CN103898205B - 半胱氨酸蛋白酶抑制剂sn的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN（Cystatin？SN）的新用途，具体为Cystatin？SN在制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌或食管癌标志物中的应用；本发明还公开了诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌或食管癌标志物的捕获剂，并将捕获剂用于制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌或食管癌的试剂盒，制得的试剂盒具有特异性好、灵敏度高等优点，能够用于肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌或食管癌的早期诊断、治疗过程中的疗效评估以及治疗后的移转复发监控。

Description

半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的应用
技术领域
本发明属于医学检测领域，涉及半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的应用。
背景技术
随着对肿瘤发病机理研究的不断深入，发现Cystatin家族作为组织蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶的内源性抑制剂，在肿瘤的发生、发展、浸润和转移过程中起着非常重要的作用。研究结果显示，Cystatin家族成员在不同肿瘤中的表达水平有所上升，例如Cystatin C在卵巢癌和头颈部癌症中的表达有不同水平的上升，stefin A在非小细胞肺癌中的表达水平有所增加，Cystatin F在多种肿瘤中的表达水平都有显著增加，很可能是由于在肿瘤发生、发展过程中需要组织蛋白酶的参与，先诱导其表达量增加，再激活机体本身的应激机制，导致Cystatin的表达量上升以抑制过盛的组织蛋白酶活性。但Cystatin的表达量并不与肿瘤的发展呈正相关，例如在胶质瘤中，Cystatin C的低表达意味着疾病的晚期，患者的生存期较短，且易于复发，这可能是到了肿瘤的后期阶段，会有一些其他的机制对Cystatin的水平进行调控，以促进肿瘤的进一步恶化。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN（Cystatin SN）是人类Cystatin家族成员，由CST1基因编码的含141个氨基酸的蛋白质，分子量为16.4Kda。Cystatin SN分子中含有两个二硫键，为典型的分泌蛋白，分布于体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等。据文献报道，CST1在胃癌组织中的表达量高于正常胃粘膜组织，在胃癌细胞系中的表达部位与胃癌组织较一致，且表达率随细胞系的分化程度降低而降低；临床资料分析表明，CSTl的表达与浸润深度、远处转移以及肿瘤分期（TNM分析）相关；生存分析表明，CST1表达阳性组的5年生存率显著高于无表达组；Cox回归分析表明，CSTl是一个独立预后因子；从而提示CST1可能在胃癌的发生、发展过程中发挥类似肿瘤抑制因子的作用。但迄今为止，CST1与其他癌，如胰腺癌、食管癌、肝癌和胃肠间质瘤等的关系尚未见文献报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN在制备诊断和预示胰腺癌、食管癌、肝癌或胃肠间质瘤标志物中的应用；本发明的目的之二在于提供胰腺癌、食管癌、肝癌或胃肠间质瘤标志物的捕获剂；本发明的目的之三在于提供含有前述捕获剂的试剂盒。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1. CST1基因、CST1基因的mRNA、CST1基因的cDNA、CST1基因截短片段、CST1基因编码的Cystatin SN蛋白或Cystatin SN多肽在制备诊断和预示胰腺癌、食管癌、肝癌或胃肠间质瘤标志物中的应用，所述CST1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述CST1基因截短片段是以SEQ ID NO.2、5所示核苷酸序列为上游引物，SEQ ID NO.3、6所示核苷酸序列为下游引物扩增所得，所述SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3配对，所述SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6配对。
优选的，所述CST1基因编码的Cystatin SN蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
2.胰腺癌、食管癌、肝癌或胃肠间质瘤标志物的捕获剂，所述标志物为CST1基因、CST1基因的mRNA、CST1基因的cDNA、CST1基因截短片段、CST1基因编码的Cystatin SN蛋白或Cystatin SN多肽。
优选的，所述捕获剂为识别Cystatin SN蛋白或Cystatin SN多肽的特异性抗体。
优选的，所述捕获剂为检测CST1基因、CST1基因的mRNA、CST1基因的cDNA或CST1基因的截短片段的特异引物和探针。
更优选的，所述特异引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.含有所述捕获剂的试剂或试剂盒。
优选的，所述试剂盒为CST1基因、CST1基因的mRNA、CST1基因的cDNA、CST1基因截短片段的荧光定量PCR检测试剂盒，其上游引物如SEQ ID NO.5所示，下游引物如SEQ IDNO.6所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.：7所示；或；
所述试剂盒为Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒，包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
更优选的，所述单克隆抗体为鼠抗人Cystatin SN单克隆抗体，所述多克隆抗体为兔抗人Cystatin SN多克隆抗体。
本发明的有益效果在于：本发明公开了CST1基因、CST1基因的mRNA、CST1基因的cDNA、CST1基因截短片段、CST1基因编码的Cystatin SN蛋白或Cystatin SN多肽作为检测肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌或食管癌标志物的应用，并公开了检测上述标志物的捕获剂，将捕获剂与常规试剂组成检测试剂盒（包括荧光定量PCR试剂盒和Cystatin SN蛋白酶联免疫检测试剂盒），其试剂盒具有灵敏度高、特异性好等优点，能够用于肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌或食管癌的早期诊断，其的诊断结果早于临床症状，同时还可以用于治疗过程的疗效评估和治疗后的移转复发监控。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为重组质粒结构图。
图2为CST1 mRNA绝对定量检测试剂盒检测胰腺癌ROC曲线。
图3为CST1 mRNA绝对定量检测试剂盒检测食管癌ROC曲线。
图4为CST1 mRNA绝对定量检测试剂盒检测肝癌ROC曲线。
图5为CST1 mRNA绝对定量检测试剂盒检测胃肠间质瘤ROC曲线。
图6为Cystatin SN血清检测试剂盒检测Cystatin SN蛋白的标准曲线。
图7为Cystatin SN血清检测试剂盒检测胰腺癌ROC曲线。
图8为Cystatin SN血清检测试剂盒检测食管癌ROC曲线。
图9为Cystatin SN血清检测试剂盒检测肝癌ROC曲线。
图10为Cystatin SN血清检测试剂盒检测胃肠间质瘤ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明使用的试剂如下：Taq DNA聚合酶购自罗氏公司（货号为：12032953001）；尿嘧啶-DNA 糖基化酶（UDG）购自NEB公司；dNTPs购自TAKARA公司；引物和探针由上海英潍捷基生物技术有限公司合成；CST1单克隆抗体购自美国R&D公司（货号为：MAB1285）；兔抗人CST1多克隆抗体、Cystatin SN蛋白标准品购自北京义翘神州生物技术有限公司。
实施例1 制备重组质粒标准品
重组质粒标准品制备，按照分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的步骤及条件制备：
根据CST1基因（CST1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）序列设计扩增CST1基因截短片段，具体如下：
上游引物：5’-tcgggctctcaccctcctct-3’（SEQ ID NO.2）；
下游引物：5’-agggaggcgatgctactgttta-3’（SEQ ID NO.3）。
以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为引物，人cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：上、下游引物终浓度为250nM，Taq DNA聚合酶终浓度为1U/反应；dNTPs终浓度为250 nM，其他试剂参照试剂盒说明进行。PCR反应条件为：37℃，2分钟；95℃预变性5分钟；95℃变性10秒，60℃退火并延伸30秒，进行45个循环。获得如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，将扩增获得的核苷酸序列连入pMD18-T载体中，得含CST1基因截短片段的重组质粒，结构如图1所示。将含CST1基因的重组质粒转入DH5α，筛选阳性克隆，然后提取重组质粒，作为标准品S。将重组质粒分别稀释至浓度为106copy/μL、105copy/μL、104copy/μL、2000copy/μL、500 copy/μL、250copy/μL和62.5copy/μL，并分别命名为标准品S1、标准品S2、标准品S3、标准品S4、标准品S5、标准品S6和标准品S7。
实施例2 构建CST1荧光定量PCR检测试剂盒
根据CST1基因的核苷酸序列设计检测CST1基因、CST1基因的cDNA、CST1基因的mRNA或CST1基因截短片段的绝对定量PCR引物和探针，具体如下：
上游引物为：5’-ggtactaagagccaggcaacag-3’（SEQ ID NO.5）；下游引物为：5’-agttgggctgggacttggta-3’（SEQ ID NO.6）；探针为：FAM-cggcccacctctacgtcgaagaagtaattca-TAMRA（SEQ ID NO.7）。同时以人B2M基因为内控，设计内控基因的检测引物和探针：上游引物：5’-actgaattcacccccactga-3’（SEQ ID NO.8）；下游引物：5’-cctccatgatgctgcttaca-3’（SEQ ID NO.9）；探针：FAM –tatgcctgccgtgtgaaccatgtgac- TAMRA（SEQ ID NO.10）。然后利用设计的引物和探针与其他常规试剂组成CST1 mRNA绝对定量检测试剂盒，试剂盒成分如表1所示。
表1、CST1 荧光定量PCR检测试剂盒
注：表1中的CP值为扩增曲线的交叉点(crossing point)，也称为Ct值。
（1）CST1 荧光定量PCR检测试剂盒检测胰腺癌
将CST1 荧光定量PCR检测试剂盒检测胰腺穿刺组织中CST1基因的mRNA表达量，其中胰腺癌20例，胰腺炎20例，检测体系为：上、下游引物终浓度分别为250nM，Taq DNA聚合酶终浓度1U/反应，UDG为0.5U/反应，dNTP终浓度250 nM，探针终浓度250 nM，使用RocheLightCycler®480 荧光定量PCR仪检测。将检测结果进行受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析，结果图2所示。ROC曲线分析表明，曲线下面积为0.996，被检分析物的量值（cutoff值）为1496copy时，灵敏度为95.7%，特异性为98.4%。
应用：利用CST1荧光定量PCR检测试剂盒对100例疑似胰腺癌患者进行检测，检测患者胰腺组织样本中CST1基因mRNA的表达量。结果显示，100例被检组织样本中，6例CST1基因的mRNA表达量大于1496copy，为胰腺癌患者；94例CST1基因的mRNA表达量小于1496copy，为非胰腺癌患者。
（2）CST1 荧光定量PCR检测试剂盒检测食管癌
将CST1 荧光定量PCR检测试剂盒检测食管组织样本中CST1基因的mRNA表达量，其中食管癌20例，食管炎20例，检测条件与胰腺癌相同，将检测结果绘制ROC曲线（图3）。结果表明，曲线下面积为0.837，cutoff值1036copy，诊断灵敏度79.5%，特异性88.5%。
应用：利用CST1荧光定量PCR检测试剂盒对100例疑似食管癌患者进行检测，检测患者食管组织样本中CST1基因mRNA的表达量。结果显示，100例被检组织样本中，10例CST1基因的mRNA表达量大于1036copy，为食管癌患者；90例CST1基因的mRNA表达量小于1036copy，为非食管癌患者。
（3）CST1 荧光定量PCR检测试剂盒检测肝癌
将CST1 荧光定量PCR检测试剂盒检测肝癌组织样本中CST1基因的mRNA表达量，其中肝癌20例，肝炎20例，检测条件与胰腺癌相同，将检测结果绘制ROC曲线（图4）。结果表明，曲线下面积为0.939，cutoff值1347copy，诊断灵敏度91.4%，特异性96%。
应用：利用CST1荧光定量PCR检测试剂盒对100例疑似肝癌患者进行检测，检测患者肝组织样本中CST1基因mRNA的表达量。结果显示，100例被检组织样本中，26例CST1基因的mRNA表达量大于1347copy，为肝癌患者；74例CST1基因的mRNA表达量小于1347copy，为非肝癌患者。
（4）CST1 荧光定量PCR检测试剂盒检测胃肠道间质瘤
将CST1荧光定量检测剂盒检测胃肠道间叶组织样本中CST1基因的mRNA表达量，其中胃肠道间质瘤20例，胃肠道炎20例，检测条件与胰腺癌相同，将检测结果绘制ROC曲线（图5）。结果表明，曲线下面积为0.805，cutoff值1295copy，诊断灵敏度85.7%，特异性89.7%。
应用：利用CST1荧光定量PCR检测试剂盒对100例疑似胃肠道间质瘤患者进行检测，检测患者胃肠道间叶组织样本中CST1基因mRNA的表达量。结果显示，100例被检组织样本中，7例CST1基因的mRNA表达量大于1295copy，为胃肠道间质瘤患者；93例CST1基因的mRNA表达量小于1295copy，为非胃肠道间质瘤患者。
由此可知，CST1基因的mRNA可以作为胰腺癌、肝癌、食管癌或胃肠道间质瘤的标志物，检测CST1基因的mRNA表达量可以判断是否患病。同理CST1基因的其他形式如CST1基因、CST1基因的cDNA或CST1基因截短片段均可以作为胰腺癌、肝癌、食管癌或胃肠道间质瘤的标志物。
实施例3 建立Cystatin SN血清检测反应体系及其优化
用浓度为5μg/mL鼠抗人Cystatin SN单克隆抗体包被ELISA板，于4℃条件下包被过夜，洗板；然后在质量分数为2%的BSA中室温封闭2小时，洗板；将浓度分别为0pg/mL，50pg/mL，100pg/mL，200pg/mL，400 pg/mL，800 pg/mL，1600 pg/mL的Cystatin SN蛋白标准品（编码Cystatin SN蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示）和样品加入封闭板中，于37℃反应1小时，洗板；然后用浓度为0.5μg/mL HRP标记的兔抗人Cystatin SN多克隆抗体，在37℃条件下反应1小时，洗板；再与四甲基联苯胺（TMB）反应2-3分钟，最后用浓度为2M 的硫酸终止反应，并于450nm条件下检测OD值（图6）。由图6可知，Cystatin SN酶联免疫检测的线性范围为50pg/mL-1600pg/mL，在线性范围内相关系数r≥0.990，回收率在90%~110%范围内。
检测体系优化，比对由美国R&D、英国Abcam和美国NOVUS BIOLOGICALS提供的Cystatin SN单克隆抗体，美国R&D公司和北京义翘神州生物技术有限公司生产的CystatinSN蛋白标准品和美国R&D、英国Abcam和北京义翘神州生物技术有限公司生产Cystatin SN多克隆抗体对反应体系的影响。结果表明，Cystatin SN单抗优选R&D公司提供的产品，最佳工作浓度为5μg/mL；Cystatin SN蛋白标准品和Cystatin SN多克隆抗体优选北京义翘神州生物技术有限公司产品，最佳工作浓度为0. 5μg/mL，在最佳条件下，可实现背景OD值＜0.1，能够有效区分阴性组与阳性组，且具有统计学意义。
固相载体的确定：对美国Corning、德国Greiner、美国Thermo 和丹麦Nunc 4种不同厂家生产的酶标板进行比较，结果表明，美国corning公司（货号为：9018）和thermo（货号为：468667）公司的酶标板符合背景OD值＜0.1，且信噪比较高。
包被液的选择：根据抗体包被于固相载体所需要的缓冲体系，ELISA常用包被液为缓冲盐溶液，分别用磷酸盐缓冲液（pH7.5）和碳酸盐缓冲液（pH9.6）检测包被环境对反应体系的影响，结果显示碳酸盐缓冲液（pH9.6）可满足空白组OD值＜0.1，有效区分空白组、阴性组和阳性组，信噪比较高。
稀释剂的选择：通过实验对比了2种商品化稀释剂（分别购自天津博美科生物技术有限公司（货号BMKF017-1）和上海西唐生物科技有限公司（货号C0901））和自制稀释剂的稀释效果，主要从保护蛋白能力，自身稳定性两方面评价稀释剂的稀释效果。结果显示自制稀释剂效果更佳，自制稀释剂的终浓度如下：含浓度为3m的EDTA、质量分数为0.5% 的BSA、1×PBS、质量分数为0.05% 的Tween-20和质量分数为0.02% 的硫柳汞（pH6.0）。
稳定剂的选择：使用3种不同稳定剂（具体如下：稳定剂Ⅰ：质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油和质量分数为1.3%的NaCl；稳定剂Ⅱ：质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油，质量分数为0.1%的EDTA和质量分数为1.3%的NaCl，稳定剂Ⅲ：体积分数为68.8%的PBS，体积分数为30%的胎牛血清和质量分数为0.2%的硫柳汞）分别稀释单克隆抗体、蛋白标准品和多克隆抗体至浓度为0.5mg/mL、0.16ng/mL和50μg/mL，使用时按体积比为1：100稀释。并于第0天、第7天和第14天进行检测。结果显示稳定剂Ⅲ效果最佳，具体组分为：体积分数为68.8%的PBS、体积分数为30%血清和质量分数为0.2%硫柳汞。
通过以上主要原材料的研究确定了检测体系的主要组分，建立了成熟的CystatinSN血清检测体系。
实施例4 Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒
根据实施例3中建立Cystatin SN酶联免疫检测体系构建Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒，具体组分如表2所示：
表2. Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒组分
组份 规格（96测试） 包装 备注
①酶标板 12条×8孔 不透明铝箔纸真空包装 已包被Cystatin SN单克隆抗体（5μg/mL）
②酶标抗体 100μL/管 1mL黄盖离心管 Cystatin SN多克隆抗体（浓度为5μg/mL）
③标准品 100μL/管 1mL蓝盖离心管 含浓度160ng/mL的Cystatin SN蛋白，体积分数为68.8%的PBS，质量分数为0.02%硫柳汞及体积分数为30%胎牛血清
④稀释液 25mL/瓶 无色澄清 含浓度为3mMEDTA、质量分数为0.5%BSA、1×PBS、质量分数为0.05% 的Tween-20和质量分数为0.02% 的硫柳汞（pH6.0）
⑤洗涤浓缩液 20mL/瓶 无色澄清 25×PBST储备液（含质量分数为3.75%的Tween-20）
⑥TMB底物溶液A 5.5mL/瓶 棕色不透明管，避光保存 浓度为0.4g/L 的TMB
⑦TMB底物溶液B 5.5mL/瓶 棕色不透明管，避光保存 质量分数为0.02% 的H2O2
⑧终止液 11mL/瓶 无色透明 浓度为2M的硫酸
⑨封膜 3张 用于孵育时贴在板条上 防止液体蒸发
⑩质控品 500μL/管 1mL白盖离心管 浓度为200pg/mL的Cystatin SN蛋白
评价Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒：将Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒检测Cystatin SN蛋白，在Cystatin SN蛋白浓度为160pg/mL和80pg/mL 2个水平重复检测10次，结果显示变异系数CV≤10%；用3个批号试剂盒检测同一样本，则3个批号试剂盒的批间变异系数CV≤15%。对试剂盒稳定性进行研究显示，在4℃条件下保存8个月，开封后在4℃条件下保存2个月，在0-4℃运输7天均能保持稳定。
实施例5 Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒诊断和预示胰腺癌
（1）Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒诊断胰腺癌
从上海肿瘤医院收集100例胰腺癌患者术前血清，从血站收集245例献血人员血清，每例血清1 mL。使用Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒分别检测胰腺癌患者和健康人血清中Cystatin SN浓度，并根据检测结果绘制ROC曲线（图7）。结果显示区分胰腺癌患者与正常人的cutoff值为128.33pg/mL，曲线下面积为0.908，诊断灵敏度为85%，特异性为89.6%，阳性预测值为86.6%，阴性预测值为91.5%，整体符合率为89.7%。
应用：利用Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒对100例疑似胰腺癌患者进行检测，检测患者血清中Cystatin SN蛋白浓度。结果显示，100例被检样本中，19例Cystatin SN蛋白表达量大于128.33pg/mL，为胰腺癌患者；81例Cystatin SN蛋白表达量小于128.33pg/mL，为非胰腺癌患者，与临床诊断结果一致。
（2）Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒评估胰腺癌疗效
从上海肿瘤医院取10例胰腺癌患者放疗前和放疗后的血清，检测血清中CystatinSN浓度。根据Cystatin SN浓度变化评估胰腺癌的疗效，评价标准为：Cystatin SN浓度与治疗前相比下降小于50%，判断为治疗无效；Cystatin SN浓度与治疗前相比下降大于50%，判断为病情改善；Cystatin SN浓度与治疗前相比下降大于90%，判断为有效；Cystatin SN浓度下降至128.33pg/mL以下，判断为治疗效果显著，10名胰腺癌患者的疗效评估结果如表3所示。同时，医生根据临床症状评估疗效，结果如表3所示。
表3、Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒评估胰腺癌疗效结果
患者编号 治疗前后浓度变化百分比 临床评价
1 升高10% 无效
2 降低56% 改善
3 降低17% 无效
4 降低28% 有效
5 升高5% 无效
6 降低70% 改善
7 降低39% 无效
8 降低94% 有效
9 降低33% 无效
10 降低66% 改善
由表3可知，使用Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒的评估结果是10例患者中1例对放疗有效， 6例对放疗无效，其余3例放疗后病情得到改善，与临床判断结果相比符合率达90%。
（3）Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒监控胰腺癌的转移复发
对6例来自上海肿瘤医院的放疗疗程结束后的胰腺癌患者进行跟踪随访，治疗后六周首次检测血清Cystatin SN浓度，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次（表4）。根据检测结果判断是否转移复发，判断标准为：如果Cystatin SN浓度大于cutoff值则发生了移转复发，如果Cystatin SN浓度小于cutoff值则未发生移转复发，即无进展生存，结果如表4所示。9个月时，医生根据临床症状判断胰腺癌是否发生转移复发，结果如表4所示。
表4、Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒监控胰腺癌转移复发结果
患者编号 6周pg/mL 3个月pg/mL 6个月pg/mL 9个月pg/mL 临床评价
1 120.36 126.28 128.79 117.66 无进展生存
2 189.78 178.33 196.57 216.48 转移复发
3 116.09 112.13 124.71 125.67 无进展生存
4 159.38 166.45 175.68 209.47 转移复发
5 116.45 128.34 115.47 119.88 无进展生存
6 129.68 124.39 129.48 136.46 转移复发
由表4可知，试剂盒监控结果为 6例胰腺癌患者中，有3例发生了转移复发，另外3例未发生转移复发。因此，利用Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒检测血清中Cystatin SN浓度变化可监控胰腺癌转移复发，监控结果早于临床症状和体征发现，医生可提前进行干预。
实施例6 Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒诊断和预示食管癌
（1）Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒诊断食管癌
从上海肿瘤医院收集100例食管癌患者术前血清，从血站收集245例正常献血人员血清，每例血清1mL。使用Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒分别检测食管癌患者和健康人血清中Cystatin SN浓度，根据检测结果绘制ROC曲线（图8）。结果显示，区分食管癌与健康人的cutoff值为130.47pg/mL，曲线下面积为0.854，诊断灵敏度为78%，特异性为85.1%，阳性预测值为80.6%，阴性预测值为84.5%，整体符合率为85.7%。
应用：利用Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒对100例疑似食管癌患者进行检测，检测患者血清中Cystatin SN蛋白浓度。结果显示，100例被检样本中，20例Cystatin SN蛋白表达量大于130.47pg/mL，为食管癌患者；80例Cystatin SN蛋白表达量小于130.47pg/mL，为非食管癌患者，与临床诊断结果一致。
（2）Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒用于食管癌的疗效评估
从上海肿瘤医院取10例食管癌患者化疗前和化疗后的血清，检测血清中CystatinSN浓度。根据Cystatin SN浓度变化评估食管癌的疗效，评价标准为：Cystatin SN浓度与治疗前相比下降小于50%，判断为治疗无效；Cystatin SN浓度与治疗前相比下降大于50%，判断为病情改善；Cystatin SN浓度与治疗前相比下降大于90%，判断为有效；Cystatin SN浓度下降至130.47pg/mL以下，判断为治疗效果显著，10名食管癌患者的疗效评估结果如表5所示。同时，医生根据临床症状评估化疗对食管癌的疗效，结果如表5所示。
表5、Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒评估食管癌疗效结果
患者编号 治疗前后浓度变化百分比 临床评价
1 升高1% 有效
2 降低54% 改善
3 降低27% 无效
4 降低38% 无效
5 升高9% 无效
6 降低73% 改善
7 降低34% 无效
8 降低95% 有效
9 降低37% 无效
10 降低61% 改善
由表5可知，Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒检测结果是10名食管癌患者中，其中6名患者对化疗无效，其中1名患者对化疗有效，其余3名患者化疗后病情得到改善，与临床判断对比符合率达90 %。
（3）Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒监控食管癌转移复发
对6例来自上海肿瘤医院的经化疗疗程结束后的食管癌患者进行跟踪随访，治疗后六周首次采集患者血清，检测血清中Cystatin SN浓度，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次。根据检测结果判断是否转移复发，判断标准为：如果Cystatin SN浓度大于cutoff值则发生了移转复发；如果Cystatin SN浓度小于cutoff值则未发生转移复发，即无进展生存，结果如表6所示。9个月时，医生根据临床症状判断食管癌是否发生转移复发，结果如表6所示。
表6、Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒监控食管癌转移复发结果
患者编号 6周pg/mL 3个月pg/mL 6个月pg/mL 9个月pg/mL 临床评价
1 123.36 136.28 118.79 107.66 无进展生存
2 169.78 158.33 169.57 206.48 转移复发
3 116.09 112.13 124.71 125.67 无进展生存
4 159.38 166.45 175.68 209.47 转移复发
5 116.45 128.34 115.47 119.88 无进展生存
6 129.68 124.39 129.48 126.46 无进展生存
由表6可知，试剂盒监控结果为6例食管癌患者中有2例发生了转移复发，其余4例未发生移转复发，为无进展生存。因此利用Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒检测血清中Cystatin SN的浓度变化可监控食管癌的转移复发，并早于临床症状和体征发现，为医生提前进行干预提供指导。
实施例7 Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒诊断和预示肝癌
（1）Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒诊断肝癌
从上海肿瘤医院收集100例肝癌患者的术前血清，同时从血站收集245例献血人员血清，每例血清1mL。使用Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒分别检测肝癌患者和健康人血清中Cystatin SN浓度，然后根据检测结果绘制ROC曲线（图9）。结果表明，肝癌与正常人的cutoff值为148.56pg/mL，曲线下面积为0.937，诊断灵敏度为89%，特异性为91.6%，阳性预测值为88.6%，阴性预测值为91.5%，整体符合率为89.7%。
应用：利用Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒对100例疑似肝癌患者进行检测，检测患者血清中Cystatin SN蛋白浓度。结果显示，100例被检样本中，35例Cystatin SN蛋白表达量大于148.56pg/mL，为肝癌患者；65例Cystatin SN蛋白表达量小于148.56pg/mL，为非肝癌患者，与临床诊断结果一致。
（2）Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒评估肝癌疗效
从上海肿瘤医院取10例肝癌患者放疗前和放疗结束后的血清，检测血清中Cystatin SN浓度。根据治疗前后Cystatin SN的浓度变化，评价肝癌疗效，评价标准为：Cystatin SN浓度与治疗前相比下降小于50%，判断为治疗无效；Cystatin SN浓度与治疗前相比下降大于50%，判断为病情改善；Cystatin SN浓度与治疗前相比下降大于90%，判断为有效；Cystatin SN浓度下降至148.56pg/mL以下，判断为治疗效果显著，结果如表7所示。同时，医生根据临床症状评价肝癌疗效，结果如表7所示。
表7、Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒评估肝癌疗效结果
由表7可知，试剂盒检测10名肝癌患者的结果是1名患者对放疗有效，6名患者对放疗无效，其余3名患者放疗后病情得到善，与临床判断相比符合率达90 %。
（3） Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒监控肝癌转移复发
对6例来自上海肿瘤医院的经放疗疗程结束的肝癌患者进行跟踪随访。治疗后六周首次取采集肝癌患者血清，检测的血清中Cystatin SN的浓度，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次。根据检测结果判断是否发生转移复发，判断标准为：如果Cystatin SN浓度大于cutoff值则发生了移转复发，如果Cystatin SN浓度小于cutoff则未发生移转复发，即无进展生存，结果如表8所示。9个月时，医生根据临床症状判断肝癌患者是否发生转移复发，结果如表8所示。
表8、Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒监控肝癌转移复发结果
患者编号 6周pg/mL 3个月pg/mL 6个月pg/mL 9个月pg/mL 临床评价
1 121.36 122.28 123.79 114.66 无进展生存
2 180.78 171.33 192.57 213.48 转移复发
3 119.09 118.13 127.71 126.67 无进展生存
4 199.38 186.45 175.68 269.47 转移复发
5 110.45 122.34 114.47 116.88 无进展生存
6 129.68 128.39 127.48 136.43 无进展生存
由表8可知，试剂盒检测结果是6例患者中，有2例发生了移转复发，其余4例未发生移转复发，为无进展生存。因此，利用Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒检测血清中Cystatin SN浓度变化可以监控肝癌移转复发，其结果早于临床症状和体征发现，为医生提前进行干预提供指导。
实施例8 Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒诊断和预示胃肠道间质瘤
（1）Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒用于胃肠道间质瘤诊断
从上海肿瘤医院收集100例胃肠道间质瘤（GIST）的术前血清，同时从血站收集245例献血人员血清，每例血清1 mL。使用Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒分别检测胃肠道间质瘤患者和健康人血清中Cystatin SN浓度，然后根据检测结果绘制ROC曲线（图10）。结果显示，区分GIST与正常人的cutoff值为136.16pg/mL，曲线下面积为0.929，诊断灵敏度为75%，特异性为95.1%，阳性预测值为86.2%，阴性预测值为90.3%，整体符合率为89.3%。
应用：利用Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒对100例疑似胃肠道间质瘤患者进行检测，检测患者血清中Cystatin SN蛋白浓度。结果显示，100例被检样本中，5例CystatinSN蛋白表达量大于136.16pg/mL，为胃肠道间质瘤患者；95例Cystatin SN蛋白表达量小于136.16pg/mL，为非胃肠道间质瘤患者，与临床诊断结果一致。
（2） Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒用于胃肠道间质瘤疗效评估
从上海肿瘤医院取10例胃肠道间质瘤患者的治疗前血清，用伊马替尼治疗后再取患者血清，然后检测治疗前和治疗后血清中Cystatin SN浓度，根据血清Cystatin SN浓度评估伊马替尼对胃肠道间质瘤疗效，评价标准为：Cystatin SN浓度与治疗前相比下降小于50%，判断为治疗无效；Cystatin SN浓度与治疗前相比下降大于50%，判断为病情改善；Cystatin SN浓度与治疗前相比下降大于90%，判断为有效；Cystatin SN浓度下降至136.16pg/mL以下，判断为治疗效果显著，结果如表9所示。同时，医生根据临床症状评估胃肠道间质瘤患者的疗效，结果如表9所示。
表9、Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒评估胃肠道间质瘤疗效结果
患者编号 治疗前后浓度变化百分比 临床评估
1 升高10% 无效
2 降低56% 改善
3 降低17% 无效
4 降低28% 无效
5 升高5% 无效
6 降低70% 无效
7 降低48% 无效
8 降低94% 有效
9 降低33% 无效
10 降低66% 改善
由表9可知，Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒检测结果为10例胃肠道间质瘤患者中， 6例患者对伊马替尼治疗无效，1例患者对伊马替尼治疗有效，其余3例患者用伊马替尼治疗后病情得到改善，与临床判断结果相比符合率达 90%。
（3）Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒监控胃肠道间质瘤的转移复发
对6例上海肿瘤医院经伊马替尼治疗的胃肠道间质瘤患者进行术后监控，并对患者进行跟踪随访。治疗后六周首次采集患者血清，检测血清中Cystatin SN浓度，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次。然后根据检测结果判断是否发生转移复发，判断标准为：如果Cystatin SN浓度大于cutoff值则发生了移转复发，如果Cystatin SN浓度小于cutoff则未发生移转复发，即无进展生存，其结果见表10。9个月时，医生根据临床症状判断胃肠道间质瘤患者是否发生转移复发，结果如表10所示。
表10、Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒监控胃肠道间质瘤转移复发结果
患者编号 6周pg/mL 3个月pg/mL 6个月pg/mL 9个月pg/mL 临床评价
1 130.36 136.28 128.79 117.66 无进展生存
2 189.78 178.33 196.57 216.48 转移复发
3 116.09 112.13 124.71 125.67 无进展生存
4 159.38 166.45 175.68 209.47 转移复发
5 116.45 128.34 115.47 119.88 无进展生存
6 129.68 124.39 119.48 116.46 无进展生存
由表10可知，试剂盒检测结果是6例患者中，有2例发生了转移复发，其余4例未发生移转复发，为无进展生存。因此Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒可监控胃肠道间质瘤转移复发，可早于临床症状和体征发现，为医生提前进行干预提供指导。
综上所述，Cystatin SN蛋白可以作为胰腺癌、肝癌、食管癌或胃肠道间质瘤的标志物，根据其浓度判断是否患病或发生转移复发，并根据浓度变化判断疗效。而检测过程中抗体结合位点一般为Cystatin SN蛋白的抗原表位或Cystatin SN蛋白的多肽序列，因此，Cystatin SN蛋白的抗原表位或Cystatin SN蛋白的多肽也可以作为胰腺癌、肝癌、食管癌或胃肠道间质瘤的标志物。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
<110> 王弢
<120> 半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的应用
<160> 11
<210> 1
<211> 781
<212> DNA
<213> Homo sapiens（智人）
<220>
<223> CST1基因序列
<400> 1
gggctccctg cctcgggctc tcaccctcct ctcctgcagc tccagctttg tgctctgcct 60
ctgaggagac catggcccag tatctgagta ccctgctgct cctgctggcc accctagctg 120
tggccctggc ctggagcccc aaggaggagg ataggataat cccgggtggc atctataacg 180
cagacctcaa tgatgagtgg gtacagcgtg cccttcactt cgccatcagc gagtataaca 240
aggccaccaa agatgactac tacagacgtc cgctgcgggt actaagagcc aggcaacaga 300
ccgttggggg ggtgaattac ttcttcgacg tagaggtggg ccgcaccata tgtaccaagt 360
cccagcccaa cttggacacc tgtgccttcc atgaacagcc agaactgcag aagaaacagt 420
tgtgctcttt cgagatctac gaagttccct gggagaacag aaggtccctg gtgaaatcca 480
ggtgtcaaga atcctaggga tctgtgccag gccattcgca ccagccacca cccactccca 540
ccccctgtag tgctcccacc cctggactgg tggcccccac cctgcgggag gcctccccat 600
gtgcctgcgc caagagacag acagagaagg ctgcaggagt cctttgttgc tcagcagggc 660
gctctgccct ccctccttcc ttcttgcttc taatagccct ggtacatggt acacaccccc 720
ccacctcctg caattaaaca gtagcatcgc ctccct ctga aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 780
a 781
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CST1基因上游引物
<400> 2
tcgggctctc accctcctct 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CST1基因下游引物
<400> 3
agggaggcga tgctactgtt ta 22
<210> 4
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CST1基因截短序列
<400> 4
tcgggctctc accctcctct cctgcagctc cagctttgtg ctctgcctct gaggagacca 60
tggcccagta tctgagtacc ctgctgctcc tgctggccac cctagctgtg gccctggcct 120
ggagccccaa ggaggaggat aggataatcc cgggtggcat ctataacgca gacctcaatg 180
atgagtgggt acagcgtgcc cttcacttcg ccatcagcga gtataacaag gccaccaaag 240
atgactacta cagacgtccg ctgcgggtac taagagccag gcaacagacc gttggggggg 300
tgaattactt cttcgacgta gaggtgggcc gcaccatatg taccaagtcc cagcccaact 360
tggacacctg tgccttccat gaacagccag aactgcagaa gaaacagttg tgctctttcg 420
agatctacga agttccctgg gagaacagaa ggtccctggt gaaatccagg tgtcaagaat 480
cctagggatc tgtgccaggc cattcgcacc agccaccacc cactcccacc ccctgtagtg 540
ctcccacccc tggactggtg gcccccaccc tgcgggaggc ctccccatgt gcctgcgcca 600
agagacagac agagaaggct gcaggagtcc tttgttgctc agcagggcgc tctgccctcc 660
ctccttcctt cttgcttcta atagccctgg tacatggtac acaccccccc acctcctgca 720
attaaacagt agcatcgcct ccct 744
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CST1 mRNA绝对定量上游引物
<400> 5
ggtactaagagccaggcaacag 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CST1 mRNA绝对定量下游引物
<400> 6
agttgggctg ggacttggta 20
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CST1 mRNA绝对定量探针
<400> 7
cggcccacct ctacgtcgaa gaagtaattc a 31
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B2M基因上游引物
<400> 8
actgaattca cccccactga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B2M基因下游引物
<400> 9
cctccatgat gctgcttaca 20
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B2M基因绝对定量探针
<400> 10
tatgcctgcc gtgtgaacca tgtgac 26
<210> 11
<211> 141
<212> PRT
<213> Homo sapiens（智人）
<220>
<223> Cystatin SN 氨基酸序列
<400> 11
Met Ala Gln Tyr Leu Ser Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ala Thr Leu
1 5 10 15
Ala Val Ala Leu Ala Trp Ser Pro Lys Glu Glu Asp Arg Ile Ile
20 25 30
Pro Gly Gly Ile Tyr Asn Ala Asp Leu Asn Asp Glu Trp Val Gln
35 40 45
Arg Ala Leu His Phe Ala Ile Ser Glu Tyr Asn Lys Ala Thr Lys
50 55 60
Asp Asp Tyr Tyr Arg Arg Pro Leu Arg Val Leu Arg Ala Arg Gln
65 70 75
Gln Thr Val Gly Gly Val Asn Tyr Phe Phe Asp Val Glu Val Gly
80 85 90
Arg Thr Ile Cys Thr Lys Ser Gln Pro Asn Leu Asp Thr Cys Ala
95 100 105
Phe His Glu Gln Pro Glu Leu Gln Lys Lys Gln Leu Cys Ser Phe
110 115 120
Glu Ile Tyr Glu Val Pro Trp Glu Asn Arg Arg Ser Leu Val Lys
125 130 135
Ser Arg Cys Gln Glu Ser
140 141

Claims (8)

1.检测胰腺癌标志物的试剂在制备诊断和预示胰腺癌试剂盒中的应用，所述胰腺癌标志物为 CST1基因、CST1基因的mRNA、CST1基因的cDNA、CST1基因截短片段、CST1基因编码的Cystatin SN蛋白或Cystatin SN多肽，所述CST1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述CST1基因截短片段是以SEQ ID NO.2、5所示核苷酸序列为上游引物，SEQ ID NO.3、6所示核苷酸序列为下游引物扩增所得，所述SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3配对，所述SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6配对。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述CST1基因编码的Cystatin SN蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂为胰腺癌标志物的捕获剂，所述捕获剂为识别Cystatin SN蛋白或Cystatin SN多肽的特异性抗体；
或所述捕获剂为检测CST1基因、CST1基因的mRNA、CST1基因的cDNA或CST1基因截短片段的特异引物和探针，所述特异引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂被制备成试剂盒。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述试剂盒为CST1基因、CST1基因的mRNA、CST1基因的cDNA、CST1基因截短片段的荧光定量PCR检测试剂盒，其上游引物如SEQ IDNO.5所示，下游引物如SEQ ID NO.6所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
或所述试剂盒为Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒，包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述单克隆抗体为鼠抗人Cystatin SN单克隆抗体，所述多克隆抗体为兔抗人Cystatin SN多克隆抗体。
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