CN112014578B

CN112014578B - 半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与Cathepsin L1复合物作为胃癌诊断标志物的应用

Info

Publication number: CN112014578B
Application number: CN202011135409.6A
Authority: CN
Inventors: 王力军; 孙玉龙; 杨亚云; 王弢
Original assignee: Shanghai Liangrun Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Liangrun Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2040-10-22
Also published as: WO2022083586A1; CN112014578A

Abstract

本发明涉及医学诊断学领域，具体而言，涉及一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与Cathepsin L1复合物作为胃癌诊断标志物的应用。通过CST1‑CTSL复合物的检测能够有效的提高标志物的组织特异性，还能够有效提高对早期胃癌的检测率。

Description

半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与Cathepsin L1复合物作为胃癌诊断标志物的应用

技术领域

本发明涉及医学诊断学领域，具体而言，涉及一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与Cathepsin L1复合物作为胃癌诊断标志物的应用。

背景技术

胃癌(gastric carcinoma)是指原发于胃的上皮源性恶性肿瘤。研究发现在肿瘤的侵袭转移过程中，肿瘤细胞必须穿越周围的基质，基质的降解主要与各种组织蛋白水解酶有关，研究表明肿瘤细胞的侵袭转移能力与组织蛋白酶降解细胞外基质的能力密切相关。

组织蛋白酶L1（Cathepsin L1,CTSL）是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，广泛存在于人体组织细胞中，该酶是一种肽链内切酶，但同时也具有外切酶活性，该酶通常以无活性的前体形式被合成，其内肽酶活性在溶酶体的酸性PH中通过自溶获得，而外肽酶活性则通过内肽酶活性获得。CTSL的表达在大多数的恶性肿瘤中上调，如胸，肺，胃，黑色素瘤，神经胶质瘤，而且其表达水平与肿瘤恶性程度相关。半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN( cystatins SN，CST1) 是组织蛋白酶抑制剂的一种，由CST1基因编码的含141个氨基酸的蛋白质，分子量为16.4Kda。CST1分子中含有两个二硫键，为典型的分泌蛋白，它能抑制细胞内、外的组织蛋白酶活性，在肿瘤的生长、血管生成、浸润和转移中起重要作用，并且有研究表明CST1的高表达与多种癌症相关。

目前对于胃癌的肿瘤标记物分析主要包括CA125、CEA、CA199等，但是临床检测阳性率仅20%-40%。由于CTSL用作肿瘤诊断标志物时组织特异性较差，很难定位到具体肿瘤类型，不仅仅在胃癌中有高表达，在胃癌、神经胶质瘤、黑色素瘤等患者中也存在表达。虽然CST1在胃癌中有一定的区分度，但是由于其序列上与同家族的半胱氨酸蛋白酶抑制剂S（cystatins S，CST4）存在高度同源性，因此CST1作为胃癌靶标也具有一定的局限性。

发明内容

本发明涉及半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与Cathepsin L1复合物的定量检测剂在制备用于胃癌的诊断、辅助诊断或预后分析的试剂盒中的应用。

可选的，所述定量检测剂用于执行如下任一种方法：

免疫共沉淀以及酶联免疫吸附试验。

可选的，所述定量检测剂为所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与Cathepsin L1复合物的特异性抗体。

可选的，所述特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

可选的，所述特异性抗体由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列免疫得到。

可选的，所述特异性抗体具有用于指示信号强度的标记。

可选的，所述用于指示信号强度的标记选自发色团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金或酶中的任一种或多种。

本发明还涉及胃癌诊断、辅助诊断或预后分析试剂盒，其包含如上所定义的特异性抗体。

可选的，所述试剂盒还包含固相载体、封闭液、显色剂、CST1-CTSL融合抗原的校准品以及洗涤缓冲液中的至少一种。

可选的，所述固相载体为化学发光板。

通过CST1-CTSL复合物的检测能够有效的提高标志物的组织特异性，还能够有效提高对早期胃癌的检测率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中CST1-CTSL重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图；

图2为本发明一个实施例中CST1-CTSL检测试剂盒校准曲线；

图3为本发明一个实施例中CST1-CTSL对胃癌和正常人检测结果的样本浓度散点图；

图4为本发明一个实施例中CST1-CTSL对胃癌诊断的ROC曲线。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与Cathepsin L1复合物（CST1-CTSL复合物）的定量检测剂在制备用于胃癌的诊断、辅助诊断或预后分析的试剂盒中的应用。

本发明提供了一种用于诊断的新标志物：CST1-CTSL复合物。据文献报道，CTSL可被CST1抑制而结合形成复合物，而CST4不具备此能力。因此通过CST1-CTSL复合物的检测能够有效的提高标志物的组织特异性，还能够有效提高对早期胃癌的检测率。

本文使用的术语“标志物”指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。这样的分子靶标的实例是蛋白或多肽。在本发明中用作标志物的蛋白或多肽预期包括所述蛋白的天然存在的变体以及所述蛋白或所述变体的片段，特别是免疫学上可检测的片段。免疫学上可检测的片段优选地包含所述标志物多肽的至少5、6、7、8、9、10、11、12、15或20个连续氨基酸。本领域的技术人员可认识到，由细胞释放的蛋白或存在于胞外基质中的蛋白可能受到损害（例如，在炎症过程中），且可被降解或切割成这样的片段。某些标志物以无活性形式合成，其可以随后通过蛋白酶解来激活。如熟练的技术人员将明白的，蛋白或其片段也可以作为复合物的部分而存在。这样的复合物也可以用作本发明意义上的标志物。另外，或在替代方案中，标志物多肽或其变体可以携带翻译后修饰。翻译后修饰的非限制性实例是糖基化、酰化和/或磷酸化。特别地，所述标志物应当位于CST1-CTSL复合物中CST1和CTSL结合部位，这种“结合”是指CST1和CTSL相互作用时氨基酸序列互相接触的部位，可以是线性表位或空间表位。

在一些实施方式中，所述定量检测试剂为所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN以及所述Cathepsin L1的特异性抗体，所述抗体可用于执行免疫共沉淀或酶联免疫吸附试验以对所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与Cathepsin L1复合物进行检测。

定量检测试剂对半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与Cathepsin L1复合物的检测可采用本领域公知的方法；可尝试的方法例如生物质谱法、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、色谱法、酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。常见的优选方法为免疫共沉淀以及酶联免疫吸附试验，可通过A抗体捕获CST1，并洗去未结合的组分，再通过带有信号物质的B抗体检测CTSL；当然也可以捕获CTSL再检测CST1，这对本领域技术人员说容易的。

定量检测剂通常是特异性地检测CST1-CTSL复合物的试剂，例如，特异性结合CST1-CTSL复合物的凝集素、特异性结合CST1-CTSL复合物的适配体或特异性结合CST1-CTSL复合物的抗体及抗体片段。特异性的结合剂对其相应的靶分子具有至少10⁷ l/mol的亲和力。特异性的结合剂优选对其靶分子具有10⁸ l/mol、或更优选10⁹ l/mol的亲和力。技术人员将理解，使用术语“特异性的”表示，样品中存在的其它生物分子不与CST1-CTSL复合物的定量检测剂发生显著的结合，这样的生物分子特别为单独游离的CST1和CTSL。

在一些实施方式中，所述定量检测剂为CST1-CTSL复合物的特异性抗体。

在一些实施方式中，所述特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

在一些实施方式中，所述特异性抗体由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列免疫得到。

抗体免疫后可经过筛选过程，如本领域技术人员所容易想到的，可通过CST1-CTSL重组蛋白筛选特异性结合CST1-CTSL复合物的抗体，任选的还包括挑选抗体效价高的抗体。

在一些实施方式中，所述特异性抗体具有用于指示信号强度的标记。

在一些实施方式中，所述用于指示信号强度的标记选自发色团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金或酶中的任一种或多种。

下面非限定部分列出这些标记：

·产生可检测信号的酶，如通过比色法、荧光和发光来检测，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

·发色团，如荧光、量子点、荧光微球、发光化合物（如吖啶酯或其衍生物）和染料。

·具有能被电子显微镜或通过其电特性，如传导性、电流分析、电压测量和电阻等检测的电子密度的基团。

·可检测基团，如其分子大小足以诱导在其物理和/或化学特性上可检测的修饰；这种检测可通过光学方法(如衍射、表面胞质团共振，表面变异和接触变异角度)或物理方法(如原子力谱学和隧道效应)实现。

·电子致密物质，如放射性分子（如³²P，³⁵S或¹²⁵I）。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及胃癌诊断试剂盒，其包含如上所定义的特异性抗体。

在一些实施方式中，所述的试剂盒还包含固相载体、封闭液、显色剂、CST1-CTSL融合抗原的校准品以及洗涤缓冲液中的至少一种。

CST1-CTSL融合抗原的校准品优选具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

封闭液可以为BSA、牛血清、脱脂牛奶、TBST等成分中的一种或多种。

显色液可根据抗体上标记的物质进行确定，例如当标记的物质为辣根过氧化物酶时，显色剂可以为鲁米诺。

洗涤缓冲液可为PBS、TBS等成分。

其中，封闭液、显色液、洗涤缓冲液可以工作浓度的形式包装于试剂盒中，也可以它们的浓缩母液的形式被包装（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50倍浓缩的母液）。

固相载体通常用于包被抗体，用于包被抗体的固相载体物质可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等材质，载体的形式可以是试管、EP管、多孔板（特别是化学发光板）、微量反应板凹孔、小珠（特别是磁珠）、小圆片等。

优选的固相载体为化学发光板。其含有的孔位可以为16、32、48、64、96或更多。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于胃癌的诊断、辅助诊断或预后分析的方法，所述方法包括：使用如上所述的定量检测剂/试剂盒测量CST1-CTSL复合物的含量。

检测的样本可以为受试者的血液、血清、脑脊髓液、组织或组织裂解液、精液以及唾液样品中的至少一种。

受试者通常为哺乳动物，优选为灵长类动物，再优选为人。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1CST1-CTSL重组蛋白的表达和纯化

蛋白表达：按照序列表SEQ ID NO：1的氨基酸序列合成基因并优化为哺乳动物表达密码子。将基因插入到含有6×His标签的pcDNA3.1载体上，得pcDNA3.1-CST1-CTSL。然后将pcDNA3.1-CST1-CTSL转化至DH5α，挑取阳性克隆并大量培养后，用高纯度质粒提取试剂盒提取重组质粒pcDNA3.1-CST1-CTSL。重组质粒转入293t细胞中，并同时转染pcDNA3.1空载体作为阴性对照，分别在含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO₂条件下培养72h，收集上清，利用0.22µm滤膜过滤上清液。

SEQ ID NO:1MNPTLILAAFCLGIASATLTFDHSLEAQWTKWKAMHNRLYGMNEEGWRRAVWEKNMKMIELHNQEYREGKHSFTMAMNAFGDMTSEEFRQVMNGFQNRKPRKGKVFQEPLFYEAPRSVDWREKGYVTPVKNQGQCGSCWAFSATGALEGQMFRKTGRLISLSEQNLVDCSGPQGNEGCNGGLMDYAFQYVQDNGGLDSEESYPYEATEESCKYNPKYSVANDTGFVDIPKQEKALMKAVATVGPISVAIDAGHESFLFYKEGIYFEPDCSSEDMDHGVLVVGYGFESTESDNNKYWLVKNSWGEEWGMGGYVKMAKDRRNHCGIASAASYPTVGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSWSPKEEDRIIPGGIYNADLNDEWVQRALHFAISEYNKATKDDYYRRPLRVLRARQQTVGGVNYFFDVEVGRTICTKSQPNLDTCAFHEQPELQKKQLCSFEIYEVPWENRRSLVKSRCQES

蛋白纯化：将所得500mL滤液进行非变性条件下的Ni-NTA 亲和层析，平衡缓冲液为50mM PBS、10mM 咪唑、150mM NaCl，pH 7.6。上样完毕后，清洗10mL；用50mM PBS、250mM咪唑、150mM NaCl，pH7.6洗脱，收集洗脱液。利用3kD超滤管浓缩蛋白溶液，将蛋白保存于pH7.4 50mM PBS缓冲液中，-80℃保存。纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳纯度鉴定，分子量大小在52kD左右，灰度分析表明蛋白纯度达到95%以上，见附图1。

实施例2 CST1-CTSL重组蛋白的活性验证和抗体配对

活性分析：以1ug/ml的重组CST1-CTSL蛋白的碳酸盐缓冲液（pH9.5），100ul体积4℃过夜包被化学发光板，梯度稀释捕获抗体和酶标抗体（浓度为0~1ug/ml），加入羊抗鼠IgG-HRP（100ng/ml）。检测发现捕获抗体和检测抗体在100ng/ml时的发光值均不低于20万，蛋白与抗体的反应曲线R²>0.99，蛋白的反应活性满足要求。

抗体配对：以1ug/ml捕获抗体包被化学发光板，加入100ul不同浓度（5~1000pg/mL）的CST1-CTSL校准品，37℃孵育60min，洗涤后加入100uL浓度为100ng/ml的辣根过氧化物酶标记的检测抗体，并于37℃孵育60min，洗涤后加入化学发光底物并测定各孔发光强度。从结果上看，捕获抗体和检测抗体配对良好，可用于双抗夹心体系构建。

实施例3 CST1-CTSL校准曲线绘制

校准曲线绘制：首先在化学发光板上4℃过夜包被捕获抗体，浓度为1μg/mL，将重组人CST1-CTSL校准品蛋白用蛋白质稳定剂稀释为0pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1500pg/mL，每孔100μL，再加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体，浓度5ng/ml，每孔100μL，37℃孵育1小时。用PBST清洗3次，加入化学发光底物并测定各孔发光强度。从校准曲线计算出被测样品的CST1-CTSL含量。校准曲线线性范围10~1500pg/mL，附图2为CST1-CTSL检测试剂盒校准曲线，其中，Y轴代表发光值对数值，X轴代表CST1-CTSL校准品的浓度对数值。

实施例4、CST1-CTSL试剂盒临床性能验证

CST1-CTSL检测试剂盒用于胃癌诊断：从医院收集胃癌患者术前血清各50例；同时从血站收集50例健康献血人员血清。使用CST1-CTSL检测试剂盒检测胃癌、正常人血清中CST1-CTSL浓度。样本浓度散点图显示，CST1-CTSL对胃癌和正常人检测结果的区分具有统计学意义，见附图3。ROC曲线统计结果显示，曲线下面积为0.87，以86pg/mL作为检测参考值，CST1-CTSL检测试剂盒特异性为90%，灵敏度为85%，见附图4。

综上所述，本发明所提供的试剂盒采用特异性针对CST1-CTSL的单克隆抗体作为捕获和检测抗体，使得试剂盒还具有灵敏度高、特异性好、检测限低及稳定性好等特性。线性范围达到10~1500pg/mL，最低检测限可达5pg/mL。CST1-CTSL复合物本身兼具CST1和CTSL蛋白的组织特异性，在检测胃癌样本时，特异性90%，灵敏度可达到85%。CST1-CTSL检测试剂盒能够用于胃癌的早期诊断、治疗过程中的疗效评估以及治疗后的转移复发监控。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海良润生物医药科技有限公司

<120> 半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与Cathepsin L1复合物作为胃癌诊断标志物的应用

<141> 2020-09-25

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 474

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 1

Met Asn Pro Thr Leu Ile Leu Ala Ala Phe Cys Leu Gly Ile Ala Ser

1 5 10 15

Ala Thr Leu Thr Phe Asp His Ser Leu Glu Ala Gln Trp Thr Lys Trp

20 25 30

Lys Ala Met His Asn Arg Leu Tyr Gly Met Asn Glu Glu Gly Trp Arg

35 40 45

Arg Ala Val Trp Glu Lys Asn Met Lys Met Ile Glu Leu His Asn Gln

50 55 60

Glu Tyr Arg Glu Gly Lys His Ser Phe Thr Met Ala Met Asn Ala Phe

65 70 75 80

Gly Asp Met Thr Ser Glu Glu Phe Arg Gln Val Met Asn Gly Phe Gln

85 90 95

Asn Arg Lys Pro Arg Lys Gly Lys Val Phe Gln Glu Pro Leu Phe Tyr

100 105 110

Glu Ala Pro Arg Ser Val Asp Trp Arg Glu Lys Gly Tyr Val Thr Pro

115 120 125

Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Thr

130 135 140

Gly Ala Leu Glu Gly Gln Met Phe Arg Lys Thr Gly Arg Leu Ile Ser

145 150 155 160

Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser Gly Pro Gln Gly Asn Glu

165 170 175

Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met Asp Tyr Ala Phe Gln Tyr Val Gln Asp

180 185 190

Asn Gly Gly Leu Asp Ser Glu Glu Ser Tyr Pro Tyr Glu Ala Thr Glu

195 200 205

Glu Ser Cys Lys Tyr Asn Pro Lys Tyr Ser Val Ala Asn Asp Thr Gly

210 215 220

Phe Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Lys Ala Leu Met Lys Ala Val Ala

225 230 235 240

Thr Val Gly Pro Ile Ser Val Ala Ile Asp Ala Gly His Glu Ser Phe

245 250 255

Leu Phe Tyr Lys Glu Gly Ile Tyr Phe Glu Pro Asp Cys Ser Ser Glu

260 265 270

Asp Met Asp His Gly Val Leu Val Val Gly Tyr Gly Phe Glu Ser Thr

275 280 285

Glu Ser Asp Asn Asn Lys Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp Gly Glu

290 295 300

Glu Trp Gly Met Gly Gly Tyr Val Lys Met Ala Lys Asp Arg Arg Asn

305 310 315 320

His Cys Gly Ile Ala Ser Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Val Gly Gly Gly

325 330 335

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

340 345 350

Ser Trp Ser Pro Lys Glu Glu Asp Arg Ile Ile Pro Gly Gly Ile Tyr

355 360 365

Asn Ala Asp Leu Asn Asp Glu Trp Val Gln Arg Ala Leu His Phe Ala

370 375 380

Ile Ser Glu Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Asp Asp Tyr Tyr Arg Arg Pro

385 390 395 400

Leu Arg Val Leu Arg Ala Arg Gln Gln Thr Val Gly Gly Val Asn Tyr

405 410 415

Phe Phe Asp Val Glu Val Gly Arg Thr Ile Cys Thr Lys Ser Gln Pro

420 425 430

Asn Leu Asp Thr Cys Ala Phe His Glu Gln Pro Glu Leu Gln Lys Lys

435 440 445

Gln Leu Cys Ser Phe Glu Ile Tyr Glu Val Pro Trp Glu Asn Arg Arg

450 455 460

Ser Leu Val Lys Ser Arg Cys Gln Glu Ser

465 470

Claims

1.半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与Cathepsin L1复合物的定量检测剂在制备用于胃癌的诊断、辅助诊断或预后分析的试剂盒中的应用；

所述定量检测剂为所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN以及所述Cathepsin L1的特异性抗体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特异性抗体用于执行免疫共沉淀或酶联免疫吸附试验以对所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与Cathepsin L1复合物进行检测。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性抗体由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列免疫得到。

5.根据权利要求1~4任一项所述的应用，其特征在于，所述特异性抗体具有用于指示信号强度的标记。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述用于指示信号强度的标记选自发色团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金或酶中的任一种或多种。

7.胃癌诊断、辅助诊断或预后分析试剂盒，其特征在于，包含权利要求1~6任一项中所定义的特异性抗体。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包含固相载体、封闭液、显色剂、CST1-CTSL融合抗原的校准品以及洗涤缓冲液中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为化学发光板。