CN107688095A - 检测人胱抑素sn的酶联免疫试剂盒及制备方法及检测方法 - Google Patents

检测人胱抑素sn的酶联免疫试剂盒及制备方法及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒及制备方法及检测方法。目前市场上还没有人胱抑素SN(CST1)酶联免疫检测试剂盒。本发明检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的特点在于：包括包被酶标板、酶结合物、校准品、底物、洗液和终止液，包被酶标板为聚苯乙烯包被的CST1抗体，酶结合物为HRP标记的CST1抗体，校准品为CST1抗原，底物为TMB的显色剂，终止液为0.5mol/L的硫酸；洗液为PB的缓冲液，所述洗液如下：1000mL洗液中含有90g的NaCl、29g的Na2HPO4·12H2O、2.97g的NaH2PO4·2H2O、以及10ml的吐温20。本发明操作简便，检测快速，检测结果准确。

Description

检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒及制备方法及检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒及制备方法及检测方法。
背景技术
人胱抑素SN(CST1)最早在人的唾液中通过离子交换层析分离获得，又称分泌型蛋白，相对分子质量约14500，由121个氨基酸构成，包含3个外显子和2个内含子，目前市场上还没有人胱抑素SN(CST1)酶联免疫检测试剂盒。虽然现在有一些人胱抑素C的检测方法，如公开日为2013年04月03日，公开号为CN103018465A的中国专利中，公开了一种人胱抑素C化学发光定量检测方法，又如公开日为2011年01月05日，公开号为CN101937000A的中国专利中，公开了一种人胱抑素C的磁微粒分离化学发光免疫分析检测方法，但是这些方法均不适用于人胱抑素SN(CST1)的检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种操作简便，检测快速，检测结果准确的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒及制备方法及检测方法。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的特点在于：包括包被酶标板、酶结合物、校准品、底物、洗液和终止液，包被酶标板为聚苯乙烯包被的CST1抗体，酶结合物为HRP标记的CST1抗体，校准品为CST1抗原，底物为TMB的显色剂，终止液为0.5mol/L的硫酸；洗液为PB的缓冲液，所述洗液如下：1000mL洗液中含有90g的NaCl、29g的Na2HPO4·12H2O、2.97g的NaH2PO4·2H2O、以及10ml的吐温20。
一种制备检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的方法，其特点在于：所述制备方法的步骤如下：
A、板子制作：
1）用碳酸盐包被缓冲液将CST1抗体稀释至工作浓度，包被96孔酶标板，每孔100μl，2～8℃孵育过夜或37℃烘箱2小时；
2）弃去孔中液体，每孔加入300～350μl的洗液，静置3分钟，弃去洗液，甩干，洗涤3遍；
3）加入终止液，每孔200μl，2～8℃孵育过夜或37℃烘箱2小时；
4）弃去孔中液体，甩干，37℃烘箱过夜；密封；2～8℃保存；
B、酶结合物标记：
1）取5mg HRP溶于0.5 ml 浓度为0.2mol/L、pH值为5.6的醋酸盐缓冲液中；加入0.25ml新鲜配制的浓度为0.1mol/L的NaIO4；混匀；此时溶液颜色应由黄棕色变为墨绿色，4℃保温30min；
2）加入0.5ml体积百分浓度为2.5%的已二醇，混匀；室温置30min；此时溶液应恢复为黄色；
3）加入5～10mg待标记的抗体，用浓度为1.0mol/L、pH值为9.5的CBS调节pH值至9.0，混匀；透析，4℃过夜；
4）加入0.1ml或0.5mg NaHB4，混匀；4℃放置2小时后，对浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS透析，4℃过夜；加入中性甘油后分装；
C、酶结合物配制：
用酶稀释液把标记好的酶稀释到1ug/ml；
D、校准品配制：
用校准品稀释液把抗原稀释到20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，0ng/ml。
作为优选，本发明所述板子制作步骤的工序1）中，CST1抗体的工作浓度为1～3μg/ml。
作为优选，本发明所述板子制作步骤的工序1）中，CST1抗体的工作浓度为2μg/ml。
作为优选，本发明所述板子制作步骤的工序1）中，2～8℃孵育过夜的时间为16～24小时；所述板子制作步骤的工序3）中，2～8℃孵育过夜的时间为16～24小时；所述板子制作步骤的工序4）中，37℃烘箱过夜的时间为16～24小时。
作为优选，本发明所述酶结合物标记步骤的工序3）中，过夜的时间为16～24小时；所述酶结合物标记步骤的工序4）中，过夜的时间为16～24小时。
一种检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特点在于：所述检测方法的步骤如下：
1）取出试剂盒和血清样品，室温平衡15～30分钟；浓缩洗涤液用蒸馏水1∶19稀释，待用；
2）取出包被板，每孔加入50μl标准品、质控血清和血清样品；
3）每孔分别加入酶结合物50μl；
4）微量振荡器振荡30秒使其混合均匀，封膜覆盖，置37℃温育0.5小时；
5）甩干孔内混合物，用洗涤液注满各孔，静置18～22秒，甩干孔内液体，重复5次，最后拍干；
6）每孔加入底物2滴或100μl；
7）微量振荡器振荡30秒，37℃避光反应10分钟以内，用酶标仪测定各孔的OD值。
作为优选，本发明所述步骤2）中的标准品为S0～S6。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明的试剂盒具有操作简便，仅需一步温育反应即可，还具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确、范围广、能在40分钟内得到检测结果，且成本低等优点。
附图说明
图1是本发明实施例的CST1的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例。
本实施例中检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒包括包被酶标板、酶结合物、校准品、底物、洗液和终止液，包被酶标板为聚苯乙烯包被的CST1抗体，酶结合物为HRP标记的CST1抗体，校准品为CST1抗原，底物为TMB的显色剂，终止液为0.5mol/L的硫酸；洗液为PB的缓冲液，所述洗液如下：1000mL洗液中含有90g的NaCl、29g的Na2HPO4·12H2O、2.97g的NaH2PO4·2H2O、以及10ml的吐温20。
本实施例中制备检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的方法的步骤如下：
A、板子制作：
1）用碳酸盐包被缓冲液将CST1抗体稀释至工作浓度，包被96孔酶标板，每孔100μl，2～8℃孵育过夜或37℃烘箱2小时；
2）弃去孔中液体，每孔加入300～350μl的洗液，静置3分钟，弃去洗液，甩干，洗涤3遍；
3）加入终止液，每孔200μl，2～8℃孵育过夜或37℃烘箱2小时；
4）弃去孔中液体，甩干，37℃烘箱过夜；密封；2～8℃保存；
B、酶结合物标记：
1）取5mg HRP溶于0.5 ml 浓度为0.2mol/L、pH值为5.6的醋酸盐缓冲液中；加入0.25ml新鲜配制的浓度为0.1mol/L的NaIO4；混匀；此时溶液颜色应由黄棕色变为墨绿色，4℃保温30min；
2）加入0.5ml体积百分浓度为2.5%的已二醇，混匀；室温置30min；此时溶液应恢复为黄色；
3）加入5～10mg待标记的抗体，用浓度为1.0mol/L、pH值为9.5的CBS调节pH值至9.0，混匀；透析，4℃过夜；
4）加入0.1ml或0.5mg NaHB4，混匀；4℃放置2小时后，对浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS透析，4℃过夜；加入中性甘油后分装；
C、酶结合物配制：
用酶稀释液把标记好的酶稀释到1ug/ml；
D、校准品配制：
用校准品稀释液把抗原稀释到20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，0ng/ml。
本实施例的板子制作步骤的工序1）中，CST1抗体的工作浓度为1～3μg/ml，优选为2μg/ml。
本实施例的板子制作步骤的工序1）中，2～8℃孵育过夜的时间为16～24小时；板子制作步骤的工序3）中，2～8℃孵育过夜的时间为16～24小时；板子制作步骤的工序4）中，37℃烘箱过夜的时间为16～24小时。酶结合物标记步骤的工序3）中，过夜的时间为16～24小时；酶结合物标记步骤的工序4）中，过夜的时间为16～24小时。酶稀释液如下：1000mL酶稀释液中含有8g的NaCl、0.2g的KCl、3.63g的Na2HPO4·12H2O、以及0.24g的KH2PO4。
本实施例中检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的检测方法的步骤如下：
1）取出试剂盒和血清样品，室温平衡15～30分钟；浓缩洗涤液用蒸馏水1∶19稀释，待用；
2）取出包被板，每孔加入50μl标准品、质控血清和血清样品；标准品为S0～S6
3）每孔分别加入酶结合物50μl；
4）微量振荡器振荡30秒使其混合均匀，封膜覆盖，置37℃温育0.5小时；
5）甩干孔内混合物，用洗涤液注满各孔，静置18～22秒，甩干孔内液体，重复5次，最后拍干；
6）每孔加入底物2滴或100μl；
7）微量振荡器振荡30秒，37℃避光反应10分钟以内，用酶标仪测定各孔的OD值。
如附图1所示，图1中X轴表示校准品浓度值，单位是ng/ml，Y轴表示OD值，曲线表示CST1的标准曲线，未知标本测得OD值可以通过标准曲线算出浓度值。
本实施例可以采用ELISA双抗体酶联免疫夹心法定量检测人血清、血浆及相关液体样本中的人胱抑素SN(CST1)含量。cystatin SN最早在人的唾液中通过离子交换层析分离获得，又称分泌型蛋白，相对分子质量约14500，由121个氨基酸构成，包含3个外显子和2个内含子，定位于染色体20p11.2。
Cystatin SN在肿瘤中的表达及作用如下：
Cystatin SN与胃癌 choi等使用PcR方法分析了15例胃癌患者癌组织中cystatin SNmRNA转录水平，发现在胃癌组织中Cystatin SN mRNA转录水平较正常组织增加6倍多。对77例胃癌患者进行IHc分析，其中31例胃癌患者Cystatin SN表达水平增加，主要积聚于细胞质和细胞核周围区域，而在正常胃黏膜中弱表达。临床病理资料分析显示，cystatin SN在胃癌组织中的高表达与肿瘤TNM分期有关(P=o．044)，与淋巴结的转移可能相关(P=0.53)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小、浸润深度、分化程度无关。研究发现，T细胞因子(T ceUfactor，TCF)/β一连环蛋白信号介导肿瘤细胞增殖基因如c—Myc和cyclin D1，进而在肿瘤细胞增殖过程中起一定作用。choi等使用氯化锂作为糖原合成酶激酶-3β抑制剂和小干扰RNA (siRNA)模仿TcF/β-连环蛋白信号，发现Cystatin SN 可作为TcF靶点，高度参与细胞增殖，其表达水平上调可能与胃部肿瘤发生显著相关。
Cvstatin SN与结直肠癌 cystain sN被确认为新的结直肠癌的生物标志物，在结直肠癌中表达水平升高，它的上调通过中和CST3对组织蛋白酶B的蛋白水解活性导致结直肠癌的发生。Kim等在检测Cystatin SN cDNA序列时发现，在结肠癌组织中编码精氨酸-91的密码子CGC突变为CGA，IHC染色显示Cystatin SN在结肠癌组织中表达水平增高。Yoneda等。使用westem blotting法检测结直肠癌患者的尿液样本，发现在结直肠癌患者的尿液中cystatin sN的浓度与健康对照组相比是增高的，这一发现说明Cystatin SN在结直肠癌中可能通过尿液排泄。酶联免疫吸附法检测发现健康对照组中cystatin sN中位水平为1.12ng/ml，结直肠癌患者血清中cystatin sN的水平为1.7 ng/ml，二者差异有统计学意义(P＜0.0001)。 cystatin sN在结直肠癌中的诊断敏感性为27.7％，而癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，cEA)和糖类抗原19—9(carbohydrate ant培en 19_9，CAl9—9)敏感性分别为50.3％、23.9％，三者结合敏感性为62.9％，特异性为90.0％，比CEA和CAl9.9在结直肠癌I、Ⅱ期诊断敏感性都高，提示检测结直肠癌患者血清中 Cystatin SN表达水平可提高结直肠癌的诊断准确性，尤其是结合了cEA和CAl9—9，有助于早期发现结直肠癌患者，增加手术治愈的可能性，减少结直肠癌患者的死亡率。
Cystatin SN与胰腺癌 Cystatin SN促进胰腺细胞增殖，是早期检测胰腺癌的有效生物标志物。Jiang等研究发现Cystatin SN在胰腺癌组织中表达水平增高。将CSTl一siRNA 转染到人胰腺癌细胞(PANc-1)中，发现csTl-siRNA 组中PANc-1细胞平均克隆数减少，生存活力下降，恶性相关蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)、cyclin D1、 cyclin A和cyclinE明显减少。异种移植分析发现，转染CSTl一siRNA一周后，肿瘤的大小比对照组明显减小，提示csTl促进肿瘤细胞增殖。研究还发现，在9种不同消化系统癌细胞株中，包括胰腺癌细胞株(PANC一1、Bxpc一3、SWl990)，肝癌细胞株(HepG一2、 Hep3B)，胃癌细胞株(SCG7901)，结直肠癌细胞株(HCTll6、HT．29、SW480)，CSTl mRNA和蛋白在胰腺癌、胃癌、结直肠癌细胞株中表达水平上调，在胰腺癌细胞株中表达水平显著升高，而在肝癌细胞株中无表达，同时酶联免疫试剂盒检测发现CSTl存在于胰腺癌患者血浆中，其表达水平比健康对照组表达水平增高，提示csTl过表达可能对胰腺癌的诊断起重要作用，有望成为临床检测胰腺癌的生物标志物，与其他常用的生物标志物如CAl9—9、CA242、CEA联用，可提高胰腺癌诊断的准确性。
Cystatin SN与肺癌 Mullaudi等研究发现，在肺癌启动子区cSTl低甲基化并且表达上调。Kim等利用RNA序列分析和质谱分析方法，发现肺腺癌组织中cSTl与CDHl7的同义单核苷酸多态性和HNFlA在这些组织的突变基因中选择性富集，因此其表达比邻近正常组织中更高。cao等使用IHc和荧光原位杂交方法，回顾性分析了174例非小细胞肺癌患者术后标本，其中鳞状细胞癌76例、腺癌98例，发现52例腺癌、37例鳞状细胞癌组织中Cystatin SN表达水平上调，其表达水平增高与肺癌侵袭脏胸膜密切相关(P<0.05)。临床病理资料分析显示，Cystatin sN表达水平下调的患者比表达水平增高的患者中位生存时间延长，其表达水平上调使非小细胞肺癌的复发、转移和预后的风险增加。cox比例风险模型分析发现，cystatin sN的表达水平、肿瘤TNM分期、辅助化 疗是非小细胞肺癌患者独立的预后因素和术后生存的重要预测指标。
目前研究表明，cystatin sN在胃癌、结直肠癌、胰 腺癌、肺癌等多种肿瘤组织中表达水平增高，与肿瘤患者的复发和转移等不良预后密切相关。
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被酶标板、酶结合物、校准品、底物、洗液和终止液，包被酶标板为聚苯乙烯包被的CST1抗体，酶结合物为HRP标记的CST1抗体，校准品为CST1抗原，底物为TMB的显色剂，终止液为0.5mol/L的硫酸；洗液为PB的缓冲液，所述洗液如下：1000mL洗液中含有90g的NaCl、29g的Na2HPO4·12H2O、2.97g的NaH2PO4·2H2O、以及10ml的吐温20。
2.一种制备如权利要求1所述的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的方法，其特征在于：所述制备方法的步骤如下：
A、板子制作：
1）用碳酸盐包被缓冲液将CST1抗体稀释至工作浓度，包被96孔酶标板，每孔100μl，2～8℃孵育过夜或37℃烘箱2小时；
2）弃去孔中液体，每孔加入300～350μl的洗液，静置3分钟，弃去洗液，甩干，洗涤3遍；
3）加入终止液，每孔200μl，2～8℃孵育过夜或37℃烘箱2小时；
4）弃去孔中液体，甩干，37℃烘箱过夜；密封；2～8℃保存；
B、酶结合物标记：
1）取5mg HRP溶于0.5 ml 浓度为0.2mol/L、pH值为5.6的醋酸盐缓冲液中；加入0.25ml新鲜配制的浓度为0.1mol/L的NaIO4；混匀；4℃保温30min；
2）加入0.5ml体积百分浓度为2.5%的已二醇，混匀；室温置30min；
3）加入5～10mg待标记的抗体，用浓度为1.0mol/L、pH值为9.5的CBS调节pH值至9.0，混匀；透析，4℃过夜；
4）加入0.1ml或0.5mg NaHB4，混匀；4℃放置2小时后，对浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS透析，4℃过夜；加入中性甘油后分装；
C、酶结合物配制：
用酶稀释液把标记好的酶稀释到1ug/ml；
D、校准品配制：
用校准品稀释液把抗原稀释到20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，0ng/ml。
3.根据权利要求2所述的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于：所述板子制作步骤的工序1）中，CST1抗体的工作浓度为1～3μg/ml。
4.根据权利要求3所述的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于：所述板子制作步骤的工序1）中，CST1抗体的工作浓度为2μg/ml。
5.根据权利要求2所述的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于：所述板子制作步骤的工序1）中，2～8℃孵育过夜的时间为16～24小时；所述板子制作步骤的工序3）中，2～8℃孵育过夜的时间为16～24小时；所述板子制作步骤的工序4）中，37℃烘箱过夜的时间为16～24小时。
6.根据权利要求2所述的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于：所述酶结合物标记步骤的工序3）中，过夜的时间为16～24小时；所述酶结合物标记步骤的工序4）中，过夜的时间为16～24小时。
7.一种如权利要求1～6任一权利要求所述的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于：所述检测方法的步骤如下：
1）取出试剂盒和血清样品，室温平衡15～30分钟；浓缩洗涤液用蒸馏水1∶19稀释，待用；
2）取出包被板，每孔加入50μl标准品、质控血清和血清样品；
3）每孔分别加入酶结合物50μl；
4）微量振荡器振荡30秒使其混合均匀，封膜覆盖，置37℃温育0.5小时；
5）甩干孔内混合物，用洗涤液注满各孔，静置18～22秒，甩干孔内液体，重复5次，最后拍干；
6）每孔加入底物2滴或100μl；
7）微量振荡器振荡30秒，37℃避光反应10分钟以内，用酶标仪测定各孔的OD值。
8.根据权利要求7所述的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤2）中的标准品为S0～S6。
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