CN103911426B - 半胱氨酸蛋白酶抑制剂s的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了半胱氨酸蛋白酶抑制剂S(Cystatin?S)的新用途,具体为Cystatin?S在制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物中的应用;本发明还公开了诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物的捕获剂,并将捕获剂用于制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的试剂盒,制得的试剂盒具有特异性好、灵敏度高等优点,能够用于肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的早期诊断、治疗过程中的疗效评估以及治疗后的转移复发监控。
Description
技术领域
本发明属于医学检测领域,涉及半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的应用。
背景技术
随着对肿瘤发病机理研究的不断深入,发现Cystatin家族作为组织蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶的内源性抑制剂,在肿瘤的发生、发展、浸润和转移过程中起着非常重要的作用。研究结果显示,Cystatin家族成员在不同肿瘤中的表达水平有所上升,例如CystatinC在卵巢癌和头颈部癌症中的表达有不同水平的上升,stefinA在非小细胞肺癌中的表达水平有所增加,CystatinF在多种肿瘤中的表达水平都有显著增加,很可能是由于在肿瘤发生、发展过程中需要组织蛋白酶的参与,先诱导其表达量增加,再激活机体本身的应激机制,导致Cystatin的表达量上升以抑制过里量的组织蛋白酶活性。但Cystatin的表达量并不与肿瘤的发展呈正相关,例如在胶质瘤中,CystatinC的低表达意味着疾病的晚期,患者的生存期较短,且易于复发,这可能是到了肿瘤的后期阶段,会有一些其他的机制对Cystatin的水平进行调控,以促进肿瘤的进一步恶化。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂S(CystatinS)是人类Cystatin家族成员,由CST4基因编码的含141个氨基酸的蛋白质,分子量为16.4Kda。CystatinS分子中含有两个二硫键,为典型的分泌蛋白,分布于体液和分泌物中,如眼泪、唾液、血清、血浆等。据文献报道,CST4在胃癌组织中的表达量高于正常胃粘膜组织,在胃癌细胞系中的表达部位与胃癌组织较一致,且表达率随细胞系的分化程度降低而降低。临床资料分析表明,CST4的表达与浸润深度、远处转移以及肿瘤分期(TNM分析)相关;生存分析表明,CST4表达阳性患者的5年生存率显著高于无表达组;Cox回归分析表明,CST4是一个独立预后因子;从而提示CST4可能在胃癌的发生、发展过程中发挥类似肿瘤抑制因子的作用。但迄今为止,CST4可用于胃癌的疗效评估、转移复发监控未见报道,同时也未见CST4与其他疾病如胰腺癌、食管癌、肝癌和胃肠间质瘤等相关的报道。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的CystatinS蛋白或CystatinS多肽在制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物中的应用;本发明的目的之二在于提供肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物的捕获剂;本发明的目的之三在于提供含有上述捕获剂的试剂盒。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
1.CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的CystatinS蛋白或CystatinS多肽在制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物中的应用,所述CST4基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
优选的,所述CST4基因截短片段是以SEQIDNO.2、5所示核苷酸序列为上游引物,SEQIDNO.3、6所示核苷酸序列为下游引物扩增所得的核苷酸序列,所述SEQIDNO.2与SEQIDNO.3配对,所述SEQIDNO.5与SEQIDNO.6配对。
优选的,所述CST4基因编码的CystatinS蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。
优选的,所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
2.肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物的捕获剂,所述标志物为CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的CystatinS蛋白或CystatinS多肽,所述CST4基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
优选的,所述捕获剂为识别CystatinS蛋白或CystatinS多肽的特异性抗体。
优选的,所述捕获剂为检测CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因的截短片段的特异引物和探针。
优选的,所述特异引物如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示,所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。
3.含有所述捕获剂的试剂或试剂盒。
优选的,所述试剂盒为CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因截短片段实时定量检测试剂盒,其上游引物如SEQIDNO.5,下游引物SEQIDNO.6所示,探针的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示;或,
所述试剂盒为CystatinS酶联免疫检测检测试剂盒,包括包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
更优选的,所述单克隆抗体为鼠抗人CystatinS单克隆抗体,所述多克隆抗体为兔抗人CystatinS多克隆抗体,所述显色底物为四甲基联苯胺。
本发明的有益效果在于:本发明公开了CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的CystatinS蛋白或CystatinS多肽作为检测肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的标志物,并公开了检测上述标志物的捕获剂,将捕获剂与常规试剂组成检测试剂盒,获得的试剂盒具有灵敏度高、特异性好等优点,能够用于肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的早期诊断,利用试剂盒的诊断结果可早于临床症状,同时还可以用于治疗过程的疗效评估和治疗后的转移复发监控。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图:
图1为重组质粒结构图。
图2为CST4基因的mRNA绝对定量检测试剂盒检测胰腺癌ROC曲线。
图3为CST4基因的mRNA绝对定量检测试剂盒检测食管癌ROC曲线。
图4为CST4基因的mRNA绝对定量检测试剂盒检测肝癌ROC曲线。
图5为CST4基因的mRNA绝对定量检测试剂盒检测胃肠间质瘤ROC曲线。
图6为CST4基因的mRNA绝对定量检测试剂盒检测胃癌ROC曲线。
图7为CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测CystatinS蛋白的标准曲线。
图8为CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测胰腺癌ROC曲线。
图9为CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测食管癌ROC曲线。
图10为CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测肝癌ROC曲线。
图11为CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测胃肠间质瘤ROC曲线。
图12为CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测胃癌ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明使用的试剂如下:TaqDNA聚合酶购自罗氏公司(货号为:12032953001);尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)购自NEB公司;dNTPs购自TAKARA公司;引物和探针由上海英潍捷基生物技术有限公司合成;CystatinS单克隆抗体购自美国R&D公司(货号为:MAB1296);兔抗人CystatinS多克隆抗体(货号为:11542-RP02)、CystatinS蛋白标准品(货号11542-H08H)购自北京义翘神州生物技术有限公司。
实施例1制备重组质粒标准品
重组质粒标准品制备,按照分子克隆实验指南(第三版,J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译,科学出版社,2002年)中的步骤及条件制备:
根据报道的CST4基因序列设计扩增CST4基因截短片段的引物(CST4基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示),具体如下:
上游引物:5’-ctgcctctgaggagaccatggc-3’(SEQIDNO.2);
下游引物:5’-ggcgatgctactgtttaattgcag-3’(SEQIDNO.3)。
以SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列为引物,人cDNA为模板进行PCR扩增,PCR反应体系:上、下游引物终浓度为250nM,TaqDNA聚合酶终浓度为1U/反应;dNTPs终浓度为250nM,其他试剂参照试剂盒说明书进行。PCR反应条件为:37℃,2分钟;95℃预变性5分钟;95℃变性10秒,60℃退火并延伸30秒,进行45个循环,获得如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。将扩增获得的序列连入pMD18-T载体中,得含CST4基因截短片段的重组质粒,结构如图1所示。将含CST4基因的重组质粒转入DH5α,筛选阳性克隆,然后提取重组质粒,作为标准品S。将重组质粒分别稀释至浓度为106copy/μL、105copy/μL、104copy/μL、2000copy/μL、500copy/μL、250copy/μL和62.5copy/μL,并分别命名为标准品S1、标准品S2、标准品S3、标准品S4、标准品S5、标准品S6和标准品S7。
实施例2构建CST4荧光定量PCR检测试剂盒
根据CST4基因序列设计定量检测CST4基因、CST4基因的cDNA、CST4基因的mRNA或CST4基因截短片段的引物和探针,具体如下:
上游引物为:5’-aacaaggccaccgaagatga-3’(SEQIDNO.5);下游引物为:5’-ccacctctacgtcgaagaagta-3’(SEQIDNO.6);探针为:FAM-cccaaaggtctgctccctggctcgca-TAMRA(SEQIDNO.7)。同时以人B2M基因为内控,并设计内控基因的检测引物和探针:上游引物为:5’-actgaattcacccccactga-3’(SEQIDNO.8);下游引物为:5’-cctccatgatgctgcttaca-3’(SEQIDNO.9);探针为:FAM–tatgcctgccgtgtgaaccatgtgac-TAMRA(SEQIDNO.10)。然后利用设计的引物和探针与其他常规试剂组成CST4荧光定量检测试剂盒,试剂盒成分如表1所示。
表1、CST4荧光定量PCR检测试剂盒
注:表1中的CP值为扩增曲线的交叉点(crossingpoint),也称为Ct值。
(1)利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒诊断胰腺癌
利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒检测胰腺穿刺活检组织中的CST4基因的mRNA表达量,样本来源于上海肿瘤医院,其中胰腺癌20例,胰腺炎20例,检测体系为:上、下游引物终浓度分别为250nM,TaqDNA聚合酶终浓度1U/反应,UDG为0.5U/反应,dNTP终浓度250nM,探针终浓度250nM,使用RocheLightCycler?480的荧光定量PCR仪进行检测。将检测结果作受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析,结果如图2所示。ROC曲线分析表明,曲线下面积为0.833,被检分析物的量值(cutoff值)为1346copy时,灵敏度为81.7%,特异性为79.9%。
应用:利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒对100例疑似胰腺癌患者进行检测,检测患者胰腺组织样本中CST4基因mRNA的表达量。结果显示,100例被检组织样本中,26例CST4基因的mRNA表达量大于1346copy,为胰腺癌患者;74例CST4基因的mRNA表达量小于1346copy,为非胰腺癌患者。
(2)利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒诊断食管癌
利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒检测食管组织样本中CST4基因的mRNA表达量,样本来源于上海肿瘤医院,其中食管癌20例,食管炎20例,检测条件与胰腺癌相同,将检测结果绘制ROC曲线(图3)。结果表明,曲线下面积为0.861,cutoff值1159copy时,诊断灵敏度为81.7%,特异性为84.6%。
应用:利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒对100例疑似食管癌患者进行检测,检测患者食管组织中CST4基因mRNA的表达量。结果显示,100例被检组织样本中,31例CST4基因的mRNA表达量大于1159copy,为食管癌患者;69例CST4基因的mRNA表达量小于1159copy,为非食管癌患者。
(3)利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒诊断肝癌
利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒检测肝组织样本中CST4基因mRNA的表达量,样本来源于上海肿瘤医院,其中肝癌20例,肝炎20例,检测条件与胰腺癌相同,将检测结果绘制ROC曲线(图4)。结果表明,曲线下面积为0.88,cutoff值1543copy时,诊断灵敏度为78.3%,特异性为89.9%。
应用:利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒对100例疑似肝癌患者进行检测,检测患者肝组织中CST4基因mRNA的表达量。结果显示,100例被检组织样本中,34例CST4基因的mRNA表达量大于1543copy,为肝癌患者;66例CST4基因的mRNA表达量小于1543copy,为非肝癌患者。
(4)利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒诊断胃肠道间质瘤
利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒检测胃肠道间叶组织样本中CST4基因的mRNA表达量,样本来源于上海肿瘤医院,其中胃肠道间质瘤20例,胃肠道20例,检测条件与胰腺癌相同,将检测结果绘制ROC曲线(图5)。结果表明,曲线下面积为0.887,cutoff值1439copy时,诊断灵敏度为86.7%,特异性为88.9%。
应用:利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒对100例疑似胃肠道间质瘤患者进行检测,检测患者胃肠道间叶组织中CST4基因mRNA的表达量。结果显示,100例被检组织样本中,13例CST4基因的mRNA表达量大于1439copy,为胃肠道间质瘤患者;87例CST4基因的mRNA表达量小于1439copy,为非胃肠道间质瘤患者。
(5)利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒诊断胃癌
利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒检测胃癌组织样本中CST4基因的mRNA表达量,样本来源于上海肿瘤医院,其中胃癌20例(腺癌15例,鳞癌4例,腺鳞癌1例),胃炎20例(萎缩性胃炎14例,浅表性胃炎4例,肥厚性胃炎2例),检测条件与胰腺癌相同,将检测结果绘制ROC曲线(图6)。结果表明,曲线下面积为0.933,cutoff值1443copy时,诊断灵敏度为88.3%,特异性为96.9%。
应用:使用CST4荧光定量PCR检测试剂盒对100例疑似胃癌患者进行检测,检测患者胃组织样本中CST4基因mRNA的表达量。结果显示,100例被检组织样本中,27例CST4基因的mRNA表达量大于1443copy,为胃癌患者;73例CST4基因的mRNA表达量小于1443copy,为非胃癌患者。
由此可知,CST4基因的mRNA可以作为胰腺癌、肝癌、食管癌、胃肠道间质瘤或胃癌的标志物,根据CST4基因的mRNA表达量可以判断是否患病。同理CST4基因的其他形式如CST4基因、CST4基因的cDNA或CST4基因截短片段均可以作为胰腺癌、肝癌、食管癌、胃肠道间质瘤或胃癌的标志物。
实施例3建立CystatinS酶联免疫检测反应体系及其优化
用浓度为5μg/mL鼠抗人CystatinS单克隆抗体包被ELISA板,于4℃条件下包被过夜,洗板;然后用质量分数为2%的BSA室温封闭2小时,洗板;将浓度分别为0pg/mL,50pg/mL,100pg/mL,200pg/mL,400pg/mL,800pg/mL,1600pg/mL的CystatinS蛋白标准品(编码CystatinS蛋白的氨基酸如SEQIDNO.11所示)和样品加入封闭板中,于37℃反应1小时,洗板;然后用浓度为0.5μg/mLHRP标记的兔抗人CystatinS多克隆抗体杂交,在37℃条件下反应1小时,洗板后与四甲基联苯胺(TMB)反应2-3分钟,最后用浓度为2M的硫酸终止反应,并于450nm条件下检测OD值,然后以CystatinS蛋白标准品浓度为横坐标,OD值为纵坐标绘制标准曲线(图7)。结果显示,CystatinS酶联免疫检测的线性范围为50pg/mL-1600pg/mL,在线性范围内标准品线性相关系数r≥0.990,回收率在90%~110%范围内。
检测体系优化,比对由美国R&D、英国Abcam和美国NOVUSBIOLOGICALS提供的CystatinS单克隆抗体,美国R&D公司和北京义翘神州生物技术有限公司生产的CystatinS蛋白标准品和美国R&D、英国Abcam和北京义翘神州生物技术有限公司生产的CystatinS多克隆抗体对检测体系的影响。结果表明,CystatinS单克隆抗体优选R&D公司提供的产品,最佳工作浓度为5μg/mL;CystatinS蛋白标准品和CystatinS多克隆抗体优选北京义翘神州生物技术有限公司提供的产品,最佳工作浓度为0.5μg/mL,在最佳条件下,可实现背景OD值<0.1,能够有效区分阴性组与阳性组,且具有统计学意义。
固相载体的确定:对美国Corning、德国Greiner、美国Thermo和丹麦Nunc4个不同厂家生产的酶标板进行了比较,结果表明,美国corning公司(货号为:9018)和thermo(货号为:468667)公司的酶标板符合背景OD值<0.1,且信噪比较高。
包被液的选择:根据抗体包被于固相载体所需要的缓冲体系,ELISA常用包被液为缓冲盐溶液,分别用磷酸盐缓冲液(pH7.5)和碳酸盐缓冲液(pH9.6)检测包被液对反应体系的影响,结果显示碳酸盐缓冲液(pH9.6)可满足空白组OD值<0.1,有效区分空白组、阴性组和阳性组,信噪比较高。
稀释剂的选择:实验对比了2种商品化稀释剂(购自天津博美科生物技术有限公司(货号BMKF017-1)和上海西唐生物科技有限公司(货号C0901))和1种自制稀释剂的稀释效果,主要从保护蛋白能力,自身稳定性两方面评价稀释剂的稀释效果。结果显示自制稀释剂效果最佳,自制稀释剂各组分的浓度如下:3mMEDTA、质量分数为0.5%的BSA、1×PBS、质量分数为0.05%的Tween-20和质量分数为0.02%的硫柳汞(pH6.0)。
稳定剂的选择:使用3种稳定剂(具体如下:稳定剂Ⅰ:质量分数为3%的蔗糖,体积分数为8%的甘油和质量分数为1.3%的NaCl;稳定剂Ⅱ:质量分数为3%的蔗糖,体积分数为8%的甘油,质量分数为0.1%的EDTA和质量分数为1.3%的NaCl,稳定剂Ⅲ:体积分数为68.8%的PBS,体积分数为30%的胎牛血清和质量分数为0.2%的硫柳汞)分别稀释单克隆抗体、蛋白标准品和多克隆抗体至浓度为0.5mg/mL、0.16ng/mL和50μg/mL,使用时按体积比为1:100稀释,并于第0天、第7天和第14天进行检测OD值。结果显示,稳定剂Ⅲ效果最佳,具体组分为:体积分数为68.8%的PBS、体积分数为30%胎牛血清和质量分数为0.2%硫柳汞。
通过以上成分确定检测体系的主要组分,建立成CystatinS酶联免疫检测体系。
实施例4CystatinS酶联免疫检测试剂盒
根据实施例3中建立CystatinS酶联免疫检测体系构建CystatinS酶联免疫检测试剂盒,具体组分如表2所示:
表2.CystatinS酶联免疫检测试剂盒组分
组份 | 规格(96测试) | 包装 | 备注 |
①酶标板 | 12条×8孔 | 不透明铝箔纸真空包装 | 已包被Cystatin S单克隆抗(浓度为5μg/mL) |
②酶标抗体 | 100μL/管 | 1mL黄盖离心管 | Cystatin S多克隆抗体(浓度为5μg/mL) |
③标准品 | 100μL/管 | 1mL蓝盖离心管 | 含浓度为160ng/mL的Cystatin S蛋白,体积分数为68.8%的PBS,质量分数为0.02%硫柳汞及体积分数为30%胎牛血清 |
④稀释液 | 25mL/瓶 | 无色澄清 | 含浓度为3mM EDTA、质量分数为0.5% 的BSA、1×PBS、质量分数为0.05% 的Tween-20和质量分数为0.02% 的硫柳汞(pH6.0) |
⑤洗涤浓缩液 | 20mL/瓶 | 无色澄清 | 25×PBST储备液(含质量分数为3.75%的Tween-20) |
⑥TMB底物溶液A | 5.5mL/瓶 | 棕色不透明管,避光保存 | 浓度为0.4g/L 的TMB |
⑦TMB底物溶液B | 5.5mL/瓶 | 棕色不透明管,避光保存 | 质量分数为0.02% 的H2O2 |
⑧终止液 | 11mL/瓶 | 无色透明 | 浓度为2M的硫酸 |
⑨封膜 | 3张 | 用于孵育时贴在板条上 | 防止液体蒸发 |
⑩质控品 | 500μL/管 | 1mL白盖离心管 | 浓度为200pg/mL的Cystatin S蛋白 |
评价CystatinS酶联免疫检测试剂盒:使用CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测CystatinS蛋白,将CystatinS蛋白在浓度为160pg/mL和80pg/mL两个水平重复检测10次,检测结果显示变异系数CV≤10%;用3个批号试剂盒检测同一样本,表明3个批号试剂盒的批间变异系数CV≤15%。对试剂盒稳定性进行研究显示,在4℃条件下保存8个月、开封后在4℃条件下保存2个月,在0-4℃运输7天均能保持稳定。
实施例5CystatinS酶联免疫检测试剂盒诊断和预示胰腺癌
(1)CystatinS酶联免疫检测试剂盒诊断胰腺癌
从上海肿瘤医院收集100例胰腺癌患者术前血清,同时血站收集245例正常献血人员血清,每例血清1mL。使用CystatinS酶联免疫检测试剂盒分别检测胰腺癌患者和正常人血清中的CystatinS浓度,然后根据检测结果绘制ROC曲线(图8)。结果显示区分胰腺癌患者与健康人的cutoff值为139.58pg/mL,曲线下面积为0.845,诊断灵敏度为79.6%,特异性为85.7%,阳性预测值为80.2%,阴性预测值为83.3%,整体符合率为82.6%。
应用:利用CystatinS酶联免疫检测试剂盒对100例疑似胰腺癌患者进行检测,检测患者血清中CystatinS蛋白浓度。结果显示,100例被检样本中,12例CystatinS蛋白表达量大于139.58pg/mL,为胰腺癌患者;88例CystatinS蛋白表达量小于139.58pg/mL,为非胰腺癌患者,与临床诊断结果一致。
(2)CystatinS酶联免疫检测试剂盒评估胰腺癌的疗效
取上海肿瘤医院的10例胰腺癌患者放射治疗前血清,检测血清中CystatinS蛋白浓度,治疗后再检测CystatinS浓度。根据CystatinS浓度变化评估胰腺癌的疗效,评价标准为:CystatinS浓度与治疗前相比下降小于50%,判断为治疗无效;CystatinS浓度与治疗前相比下降大于50%,判断为病情改善;CystatinS浓度与治疗前相比下降大于90%,判断为有效;CystatinS浓度下降至139.58pg/mL以下,判断为治疗效果显著,如表3所示。同时,医生根据临床症状评估疗效,结果如表3所示。
表3、CystatinS酶联免疫检测试剂盒评估胰腺癌疗效结果
患者编号 | 治疗前后浓度变化百分比 | 临床评价 |
1 | 升高3% | 有效 |
2 | 降低58% | 改善7 --> |
3 | 降低17% | 无效 |
4 | 降低28% | 无效 |
5 | 升高5% | 无效 |
6 | 降低70% | 改善 |
7 | 降低29% | 无效 |
8 | 降低94% | 有效 |
9 | 降低33% | 改善 |
10 | 降低66% | 改善 |
由表3可知,CystatinS酶联免疫检测试剂盒的检测结果为10例胰腺癌患者中,其中1例患者对放疗有效,5例患者对放疗无效,其余4例患者放疗后改善作用,与临床结果对比符合率达80%。
(3)CystatinS血清检测试剂盒监控胰腺癌的转移复发
对6例来自上海肿瘤医院的疗程结束后的胰腺癌患者进行跟踪随访,治疗后六周首次采集患者血清,检测血清中CystatinS浓度,以后每三个月检测一次,跟踪九个月,检测四次。根据检测结果判断是否转移复发,判断标准为:如果CystatinS浓度大于cutoff值则发生了转移复发,如果CystatinS浓度小于cutoff则未发生转移复发,即无进展生存,结果如表4所示。9个月时,医生根据临床症状评价胰腺癌患者是否发生转移复发,结果如表4所示。
表4、CystatinS酶联免疫检测试剂盒监控胰腺癌转移复发结果
患者编号 | 6周pg/mL | 3个月pg/mL | 6个月pg/mL | 9个月pg/mL | 临床评价 |
1 | 121.36 | 136.28 | 138.79 | 127.66 | 无进展生存 |
2 | 169.78 | 178.33 | 196.57 | 216.48 | 转移复发 |
3 | 106.09 | 102.13 | 114.71 | 115.67 | 无进展生存 |
4 | 159.38 | 166.45 | 175.68 | 209.47 | 转移复发 |
5 | 116.45 | 128.34 | 115.47 | 119.88 | 无进展生存 |
6 | 129.68 | 124.39 | 119.48 | 126.46 | 无进展生存 |
由表4可知,对6例胰腺癌患者转移复发监控发现,有2例出现了转移复发,其余4例无进展生存,与临床评价结果相同。因此利用CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测血清CystatinS浓度变化,可监控胰腺癌转移复发,使用该试剂盒监控可早于临床症状和体征发现,为医生提前进行干预提供指导。
实施例6CystatinS酶联免疫检测试剂盒诊断和预示食管癌
(1)CystatinS酶联免疫检测试剂盒诊断食管癌
从上海肿瘤医院收集100例食管癌患者术前血清,同时从血站收集245例健康献血人员血清;每例血清1mL。使用CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测食管癌患者和健康人血清中的CystatinS浓度,根据检测结果绘制ROC曲线(图9)。结果显示,区分食管癌与健康人的cutoff值为149.66pg/mL,曲线下面积为0.883,诊断灵敏度为83.6%,特异性为86.3%,阳性预测值为82.6%,阴性预测值为82.6%,整体符合率为81.8%。
应用:利用CystatinS酶联免疫检测试剂盒对100例疑似食管癌患者进行检测,检测患者血清中CystatinS蛋白浓度。结果显示,100例被检组织样本中,11例CystatinS蛋白浓度大于149.66pg/mL,为食管癌患者;89例CystatinS蛋白浓度小于149.66pg/mL,为非食管癌患者,与临床诊断结果一致。
(2)CystatinS酶联免疫检测试剂盒评估食管癌疗效
从上海肿瘤医院收集10例食管癌患者血清,化疗前检测CystatinS浓度,治疗结束后再检测CystatinS浓度。根据CystatinS浓度变化对食管癌进行疗效评估,评价标准为:CystatinS浓度与治疗前相比下降小于50%,判断为治疗无效;CystatinS浓度与治疗前相比下降大于50%,判断为病情改善;CystatinS浓度与治疗前相比下降大于90%,判断为有效;CystatinS浓度下降至149.66pg/mL以下,判断为治疗效果显著,10名食管癌患者的疗效评估结果如表5所示。同时医生根据临床症状评价食管癌的疗效,结果如表5所示。
表5、CystatinS酶联免疫检测试剂盒评估食管癌疗效结果
患者编号 | 治疗前后浓度变化百分比 | 临床评价 |
1 | 升高5% | 无效 |
2 | 降低48% | 有效 |
3 | 降低16% | 无效 |
4 | 降低30% | 无效 |
5 | 升高7% | 无效 |
6 | 降低67% | 改善 |
7 | 降低28% | 无效 |
8 | 降低91% | 有效 |
9 | 降低34% | 无效 |
10 | 降低69% | 无效 |
由表5可知,试剂盒检测结果是10名食管癌患者中,其中有7名患者对化疗无效,1名患者对化疗有效,其余2名患者化疗后病情得到改善,与临床判断对比符合率达80%。
(3)CystatinS酶联免疫检测试剂盒监控食管癌转移复发
对6例来自上海肿瘤医院的经化疗结束的食管癌患者进行跟踪随访,治疗后六周首次采集患者血清,检测血清中CystatinS浓度,以后每三个月检测一次,跟踪九个月,检测四次。根据检测结果判断是否发生转移复发,判断标准为:如果CystatinS浓度大于cutoff值,表明发生了转移复发,如果CystatinS浓度小于cutoff值,表明未发生转移复发,为无进展生存,结果如表6所示。9个月时,医生根据临床症状判断食管癌患者是否发生转移复发,结果如表6所示。
表6、CystatinS酶联免疫检测试剂盒监控食管癌转移复发结果
患者编号 | 6周pg/mL | 3个月pg/mL | 6个月pg/mL | 9个月pg/mL | 临床评价 |
1 | 123.36 | 126.28 | 137.79 | 125.66 | 无进展生存 |
2 | 169.18 | 178.23 | 196.37 | 216.48 | 转移复发 |
3 | 106.19 | 102.33 | 114.51 | 115.77 | 无进展生存 |
4 | 159.38 | 166.45 | 175.68 | 209.47 | 转移复发9 --> |
5 | 116.45 | 128.35 | 115.46 | 119.87 | 无进展生存 |
6 | 129.69 | 124.38 | 119.47 | 126.46 | 无进展生存 |
由表6可知,试剂盒检测结果是6例食管癌患者中有2例出现了转移复发,其余4例无进展生存,与临床评价结果一致。因此可以利用CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测血清CystatinS浓度变化来监控食管癌转移复发,并且利用试剂盒监控结果早于临床症状和体征发现,为医生提前进行干预提供指导。
实施例7CystatinS酶联免疫检测试剂盒诊断和预示肝癌
(1)CystatinS酶联免疫检测试剂盒诊断肝癌
从上海肿瘤医院收集100例肝癌患者的术前血清,同时从血站收集245例献血人员血清,每例血清1mL。使用CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测肝癌患者和健康人血清中CystatinS浓度,然后根据检测结果绘制ROC曲线(图10)。结果表明,肝癌与正常人的cutoff值为169.38pg/mL,曲线下面积为0.857,诊断灵敏度为77.8%,特异性为89.2%,阳性预测值为80.9%,阴性预测值为85.4%,整体符合率为84.3%。
应用:利用CystatinS酶联免疫检测试剂盒对100例疑似肝癌患者进行检测,检测血清中CystatinS蛋白浓度。结果显示,100例被检样本中,29例CystatinS蛋白浓度大于169.38pg/mL,为肝癌患者;71例CystatinS蛋白浓度小于169.38pg/mL,为非食管癌患者,与临床诊断结果一致。
(2)CystatinS酶联免疫检测试剂盒评估肝癌疗效
取10例上海肿瘤医院的肝癌患者放疗前血清,检测CystatinS浓度,治疗结束后再取血清检测CystatinS浓度。根据治疗前后CystatinS的浓度变化,评价肝癌疗效,评价标准为:CystatinS浓度与治疗前相比下降小于50%,判断为治疗无效;CystatinS浓度与治疗前相比下降大于50%,判断为病情改善;CystatinS浓度与治疗前相比下降大于90%,判断为有效;CystatinS浓度下降至169.38pg/mL以下,判断为治疗效果显著,其检测结果如表7所示。同时,医生根据临床症状评价肝癌疗效,结果如表7所示。
表7、CystatinS酶联免疫检测试剂盒评估肝癌疗效结果
由表7可知,试剂盒检测10名患者的结果为,6名患者治疗后无效,3名患者治疗后病情得到改善,只有1名患者治疗有效,与临床判断相比符合率达90%。
(3)CystatinS酶联免疫检测试剂盒监控肝癌转移复发
对6例放疗结束后的肝癌患者进行跟踪随访(患者来自上海肿瘤医院),治疗后六周首次取采集患者血清,检测血清中CystatinS浓度,以后每三个月检测一次,跟踪九个月,共检测四次。然后根据检测结果判断是否发生转移复发,评价标准为:如果CystatinS浓度大于cutoff值表明出现了转移复发,如果CystatinS浓度小于cutoff值表明未出现转移复发,即无进展生存,其检测结果见表8。9个月时,医生根据患者临床症状评价肝癌患者是否发生转移复发,结果如表8所示。
表8、CystatinS酶联免疫检测试剂盒监控肝癌转移复发结果
患者编号 | 6周pg/mL | 3个月pg/mL | 6个月pg/mL | 9个月pg/mL | 临床评价 |
1 | 129.36 | 139.28 | 137.79 | 126.66 | 无进展生存 |
2 | 169.78 | 178.33 | 196.27 | 216.38 | 转移复发 |
3 | 116.09 | 122.13 | 134.71 | 125.67 | 无进展生存 |
4 | 159.98 | 166.85 | 175.78 | 209.67 | 转移复发 |
5 | 136.45 | 138.34 | 125.47 | 139.88 | 无进展生存 |
6 | 129.68 | 121.39 | 112.48 | 121.49 | 无进展生存 |
由表8可知,试剂盒检测结果为10例患者中有2例出现了转移复发,其余4例未出现转移复发,为无进展生存,与临床评价一致。因此,CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测血清CystatinS浓度变化可对肝癌转移复发进行监控,其结果监控结果早于临床症状和体征发现肝癌患者复发转移,为医生提前进行干预提供指导。
实施例8CystatinS酶联免疫检测试剂盒诊断和预示胃肠道间质瘤
(1)CystatinS酶联免疫检测试剂盒诊断胃肠道间质瘤
从上海肿瘤医院收集100例胃肠道间质瘤(GIST)患者的术前血清,同时从血站收集245例献血人员血清,每例血清1mL。使用CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测胃肠道间质瘤患者和健康人血清中CystatinS浓度,然后根据检测结果绘制ROC曲线(图11)。结果显示,区分GIST与正常人的cutoff值为149.29pg/mL,曲线下面积为0.898,诊断灵敏度为75%,特异性为95.1%,阳性预测值为86.2%,阴性预测值为90.3%,整体符合率为89.3%。
应用:利用CystatinS酶联免疫检测试剂盒对100例疑似胃肠道间质瘤患者进行检测,检测血清中CystatinS蛋白浓度。结果显示,100例被检样本中,8例CystatinS蛋白浓度大于149.29pg/mL,为胃肠道间质瘤患者;92例CystatinS蛋白浓度小于149.29pg/mL,为非食管癌患者,与临床诊断结果一致。
(2)CystatinS酶联免疫检测试剂盒评估胃肠道间质瘤疗效
从上海肿瘤医院取10例胃肠道间质瘤患者的治疗前血清,用伊马替尼治疗后再取患者血清,然后检测治疗前和治疗后血清中CystatinS浓度,并根据血清中CystatinS浓度变化评估伊马替尼对胃肠道间质瘤的疗效。评价标准为:CystatinS浓度与治疗前相比下降小于50%,判断为治疗无效;CystatinS浓度与治疗前相比下降大于50%,判断为病情改善;CystatinS浓度与治疗前相比下降大于90%,判断为治疗有效;CystatinS浓度下降至149.29pg/mL以下,判断为治疗效果显著(表9)。同时,医生根据临床症状评估胃肠道间质瘤的疗效,结果如表9所示。
表9、CystatinS酶联免疫检测试剂盒评估胃肠道间质瘤疗效结果
患者编号 | 治疗前后浓度变化百分比 | 临床评价 |
1 | 升高7% | 无效 |
2 | 降低58% | 改善 |
3 | 降低17% | 无效 |
4 | 降低28% | 有效 |
5 | 升高5% | 无效 |
6 | 降低70% | 改善 |
7 | 降低48% | 改善 |
8 | 降低94% | 有效 |
9 | 降低33% | 无效 |
10 | 降低66% | 改善 |
由表9可知,试剂盒检测结果是10例胃肠道间质瘤患者中,其中6例患者治疗无效,其中1例患者治疗有效,其余3例患者治疗后病情得到改善,与临床判断结果对比符合率达80%。
(3)CystatinS酶联免疫检测试剂盒监控胃肠道间质瘤的转移复发
对6例经伊马替尼治疗结束后的胃肠道间质瘤患者进行术后监控(患者来自上海肿瘤医院),治疗后六周首次采集患者血清,检测血清中CystatinS浓度,以后每隔三个月检测一次,跟踪九个月,共检测四次。然后根据检测结果判断是否发生转移复发,评价标准为:如果CystatinS浓度大于cutoff值,表明发生了转移复发;如果CystatinS浓度小于cutoff值表明未发生转移复发,为无进展生存,结果见表10。9个月时,医生根据临床症状判断胃肠道间质瘤患者是否发生转移复发,结果如图10所示。
表10、CystatinS酶联免疫检测试剂盒监控胃肠道间质瘤转移复发结果
患者编号 | 6周pg/mL | 3个月pg/mL | 6个月pg/mL | 9个月pg/mL | 临床评价 |
1 | 131.36 | 146.28 | 128.79 | 127.66 | 无进展生存 |
2 | 169.78 | 178.33 | 196.57 | 216.48 | 转移复发 |
3 | 106.09 | 102.13 | 114.71 | 115.67 | 无进展生存 |
4 | 159.38 | 166.45 | 175.68 | 209.47 | 转移复发 |
5 | 116.45 | 128.34 | 115.47 | 119.88 | 无进展生存 |
6 | 139.68 | 124.39 | 119.48 | 126.46 | 无进展生存 |
由表10可知,试剂盒检测结果是被检的6例患者中,其中2例有转移复发,其余4例无进展生存。因此利用CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测血清中CystatinS浓度变化,可监控胃肠道间质瘤转移复发,监控结果早于临床症状和体征发现,为医生提前进行干预提供指导。
实施例9CystatinS酶联免疫检测试剂盒诊断和预示胃癌
(1)CystatinS酶联免疫检测试剂盒诊断胃癌
从上海肿瘤医院收集100例胃癌患者的术前血清,同时从血站收集245例健康献血人员血清,每例血清1mL。使用CystatinS酶联免疫检测试剂盒分别检测胃癌患者和健康人血清中CystatinS浓度,然后根据检测结果绘制ROC曲线(图12)。结果显示,区分胃癌患者与健康人的cutoff值为96.0125pg/mL,曲线下面积为0.845,诊断灵敏度为76%,特异性为85.3%。
应用:利用CystatinS酶联免疫检测试剂盒对100例疑似胃癌患者进行检测,检测血清中CystatinS蛋白浓度。结果显示,100例被检样本中,23例CystatinS蛋白浓度大于96.0125pg/mL,为胃癌患者;77例CystatinS蛋白浓度小于96.0125pg/mL,为非胃癌患者,与临床诊断结果一致。
(2)CystatinS酶联免疫检测试剂盒评估胃癌疗效
从上海肿瘤医院取10例胃癌患者的治疗前血清,经化疗后再取患者血清,然后检测治疗前和治疗后血清中CystatinS浓度,并根据血清中CystatinS浓度评估化疗对胃癌疗效(表11)。评价标准为:CystatinS浓度与治疗前相比下降小于50%,判断为治疗无效;CystatinS浓度与治疗前相比下降大于或等于50%,判断为病情改善;CystatinS浓度与治疗前相比下降大于或等于90%,判断为治疗有效;CystatinS浓度下降至96.0125pg/mL以下,判断为治疗效果显著。同时,医生根据临床结果评价胃癌的疗效,结果如表11所示。
表11、CystatinS酶联免疫检测试剂盒评估胃癌疗效结果
患者编号 | 治疗前后浓度变化百分比 | 临床评价 |
1 | 升高4.2% | 无效 |
2 | 降低60.9% | 无效 |
3 | 降低18.8% | 无效 |
4 | 降低25.7% | 有效 |
5 | 升高8.9% | 无效 |
6 | 降低71.8% | 改善 |
7 | 降低23.3% | 无效 |
8 | 降低90.6% | 有效 |
9 | 降低29.7% | 无效 |
10 | 降低63.7% | 改善 |
由表11可知,试剂盒评估结果是10例胃癌患者中,其中6例治疗无效,其中1例治疗有效,其余3例治疗后病情得到改善,与临床判断结果相比符合率达80%。
(3)CystatinS酶联免疫检测试剂盒监控胃癌的转移复发
对6例来自上海肿瘤医院的经化疗结束后的胃癌患者进行术后监控,并对患者进行跟踪随访。治疗后六周首次采集患者血清,检测血清中CystatinS浓度,以后每隔三个月检测一次,跟踪九个月,共检测四次。然后根据检测结果判断是否发生转移复发,评价标准为:如果CystatinS浓度大于cutoff值,表明发生了转移复发;如果CystatinS浓度小于cutoff值,表明未发生转移复发,为无进展生存,结果见表12。9个月时,医生根据临床症状评价胃癌患者是否发生转移复发,结果如表12所示。
表12、CystatinS酶联免疫检测试剂盒监控胃癌转移复发结果
患者编号 | 6周pg/mL | 3个月pg/mL | 6个月pg/mL | 9个月pg/mL | 临床评价 |
1 | 96.36 | 79.28 | 77.79 | 86.66 | 无进展生存 |
2 | 169.08 | 168.33 | 196.67 | 216.68 | 转移复发 |
3 | 64.09 | 74.13 | 83.71 | 95.47 | 无进展生存 |
4 | 153.98 | 165.85 | 176.78 | 259.67 | 转移复发 |
5 | 63.45 | 66.34 | 73.47 | 64.88 | 无进展生存 |
6 | 72.68 | 73.39 | 84.48 | 75.49 | 无进展生存 |
由表12可知,试剂盒检测结果是6例患者中2例患者发生了转移复发,其余4例患者无进展生存,与临床评价一致。因此,利用CystatinS酶联免疫检测试剂盒检测血清中CystatinS浓度变化,结果可监控胃肠道间质瘤转移复发,监控结果早于临床症状和体征发现,为医生提前进行干预提供指导。
综上所述,CystatinS蛋白可以作为胰腺癌、肝癌、食管癌、胃肠道间质瘤或胃癌的标志物,根据其表达量变化判断是否患病。而检测过程中抗体结合位点一般为CystatinS蛋白的抗原表位或CystatinS蛋白多肽,因此,CystatinS蛋白的抗原表位或CystatinS蛋白的多肽也可以作为胰腺癌、肝癌、食管癌、胃肠道间质瘤或胃癌的标志物。
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
<110>王弢
<120>半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的应用
<160>11
<210>1
<211>736
<212>DNA
<213>Homosapiens(智人)
<220>
<223>CST4基因序列
<400>1
ggctctcaccctcctctcctgcagctccagctttgtgctctgcctctgaggagaccatgg60
cccggcctctgtgtaccctgctactcctgatggctaccctggctggggctctggcctcga120
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aaacagtagcatcgcc736
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CST4基因上游引物
<400>2
ctgcctctgaggagaccatggc22
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CST4基因下游引物
<400>3
ggcgatgctactgtttaattgcag24
<210>4
<211>697
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CST4基因截短序列
<400>4
ctgcctctgaggagaccatggcccggcctctgtgtaccctgctactcctgatggctaccc60
tggctggggctctggcctcgagctccaaggaggagaataggataatcccaggtggcatct120
atgatgcagacctcaatgatgagtgggtacagcgtgcccttcacttcgccatcagcgagt180
acaacaaggccaccgaagatgagtactacagacgcccgctgcaggtgctgcgagccaggg240
agcagacctttgggggggtgaattacttcttcgacgtagaggtgggccgcaccatatgta300
ccaagtcccagcccaacttggacacctgtgccttccatgaacagccagaactgcagaaga360
aacagttgtgctctttcgagatctacgaagttccctgggaggacagaatgtccctggtga420
attccaggtgtcaagaagcctaggggtctgtgccaggccagtcacaccgaccaccaccca480
ctcccacccactgtagtgctcccacccctggactggtggcccccaccctgcgggaggcct540
ccccatgtgcctgtgccaagagacagacagagaaggctgcaggagtcctttgttgctcag600
cagggcgctctgccctccctccttccttcttgcttctaatagacctggtacatggtacac660
acacccccacctcctgcaattaaacagtagcatcgcc697
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CST4mRNA绝对定量上游引物
<400>5
aacaaggccaccgaagatga20
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CST4mRNA绝对定量下游引物
<400>6
ccacctctacgtcgaagaagta22
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CST4mRNA绝对定量探针
<400>7
cccaaaggtctgctccctggctcgca26
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M基因上游引物
<400>8
actgaattcacccccactga20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M基因下游引物
<400>9
cctccatgatgctgcttaca20
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M基因绝对定量探针
<400>10
tatgcctgccgtgtgaaccatgtgac26
<210>11
<211>141
<212>PRT
<213>Homosapiens(智人)
<220>
<223>CystatinS氨基酸序列
<400>11
MetAlaArgProLeuCysThrLeuLeuLeuLeuMetAlaThrLeu
151015
AlaGlyAlaLeuAlaSerSerSerLysGluGluAsnArgIleIle
202530
ProGlyGlyIleTyrAspAlaAspLeuAsnAspGluTrpValGln
354045
ArgAlaLeuHisPheAlaIleSerGluTyrAsnLysAlaThrGlu
505560
AspGluTyrTyrArgArgProLeuGlnValLeuArgAlaArgGlu
657075
GlnThrPheGlyGlyValAsnTyrPhePheAspValGluValGly
808590
ArgThrIleCysThrLysSerGlnProAsnLeuAspThrCysAla
95100105
PheHisGluGlnProGluLeuGlnLysLysGlnLeuCysSerPhe
110115120
GluIleTyrGluValProTrpGluAspArgMetSerLeuValAsn
125130135
SerArgCysGlnGluAla
140141
Claims (8)
1.检测肝癌标志物的试剂在制备诊断和预示肝癌试剂盒中的应用,所述标志物为CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的CystatinS蛋白或CystatinS多肽,所述CST4基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述CST4基因截短片段是以SEQIDNO.2、5所示核苷酸序列为上游引物,SEQIDNO.3、6所示核苷酸序列为下游引物扩增所得的核苷酸序列,所述SEQIDNO.2与SEQIDNO.3配对,所述SEQIDNO.5与SEQIDNO.6配对。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述CST4基因编码的CystatinS蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述试剂为肝癌标志物的捕获剂,所述标志物为CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的CystatinS蛋白或CystatinS多肽,所述CST4基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;
所述捕获剂为识别CystatinS蛋白或CystatinS多肽的特异性抗体;
或所述捕获剂为检测CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因截短片段的特异引物和探针;
所述特异引物如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示,所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述试剂被制备成试剂盒。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述试剂盒为CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因截短片段实时定量检测试剂盒,其上游引物如SEQIDNO.5,下游引物SEQIDNO.6所示,探针的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示;或,
所述试剂盒为CystatinS酶联免疫检测试剂盒,包括包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于:所述单克隆抗体为鼠抗人CystatinS单克隆抗体,所述多克隆抗体为兔抗人CystatinS多克隆抗体,所述显色底物为四甲基联苯胺。
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