置保存，尽快使用。
清洗过程所用的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液的pH为6.5、浓度为0.05mol/L。
图2是本发明凝血酶磁珠与磁铁吸引的示意图，将本发明实施例1制备得到的凝血酶磁珠放在磷酸盐缓冲溶液中，然后放置在玻璃瓶内，在玻璃瓶外放置磁铁，玻璃瓶内的凝血酶磁珠聚集在靠近磁铁的位置。
图3是本发明凝血酶磁珠的电镜图，显示出羧基化磁珠与凝血酶充分结合后，分散、粒径较为均匀。
应用案例：
将实施例1制备得到的凝血酶磁珠用于制作微创可溶栓的脑卒中模型，包括以下步骤：
小鼠麻醉：将小鼠放置于气麻机的麻醉诱导盒中，将异氟烷流量调制2％，待小鼠完全麻醉；
小鼠术前准备：将麻醉后的小鼠水平置于手术台上，放置恒温毯，温度设置为37℃，剔除颈部毛发，持续异氟烷吸入麻醉；
颈动脉暴露：从小鼠颈正中剪开一长约1cm刀口，将胸锁乳突肌牵开，暴露颈总动脉和颈分叉；
放置磁铁：将直径为2mm的圆形磁铁放置于颈总动脉下方，并用钛金属动脉瘤夹暂时夹闭颈外动脉；
尾静脉注射凝血酶磁珠:吸取凝血酶磁珠160ul，约0.80mg，注射入尾静脉；
血栓形成:在颈总动脉处聚集的磁珠与流动的血液形成血栓,需要3min；
血栓堵塞大脑中动脉：移去磁铁，镊子轻夹血栓，向上移动，进入脑动脉；
缝合皮肤，形成脑卒中模型。
图4是本发明应用案例中凝血酶磁珠的应用过程图，展示了实施例1制备的凝血酶磁珠注入小鼠的尾静脉，在总动脉处放置磁铁，使凝血酶磁珠在磁铁放置位置的颈总动脉内聚集，而后形成血栓。
图5是本发明应用实例手术过程中，将磁铁放入颈总动脉之后随着时间的推移，凝血酶磁珠在放置磁铁的位置聚集，在凝血酶的作用下，血栓慢慢在颈总动脉形成，颈总动脉放置磁铁处颜色变深，显示了本发明凝血酶磁珠所达成的效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种凝血酶磁珠，其特征在于，所述凝血酶磁珠为羧基化磁珠与凝血酶反应形成的带凝血酶的磁珠。
2.一种权利要求1所述的凝血酶磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.磁珠活化：将羧基化磁珠通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐试剂与N-羟基琥珀酰亚胺试剂混合激活，后放置于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，再进行混匀，得到活化后的磁珠；
S2.凝血酶与活化磁珠链接：将步骤S1中得到的活化后的磁珠用2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液清洗，随后加入凝血酶，再进行混匀；
S3.封闭磁珠未连接的羧基：将步骤S2中得到的磁珠放置于磁力架上，移液器弃去上清，同时加入2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液与血清蛋白；
S4.清洗与保存：将步骤S3中得到的磁珠放置于磁力架上，弃去上清，加入磷酸缓冲盐溶液，得到凝血酶磁珠。
3.根据权利要求2所述的凝血酶磁珠的制备方法，其特征在于，在磁珠活化之前对羧基化磁珠进行清洗，羧基化磁珠清洗的方式为：取羧基化磁珠，用2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液清洗，再放在磁力架上，将羧基化磁珠聚集于试管底部，再用移液器吸弃上清。
4.根据权利要求3所述的凝血酶磁珠的制备方法，其特征在于，所述2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液的pH值为6.5，浓度为0.05mol/L，清洗过程中所述2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液与所述羧基化磁珠的体积比为5:1。
5.根据权利要求2所述的凝血酶磁珠的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述羧基化磁珠的粒径为100-120nm，浓度为5mg/ml。
6.根据权利要求2所述的凝血酶磁珠的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐试剂与所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:2。
7.根据权利要求2所述的凝血酶磁珠的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐试剂与所述羧基化磁珠的质量比为1:9.8-10.2；步骤S1中所述混匀的温度为20-25℃，时间为3-5h。
8.根据权利要求2所述的凝血酶磁珠的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述凝血酶与步骤S1中羧基化磁珠的投料比为50-100:200，所述凝血酶以ug计，所述羧基化磁珠以uL计；步骤S2中所述混匀的温度为20-25℃，时间为6-8h。
9.根据权利要求2所述的凝血酶磁珠的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述血清蛋白与步骤S2中凝血酶的质量比为1000:50-100。
10.根据权利要求2所述的凝血酶磁珠的制备方法，其特征在于，步骤S4中得到凝血酶磁珠在4±0.5℃下放置保存。
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