CN102876634A

CN102876634A - 孕马血清促性腺激素双抗体夹心elisa试剂盒

Info

Publication number: CN102876634A
Application number: CN2012103510350A
Authority: CN
Inventors: 韩国才; 苏晓倩; 邓亮
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2012-09-19
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-09-19
Also published as: CN102876634B

Abstract

本发明提供了一种孕马血清促性腺激素（PMSG）单克隆抗体杂交瘤细胞株D-3和A-4，其保藏编号为CGMCC No.6450和CGMCCNo.6449。本发明还提供PMSG双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其包括：包被PMSG单克隆抗体的酶标板、酶标记的PMSG单克隆抗体，捕获抗体和检测抗体分别针对PMSG蛋白不同的抗原决定簇。本发明检测试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测定性快、定量准、重现性好等特点，并能对成品制剂进行标准校对，与现有商品化PMSG检测试剂盒相比，费用低、检测灵敏度高，且检测PMSG最低检测限为30mIU/ml，检测范围在30~200mIU，适合推广应用。

Description

孕马血清促性腺激素双抗体夹心ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及一种ELISA检测试剂盒，具体地说是一种检测孕马血清促性腺激素的双抗体夹心ELISA试剂盒。

背景技术

孕马血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotrophin PMSG)又称马绒毛膜促性腺激素(equine chorionic gonadotropin，eCG)。PMSG是从怀孕40-120天母马血液中提纯的一种糖蛋白激素，是一种经济实用的促性腺激素，在生产上常用以代替较昂贵的促卵泡素（FSH）而广泛应用于动物的诱发发情、超数排卵或增加排卵率(如提高双羔率)；对卵巢发育不全或雄性生精能力衰退等也都可收到一定疗效。由于孕马血清中PMSG的含量受多种因素的影响，不同妊娠期、不同品种、同一品种不同年龄及胎次等都对其影响较大。因此在用血清提纯PMSG之前，能对血清中PMSG效价进行检测，对于生产提纯具有重要的指导意义。

综合生殖激素的检测方法有多种多样，主要有放射性免疫分析法、免疫胶体金检测法、酶联免疫分析法(ELISA)、反向间接血凝法、色谱技术、化学发光技术及生物传感器技术等。目前，我国关于PMSG的检测有3种方法。其一是大鼠卵巢增重法，该法是依据《中华人民共和国兽药规范》（1993）血促性素（孕马血清促性腺激素PMSG）生物检定法，采用PMSG能促进大鼠卵巢增长的原理，将不同浓度的标准品注入相同来源的大鼠体内，根据卵巢增重情况绘制标准曲线，再将同体积待检样品注入同系相同生理状况的大鼠体内，测定其卵巢增重从而确定激素含量。由于该法灵敏度低、实验周期长、饲养实验动物变数大、影响因素较多，不易于生产与科研中推广应用。其二是反向间接血凝法，该法的原理是将纯化的PMSG抗体吸附到双醛化得羊红血球表面，遇到相应抗原，血球即被动凝集，按完全凝集孔样本的稀释倍数即可得到抗原的血凝效价。此法虽达到快速检测目的，但不同批次醛化红血球差异大，且抗体纯度要求高，质量要求均一，导致测定结果的差异大，也不适于生产应用。其三是放射性免疫检测法，使放射性标记抗原和未标记抗原（待测物）与不足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。此法快速准确，样品需要量少，但由于此种方法具有高度放射性，对操作人员健康有害，同时检测所需的仪器较昂贵，也不利于推广应用。另外免疫胶体金检测法只能实现定性和半定量检测，目前阶段不宜推广使用。色谱技术、化学发光技术及生物传感器技术同样也可以用于激素检测，但由于其检测条件的限制性，在试验室中作为科研检测方法可以应用，但不适合于野外检测，对实际生产的指导意义不大。

ELISA凭借其高度的灵敏度、良好的特异性、检测速度及低检测成本等优势已被广泛应用于生物、化学、医学、环境科学等学科的分析检测中。近年来，随着生物医学的研究进展，免疫学以其独特的优势有力的推动了医学和生物学中各个领域的发展。目前美国DRG公司生产的孕马血清促性腺激素快速检测试剂盒，能够在短短几个小时内完成多个样品的检测，准确省时。但由于进口价格昂贵，一个96孔检测板需要花费1800~2000元，同时由于DRG公司生产的试剂盒检测范围为0-80IU，国内有些马种的最高含量达到140IU，超出了其检测范围，因此急需建立一种快速、准确、省时、简便易操作的检测PMSG含量的方法并研制试剂盒，解决进口昂贵、检测范围窄的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种孕马血清促性腺激素单克隆抗体。

本发明的目的之二在于提供一种用于检测孕马血清促性腺激素的双抗体夹心ELISA试剂盒，以克服上述不足。

本发明提供一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体杂交瘤细胞株D-3，其保藏编号为CGMCC No.6450。

本发明提供一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体杂交瘤细胞株A-4，其保藏编号为CGMCC No.6449。

杂交瘤细胞株D-3和A-4已于2012年9月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101）保藏，分类命名为杂交瘤细胞，保藏号分别为CGMCC No.6450和CGMCCNo.6449。

本发明提供的一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体，是由杂交瘤细胞株D-3或A-4分泌获得，所述杂交瘤细胞株D-3的保藏编号为CGMCC No.6450，所述杂交瘤细胞株A-4的保藏编号为CGMCCNo.6449。

本发明提供一种用于检测PMSG的试剂、药剂或试剂盒，其包括上述的PMSG单克隆抗体。

本发明提供一种检测PMSG的方法，包括使用上述的PMSG单克隆抗体。

本发明还提供了上述PMSG单克隆抗体在制备检测PMSG试剂盒中的应用。

本发明提供了一种检测孕马血清促性腺激素PMSG的双抗体夹心ELISA试剂盒，其包括：

（1）包被PMSG单克隆抗体的酶标板；

（2）酶标记的PMSG单克隆抗体；

其中，包被在酶标板的PMSG单克隆抗体与酶标记PMSG单克隆抗体分别针对PMSG蛋白不同的抗原决定簇。

进一步地，本发明试剂盒中包被在酶标板的PMSG单克隆抗体与酶标记PMSG单克隆抗体分别为杂交瘤细胞株D-3或A-4分泌获得。

优选地，所述包被在酶标板的PMSG单克隆抗体为杂交瘤细胞株D-3分泌获得，酶标记PMSG单克隆抗体为杂交瘤细胞株A-4分泌获得。所述杂交瘤细胞株D-3的保藏编号为CGMCC No.6450，所述杂交瘤细胞株A-4的保藏编号为CGMCC No.6449。

本发明提供的PMSG试剂盒，还包括以下试剂中的一种或多种：洗涤液、酶标抗体稀释液、底物显色液、终止液、PMSG标准品。

本发明的试剂盒中，酶标记PMSG单克隆抗体的标记酶为辣根过氧化物酶，具体标记方法包括如下步骤：取5mg的HRP溶于1mL三蒸水，加入新鲜配制的0.1mol/L NaIO₄ 0.2mL，室温下避光搅拌20min，混匀后装入透析袋中，以0.001mol/L pH 4.4醋酸钠缓冲液4℃透析过夜，加20μL0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲溶液，使pH升高到9.0-9.5，加入含有10mg纯化PMSG单克隆抗体IgG 1mL，混匀后装入预先活化的透析袋中，以0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析过夜，使辣根过氧化物酶与抗体充分结合，取出透析袋中的液体，加入4mg/mL的硼氢化钠100μL，置4℃还原6-8小时，加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置过夜，3000rpm，离心10min，将所得的沉淀溶于1ml 0.01mol/L的PBS中，装入透析袋中以0.01mol/L的PBS透析过夜充分除去硫酸铵，透析24-36h，离心除去沉淀，即得纯化酶标记抗体。

本发明试剂盒中，PMSG单克隆抗体的包被方法是：将12.44μg/mL的单克隆抗体按100μL/孔加入到酶标板中，37℃孵育2h，用含0.05%吐温-20和0.05%叠氮化钠，ph7.4的0.02M磷酸盐缓冲液PBST溶液洗涤。

本发明检测孕马血清促性腺激素试剂盒可以弥补国内生物检定方法的不足。仅需要几个小时就能测得结果，相对于生物检定法需要5天左右时间具有明显时间优势；相对于操作过程来说，本试验仅需要简单加样，而且一块96孔微量板可以检测80-90个样品，远比生物法操作简单易行；本试验方案耗费材料少，用量都在微量水平，每个样品检测成本为10~15元，更适合于生产应用。运用本发明检测试剂盒检测PMSG最低检测限为30mIU/ml，检测范围在30~200mIU。本发明为生产中PMSG的快速检测提供了可靠的手段。本发明试剂盒便于操作、使用成本低、稳定性和重复性好，适合大规模推广应用。

附图说明

图1为5只BALB/c系小鼠免疫PMSG后的抗血清吸光度图。

图2为不同酶标板条的标准曲线，其中横坐标上的1-6分别代表标准品的浓度0、30、90、271、810、2430mIU，纵坐标为吸光度值。

图3为酶标抗体不同工作浓度的标准曲线图。

图4标准曲线图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1孕马血清促性腺激素单克隆抗体的制备及鉴定

1材料

1.1实验动物BALB/c小鼠购自北京维通利华试验动物公司；小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0购自中科院动物所。

1.2主要仪器和试剂酶标仪MK3购自热电公司；酶标板购自Nunc公司；细胞培养板购自Coster公司。弗氏完全佐剂（FCA）和弗氏不完全佐剂（FIA）由北京勤邦生物技术有限公司提供；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥公司；PMSG纯品、HAT和HT选择培养基等购自Sigma公司；胎牛血清购自Hyclone公司；其他常规化学试剂购自北京化学试剂公司，除特殊说明外均为分析纯。

2方法

2.1动物免疫

取PMSG提纯品作为免疫原，分别用PBS（0.01mol/L，pH7.2）稀释至1mg/mL左右备用。免疫小鼠时，取免疫原与等量的弗氏佐剂，制成乳化剂，按照下表的免疫程序免疫6-8周龄BALB/c小鼠5只（分别编号为1#、2#、3#、4#、5#），每只小鼠100μL，免疫间隔为2周。三免后第7天，小鼠尾部采血，室温静置1h，4℃过夜，10000rpm离心10min，收集血清，4℃保存。

表1BALB/c小鼠的免疫方案

Figure 2012103510350100002DEST_PATH_IMAGE001

2.2抗血清效价检测

（1）包被抗原（PMSG）用包被液作系列稀释，每一行为一个稀释度，加入96孔板中，100μL/孔，4℃过夜。弃液，洗涤液洗涤3次，用吸水纸拍干，每次3min;

（2）加明胶封闭液，200μL/孔，37℃放置2h，洗涤同上；

（3）将待测血清样品作倍比稀释，每一个列为一个稀释度加入96孔板，100μL/孔，同时设阴性对照、空白对照，37℃放置0.5h，洗涤同上；

（4）用稀释液将酶标二抗按1:5000稀释，100μL/孔，37℃反应0.5h，洗涤同上；

（5）然后加新配置的底物100μL/孔，同样温度下反应15min;后加终止液，50μL/孔，并检测OD值。

2.3细胞融合及建株

（1）脾脏细胞和饲养细胞的制备取达到免疫效果的小鼠短颈处死，用酒精消毒后，在无菌条件下取出脾脏，磨碎，过50目的筛网，加入到含有生理盐水的培养皿中，用吸管打散细胞团。将上清液转移至15ml离心管中，静置后弃上清。用盐水悬浮沉降的细胞，取少许检查其活力。同系小鼠取其巨噬细胞作为饲养细胞。

（2）细胞融合取分别用二甲基亚砜（DMSO）悬浮的已处理好的免疫小鼠的脾细胞与同系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0按10:1进行融合，融合剂为聚乙二醇（PEG）。将融合后的细胞加入HAT和HT培养液后分种于已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，每天观察并记录细胞生长情况。融合后第3天每孔用HAT培养液半量换液，融合后第7、10天改用HT培养液半量换液，后改用含有15%胎牛血清的细胞生长培养液换液。

2.4阳性细胞株的筛选及克隆

通过选择培养基的作用，骨髓瘤细胞和脾细胞等未融合或未有效融合的细胞将无法生长，而有效融合的杂交瘤细胞将在培养孔内生长、增殖，并分泌抗体。参照《体外培养的原理与技术》，融合后第10-14天取细胞上清进行ELISA检测，显示阳性的培养孔内的细胞采用有限稀释法进行克隆化培养，直到检测到阳性的单克隆细胞为止，扩大培养后冻存细胞及制备腹水。

2.5单克隆抗体的鉴定

2.5.1单抗识别表位的初步分析

采用测相加指数法，PMSG纯品以3μg/mL浓度包被酶标板，洗涤后封闭，洗涤后分别加入饱和稀释度的单抗，37℃作用30min，洗涤后每孔分别两两组合加入另一株单抗，37℃作用30min，洗涤后加入工作浓度的HRP标记羊抗鼠二抗，37℃作用30min，洗涤后显色测定OD_450nm值。按如下公式计算两种单克隆抗体叠加后的AI值：

AI=（A1.2-A1）／A2×100%（A1.2：表示2株单抗叠加后的OD值；A1：表示第1株单抗自身叠加的OD值；A2：表示第2株单抗自身叠加的OD值）。

当两两抗体叠加之后的AI值大于30%认为两株单抗识别不同位点。

2.5.2杂交瘤细胞腹水中单克隆抗体效价的测定

2.5.3免疫印迹（Western blotting）试验

2.6单克隆抗体的大量生产

克隆化的杂交瘤细胞在体外和体内都能产生抗体，但只有满足最适条件才能达到最高产量。本试验采用体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体，即选择BALB/c系小鼠于腹腔注射0.5mL的石蜡油，1-2周后再按10⁶个/mL的细胞数腹腔注射0.5mL稳定的杂交瘤细胞。待腹腔肿胀时，收集腹水。由于腹水中含有其他未知蛋白，必须用盐析法或过蛋白质G柱纯化抗体后才能用于ELISA检测。

2.7抗体特异性检测及交叉反应性比较

采用间接ELISA法检测抗体的特异性及与垂体分泌的促卵泡素（FSH）、促黄体生成素（LH）的交叉反应性。

2.8单克隆抗体的亲和常数的测定

相对亲和力的测定参照徐志凯（实用单克隆抗体技术，1991，细胞与分子免疫学杂志）介绍的间接ELISA方法来进行。

2.9杂交瘤细胞系分泌单抗的稳定性检测

3结果

3.1小鼠抗血清的效价

用PMSG免疫的BALB/c系小鼠共5只，尾部采血进行抗血清效价的检测，根据测得的OD值绘制小鼠免疫反应的敏感性，结果见图1。图1表明，5只小鼠注射PMSG后，抗血清均按1:1000稀释后，第一次采血检测1#、4#小鼠血清免疫反应吸光度值都达到了1.0以上，其中1#小鼠免疫反应更敏感，因此取1#小鼠的脾细胞与同系小鼠的骨髓瘤细胞进行融合。

3.2阳性细胞株的筛选

本发明共获得稳定分泌抗PMSG单克隆抗体的杂交瘤细胞株8株。间接ELISA法检测细胞上清结果显示其OD值都在1.0以上，有的甚至达到2.0以上（表2）。在克隆化培养过程中，其OD值都呈稳定升高趋势，说明杂交瘤细胞株分泌抗体的稳定性良好。最终获得了8株能稳定分泌PMSG单克隆抗体的细胞株，命名为杂交瘤细胞。其中选择杂交瘤细胞A-4和D-3于2012年9月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为杂交瘤细胞，保藏号为分别为CGMCC No.6449和CGMCC No.6450。

表2细胞克隆及筛选OD值

Figure 2012103510350100002DEST_PATH_IMAGE002

注：“-”代表当观察到细胞培养孔中的细胞为单细胞，故停止克隆，进行扩大培养，下同，表中细胞株编号2对应的是A-4杂交瘤细胞株，3对应的是D-3杂交瘤细胞株。

3.3单抗识别表位

采用测相加指数法测定单克隆抗体的抗原识别表位。经过计算在A-4和D-3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能识别PMSG蛋白的不同表位。

3.4免疫印迹（Western blotting）试验

以D-3、A-4的腹水为一抗，HRP-羊抗鼠IgG为二抗进行Western blotting鉴定，结果显示，2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能特异性的识别PMSG。

3.5腹水的效价

上述8株细胞株均能稳定分泌抗抗PMSG单克隆抗体，计算阳性吸光度值与阴性吸光度比值即P/N，大于2.1的最大稀释倍数即为抗体对应的效价，由表中可知经检测其抗体效价均在10^-5以上（表3）。表中杂交瘤细胞株D-3对应的编号为3，杂交瘤细胞株A-4对应的编号为2。

表3腹水效价

注：由于试验中阳性腹水的效价很高，稀释到10⁵倍时阳性血清的OD值仍然远远大于阴性对照P/N>>2.1，因此“-”表示稀释到使阳性血清OD值为1.0左右时不再对其稀释。

3.6抗体特异性及交叉反应

8株细胞株的细胞培养上清液与PMSG反应的OD值均在1.0以上，说明获得的细胞株分泌抗体的能力较强；与FSH反应OD值均在0.1以下，可视为无交叉；与LH反应OD值有微弱交叉，但因LH在马血液内含量很微弱（Evans et al.,1976），可忽略其影响。

表4抗PMSG单克隆抗体与FSH和LH交叉反应

Figure 2012103510350100002DEST_PATH_IMAGE003

Figure 2012103510350100002DEST_PATH_IMAGE004

3.7单克隆抗体的亲和常数的测定

经间接ELISA得到2株单克隆抗体（D-3、A-4杂交瘤细胞株分泌）与不同浓度PMSG的反应曲线，以曲线平坦段的OD值计算为100%，得到OD值为50%时所对应点的浓度［Ab］t，再根据亲和常数计算公式就可以得到2株单抗的亲和常数分别为8.35×10¹⁰、7.55×10¹⁰。

3.8杂交瘤细胞系分泌单抗的稳定性检测

分别在3个月和10个月后，从液氮中取出冻存的杂交瘤细胞株复苏，扩大培养后，制备腹水，进行间接ELISA检测。结果表明D-3株和A-4株分泌的单克隆抗体的上清效价都达到了1:5×10⁵，腹水的效价没有降低，表明单克隆细胞株分泌抗体的活性没有降低，稳定性良好。

实施例2孕马血清促性腺激素ELISA检测方法的建立

1材料

1.1PMSG单克隆抗体

1.2耗材

PMSG标准品购自美国Sigma公司，酶标板，购自美国costar公司；底物A、B液，购自北京望尔生物技术有限公司；辛酸，北京金龙化学试剂有限公司；饱和硫酸铵、乙二醇、硼氢化钠，北京化学试剂有限公司；辣根过氧化物酶（HRP），购自北京中杉金桥公司；高碘酸钠NaIO₄，购自汕头市西陇化工厂有限公司。

2.方法

2.1单克隆抗体腹水的制备与纯化

常规方法制备8株杂交瘤细胞的腹水。利用辛酸-饱和硫酸铵法进行IgG纯化。

(1)饱和硫酸铵溶液的配制：称取500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取适量饱和硫酸铵溶液，用2mol/L NaOH调pH至7.8。

(2)盐析：吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟后弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L pH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。

(3)脱盐：采用透析法脱盐。先将透析袋于2%NaHCO₃，1mmol/LEDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（或放于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存备用）。将盐析样品装入透析袋中，用50-100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析（4℃）12-24小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂（碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20%NaOH50ml）检测，直至透析外液无黄色物形成为止。

(4)蛋白含量的检测：

（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀）×稀释倍数

2.2酶标单克隆抗体的制备及鉴定

2.2.1过碘酸钠法酶标

取5mg的HRP溶于1mL三蒸水，加入新鲜配制的0.1mol/L NaIO₄0.2mL，室温下避光搅拌20min，混匀后装入透析袋中，以0.001mol/L pH4.4醋酸钠缓冲液4℃透析过夜，加20μL 0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲溶液，使pH升高到9.0-9.5，加入含有10mg纯化PMSG单克隆抗体IgG1mL，混匀后装入预先活化的透析袋中，以0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析过夜，使辣根过氧化物酶与抗体充分结合，取出透析袋中的液体，加入4mg/mL的硼氢化钠100μL，置4℃还原6-8小时，加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置过夜，3000rpm，离心10min，将所得的沉淀溶于1ml 0.01mol/L的PBS中，装入透析袋中以0.01mol/L的PBS透析过夜充分除去硫酸铵，透析24-36h，离心除去沉淀，即得纯化酶标记抗体。加50%甘油混匀，置-20℃保存。

2.2.2戊二醛法酶标

戊二醛法的原理是利用戊二醛的双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜；反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中；用1M pH9.5碳酸盐缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时；加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时；在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时；3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中；将上述溶液装入透析袋中，对0.15M pH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。

2.2.3酶标抗体的验证

采用间接ELISA方法对上述两种方法制备的酶标抗体进行验证，确定其是否标记成功。操作步骤如下：

将PMSG标准品用碳酸盐缓冲液梯度稀释后，加入酶标板孔，每孔100μl，37℃孵育2h后，取出洗板1次；每孔加入封闭液150μl，37℃温育2h后，取出甩干备用；分别将制备好的酶标抗体梯度稀释后，加入已做好标记的包被有抗原的酶标板孔内，每孔100μl，同时设置阴性对照和空白对照，37℃反应30min后，取出洗板4-5次；每孔加底物显色液A液和B液各50μl，37℃反应15min；每孔加终止液50μl，在酶标仪上测其450nm和630nm的吸光度值。

2.3夹心配对抗体的选择

采用棋盘法进行单克隆抗体和酶标抗体的配对试验，操作步骤如下：

将纯化得到的8株单克隆抗体稀释至适当的倍数后，按照酶标抗体验证中的a和b的包板步骤进行包被；

将PMSG标准品稀释至适当倍数后，加入已包被有抗体的酶标板孔中，每孔50μl，随即每孔加入梯度稀释好的酶标抗体，37℃反应1h后，取出洗板4-5次；

每孔加底物显色液A液和B液各50μl，37℃反应15min后；每孔加终止液50μl，在酶标仪上测其450nm和630nm的吸光度值。

2.4不同抗体夹心法的筛选

分别用上述介绍的过碘酸钠法和戊二醛法多制备的多抗进行了酶标记，并与上步筛选出的最佳配对抗体进行比较，确定双抗夹心法是用单抗-单抗夹心还是用单抗-多抗夹心。

2.5包被工艺的确定

2.5.1酶标板的筛选

选取了6种酶标板，1-6号酶标板均为聚苯乙烯（PS）材质，其来源和货号分别为：1.怡佳美公司，货号为：改20；2.NUNC公司，货号为446469；3-5为厦门云鹏公司，货号分别为96THA-Y6，AT146，BT146，6.金灿华公司，货号106-004。将标准品按3倍的梯度绘制标准曲线，并用质控的阳性样本进行符合试验，筛选效果最好的酶标板。

2.5.2封闭液的筛选

选取了6种封闭液，1-6号封闭液分别为：1号：PBS加5%酪蛋白；2号：PBS加1%牛血清白蛋白；3号：PBS加5%明胶；4号：PBS加1%脱脂乳粉；5号：PBS加5%脱脂乳粉；6号：PBS加3%脱脂乳粉。1-6种封闭液所用的PBS均为pH为7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液。先将酶标抗体梯度稀释后，分别测了0标准品和7.68IU标准品的抑制情况，初步筛选出几种比较好的封闭液，继而检测标准曲线，确定效果最好的封闭液。

2.5.3包被液的筛选

选取了6种包被缓冲液，1-6号包被缓冲液分别为：1号：pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；2号：pH9.6，0.04mol/L的碳酸盐缓冲液；3号：pH6.0，0.02mol/L的磷酸盐缓冲液；4号：pH8.0，0.02mol/L的磷酸盐缓冲液；5号：pH7.2，0.02mol/L的磷酸盐缓冲液；6号：pH7.2，0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。检测标准曲线，筛选效果较好的包被缓冲液。

2.5.4包被抗体浓度的筛选

将2.3项中筛选出的配对的包被抗体用PBS按1：1000、1:2000、1:4000和1:8000梯度稀释后进行包板，酶标抗体用PBS稀释20000倍后，带0标准品（不含标准品的缓冲液溶液）和2.43IU标准品，确定包被抗体的最佳工作浓度。

2.6酶标抗体浓度的筛选

在预试验的基础上，将酶标抗体用PBS分别稀释20000、40000和80000倍，检测标准曲线，筛选酶标抗体的最佳工作浓度。

2.7酶标抗体稀释液的筛选

在预试验的基础上选取5种酶标抗体稀释液的种类，1-5号稀释液分别为：1号：PBS缓冲液+5%牛血清白蛋白+0.05%Tween-20；2号：PBS缓冲液+1%牛血清白蛋白+0.05%Tween-20；3号：PBS缓冲液+0.5%牛血清白蛋白+0.05%Tween-20；4号：PBS缓冲液+0.1%牛血清白蛋白+0.05%Tween-20；5号：PBS缓冲液+0.1%牛血清白蛋白。1-5号抗体稀释液所用的PBS均为pH为7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液。

检测标准曲线，并对8份阳性质控样本进行符合验证，筛选最佳的酶标抗体稀释液。

2.8反应时间和温度的筛选

分别选取37℃和25℃的反应温度，以及30min和1h的反应时间，检测标准曲线，并进行8份质控阳性样本的符合试验，筛选最佳的反应温度和时间。

2.9ELISA方法标准点的选取

将PMSG标准品分别稀释以下几个浓度，坐双孔平行，进行检测，筛选标准品浓度点。根据上述各试验，确定双抗体夹心ELISA检测方法的最终反应模式。

3结果

3.1单克隆抗体的纯化结果

8株单克隆抗体腹水用辛酸-饱和硫酸铵法纯化后，紫外分光光度计测个抗体的蛋白浓度，结果见下表5。其中，杂交瘤细胞D-3分泌的单抗纯化后编号为D-3，杂交瘤细胞株A-4分泌的单抗纯化后编号为D-2。

表5腹水纯化后蛋白浓度

Figure 2012103510350100002DEST_PATH_IMAGE005

3.2酶标单克隆抗体的制备及鉴定

对制备得到的8株单克隆抗体分别用两种方法制备了酶标抗体，对应如下表：

表6抗体酶标记结果

间接ELISA对标记后的抗体鉴定的结果见下表：

表7抗体酶标记后间接ELISA检测结果

Figure 2012103510350100002DEST_PATH_IMAGE007

注：测得的阴性对照OD值为0.428，空白对照OD值为0.416

从表中可以看出，标记后的抗体与PMSG标准品均呈显色，且与阴性和空白对照的比值均大于2.1，说明抗体标记成功；用过碘酸钠法标记的抗体比用戊二醛法标记抗体的OD值高，说明过碘酸钠法标记的效果要稍优于戊二醛法。

3.3抗体配对检测结果

表8抗体配对ELISA检测吸光度

从上表可以看出，不同抗体之间配对结果显示，显色OD值均呈阳性，在0.7-3.1之间，从上表中每株包被单抗细胞株挑选出2个显色最高的不同细胞株酶标抗体，设置阴性对照和空白对照，筛选配对效果最好的抗体，结果见下表：

表9最佳抗体配对选择结果

从上表可知，包被D-3抗体，酶标抗体选A4即纯化后的D-2抗体用过碘酸钠法标记的酶标抗体时，OD值显色最高，且P/N值>2.1，故确定最终最合适的配对抗体为包被D-3抗体，酶标抗体为A4。但阴性对照和空白对照的值普遍较高，故后续工艺需调试系统，以降低背景值。

3.4不同抗体夹心法的筛选结果

表10不同抗体夹心法ELISA检测吸光度

从上表可以看出，包被单抗，用酶标记多抗进行夹心，标准品显色OD值呈反方向梯度，故依旧选用包被单抗，用酶标记单抗进行夹心。

3.5包被工艺的筛选结果

3.5.1酶标板的确定对6种板条的检测曲线见图2。从图2中可以看出，除了4号酶标板外，其余5种酶标板均呈现良好的S型，对8份质控的阳性样本进行检测，样本的符合结果见下表：

表11不同酶标板样本符合效果检测

从上表可以看出，阳性样本符合数是1号板条最高，且30mIU标准点的抑制率为81.60%，在80%-85%的范围内，更有利于绘制标准曲线，故选1号酶标板为试验用酶标板。

3.5.2封闭液的确定0标准品和7.68IU标准品的抑制情况见下表：

表12不同封闭液封闭效果初检测

从上表中可以看出，1号和2号封闭液的背景值都很高，即非特异性反应很大，故选取3-6号封闭液进行标准曲线的检测。结果见下表：

表13不同封闭液的抑制情况

从上表可以看出，5号封闭液的30mIU标准点的抑制率为81.82%，效果更好，故选取5号封闭液（0.02M PBS，pH值7.2）+5%脱脂奶粉）为最佳封闭液。

3.5.3包被液的确定从表14可知，6号包被缓冲液（pH7.2，0.02mol的磷酸盐缓冲液）的效果较好。

表14不同包被液的包被效果OD值

3.5.4包被抗体稀释浓度的筛选结果

表15不同包被抗体浓度的检测结果

从上表可以看出，当包被抗体稀释1000倍时，0标OD值比较低，且2.43IU标准品的OD值为最高，故选包被抗体最佳工作浓度为1:1000。

3.6酶标抗体稀释浓度的筛选结果

从图3中可以看出。当酶标抗体稀释80000倍后，0标准品的OD值比较低，即背景值较低，非特异性吸附较小，且曲线上的标准品呈一定的梯度隔开，曲线形状较好，故选酶标抗体的最适工作浓度为1:80000。

3.7酶标抗体稀释液的筛选结果

表16不同酶标抗体稀释液的检测结果

从上表可以看出，2号稀释液的阳性质控样本符合率最好，且2号稀释液标准曲线30mIU标准点的抑制率为79.55%，最接近80%，故选2号稀释液为最佳酶标抗体稀释液。

3.8反应时间和温度的筛选结果

表17不同反应温度和时间结果检测

从上表可以看出，反应温度为37℃比25℃的阳性样本符合率高，且曲线形状较好，30mIU标准点的抑制率处于合理范围，故选反应温度为37℃；而反应30min时阳性样本的符合率要低于反应1h，故选反应时间为1h。

3.9标准曲线上标准点筛选结果

选取显色OD值在2.0附近的标准点，抑制达到一半的标准点，以及拐点处的标准点。故确定最终的标准点浓度为：0、0.03、0.12、0.48、2.4、12IU。标准曲线图4，R²为0.928。

3.10双抗体夹心ELISA检测方法的模式确定结果

试验确定双抗夹心ELISA检测方法的最终模式如下：

包板：将D-3抗体用pH7.20.2mol/L的磷酸盐缓冲液稀释1000倍后，加入酶标板孔内，每孔100μl，盖上盖板膜，37℃孵育2h后，取出，用含0.1%吐温-20和5%牛血清白蛋白的PBS溶液（以下简称洗液）洗板4次；

封闭：每孔加含5%脱脂乳粉的PBS（0.02M，pH7.2）封闭液250μl，盖上盖板膜，37℃孵育2h后，取出，用洗液洗板4次后甩干，备用；

加样：将标准品用PBS稀释至适当浓度后，加入酶标板孔，每孔50μl，反应60min，洗涤同上；

加酶标抗体：将用酶标抗体稀释液（PBS缓冲液+1%牛血清白蛋白+0.05%吐温-20）稀释80000倍的酶标抗体A4（即使用过碘酸钠法酶标D-2抗体）加入酶标板孔，每孔50μl，盖上盖板膜，37℃反应1h后，取出，用洗液洗板4次；

显色：每孔加底物显色液A液50μl和B液50μl底物显色液由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，底物显色液B液为四甲基联苯胺，盖上盖板膜，37℃显色15min；

终止：每孔加终止液（2mol/mL硫酸）50μl；

读板：酶标仪上双波测定各孔（OD_450nm–OD_630nm），进行结果判定。。

本发明经过多次重复试验找到最佳的检测条件即：包被液用 0.2mol/mL的磷酸盐缓冲液（pH 7.2），包被抗体的最佳工作浓度为1:1000，包被条件为37℃孵育2h；封闭液选择加5%脱脂乳粉的PBS溶液（0.02M，pH7.2），37℃孵育2h；酶标抗体的最适工作浓度为1:80000，底物作用条件为37℃避光反应15min，洗板方式为无需浸泡直接洗版4-5次。

本发明对包被液、缓冲液、洗涤液、稀释液、等分别进行了筛选。确定每种工作液后，又进行最佳组合的筛选。酶促反应的适宜温度一般为37℃，综合各种试剂盒的研制经验及检测效果分析，确定了本试验检测的反应温度为37℃。反应时间过长，会导致检测周期变长，同时还可能导致非特异性吸附增加；反应时间过短会造成抗原与抗体的反应不充分，造成抗原抗体结合疏松，导致在洗涤过程中容易解离，导致测得结果不准确。

利用建立的双抗体夹心方法与现有商品化试剂盒（购自上海博耀生物科技有限公司）的检测结果的对比，同时检测80份临床孕马血清样本。结果显示，本发明方法的特异性为92%（46/50），敏感性为93%（28/30），两者的符合率为92.5%（74/80）。结果见表18。

表18本发明与商品化试剂盒临床样本检测结果比较

Figure 2012103510350100002DEST_PATH_IMAGE009

实施例3试剂盒的构成

本例中的试剂盒的组成如下：

酶标板：包被D-3株分泌产生的单克隆抗体

酶标抗体：辣根过氧化物酶标记D-2单克隆抗体（D-2为A-4杂交瘤细胞分泌产生的纯化的单抗）

底物液：底物显色液：底物显色液由A液和B液组成，底物显色液

A液为过氧化脲；底物显色液B液为四甲基联苯胺。

终止液：（2mol/L H₂SO₄）分别取蒸馏水177.8mL和浓硫酸22.2mL混和即可。

洗涤液1000mL 10mmol/L pH 7.4的PBS中加入0.5mL Tween-20；

阴性对照：蒸馏水；

阳性对照：PMSG标准品。

Claims

1.一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体杂交瘤细胞株D-3，其保藏编号为CGMCC No.6450。

2.一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体杂交瘤细胞株A-4，其保藏编号为CGMCC No.6449。

3.一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体，其由杂交瘤细胞株D-3或A-4分泌获得，所述杂交瘤细胞株D-3的保藏编号为CGMCCNo.6450，所述杂交瘤细胞株A-4的保藏编号为CGMCC No.6449。

4.一种用于检测PMSG的试剂、药剂或试剂盒，其包括权利要求3所述的单克隆抗体。

5.一种检测PMSG的方法，其特征在于，使用权利要求3所述的单克隆抗体。

6.检测孕马血清促性腺激素ELISA试剂盒，其包括：

（1）包被PMSG单克隆抗体的酶标板；

（2）酶标记的PMSG单克隆抗体；

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述包被在酶标板的PMSG单克隆抗体与酶标记PMSG单克隆抗体分别为杂交瘤细胞株D-3或A-4分泌获得。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述包被在酶标板的PMSG单克隆抗体为杂交瘤细胞株D-3分泌获得，酶标记PMSG单克隆抗体为杂交瘤细胞株A-4分泌获得。

9.如权利要求6-8任一所述的试剂盒，其还包括以下试剂中的一种或多种：洗涤液、酶标抗体稀释液、底物显色液、终止液、PMSG标准品。

10.如权利要求6-8任一所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记PMSG单克隆抗体的标记酶为辣根过氧化物酶，具体标记方法包括如下步骤：取5mg的HRP溶于1mL三蒸水，加入新鲜配制的0.1mol/L NaIO₄0.2mL，室温下避光搅拌20min，混匀后装入透析袋中，以0.001mol/L pH4.4醋酸钠缓冲液4℃透析过夜，加20μL 0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲溶液，使pH升高到9.0-9.5，加入含有10mg纯化PMSG单克隆抗体IgG1mL，混匀后装入预先活化的透析袋中，以0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析过夜，使辣根过氧化物酶与抗体充分结合，取出透析袋中的液体，加入4mg/mL的硼氢化钠100μL，置4℃还原6-8小时，加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置过夜，3000rpm，离心10min，将所得的沉淀溶于1ml 0.01mol/L的PBS中，装入透析袋中以0.01mol/L的PBS透析过夜充分除去硫酸铵，透析24-36h，离心除去沉淀，即得纯化酶标记抗体。