CN104614531A - 脂环酸芽孢杆菌金标测试条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脂环酸芽孢杆菌金标测试条，包括衬板，其特征在于：所述衬板上附有双面胶层，其一端设有手持端吸水层，其另一端设有测试端吸水层；所述手持端吸水层与所述测试端吸水层之间的所述衬板上依次设有检测层、抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层；所述检测层的一端与所述手持端吸水层相粘附，其另一端则与所述抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层相粘附，该抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层与所述测试端吸水层相粘附；所述检测层上沿样品流动方向依次设有检测线、控制线；所述手持端吸水层与所述测试端吸水层上均设有单面胶保护层。本发明还公开了该脂环酸芽孢杆菌金标测试条的制备方法。本发明具有特异性强、灵敏度高、操作简便的特点。

Description

脂环酸芽孢杆菌金标测试条及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种金标测试条及其制备方法，尤其涉及脂环酸芽孢杆菌金标测试条及其制备方法。
背景技术
对于脂环酸芽孢杆菌属的检测和鉴定主要是常规的传统检测方法以及现代检测方法，通常采用两种方法相结合来进行检测和鉴定。传统方法包括待测菌的形态特征、生长温度范围等生理生化特性等，但传统方法检测指标多、程序复杂、耗时等缺点致使检测结果滞后，无法快速指导生产并向生产线反馈信息以采取相应的防范和控制措施。另外，各种推荐的方法不尽相同，结果也存在一定的差异，因此，亟需创建一种既快速又特异性好的检测方法，为果汁生产厂家提供一种从原料到产品的全程检测，达到及时指导生产、控制脂环酸芽孢杆菌污染的目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、操作简便的脂环酸芽孢杆菌金标测试条。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供该脂环酸芽孢杆菌金标测试条的制备方法。
为解决上述问题，本发明所述的脂环酸芽孢杆菌金标测试条，包括衬板，其特征在于：所述衬板上附有双面胶层，其一端设有手持端吸水层，其另一端设有测试端吸水层；所述手持端吸水层与所述测试端吸水层之间的所述衬板上依次设有检测层、抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层；所述检测层的一端与所述手持端吸水层相粘附，其另一端则与所述抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层相粘附，该抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层与所述测试端吸水层相粘附；所述检测层上沿样品流动方向依次设有检测线、控制线；所述手持端吸水层与所述测试端吸水层上均设有单面胶保护层。
所述手持端吸水层由多层滤纸制成。
所述测试端吸水层由无纺布制成。
所述检测线为以线形包被纯化的抗脂环酸芽孢杆菌单抗。
所述抗脂环酸芽孢杆菌单抗是通过下述步骤制得：采用常规技术将来自于脂环酸芽孢杆菌模式菌株ATCC 49025免疫接种Balb/C小鼠的脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合，选择产生所需抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞；再将杂交瘤细胞克隆得单克隆抗体。
所述控制线为以线形包被纯化的羊抗鼠IgG抗体。
所述检测层由纤维素膜制成。
如上所述的脂环酸芽孢杆菌金标测试条的制备方法，包括以下步骤：
⑴制备胶体金：
在质量浓度为0.01~0.03%的氯金酸中加入其体积0.8~1%且浓度为1%的柠檬酸三钠，煮沸10~20分钟，还原制成15~50纳米的胶体金溶液；
⑵制备抗脂环酸芽孢杆菌胶体金溶液：
在100ml所述胶体金溶液中加入2~10mg抗脂环酸芽孢杆菌抗体，混合均匀后以2000转/分的速率离心10min，得到上清液，该上清液再以10000转/分的速率离心1h，得到沉淀物；将1000ml所述沉淀物溶于4~10ml  0.02M、pH=7.4的Tris-HCl液中，得到含0.1~0.6%动物血清白蛋白、0.02%叠氮钠的抗脂环酸芽孢杆菌抗体的胶体金溶液；所述抗脂环酸芽孢杆菌抗体是指抗脂环酸芽孢杆菌单抗；
⑶将所述抗脂环酸芽孢杆菌胶体金溶液浸着无纺布，浸入量以浸入液体开始向外流出为止，然后在37℃下干燥至恒重，即得抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层；
⑷制备检测层：
将浓度为1~2mg/ml的抗脂环酸芽孢杆菌单抗和浓度为1~2mg/ml的羊抗鼠IgG抗体喷在纤维素膜上形成检测线和控制线，最后在37℃下干燥至恒重，即得检测层；
⑸在附有双面胶层的塑料制成的衬板的中段粘贴所述检测层，该衬板的两端分别黏贴多层滤纸制成的手持端吸水层和无纺布制成的测试端吸水层；然后在所述测试端吸水层与所述检测层之间夹贴所述抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层，其中该抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层的4/5部分夹在所述测试端吸水层，1/5部分压在所述检测层上；最后，在所述手持端吸水层和所述测试端吸水层上附上单面胶保护层，即得。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明是以脂环酸芽孢杆菌属的模式菌株ATCC 49025单克隆抗体为基础，采用免疫层析技术和胶体金显色原理设计而成的试纸条，其制备方法简单、成本低廉，稳定性、重复性好，使用时，快捷迅速、安全简便。
2、本发明与其他技术相比，检测成本较低，检测周期短，操作人员只需简单培训即可掌握检测要领，结果判定在3~15分钟内完成，无需特殊仪器和实验条件，这对于提高企业对该菌的检测水平和缩短检测时间具有很强的实用价值。
3、由于本发明的单克隆抗体是以一个淋巴细胞接受一个抗原决定簇刺激，经刺激后扩增的淋巴细胞产生均一的同质抗体，因此，特异性强、灵敏度高。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明的分解结构图。
图中：1—手持端吸水层  2—检测层  3—抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层   4—测试端吸水层    5—控制线    6—检测线    7—衬板   8—双面胶层9—单面胶保护层。
具体实施方式
如图1所示，脂环酸芽孢杆菌金标测试条，包括衬板7。衬板7上附有双面胶层8，其一端设有手持端吸水层1，其另一端设有测试端吸水层4；手持端吸水层1与测试端吸水层4之间的衬板7上依次设有检测层2、抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层3；检测层2的一端与手持端吸水层1相粘附，其另一端则与抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层3相粘附，该抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层3与测试端吸水层4相粘附；检测层2上沿样品流动方向依次设有检测线6、控制线5；手持端吸水层1与测试端吸水层4上均设有单面胶保护层9。
其中：
手持端吸水层1由多层滤纸制成。
测试端吸水层4由无纺布制成。
检测线6为以线形包被纯化的抗脂环酸芽孢杆菌单抗。抗脂环酸芽孢杆菌单抗是通过下述步骤制得：采用常规技术将来自于脂环酸芽孢杆菌模式菌株ATCC 49025免疫接种Balb/C小鼠的脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合，选择产生所需抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞；再将杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中，采用有限稀释法进行克隆，筛选得到克隆孔均呈抗体阳性且抗体滴度稳定的杂交瘤细胞系；最后将杂交瘤细胞系转移到细胞培养瓶中培养，然后按常规方法采用大瓶旋转培养法或同系小鼠体内诱生法进行单克隆抗体生产即得单克隆抗体。
控制线5为以线形包被纯化的羊抗鼠IgG抗体。
检测层2由纤维素膜制成。
该脂环酸芽孢杆菌金标测试条的制备方法，包括以下步骤：
⑴制备胶体金：
在质量浓度为0.01~0.03%的氯金酸中加入其体积0.8~1%且浓度为1%的柠檬酸三钠，煮沸10~20分钟，还原制成15~50纳米的胶体金溶液；
⑵制备抗脂环酸芽孢杆菌胶体金溶液：
在100ml胶体金溶液中加入2~10mg抗脂环酸芽孢杆菌抗体，混合均匀后以2000转/分的速率离心10min，得到上清液，该上清液再以10000转/分的速率离心1h，得到沉淀物；将1000ml沉淀物溶于4~10ml  0.02M、pH=7.4的Tris-HCl液中，得到含0.1~0.6%动物血清白蛋白、0.02%叠氮钠的抗脂环酸芽孢杆菌抗体的胶体金溶液；抗脂环酸芽孢杆菌抗体是指抗脂环酸芽孢杆菌单抗；
⑶将抗脂环酸芽孢杆菌胶体金溶液浸着无纺布，浸入量以浸入液体开始向外流出为止，然后在37℃下干燥至恒重，即得抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层3；
⑷制备检测层2：
将浓度为1~2mg/ml的抗脂环酸芽孢杆菌单抗和浓度为1~2mg/ml的羊抗鼠IgG抗体喷在纤维素膜上形成检测线6和控制线5，最后在37℃下干燥至恒重，即得检测层2；
⑸在附有双面胶层8的塑料制成的衬板7的中段粘贴检测层2，该衬板7的两端分别黏贴多层滤纸制成的手持端吸水层1和无纺布制成的测试端吸水层4；然后在测试端吸水层4与检测层2之间夹贴抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层3，其中该抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层3的4/5部分夹在测试端吸水层4，1/5部分压在检测层2上；最后，在手持端吸水层1和测试端吸水层4上附上单面胶保护层9，即得。

Claims (8)

1.脂环酸芽孢杆菌金标测试条，包括衬板（7），其特征在于：所述衬板（7）上附有双面胶层（8），其一端设有手持端吸水层（1），其另一端设有测试端吸水层（4）；所述手持端吸水层（1）与所述测试端吸水层（4）之间的所述衬板（7）上依次设有检测层（2）、抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层（3）；所述检测层（2）的一端与所述手持端吸水层（1）相粘附，其另一端则与所述抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层（3）相粘附，该抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层（3）与所述测试端吸水层（4）相粘附；所述检测层（2）上沿样品流动方向依次设有检测线（6）、控制线（5）；所述手持端吸水层（1）与所述测试端吸水层（4）上均设有单面胶保护层（9）。
2.如权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌金标测试条，其特征在于：所述手持端吸水层（1）由多层滤纸制成。
3.如权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌金标测试条，其特征在于：所述测试端吸水层（4）由无纺布制成。
4.如权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌金标测试条，其特征在于：所述检测线（6）为以线形包被纯化的抗脂环酸芽孢杆菌单抗。
5.如权利要求4所述的脂环酸芽孢杆菌金标测试条，其特征在于：所述抗脂环酸芽孢杆菌单抗是通过下述步骤制得：采用常规技术将来自于脂环酸芽孢杆菌模式菌株ATCC 49025免疫接种Balb/C小鼠的脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合，选择产生所需抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞；再将杂交瘤细胞克隆得单克隆抗体。
6.如权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌金标测试条，其特征在于：所述控制线（5）为以线形包被纯化的羊抗鼠IgG抗体。
7.如权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌金标测试条，其特征在于：所述检测层（2）由纤维素膜制成。
8.如权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌金标测试条的制备方法，包括以下步骤：
⑴制备胶体金：
在质量浓度为0.01~0.03%的氯金酸中加入其体积0.8~1%且浓度为1%的柠檬酸三钠，煮沸10~20分钟，还原制成15~50纳米的胶体金溶液；
⑵制备抗脂环酸芽孢杆菌胶体金溶液：
在100ml所述胶体金溶液中加入2~10mg抗脂环酸芽孢杆菌抗体，混合均匀后以2000转/分的速率离心10min，得到上清液，该上清液再以10000转/分的速率离心1h，得到沉淀物；将1000ml所述沉淀物溶于4~10ml  0.02M、pH=7.4的Tris-HCl液中，得到含0.1~0.6%动物血清白蛋白、0.02%叠氮钠的抗脂环酸芽孢杆菌抗体的胶体金溶液；所述抗脂环酸芽孢杆菌抗体是指抗脂环酸芽孢杆菌单抗；
⑶将所述抗脂环酸芽孢杆菌胶体金溶液浸着无纺布，浸入量以浸入液体开始向外流出为止，然后在37℃下干燥至恒重，即得抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层（3）；
⑷制备检测层（2）：
将浓度为1~2mg/ml的抗脂环酸芽孢杆菌单抗和浓度为1~2mg/ml的羊抗鼠IgG抗体喷在纤维素膜上形成检测线（6）和控制线（5），最后在37℃下干燥至恒重，即得检测层（2）；
⑸在附有双面胶层（8）的塑料制成的衬板（7）的中段粘贴所述检测层（2），该衬板（7）的两端分别黏贴多层滤纸制成的手持端吸水层（1）和无纺布制成的测试端吸水层（4）；然后在所述测试端吸水层（4）与所述检测层（2）之间夹贴所述抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层（3），其中该抗脂环酸芽孢杆菌金标抗体层（3）的4/5部分夹在所述测试端吸水层（4），1/5部分压在所述检测层（2）上；最后，在所述手持端吸水层（1）和所述测试端吸水层（4）上附上单面胶保护层（9），即得。
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