ES2634629T3 - Integrina alfa-V-beta 6 para el diagnóstico/pronóstico del carcinoma colorrectal - Google Patents

Integrina alfa-V-beta 6 para el diagnóstico/pronóstico del carcinoma colorrectal Download PDF

Info

Publication number
ES2634629T3
ES2634629T3 ES14712691.6T ES14712691T ES2634629T3 ES 2634629 T3 ES2634629 T3 ES 2634629T3 ES 14712691 T ES14712691 T ES 14712691T ES 2634629 T3 ES2634629 T3 ES 2634629T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
ligand
colorectal carcinoma
indicator protein
integrin
indicator
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14712691.6T
Other languages
English (en)
Inventor
Gerhard ROGLER
Michael Scharl
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Zuerich
Original Assignee
Universitaet Zuerich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47997214&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2634629(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Universitaet Zuerich filed Critical Universitaet Zuerich
Application granted granted Critical
Publication of ES2634629T3 publication Critical patent/ES2634629T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un método para el diagnóstico del carcinoma colorrectal en un paciente, que comprende detectar, en una muestra de sangre obtenida de dicho paciente, una proteína indicadora seleccionada entre el grupo compuesto por la subunidad de integrina alfa(v), la subunidad de integrina beta(6) y un heterodímero que comprende las subunidades de integrina alfa(v) y beta(6).

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Integrina alfa-V-beta 6 para el diagnostico/pronostico del carcinoma colorrectal
El carcinoma colorrectal es el tercer tumor mas frecuente en todo el mundo. Aunque el carcinoma colorrectal puede ser tratado suficientemente y con frecuencia incluso se puede curar a condicion de que el tumor sea pequeno y se detecte en una etapa temprana, el pronostico de los pacientes que padecen carcinoma colorrectal metastasico no es satisfactorio, ya que muchos no sobreviven mas alla de 5 anos.
Hasta la fecha, sin embargo, no existen marcadores fiables disponibles, en particular marcadores sericos. Los marcadores tumorales comunes para el carcinoma colorrectal incluyen el antlgeno carcinoembrionario (CEA, del ingles carcinoembryonic antigen) y CA19-9. Sin embargo, estos marcadores tumorales no son especlficos para el carcinoma colorrectal. Ademas, ademas no son lo suficientemente sensibles para el diagnostico definitivo de la enfermedad y pueden servir solo como marcadores de progreso durante el curso de la enfermedad. Pueden ser muy elevados en pacientes sin carcinoma colorrectal e incluso pueden estar en niveles normales en pacientes con carcinoma colorrectal muy avanzado.
Teniendo en cuenta la importancia crucial de un diagnostico precoz para el resultado y el pronostico de los pacientes con carcinoma colorrectal, existe una necesidad medica considerable de biomarcadores solubles para el diagnostico no invasivo, economico y de alto rendimiento del carcinoma colorrectal. Dichos biomarcadores pueden ser utiles para i) mejorar la prediccion del riesgo y el pronostico del carcinoma colorrectal, ii) proporcionar un diagnostico mas precoz y mas fiable del carcinoma colorrectal y iii) permitir controlar la progresion y la regresion del carcinoma colorrectal en tratamiento.
Por tanto, el objetivo de la presente invencion es proporcionar biomarcadores para el diagnostico del carcinoma colorrectal que mejoren el estado de la tecnica. Este objetivo se consigue mediante la materia objeto de las reivindicaciones independientes.
Mediante el analisis de suero de pacientes, se descubrio sorprendentemente que la integrina alfa(v)beta(6) (integrina avp6) puede servir como un biomarcador del carcinoma colorrectal. Las muestras de suero se obtuvieron de pacientes de control sanos y de pacientes con carcinoma colorrectal. Los niveles de integrina avp6 se analizaron mediante ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA). Se descubrieron niveles elevados de integrina avp6 en el grupo de pacientes con carcinoma colorrectal, lo que demuestra la importancia diagnostica de la integrina avp6.
Las secuencias de las subunidades de integrina alfa(v) y beta(6) estan definidas por UniProt N.° P06756 y UniProt N.° P18564.
Las subunidades de integrina alfa(v) y beta(6) forman el heterodlmero integrina alfa(v)beta(6) (integrina avp6).
De acuerdo con un primer aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para el diagnostico o el pronostico del carcinoma colorrectal en un paciente o para la evaluacion del riesgo de desarrollar o de haber desarrollado un carcinoma colorrectal en un paciente, comprendiendo dicho metodo la deteccion de una protelna indicadora seleccionada entre el grupo compuesto por la subunidad de integrina alfa(v), la subunidad de integrina beta(6) y el heterodlmero de integrina alfa(v) beta(6). En algunas realizaciones, el metodo se realiza ex vivo en una muestra obtenida del paciente, en particular una muestra de sangre.
Puede usarse cualquier metodo conocido para la deteccion de la protelna indicadora (subunidad de integrina alfa(v), subunidad de integrina beta(6) o el heterodlmero de integrina alfa(v) beta(6)) en una muestra tal como fluidos corporales. Los metodos que se tienen en consideracion son, a modo de ejemplo no limitante, la cromatografla, la espectrometrla de masas (y combinaciones de la misma), ensayos enzimaticos, la electroforesis y ensayos basados en anticuerpos (como ELISA, RIA (radioinmunoensayo, por sus siglas en ingles), EIA (inmunoensayo enzimatico, por sus siglas en ingles), CLIA (inmunoensayos de quimioluminiscencia, por sus siglas en ingles) (vease Zhou et al., J Zhejiang Univ Sci B. Diciembre de 2005; 6(12):1148-1152 y las referencias citadas en el mismo), CEDIA (inmunoensayo de donador de la enzima clonado, por sus siglas en ingles) (vease Hamwi et al., Am J Clin Pathol. Octubre de 2000; 114(4):536-43 y las referencias citadas en el mismo), CMIA (inmunoensayo de micropartlculas quimioluminiscentes, por sus siglas ingles) (vease Berry et al., Clin Chem. Octubre de 1988; 34(10):2087-90 y las referencias citadas en el mismo), MEIA (inmunoensayo enzimatico por micropartlculas, por sus siglas en ingles) (vease Rodrigues et al., Mem Inst Oswaldo Cruz. Mayo de 2009; 104(3):434-40 y las referencias citadas en el mismo), FPIA (inmunoensayo de polarizacion de fluorescencia, por sus siglas en ingles) (vease Stricher et al., Biochem J. 15 de agosto de 2005; 390 (Parte 1):29-39 y las referencias citadas en el mismo), GLORIA (inmunoensayo rapido de lectura optica marcado con oro, por sus siglas en ingles) (vease Armenta et al., Trends in Analytical Chamistry, Vol. 27, No. 4, 2008 y las referencias citadas en el mismo), analisis de micromatrices, inmunoensayos totalmente automatizados o roboticos y ensayos de aglutinacion de latex).
Los metodos bioanallticos modernos facilitan la deteccion y el aislamiento directo de las protelnas, es decir sin la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
union previa de la protelna a un anticuerpo u otro ligando selectivo. La muestra puede someterse, por ejemplo, a uno o mas desarrollos de cromatografla, seguidos de espectroscopia de masas o analisis por espectroscopia de masas multidimensional (HPCL-EM; CL-EMEM) para identificar el componente protelnico pertinente de una muestra cuantitativamente. Pueden preceder al analisis etapas de preparation de la muestra para retirar, por ejemplo, celulas o componentes sangulneos no pertinentes.
En el contexto de la presente memoria descriptiva, el termino "cantidad" tambien se refiere a la concentration. Es evidente que a partir de la cantidad total de un compuesto de interes en una muestra de tamano conocido, la concentracion del compuesto puede calcularse y viceversa.
En el contexto de la presente invention el termino "muestra" se refiere a cualquier componente de la muestra independientemente de la separation de los componentes y abarca el contenido protelnico de una muestra de sangre procesada mediante varias etapas de separacion o lavado.
Se ofrecen diversos metodos de muestreo para poner en practica la invencion. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de sangre, en particular una muestra de sangre periferica. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de suero, en particular obtenida a partir de una muestra de sangre periferica.
Algunas realizaciones incluyen el uso de uno o mas ligandos especlficamente reactivos a una protelna indicadora seleccionada entre el grupo compuesto por la subunidad de integrina alfa(v) y la subunidad de integrina beta(6).
En algunas realizaciones, el metodo comprende la detection de la protelna indicadora mediante la detection de la presencia de un ligando unido a la protelna indicadora, en el que el ligando es especlficamente reactivo a la protelna indicadora.
Un ligando, en particular un ligando especlficamente reactivo a una protelna indicadora, de acuerdo con cualquier aspecto o realization de la invencion, puede ser cualquier molecula que se una a la protelna indicadora seleccionada entre el grupo compuesto por la subunidad de integrina alfa(v) y la subunidad de integrina beta(6) con afinidad y especificidad altas.
Alta afinidad en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a la constante de disociacion de la union del ligando a la protelna indicadora, en la que la constante de disociacion es de 10-7, 10-8 o 10-9 mol/l o menos y en la que el ligando no se une a protelnas de control con caracterlsticas estructurales no relacionadas. Son protelnas de control, a modo de ejemplo no limitante, protelnas plasmaticas tales como albuminas, globulinas, lipoprotelnas, fibrinogenos, protrombina, protelnas de fase aguda, marcadores tumorales tales como CEA, CA19-9 o AFP y transferrina.
Alta especificidad en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a la relation de la protelna indicadora correctamente detectada y la suma de todos los polipeptidos detectados, en la que la relacion es del 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 99 % o el 99,9 %.
La expresion "ligando unido a la protelna indicadora" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere en particular a un ligando que esta unido no covalentemente a la protelna indicadora con afinidad y especificidad altas.
La expresion "detectar la presencia de un ligando" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere en particular a la deteccion de una cantidad del ligando que es igual o superior al llmite de deteccion (LOD, por sus siglas en ingles).
En ciertas realizaciones, el ligando es un anticuerpo.
En ciertas realizaciones, el ligando es una inmunoglobulina gamma.
En ciertas realizaciones, el ligando es un anticuerpo monoclonal que se une a o que se genera contra la subunidad de integrina alfa(v) o la subunidad de integrina beta(6).
Un ejemplo no limitante de dicho anticuerpo monoclonal es el anticuerpo contra la subunidad de integrina beta(6) de USCNK Life Sciences Inc., Wuhan, China (Kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para la integrina p6, E92099Hu).
En ciertas realizaciones, se emplea el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma ATCC HB12382 (documento US 7.150.871) como ligando.
En ciertas realizaciones, el ligando es un fragmento Fab de un anticuerpo. Un fragmento Fab es el fragmento de union a antlgeno de un anticuerpo, especlficamente reactivo a la protelna indicadora.
En otras realizaciones, el ligando es un anticuerpo de dominio unico (sdAb o nanocuerpo), por ejemplo un anticuerpo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de fragmento variable monocatenario (scFv) seleccionado por metodos de presentacion de fagos, o un anticuerpo de camelido, especificamente reactivo a la proteina indicadora.
Como alternativa, un ligando empleado en la practica de la invencion puede ser una molecula obtenida por ingenieria genetica o seleccionada para mostrar una especificidad y una afinidad altas por la proteina indicadora. Dicha molecula obtenida por ingenieria genetica o seleccionada puede ser un polipeptido similar a anticuerpo o un anticuerpo sintetico seleccionado por presentacion de fagos (vease Pini et al., J. Biol. Chem. (1998) 273, 2176921776) y las referencias citadas en el mismo o por otro metodos de seleccion evolutiva). Como alternativa, el ligando puede ser un polinucleotido o Spiegelmer con una alta selectividad para la proteina indicadora (por ejemplo SELEX, vease Ellington y Szostak, Nature 346, 818-822 y las referencias citadas en el mismo).
Una molecula similar a anticuerpo puede ser, pero no se limita a, una proteina de repeticion, tal como una "proteina de repeticion de anquirina disenada" (Molecular Partners, Zurich).
En otras realizaciones de la invencion, el ligando es un ligando de la integrina avb6, como LAP-TGF-p, osteopontina, fibronectina o miembros de la familia ADAM.
En otras realizaciones de la invencion, el ligando es un antagonista de la proteina indicadora, tal como una molecula pequena o un peptido ciclico (vease el documento EP 1754714 A1).
De acuerdo con algunas realizaciones, el metodo de la invencion comprende adicionalmente las etapas de poner en contacto, en una primera etapa de contacto, la muestra con un primer ligando especificamente reactivo a la proteina indicadora, y determinar, en una etapa de cuantificacion, la cantidad de proteina indicadora unida al ligando.
En algunas realizaciones, el metodo comprende de este modo las siguientes etapas:
- se pone en contacto sangre u otra muestra de fluido obtenida de un paciente, opcionalmente despues de un tratamiento para la retirada de componentes irrelevantes, con una superficie, como consecuencia de lo cual los componentes de la muestra se adhieren a la superficie (por ejemplo, a traves de interacciones de carga o interacciones hidrofobas);
- opcionalmente, se anade un reactivo de bloqueo para bloquear cualquier superficie que permanezca sin recubrir por la muestra y de este modo pueda conducir a la union del anticuerpo posterior u otros ligandos. Son ejemplos de dichos reactivos de bloqueo detergentes (por ejemplo, Triton X-100 o Tween) o proteinas (por ejemplo albumina de suero bovino, leche en polvo no grasa, caseina o gelatina de pescado).
- un primer ligando especificamente reactivo a la proteina indicadora (subunidad de integrina alfa(v), subunidad de integrina beta(6) o su heterodimero) se une a la proteina indicadora unida a la superficie;
- un ligando especificamente reactivo a el primer ligando se pone en contacto con el primer ligando y se determina la cantidad de proteina indicadora unida al primer ligando;
- opcionalmente, se introduce una etapa de lavado entre la primera y la segunda etapa para retirar cualquier componente de la muestra que no interactue con la superficie. Otra etapa de lavado puede seguir a la segunda etapa de contacto y preceder a la determinacion de la proteina indicadora.
En ciertas realizaciones, el ligando especificamente reactivo a el primer ligando es un anticuerpo. Si el primer ligando es un anticuerpo, el ligando especificamente reactivo a el primer ligando puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal especifico para el primer anticuerpo o fragmentos del mismo, tales como las regiones Fc o Fab. En ciertas realizaciones, el anticuerpo especificamente reactivo a el primer anticuerpo se fija o es especificamente susceptible de fijarse a una actividad enzimatica o un marcador detectable.
En un ELISA clasico el ligando especificamente reactivo a el primer ligando es un anticuerpo especificamente reactivo a la parte Fc de la IgG o IgM humana y lleva a una actividad enzimatica o marcador. Normalmente, el anticuerpo especificamente reactivo a el primer anticuerpo esta fijado a peroxidasa de rabano picante o a un marcador fluorescente.
En realizaciones en las que el primer ligando es un anticuerpo que esta marcado con biotina, el ligando especificamente reactivo a el primer ligando es estreptavidina o avidina que se unen fuertemente a la biotina fijada al primer ligando. En dichas realizaciones, la avidina o la estreptavidina se fijan entonces a una actividad enzimatica o a un marcador detectable.
En algunas realizaciones, la deteccion de la proteina indicadora se realiza en un inmunoensayo homogeneo, tal como EMIT (tecnica de inmunoensayo multiplicada por enzima, por sus siglas en ingles) (Beresini et al., Clin Chem. Noviembre de 1993; 39 (11 Parte 1):2235-41 y las referencias citadas en el mismo) o un inmunoensayo homogeneo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
basado en TERF (Kreisig et al., Anal Chem. 1 de junio 2011; 83(11):4281-7 y las referencias citadas en el mismo).
En el inmunoensayo homogeneo basado en TERF, a la muestra se le adiciona una cantidad fija de peptido derivatizado con un fluoroforo fuera del sitio de reconocimiento de anticuerpos (peptido donador). Este peptido tiene una menor afinidad por el sitio de reconocimiento de anticuerpos de la protelna indicadora. Si no hay ninguna protelna indicadora presente, el peptido donador se une al anticuerpo marcado con aceptor, apagando la intensidad de emision del donador debido a la TERF. Si la protelna indicadora esta presente, el peptido donador compite con el analito, dando como resultado una senal mas alta debido al peptido donador parcialmente liberado.
En algunas realizaciones, el ligando tiene una cualidad fluorescente o luminiscente y la determinacion de la cantidad de protelna indicadora se realiza mediante citometrla activada por fluorescencia. Una cualidad fluorescente o luminiscente en el sentido de la invencion se refiere a la capacidad del primer ligando de emitir luz despues de la excitacion por la luz (de una longitud de onda mas corta que la longitud de onda de excitacion).
En algunas realizaciones, el metodo de acuerdo con la invencion implicara la comparacion de la cantidad determinada de protelna con un patron. Una medicion absoluta puede conseguir la precision y la validez deseadas, por ejemplo, si puede alcanzarse una determinacion reproducible de la union, como es el caso para los ensayos de resonancia de plasmon superficial (SPR, por sus siglas en ingles) con un dispositivo de SPR correctamente calibrado, o las lecturas espectroscopicas en HPLC, donde la integral del cromatograma es proporcional a la cantidad de analito.
En algunas realizaciones, el ligando esta fijado a una superficie. Una superficie es la superficie de un pocillo de microtitulacion, un dispositivo de laboratorio en un chip (LOC, por sus siglas en ingles, analisis de microfluidos), una micromatriz o el material de la matriz de un inmunoensayo de flujo lateral.
Un ligando se fija, en el contexto de la presente invencion, si el ligando esta unido a la superficie por enlaces covalentes o no covalentes de manera que la fijacion resista etapas de lavado repetidas con tampon acuoso de pH 5-8. Un ejemplo de fijacion es un enlace covalente, por ejemplo, por enlace ester o amida o puente disulfuro; otro es el enlace estreptavidina-biotina o la adsorcion simple de protelnas a superficies polimericas. Los ligandos pueden fijarse a superficies de oro, por ejemplo, mediante grupos sulfuro.
En algunas realizaciones, la superficie es la superficie de un chip de microbalanza de resonancia de plasmon superficial o cuarzo, que permitira la medicion directa de la cantidad de protelna indicadora unida al ligando por medio de los cambios efectuados en las propiedades flsicas del chip. La cantidad de protelna indicadora se determina de este modo directamente.
De acuerdo con algunas realizaciones, la etapa de cuantificacion comprende adicionalmente el uso de un segundo ligando con especificidad por la protelna del indicador fijado. El segundo ligando se une a una seccion de superficie diferente de la diana con el fin de permitir que el primer y el segundo ligando sean capaces de unirse de forma conjunta.
En algunas realizaciones, el ligando, en particular el primer ligando y/o el segundo ligando lleva una actividad enzimatica o marcador, tal como una peroxidasa, para permitir ajustar el metodo en los formatos de ELISA bien establecidos. Otros marcadores pueden ser, pero no se limitan a, una actividad fosfatasa o luciferasa, o el marcador detectable es un marcador radiactivo o una partlcula de oro.
En algunas realizaciones, el ligando, en particular el primer ligando y/o el segundo ligando tienen una cualidad opticamente detectable tal como un marcador de color, una cualidad fluorescente, una fosforescente o una luminiscente.
En general, los marcadores adecuados son marcadores cromogenos, es decir, enzimas que pueden usarse para convertir un sustrato en un compuesto coloreado o fluorescente detectable, marcadores espectroscopicos, por ejemplo, marcadores fluorescentes o marcadores que presentan un color visible, marcadores de afinidad que pueden desarrollarse por un compuesto especlfico adicional para el marcador y que permite la facil deteccion y cuantificacion o cualquier otro marcador adecuado para formatos de ELISA convencionales. Los ejemplos de marcadores fluorescentes o marcadores que presentan un color visible incluyen, sin estar restringidos a, isotiocianato de fluorescelna (FITC), rodamina, aloficocianina (APC), peridinin clorofila (PerCP), ficoeritrina (PE), Alexa Fluors (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), compuestos fluorescentes DyLight (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) Colorantes ATTO (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Alemania), Colorantes BODIPY (colorantes a base de 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) y similares.
Un marcador o una actividad enzimatica opticamente detectables pueden detectarse en una superficie.
En algunas realizaciones, el metodo de acuerdo con la invencion comprende de este modo las siguientes etapas:
- en una primera etapa de contacto, una muestra de sangre u otra muestra de fluido obtenida de un paciente se
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
pone en contacto, opcionalmente despues de un tratamiento para la retirada de componentes irrelevantes, con una superficie sobre la que se fija un primer ligando especlficamente reactivo a la protelna indicadora (subunidad de integrina alfa(v), subunidad de integrina beta(6) o su heterodlmero);
- en una segunda etapa de contacto, un segundo ligando se pone en contacto con la superficie y se determina la cantidad del segundo ligando.
- Opcionalmente, se introduce una etapa de lavado entre la primera y la segunda etapa de contacto para retirar cualquier componente de la muestra distinto de la protelna indicadora. De este modo, la muestra se retira junto con cualquier componente previamente contenido en la misma que no se hubiera unido por el primer ligando. Otra etapa de lavado puede seguir a la segunda etapa de contacto y preceder a la determinacion del segundo ligando.
De acuerdo con algunas realizaciones, el primer y el segundo ligando se fijan a los respectivos componentes de un sistema que permite determinar una medicion cuantitativa de companeros emparejados por proximidad, tal como el "ensayo homogeneo de proximidad luminiscente amplificado (ALPHA, por sus siglas en ingles)" comercializado por Perkin Elmer, con lo que el oxlgeno singlete se transfiere de un companero donador a un aceptor, dando como resultado la emision de luz, si los dos companeros estan a 200 nm de distancia. Dicha disposicion permite la practica de la invencion en solucion.
De acuerdo con otras realizaciones, un volumen llquido de muestra se coloca en un area de muestra compuesta de manera que proporcione fuerzas capilares que actuan para transportar al menos una parte de la muestra hacia un area de analisis. Entre el area de muestra y el area de analisis, o como parte del area de muestra, se proporciona un area de conjugado. Se proporcionan primeros ligandos especlficos para la protelna indicadora, sin fijacion a la matriz, en el area de conjugado, y tras la union a la protelna indicadora en la muestra, estos primeros ligandos son arrastrados con el flujo capilar al area de analisis. Los primeros ligandos de acuerdo con la presente realizacion de la invencion se conjugan con micropartlculas de latex o de oro o con protelnas enzimaticamente activas. Los segundos ligandos se fijan al area de analisis, formando una llnea. Tras la union de las protelnas indicadoras (con primeros ligandos fijados) a los segundos ligandos, los "sandwiches" resultantes de segundo ligando, protelna indicadora y primer ligando forman una llnea, que puede ser visible como tal (si las partlculas se fijan a los primeros ligandos) o puede volverse visible proporcionando un sustrato para una actividad enzimatica fijada al primer ligando. La presente realizacion se denomina ensayo de flujo lateral.
En algunas realizaciones, el nivel de protelna o protelnas indicadoras de la muestra se compara con los niveles correspondientes de una muestra o muestras de un sujeto o sujetos sanos. Un nivel alterado en comparacion con el nivel de la muestra de un sujeto sano es indicativo de una enfermedad o del riesgo de desarrollar la enfermedad.
De acuerdo con ciertas realizaciones, los niveles medidos de protelna indicadora (subunidad de integrina alfa(v), subunidad de integrina beta(6) o su heterodlmero) indica si un individuo padece carcinoma colorrectal o tiene un riesgo aumentado de desarrollar dicha enfermedad. Las expresiones utilizadas en este contexto, es decir, "nivel no aumentado", "nivel no elevado", "niveles aumentados" y "niveles disminuidos" son conocidas o pueden determinarse por el experto en la materia de acuerdo con, por ejemplo, el procedimiento esbozado en los parrafos siguientes.
En algunas realizaciones, el nivel de la protelna indicadora se compara con un umbral definido. En algunas realizaciones, el umbral de la protelna indicadora se define como entre 2 y 10 ng de integrina avp6, subunidad de integrina alfa(v) o subunidad de integrina beta(6)/ml. En algunas realizaciones, el umbral de la protelna indicadora se define como entre 3 y 8 ng de integrina avp6, subunidad de integrina alfa(v) o subunidad de integrina beta(6)/ml. En algunas realizaciones, el umbral de la protelna indicadora se define como 4 ng de integrina avp6, subunidad de integrina alfa(v) o subunidad de integrina beta(6)/ml. Los pacientes con un nivel serico o plasmatico de integrina avp6, subunidad de integrina alfa(v) o subunidad de integrina beta(6) > 2 ng/ml, > 3 ng/ml o > 4 ng/ml muestran un aumento de la probabilidad de padecer la enfermedad metastasica, un tumor indiferenciado, un tumor mas avanzado y una menor esperanza de supervivencia mas alla de 5 anos. Un nivel serico de integrina avp6, subunidad de integrina alfa(v) o subunidad de integrina beta(6) > 2 ng/ml, 3 ng/ml o > 4 ng/ml puede servir como un indicador de enfermedad avanzada y un marcador pronostico para la supervivencia mas corta de los respectivos pacientes.
El experto en la materia es capaz de determinar los valores reales correspondientes al "nivel no aumentado", "nivel no elevado", "nivel aumentado" y "nivel disminuido" para los marcadores bioqulmicos relevantes. Por ejemplo, los niveles pueden asignarse de acuerdo con percentiles de los niveles observados en una muestra representativa de individuos aparentemente sanos, normalmente por debajo de una edad de 50 anos. La muestra debe ser de un tamano suficiente para producir resultados estadlsticamente significativos (por ejemplo, al menos 100, mas preferentemente al menos 500, mas preferentemente al menos 1000 individuos). Un nivel no aumentado puede corresponder, a modo de ejemplo, al nivel maximo observado en el percentil 97,5 % de los individuos sanos. Como alternativa, los niveles pueden determinarse como "intervalos normales" como se sabe en el estado de la tecnica.
Los niveles tambien pueden determinarse o refinarse adicionalmente mediante estudios realizados en individuos mediante la comparacion de niveles de protelna indicadora de individuos aparentemente sanos con individuos que
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
padecen carcinoma colorrectal. Dichos estudios pueden permitir tambien adaptar los niveles de acuerdo con el tipo de enfermedad y/o ciertos subgrupos de pacientes, por ejemplo, pacientes de edad avanzada, pacientes sometidos a medicacion o pacientes con un cierto estilo de vida.
El valor de los niveles considerados como "aumentados" o "disminuidos" tambien puede elegirse de acuerdo con la sensibilidad o la especificidad (astringencia) de exclusion deseadas. Cuanto mayor es la sensibilidad deseada, menor es la especificidad de exclusion y viceversa. En el ejemplo anterior, cuanto mayor es el percentil elegido para determinar cada nivel, mas estricto es el criterio de exclusion, es decir, menos individuos serlan considerados "individuos en riesgo".
El metodo de la invencion tambien permite la determinacion del riesgo o de la probabilidad de un individuo de padecer carcinoma colorrectal. En el contexto de la presente invencion, los terminos "riesgo" o "probabilidad" se refieren a la probabilidad de un paciente en particular de desarrollar carcinoma colorrectal. El grado de riesgo puede estar aumentado, no aumentado, aumentado o muy aumentado. "Riesgo no aumentado" o "pequena probabilidad" significa que al parecer existe muy poco o ningun aumento del riesgo de padecer o desarrollar carcinoma colorrectal en comparacion con el riesgo promedio de un individuo sano.
El grado de riesgo se asocia al nivel de protelnas indicadoras. Un nivel no alterado de protelnas indicadoras indica un riesgo no aumentado, un nivel alterado de protelnas indicadoras indica un riesgo aumentado y un nivel muy alterado de protelnas indicadoras indica un riesgo muy aumentado.
Si se altera el nivel de protelna indicadora (subunidad de integrina alfa(v), subunidad de integrina beta (6) o su heterodlmero), podrla recomendarse al paciente someterse a procedimientos adicionales de diagnostico tales como una colonoscopia, o un tratamiento primario o intervenciones secundarias como el inicio de cambios terapeuticos de estilo de vida, terapia farmacologica dependiendo de la constelacion de factores de riesgo y revisiones a intervalos regulares. Si el metodo de diagnostico de la presente invencion indica un riesgo aumentado o muy aumentado, esa information puede utilizarse para recomendar el tratamiento adicional del individuo.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invencion, se proporciona el uso de un dispositivo para el diagnostico del carcinoma colorrectal, en el que el dispositivo comprende una superficie, y dicha superficie comprende un ligando especlficamente reactivo a la protelna indicadora (subunidad de integrina alfa(v), subunidad de integrina beta(6) o su heterodlmero).
En algunas realizaciones, la superficie es una placa de ELISA, un dispositivo de LOC, un chip de resonancia de plasmon superficial, una superficie de un sensor de microbalanza de cuarzo o el material de la matriz de un inmunoensayo de flujo lateral.
De acuerdo con otro aspecto mas de la invencion, se proporciona el uso de un kit de partes para el diagnostico del carcinoma colorrectal en un paciente o para evaluar el riesgo de desarrollar o de haber desarrollado un carcinoma colorrectal de un paciente, comprendiendo dicho kit un primer ligando y un segundo ligando, siendo ambos ligandos especlficamente reactivos a una protelna indicadora seleccionada entre la subunidad de integrina alfa(v), la subunidad de integrina beta(6) y su heterodlmero.
De acuerdo con ciertas realizaciones del presente aspecto de la invencion, el primer ligando se fija a la superficie de una placa de microtitulacion y el segundo ligando comprende una actividad enzimatica o una actividad luminiscente.
En algunas realizaciones, el ligando es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de cadena unica o un anticuerpo de dominio unico.
El descubrimiento en el que se basa la presente invencion proporciona pruebas de que la integrina avp6 o su subunidad alfa (v) o beta (6) puede servir como un biomarcador del carcinoma colorrectal. Los niveles sericos de integrina avp6, de la subunidad de integrina alfa (v) o de la subunidad de integrina beta (6) estan significativamente elevados en los pacientes que padecen carcinoma colorrectal. Los niveles sericos de integrina avp6, subunidad de integrina alfa (v) o subunidad de integrina beta (6) en los pacientes de control sanos estan en o por debajo del nivel de detectabilidad.
En principio, los biomarcadores que indican la aparicion del carcinoma colorrectal serlan buenos indicadores de enfermedad. En comparacion con los predictores de riesgo convencionales un marcador de enfermedad existente de este tipo tambien deberla permitir una prediction del riesgo absoluto mas reproducible en diferentes poblaciones que los factores de riesgo cuya penetrancia esta fuertemente influenciada por factores ambientales.
En ciertas realizaciones, el metodo de la invencion se usa para el control de la progresion y la regresion del carcinoma colorrectal tras el tratamiento. Hasta el momento la progresion y la regresion del carcinoma colorrectal solo podlan evaluarse mediante tecnicas de imagen. En ciertas realizaciones, el metodo de la invencion se usa para controlar el exito del tratamiento mediante el analisis de sangre simple. La disponibilidad de dicho control de sangre es ventajosa no solo para el tratamiento cllnico de los pacientes, sino tambien para el desarrollo de farmacos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
novedosos, debido a que dicho biomarcador puede usarse como marcador sustituto en ensayos de fase 3 sin criterios de valoracion.
En ciertas realizaciones, el metodo de la invencion se usa en el diagnostico y la estrategia de tratamiento agudos del carcinoma colorrectal. Hasta el momento este diagnostico era posible ya sea mediante formacion de imagenes radiologicas, tales como la exploracion por tomografla axial computarizada o la exploracion por resonancia magnetica o mediante endoscopia. Sin embargo, estos procedimientos pueden tener efectos secundarios graves, por ejemplo debido a la radiacion o el riesgo de perforation o lesiones intestinales.
En ciertas realizaciones, el metodo de la invencion se usa para predecir el estadio del tumor de acuerdo con la clasificacion TNM, as! como para el pronostico de los pacientes que padecen carcinoma colorrectal. Hasta el momento, no existla un marcador disponible que fuera capaz de predecir el estadio del tumor, as! como el
pronostico y la supervivencia de pacientes con carcinoma colorrectal adecuadamente. Sin embargo, dicha
information serla de gran ayuda en el tratamiento de pacientes con carcinoma colorrectal.
En ciertas realizaciones, el metodo de la invencion se usa para predecir si hay presentes ciertas mutaciones asociadas al carcinoma colorrectal en el tejido tumoral de los pacientes, a saber, mutaciones en el gen que codifica el receptor del factor de crecimiento epidermico, el gen K-Ras y el gen B-Raf. Hasta el momento estos diagnosticos
eran posibles solamente mediante la evaluation histopatologica y/o genetica molecular de la muestra de tejido
tumoral tomada por endoscopia o cirugla. Sin embargo, estos procedimientos pueden tener efectos secundarios graves, por ejemplo debido al riesgo de perforacion o lesiones intestinales y ademas son muy caros.
De acuerdo con otro aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para determinar la progresion del carcinoma colorrectal, en el que el metodo comprende el metodo para el diagnostico o pronostico del carcinoma colorrectal, o para evaluar el riesgo de un paciente de desarrollar o haber desarrollado un carcinoma colorrectal de acuerdo con el primer aspecto de la invencion, en el que la progresion del carcinoma colorrectal se determina mediante la detection o cuantificacion (determination de la cantidad de) la protelna indicadora.
En algunas realizaciones, la protelna indicadora se mide en el momento del diagnostico en la sangre o el suero del paciente respectivo para determinar o evaluar la progresion del carcinoma colorrectal y la medicion se repite sistematicamente, en particular cada tres meses.
En algunas realizaciones, un aumento en el nivel sangulneo o serico de la protelna indicadora en cualquier punto temporal despues de la medicion inicial es indicativo de la progresion del carcinoma colorrectal.
De acuerdo con otro aspecto mas de la invencion, se proporciona un metodo para la determinacion de la eficacia de una terapia para un carcinoma colorrectal, en el que el metodo comprende el metodo de acuerdo con el primer aspecto de la invencion, en el que se determina la remision o la progresion del carcinoma colorrectal mediante la deteccion o cuantificacion de la protelna indicadora.
En algunas realizaciones, con el fin de determinar la eficacia de una terapia del carcinoma colorrectal, la protelna indicadora se mide en el momento del diagnostico y antes de un tratamiento antineoplasico, tal como la cirugla, la radiacion o la quimioterapia, en la sangre o el suero del paciente respectivo, en particular antes del primer tratamiento antineoplasico y se repite sistematicamente, en particular cada tres meses.
En algunas realizaciones, una disminucion en el nivel sangulneo o serico de la protelna indicadora en cualquier punto temporal despues del tratamiento antineoplasico (por ejemplo en caso de cirugla o radiacion), en particular despues de tres meses o durante el tratamiento antineoplasico (por ejemplo en caso de quimioterapia) es indicativa de la eficacia de la terapia respectiva para el carcinoma colorrectal, en el que ninguna disminucion en el nivel sangulneo o serico de la protelna indicadora indica una eficacia insuficiente o inexistente de la terapia antineoplasica respectiva.
De acuerdo con otro aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para la estadificacion de un carcinoma colorrectal, en el que el metodo comprende el metodo de acuerdo con el primer aspecto de la invencion, en el que el carcinoma colorrectal es estadifica mediante la deteccion o cuantificacion de la protelna indicadora.
En algunas realizaciones, un nivel sangulneo o serico de la protelna indicadora por encima de 4 ng/ml indica un carcinoma colorrectal que se caracteriza por un estadio tumoral de al menos T2, M1 y/o G2 de acuerdo con el sistema de estadificacion TNM (desarrollado y mantenido por la Union para el control Internacional del cancer).
La medicion de la presencia de integrina avp6, la subunidad de integrina alfa (v) o la subunidad de integrina (36 (ITGB6) en la sangre, en particular en el suero, es una alternativa barata, rapida y no invasiva. Los biomarcadores que estan disponibles actualmente y que se asocian a la aparicion del carcinoma colorrectal, tal como el antlgeno carcinoembrionario (CEA) o CA19-9, no son suficientemente especlficos ni sensibles para los fines descritos anteriormente. Por tanto, la presente invencion no solo es util para identificar pacientes en riesgo, sino tambien para controlar las intervenciones y para obtener informacion que desempena un papel crltico para el tratamiento adicional
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de los pacientes.
La invention se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y las figuras, de los que pueden derivar mas ventajas y realizaciones de las invenciones:
Breve descripcion de las figuras
Fig. 1 Los niveles sericos de integrina avp6 estan aumentados en los pacientes con carcinoma colorrectal. Los niveles sericos de integrina avp6 son mas altos en los pacientes con carcinoma colorrectal que en los pacientes con enfermedad inflamatoria activa, en los pacientes con enfermedad de Crohn fistulizante o en los pacientes de control sanos. El analisis por ELISA usando muestras de suero de 10 pacientes de control sanos, 20 pacientes con enfermedad de Crohn que presentan un tipo de enfermedad inflamatoria y 20 pacientes con EC que presentan un curso de la enfermedad fistulizante. Adicionalmente, se detectaron niveles sericos de ITGB6 en una cohorte no seleccionada de 80 pacientes con cancer colorrectal (CoCa) (cualquier estado T, cualquier estado N, cualquier estado M).
Fig. 2 Los niveles sericos de ITGB6 > 4 ng/ml son un factor pronostico de supervivencia. Los pacientes que presentan un nivel serico de ITGB6 > 4 ng/ml muestran una tasa de supervivencia mas corta que los pacientes con un nivel serico de ITGB6 < 4 ng/ml.
Fig. 3 Los niveles sericos de ITGB6 > 4 ng/ml son un factor pronostico del estadio del tumor. Los pacientes que presentan un nivel serico de ITGB6 > 4 ng/ml muestran un mayor estado T que los pacientes con un nivel serico de ITGB6 < 4 ng/ml.
Fig. 4 Los niveles sericos de ITGB6 > 4 ng/ml son un factor de pronostico para la metastasis tumoral. Los pacientes que presentan un nivel serico de ITGB6 > 4 ng/ml muestran siempre metastasis a diferencia de los pacientes con un nivel serico de ITGB6 < 4 ng/ml.
Fig. 5 Los niveles sericos de ITGB6 > 4 ng/ml son un factor pronostico para la diferenciacion del tejido tumoral. Los pacientes que presentan un nivel serico de ITGB6 > 4 ng/ml muestran mayores grados G que los pacientes con un nivel serico de ITGB6 < 4 ng/ml.
Ejemplo 1: ELISA
Se analizaron muestras de suero de pacientes de control sanos (controles, n = 10), pacientes con enfermedad intestinal inflamatoria aguda (EII activa, n = 20), pacientes con enfermedad de Crohn fistulizante (n = 20) y carcinoma colorrectal (CoCa, n = 80) mediante ELISA. Como se muestra en la figura 1, el valor medio de ITGB6 en el suero de pacientes de control sanos es de casi cero, lo que significa que no es detectable en esta poblacion. Un resultado similar puede observarse en los pacientes con EII que presentan un fenotipo de enfermedad inflamatoria. En este grupo, el valor medio de las muestras de suero analizadas tambien es de casi cero. Por el contrario, en pacientes con carcinoma colorrectal, la integrina avp6 puede detectarse en el suero, indicada por el valor medio claramente elevado de integrina avp6 en este grupo.
Ejemplo 2: Inmunohistoauimica
Metodos: Se examinaron la expresion de ITGB6 y la colocalizacion con la metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9) y la fibronectina en la metastasis en el hlgado (n = 13) y en los tumores primarios (n = 10) de pacientes con carcinoma colorrectal (CCR) mediante inmunohistoqulmica (IHQ). Se evaluaron los niveles sericos de integrina alfa(v)beta6 (ITGB6) en pacientes con CCR bien caracterizados (n = 64) mediante ELISA. Se analizo la correlation con caracterlsticas cllnicas y patologicas. Se evaluaron los niveles de mRNA por TI-PCR en tiempo real en celulas epiteliales intestinales HT29 (CEI).
Resultados: Por IHQ, se descubrio una considerable tincion de ITGB6 a lo largo del frente de invasion del tejido de CCR primario y de la metastasis de CCR en el hlgado. La IHQ revelo la coexpresion de celulas con ITGB6 tenida con MMP9, que se activa por ITGB6, as! como con fibronectina, el ligando de ITGB6, en el frente de invasion. Adicionalmente, se pudieron descubrir niveles considerablemente mas altos de ITGB6 en muestras de tejido tenidas de forma inmunohistoqulmica de tumores de cancer de colon primario as! como en metastasis hepaticas de pacientes con un nivel de ITGB6 serica por encima de 4 ng/ml en comparacion con muestras de pacientes con un nivel serico de ITGB6 por debajo del valor de corte de 4 ng/ml.
La ITGB6 fue detectable en el suero de pacientes con CCR que mostraron un valor de corte claro de ITGB6 4 ng/ml. Los niveles sericos mas altos se asociaron a una peor supervivencia (2,51 ± 1,44 frente a 4,43 ± 3,71 anos). Todos los pacientes con niveles superiores a ITGB6 4 ng/ml revelaron estadio T > 2, estadio G > 2, indicativo de tumores infiltrantes y desdiferenciados, as! como el 100 % de enfermedad metastasica (M).
Basandose en los datos del paciente, en el momento del diagnostico, el nivel serico de la protelna indicadora por
5
10
15
20
25
30
35
40
45
encima del punto de corte de 4 ng/ml indica que el estadio tumoral de acuerdo con las clasificaciones aceptadas internacionalmente es al menos T2, M1, G2, lo que sugiere un carcinoma colorrectal avanzado.
Todos los resultados indicados anteriormente, en particular, la importancia del valor de corte de 4 ng/ml se han confirmado en dos cohortes independientes. Una cohorte comprendla 16 pacientes con cancer colorrectal del Departamento de Cirugla del Hospital Universitario de Zurich y la otra cohorte contenla 20 pacientes con cancer colorrectal de los EE.UU. Para evaluar como se regula la expresion de ITGB6, se trataron CEI HT29 con factor de necrosis tumoral (TNF, 48 h), un mediador conocido de la TEM, y/o factor de crecimiento epidermico (EGF; 24 h). El tratamiento con TNF dio como resultado niveles aumentados de mRNA de ITGB6 (p < 0,01), receptor del EGF (EGFR; p < 0,05), factor de transcripcion Ets-1, el regulador sugerido de ITGB6 (p < 0,01), as! como vimentina elevada (p < 0,01) pero E-cadherina disminuida (p < 0,001), lo que indica TEM. La estimulacion con EGF dio como resultado niveles disminuidos de ARNm de ITGB6 (p < 0,05) y E-cadherina (p <0,05), pero niveles aumentados de ARNm de EGFR (p < 0,05) y de vimentina (p < 0,001). El tratamiento con EGF de las celulas pretratadas con TNF altero el aumento inducido por TNF en el nivel de ARNm de ITGB6 (p < 0,01) y Ets-1 (p <0,05), pero potencio el nivel de ARNm de EGFR (p < 0,001).
Conclusiones: En resumen, la ITGB6 se expresa fuertemente en el frente de invasion de tumores primarios y metastasis de CCR lo que senala un papel crucial de la ITGB6 en la progresion del CCR. Los niveles sericos elevados de ITGB6 se relacionan con una supervivencia mala y un estadio TNM avanzado, lo que indica una enfermedad avanzada y demuestra la utilidad de la ITGB6 como un nuevo marcador tumoral serico del CCR en la practica cllnica.
Materiales y metodos
Muestras de suero
Se obtuvieron muestras de suero de pacientes de control sanos (KO, n = 10), pacientes con EII inflamatoria activa (B1, n = 20), pacientes con enfermedad de Crohn fistulizante (B3; n = 20) y carcinoma colorrectal (CoCa, n = 80) que presentan cualquier estado T, cualquier estado N y cualquier estado M. Las muestras de suero se recogieron de pacientes masculinos y femeninos. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito antes de la recogida de muestras y los estudios fueron aprobados por el comite de etica local.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Se congelaron muestras de suero inmediatamente despues del muestreo y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior. Se obtuvo un Kit ELISA de deteccion de integrina avp6 humana (USCNK Life Sciences Inc., ELISA para integrina p6, E92099Hu) de Chemie Brunschwig AG, Basilea, Suiza. Se realizaron los ensayos de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando un volumen de muestra de 50 pl. Se detecto la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas de fluorescencia SpectraMax M2 usando el Software SoftMax Pro v5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Analisis estadistico
Los datos se presentan como las medias +/- E.T.M. para una serie de n experimentos. El analisis de datos se realizo usando el software de estadlstica SPSS.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para el diagnostico del carcinoma colorrectal en un paciente, que comprende detectar, en una muestra de sangre obtenida de dicho paciente, una protelna indicadora seleccionada entre el grupo compuesto por la subunidad de integrina alfa(v), la subunidad de integrina beta(6) y un heterodlmero que comprende las subunidades de integrina alfa(v) y beta(6).
  2. 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende detectar dicha protelna indicadora mediante la deteccion de la presencia de un ligando unido a dicha protelna indicadora, en donde dicho ligando es especlficamente reactivo a dicha protelna indicadora.
  3. 3. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que comprende determinar una cantidad de dicha protelna indicadora.
  4. 4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 3, que comprende adicionalmente la comparacion de dicha cantidad con un patron.
  5. 5. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende las etapas de:
    - poner en contacto, en una primera etapa de contacto, dicha muestra de sangre con un primer ligando especlficamente reactivo a dicha protelna indicadora;
    - determinar, en una etapa de cuantificacion, dicha cantidad de dicha protelna indicadora unida a dicho primer ligando.
  6. 6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que dicho primer ligando se fija a una superficie.
  7. 7. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en el que dicha etapa de cuantificacion comprende las etapas de poner en contacto, en una segunda etapa de contacto, dicha protelna indicadora con un segundo ligando especlficamente reactivo a dicha protelna indicadora y determinar una cantidad de dicho segundo ligando unido a dicha protelna indicadora.
  8. 8. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 2 a 7,
    en el que dicho ligando, en particular dicho primer ligando y/o dicho segundo ligando, se fija o puede fijarse especlficamente a una actividad enzimatica o un marcador detectable.
  9. 9. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra de sangre es una muestra de suero.
  10. 10. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una cantidad de dicha protelna indicadora por encima de 4 ng/ml se asigna a una alta probabilidad de que dicho paciente desarrolle o haya desarrollado un carcinoma colorrectal metastasico, un tumor indiferenciado o un carcinoma colorrectal avanzado.
  11. 11. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la deteccion de una cantidad de dicha protelna indicadora por encima de 4 ng/ml indica que dicho paciente desarrollara o ha desarrollado un carcinoma colorrectal metastasico, un tumor indiferenciado o un carcinoma colorrectal avanzado.
  12. 12. El uso de un dispositivo que comprende una superficie, comprendiendo dicha superficie un ligando especlficamente reactivo a una protelna indicadora seleccionada entre el grupo compuesto por la subunidad de integrina alfa(v), la subunidad de integrina beta(6) y un heterodlmero que comprende las subunidades de integrina alfa(v) y beta(6) fijadas a dicha superficie, para el diagnostico del carcinoma colorrectal.
  13. 13. Un metodo para determinar la progresion del carcinoma colorrectal, que comprende un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha progresion se determina mediante la deteccion o la cuantificacion de dicha protelna indicadora.
  14. 14. Un metodo para determinar la eficacia de una terapia para un carcinoma colorrectal, que comprende un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la remision o la progresion de dicho carcinoma colorrectal se determina mediante la deteccion o la cuantificacion de dicha protelna indicadora.
  15. 15. Un metodo para la estadificacion de un carcinoma colorrectal, que comprende un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho carcinoma colorrectal se estadifica mediante la deteccion o la cuantificacion de dicha protelna indicadora.
ES14712691.6T 2013-03-27 2014-03-27 Integrina alfa-V-beta 6 para el diagnóstico/pronóstico del carcinoma colorrectal Active ES2634629T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13161489 2013-03-27
EP13161489.3A EP2784511A1 (en) 2013-03-27 2013-03-27 Integrin alpha-v-beta6 for diagnosis/prognosis of colorectal carcinoma
PCT/EP2014/056167 WO2014154809A1 (en) 2013-03-27 2014-03-27 INTERGRIN ανβ6 FOR DIAGNOSIS/PROGNOSIS OF COLORECTAL CARCINOMA

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2634629T3 true ES2634629T3 (es) 2017-09-28

Family

ID=47997214

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14712691.6T Active ES2634629T3 (es) 2013-03-27 2014-03-27 Integrina alfa-V-beta 6 para el diagnóstico/pronóstico del carcinoma colorrectal

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20160047813A1 (es)
EP (2) EP2784511A1 (es)
ES (1) ES2634629T3 (es)
PL (1) PL2979096T3 (es)
WO (1) WO2014154809A1 (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106324236B (zh) * 2015-06-28 2018-10-19 上海市第一人民医院 基于纳米均相时间分辨荧光免疫与液滴微流控技术的检测生物大分子的方法
EP3400460A4 (en) 2016-01-08 2019-10-23 Commscope Technologies LLC IMPROVING AZIMUTE ACCURACY USING MULTIPLE GNSS ANTENNAS
US11046685B2 (en) 2017-02-28 2021-06-29 Morphic Therapeutic, Inc. Inhibitors of (α-v)(β-6) integrin
EP3589627A4 (en) 2017-02-28 2020-08-05 Morphic Therapeutic, Inc. INHIBITORS OF (ALPHA-V) (BETA-6) -INTEGRIN
PE20211640A1 (es) 2018-08-29 2021-08-24 Morphic Therapeutic Inc INHIBICION DE LA INTEGRINA xvß6

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4208479A (en) * 1977-07-14 1980-06-17 Syva Company Label modified immunoassays
CA2118760C (en) * 1993-04-21 2004-06-22 William Jeffrey Allard Diagnosis and monitoring of colon cancer patients by measurement of nca 50/90 in blood
ATE511850T1 (de) 1997-08-08 2011-06-15 Univ California Behandlung von blasenfibrose mit antikörpern gegen alpha-v-beta-6-integrin
DE19933173A1 (de) 1999-07-15 2001-01-18 Merck Patent Gmbh Cyclische Peptidderivate als Inhibitoren des Integrins alpha¶v¶beta¶6¶
RU2009107277A (ru) 2006-08-03 2010-09-10 Астразенека Аб (Se) АНТИТЕЛА, НАЦЕЛЕННЫЕ НА αVβ6, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
US20140113310A9 (en) 2008-12-05 2014-04-24 Myriad Genetics, Incorporated Cancer detection markers
WO2010065968A1 (en) 2008-12-05 2010-06-10 Myriad Genetics, Inc. Cancer detection markers

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014154809A1 (en) 2014-10-02
US20160047813A1 (en) 2016-02-18
US20180180617A1 (en) 2018-06-28
EP2979096A1 (en) 2016-02-03
PL2979096T3 (pl) 2018-03-30
EP2979096B1 (en) 2017-05-10
EP2784511A1 (en) 2014-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190361028A1 (en) Free ngal as a biomarker for cancer
US20180120319A1 (en) Methods for diagnosis and prognosis of epithelial cancers
ES2780192T3 (es) Folato receptor alfa como marcador diagnóstico y de pronóstico para cánceres que expresan folato receptor alfa
ES2634629T3 (es) Integrina alfa-V-beta 6 para el diagnóstico/pronóstico del carcinoma colorrectal
ES2867798T3 (es) Estándares del antígeno prostático y usos de estos
ES2906754T3 (es) Uso de laminina 2 para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular y cáncer de páncreas
JP2016536585A (ja) 膀胱癌バイオマーカー
ES2361808B1 (es) Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico o el pronóstico del c�?ncer colorrectal.
CN115372616A (zh) 胃癌相关的生物标志物及其应用
CN114660289A (zh) 肝癌标志物及其应用
US9835636B2 (en) Serological markers for detecting colorectal cancer and their application for inhibiting colorectal cancer cells
Shlyapnikov et al. Can new immunoassay techniques improve bladder cancer diagnostics With protein biomarkers?
ES2704426T3 (es) Método para detectar la reactivación de poliomavirus
ES2819055T3 (es) Método para el diagnóstico/pronóstico de cáncer colorrectal
ES2323927B1 (es) Metodo in vitro no invasivo para detectar carcinoma transicional de vejiga.
JP6691337B2 (ja) 膀胱癌患者の予後を予測するための方法
KR102346864B1 (ko) 방광암 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 조성물, 키트 및 이를 이용한 진단 방법
US20230400466A1 (en) Methods and systems for risk stratification and management of bladder cancer
JP2011520115A (ja) 胎盤増殖因子及び可溶性ｆｌｔ１に基づいて糖尿病患者の腎不全を予測するための手段及び方法
CN116457660A (zh) Timp1作为胆管癌的标志物
KR20210015259A (ko) 방광암 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 조성물, 키트 및 이를 이용한 진단 방법
CA2876802A1 (en) A method and a kit for the in vitro diagnosis of pancreatic ductal adenocarcinoma or for determining the predisposition to pancreatic ductal adenocarcinoma
BR102012023228A2 (pt) Câncer de bexiga