ES2323927B1 - Metodo in vitro no invasivo para detectar carcinoma transicional de vejiga. - Google Patents
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Abstract
Método in vitro no invasivo para detectar
carcinoma transicional de vejiga.
La presente invención se refiere a un método
in vitro no invasivo para detectar la presencia de carcinoma
transicional de vejiga en un individuo mediante análisis de orina,
para determinar el estadio o severidad de dicho cáncer o para
monitorizar el efecto del tratamiento administrado a un individuo
que padece dicho cáncer.
Description
Método in vitro no invasivo para detectar
carcinoma transicional de vejiga.
La presente invención se refiere a un método
in vitro no invasivo para detectar la presencia de carcinoma
transicional de vejiga en un individuo mediante análisis de orina,
así como al uso de secuencias peptídicas derivadas de proteínas
seleccionadas y a un kit para llevar a cabo dicho método.
El cáncer de vejiga es el cáncer más común del
tracto urinario; es también el cuarto cáncer más común en hombres y
el octavo más común en mujeres. Incluye un amplio espectro de
tumores de varios tipos histológicos como son carcinoma
transicional de vejiga (BTCC, 90%), carcinoma de células escamosas
(7%), adenocarcinoma (2%) y carcinoma no diferenciado (1%).
Los mejores indicadores del pronóstico de BTCC
son el grado y estadio del tumor. Los tumores de vejiga se
clasifican citomorfológicamente de G1 (grado bajo) a G3 (grado
alto) en estado de diferenciación decreciente e incremento de la
agresividad de la enfermedad según la Organización Mundial de la
Salud (OMS). Con respecto al estadio o grado de invasividad, los
BTCCs se clasifican como papilar superficial (Ta y T1), invasivo
del músculo (T2 a T4), y carcinoma no común in situ o tumor
in situ (TIS).
Los tumores de grado bajo normalmente están
confinados a la mucosa o infiltran las capas superficiales
(estadios Ta y T1). La mayoría de tumores de grado alto se detectan
como mínimo en el estadio T1 (invadiendo la lamina propria).
Aproximadamente un 75% de los casos diagnosticados de cáncer de
vejiga son superficiales. El 25% restante son invasivos del músculo
en el momento del diagnóstico. Los pacientes con BTCC superficial
presentan un buen pronóstico aunque el riesgo de recidiva es del
70%. A pesar de este riesgo, los tumores Ta tienden a ser de grado
bajo y solamente un 10-15% progresa con invasión
del músculo en 2 años. Sin embargo, el porcentaje de cánceres T1
que progresa al estadio T2 es más elevado
(30-50%).
Actualmente, el mejor diagnóstico para el cáncer
de vejiga se establece o bien por cistoscopia y biopsia
transuretral o por resección, siendo todos ellos métodos invasivos.
El uso de cistoscopios flexibles convierte la técnica en menos
agresiva, aunque sigue siendo invasiva y muy incómoda y requiere
alguna forma de anestesia.
La técnica no invasiva predominante para el
diagnóstico de BTCC es la identificación de células neoplásicas
mediante examen morfológico de las células de la orina. Así,
actualmente se utilizan citologías para controlar pacientes de
cáncer de vejiga diagnosticados y tratados. Aunque la citología
manual de la orina puede detectar tumores in situ que no son
detectables mediante cistoscopia, así como también tumores
localizados en la parte superior de la vejiga o en la parte
superior del tracto urinario, por ejemplo uréter, pelvis y riñón;
varios estudios han demostrado que la citología presenta muy baja
sensibilidad para el diagnóstico de cáncer de vejiga, no detectando
hasta el 50% de los tumores. Los resultados de las citologías son
sutiles y pueden confundirse con procesos reactivos o degenerativos.
Además, los estudios citológicos requieren la evaluación individual
de un experto, lo cual retrasa la disponibilidad de los resultados
y además introduce subjetividad y variación en los resultados
finales. En realidad, no se dispone de ningún método no invasivo
altamente sensible y específico para el diagnóstico del cáncer de
vejiga (Boman, H., et al., J Urol 2002,
167:80-83).
Se han realizado muchos esfuerzos para mejorar
la detección no invasiva del cáncer. Avances recientes en el perfil
de expresión de células cancerosas mediante técnicas de proteómica,
electroforesis bidimensional de alta resolución y espectrometría de
masas han hecho posible la identificación de proteínas como
marcadores de cáncer de vejiga, tales como la proteína matricial
nuclear NMP22 (Soloway, M.S., et al., J Urol 1996,
156:363-367), el ácido hialurónico y la
hialuronidasa (Pham HT, et al., Cancer Res 1997,
57:778-783), los complejos de membrana basal (BTA,
Pode, D., et al., J Urol 1999, 161:443-446),
el antígeno carcinoembrionario (CEA, Halim A.B., et al., Int
J Biol Marcadores, 1992; 7:234-239), la uroplakina
II (Wu X.R., et al., Cancer Res 1998;
58:1291-1297), el factor de dispersión/de
crecimiento hepatocitario (SF/HGF, Gohji K, et al., J Clin
Oncol 2000; 18:2963-2971), las proteínas de la
familia queratina/citoqueratina tales como citoqueratina 20
(Buchumensky V, et al., J Urol 1998,
160:1971-1974), la citoqueratina 18
(Sánchez-Carbayo M, et al., Clin Cancer Res
2000, 6:3585-3594), la proteína del tumor mamario
8-Ka (MAT-8, Morrison BW, et
al., J Biol Chem, 1995, 270:2176-2182) y la
telomerasa (Lee DH, et al., Clinical Cancer Research, 1998,
4: 535-538).
Memon A. A. et al. (Cancer Detect Prev
2005, 29:249-255) identifican siete proteínas
diferencialmente expresadas en líneas celulares y biopsias de
cáncer de vejiga. Sin embargo, no utilizan ningún control para
comparar.
Rasmussen H. H. et al. (J Urol 1996, 155
:2113-2119) describen una base de datos de las
proteínas más abundantes presentes en la orina de pacientes de
cáncer de vejiga. Celis J. E. et al (Electrophoresis 1999,
300-309) describen una base de datos de proteínas
presentes en biopsias provinientes de pacientes con cáncer de
vejiga. Sin embargo, no se identifican marcadores en ninguna de
estas referencias, ya que los autores no muestran una cuantificaión
del perfil diferencial de proteínas en muestras sanas versus
muestras tumorales.
Por ahora, no se ha encontrado ningún marcador
útil para para predecir la prognosis y la extensión del cáncer de
vejiga en ensayos clínicos (Miyake, H., et al., J Urol 2002;
167:1282-1287).
La presente invención proporciona un método
in vitro no invasivo, altamente sensible, eficiente y
rápido, relativo a proteínas asociadas con BTCC. También
proporciona un método para el diagnóstico, pronóstico y
monitorización de BTCC mediante análisis de muestras de orina. La
presente invención proporciona sorprendentemente una combinación de
biomarcadores de cáncer de vejiga para la detección de BTCC mediante
análisis de orina, con valor significativo para el diagnóstico,
pronóstico y/o monitorización de BTCC.
La alfa-amilasa (AMYS)
carcinoide, la alfa-amilasa pancreática y la alfa
amilasa IA pertenecen a la familia de las glicosil hidrolasas 13 e
hidrolizan enlaces
1,4-alfa-glucosídicos en
oligosacáridos y polisacáridos, y catalizan la primera etapa en la
digestión del glicógeno y el almidón de la dieta. El genoma humano
contiene un conjunto de genes que codifican amilasas y que se
expresan en niveles elevados o bien en la glándula salival o en el
páncreas.
La apolipoproteína A-I (APOA1)
pertenece a la familia de las apolipoproteínas A1/A4/E y participa
en el transporte inverso de colesterol desde los tejidos hasta el
hígado para su excreción mediante la promoción del reflujo de
colesterol desde los tejidos y la actuación como cofactor de la
lecitina colesterol aciltransferasa (LCAT).
La catepsina D (CATD) es una proteasa ácida que
pertenece a la familia de las peptidasas Al y que activa la
degradación proteica intracelular. Está implicada en la patogénesis
de diversas enfermedades tales como cáncer de vejiga (Ozer E.,
et al., Urology 1999, 54:50-5 y loachim E.,
et al., Anticancer Res 2002, 22:3383-8),
cáncer de mama y posiblemente enfermedad de Alzheimer. La catepsina
D se sintetiza como un precursor inactivo de 52 kDa, formado por
dos polipéptidos de 14 kDa (CATD H) y 34 kDa (CATD K). El péptido
inactivo se activa por proteólisis del extremo
N-terminal resultando en la proteína
enzimáticamente activa de 48 kDa.
La glutatión S-transferasa
(GSTP1) pertenece a una familia de enzimas que juegan un papel
importante en la detoxificación mediante catálisis de la conjugación
de algunos compuestos hidrofóbicos y electrofílicos con glutatión
reducido.
La peroxiredoxina 2 (PRDX2) pertenece a la
familia de las ahpc/tsa y está implicada en la regulación redox de
la célula. Reduce los peróxidos con equivalentes reductores
obtenidos a través del sistema de tioredoxina. No tienen capacidad
para recibir electrones de la glutaredoxina. Puede desempeñar un
papel importante en la eliminación de los peróxidos generados
durante el metabolismo. Podría participar en la cascada de señales
de los factores de crecimiento y factor de necrosis
tumoral-alfa regulando concentraciones
intracelulares de H2O2. Aumenta la actividad de células natural
killer (NK).
La proteína unida a retinol plasmático (RETBP)
pertenece a la familia de las lipocalinas y es el transportador
específico de retinol (alcohol de la vitamina A) en sangre. Libera
retinol de las reservas del hígado hacia los tejidos periféricos.
En plasma, el complejo RBP-retinol interacciona con
la transtiretina, lo que impide su pérdida por filtración a través
de los glomérulos renales. Una deficiencia de vitamina A induce una
modificación post-traduccional en la proteína
transportadora, lo cual bloquea su secreción y resulta en una
liberación y un suministro defectuosos a las células
epidérmicas.
La fosfoproteína inducida por estrés 1 (STIP1)
es una proteína adaptadora que media la asociación de las
chaperonas moleculares HSC70 y HSP90 (HSPCA y HSPCB).
La transtiretina (TTHY, antes llamada
prealbúmina) es una de las tres proteínas que se unen a hormonas
tiroideas encontradas en la sangre de los vertebrados. Se produce
en el hígado y circula al torrente sanguíneo, donde se une a
retinol y tiroxina.
El cáncer puede ser detectado analizando el
patrón de expresión de al menos 4 biomarcadores de cáncer de vejiga
en una muestra de orina. Así, la detección de al menos 4 proteínas
diferencialmente expresadas en una muestra test de orina en
comparación con orina normal es indicativa de BTCC.
Las muestras de orina son muy diversas en cuanto
a su composición, por lo que es esencial normalizar para tener en
cuenta las diferencias en la concentración total de proteína y para
eliminar tendencias entre muestras. Para normalizar niveles de
señales se pueden usar los niveles de expresión de una proteína
control, cuyo contenido en orina es siempre constante. En la
bibliografía existen numerosos ejemplos de estas proteínas
invariables. En la presente invención, la transferrina, por
ejemplo, demostró ser una proteína de concentración constante.
Biomarcadores o proteínas de cáncer de vejiga
representativas identificadas en la presente invención incluyen,
aunque no se limitan a CATD, GSTP1, RETBP, STIP1, AMYS, APOA1,
PRDX2 y TTHY.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
una combinación de biomarcadores para la detección de BTCC que
comprende los biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP y STIP1 o sus
variantes transcripcionales o
post-traduccionales.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método in vitro no invasivo que comprende: a) detectar y
cuantificar la combinación de biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP y
STIP1 o sus variantes transcripcionales o
post-traduccionales, en una muestra test de orina
de un individuo; y b) comparar el valor de expresión obtenido en a)
en la muestra test de orina con el correspondiente valor estándar
en orina normal, donde variaciones en el valor obtenido en a)
respecto al valor estándar en orina normal son indicativas de BTCC.
La expresión se determina por espectrometría o inmunoensayos.
Este método se puede adaptar a cribado
poblacional para detectar la presencia de BTCC y determinar el
estadio o la severidad de este cáncer. Además, puede usarse para
evaluar la ausencia de enfermedad después de resección quirúrgica,
establecer un diagnóstico y/o pronóstico de este cáncer y/o
monitorizar el efecto del tratamiento administrado a un individuo
que padece dicho cáncer.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
conjunto de las secuencias peptídicas derivadas los biomarcadores
CATD, GSTP1, RETBP y STIP1 o sus variantes transcripcionales o
post-traduccionales, para detectar la presencia de
BTCC mediante análisis de orina, determinar el estadio o severidad
de este cáncer, evaluar la ausencia de enfermedad después de
resección quirúrgica, establecer un diagnóstico y/o pronóstico de
este cáncer y/o monitorizar el efecto del tratamiento administrado
a un individuo que padece dicho cáncer, donde los biomarcadores
están presentes en
orina.
orina.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
conjunto de los nucleótidos o secuencias peptídicas derivados de
los biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP y STIP1 o sus variantes
transcripcionales o post-traduccionales, en métodos
de cribaje para identificar, desarrollar y evaluar la eficacia de
agentes terapéuticos para tratar BTCC.
La invención se refiere además a anticuerpos
contra los biomarcadores de cáncer de vejiga mencionados. Estos
anticuerpos pueden presentarse en una gran variedad de formas
apropiadas para cada uso, incluyendo, por ejemplo, forma soluble,
inmovilizados sobre un sustrato, o en combinación con un soporte
farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit
para llevar a cabo el método previamente descrito que comprende 1)
anticuerpos que reconocen específicamente los biomarcadores CATD,
GSTP1, RETBP y STIP1 en orina y 2) un soporte en un embalaje
adecuado.
A efectos de la invención se han utilizado las
siguientes definiciones:
"Cáncer" se refiere a la enfermedad que se
caracteriza típicamente por un crecimiento celular anormal o no
regulado, capaz de invadir tejidos adyacentes y extenderse a otros
órganos. "Carcinoma" se refiere al tejido resultante de un
crecimiento celular anormal o no regulado. "Carcinoma
transicional de vejiga" o su abreviación "BTCC" se refiere a
cualquier desorden proliferativo maligno en células epiteliales de
la vejiga urinaria. "Tumor" se refiere a cualquier masa de
tejido anormal generada por un proceso neoplástico, ya sea benigno
(no cancerígeno) o maligno (cancerígeno).
Las "proteínas de cáncer de vejiga o
biomarcadores" son proteínas expresadas diferencialmente en
BTCC, es decir, proteínas que se expresan de forma diferente en la
orina de un individuo sano respecto a la orina de un paciente de
BTCC. En la presente invención el grupo de proteínas
diferencialmente expresadas incluye los biomarcadores CATD, GSTP1,
RETBP, STIP1, AMYS, APOA1, PRDX2 y TTHY, así como también cualquier
proteína de una muestra de orina, cuya proporción varía al menos 2
veces cuando se comparan 2 muestras de orina diferentes: una de un
individuo sano y otra de un paciente de BTCC, donde esta
cuantificación se lleva a cabo mediante un analizador de imágenes,
por ejemplo, el software Progenesis PG220. Los biomarcadores de
cáncer de vejiga tal como se han descrito pueden tener cualquier
longitud y pueden comprender secuencias adicionales derivadas de la
proteína nativa y/o secuencias heterólogas; incluyen cualquier
variante transcripcional o post-traduccional, así
como también cualquier secuencia con al menos un 95% de identidad
con las secuencias descritas, donde identidad se define como el
porcentaje de residuos idénticos entre dos secuencias. Los expertos
en la materia podrán apreciar que fragmentos o variantes de las
secuencias pueden ser igualmente útiles en el tratamiento y
detección del cáncer.
La frase "detectar biomarcadores" significa
determinar la existencia de biomarcadores, mientras que la frase
"cuantificar biomarcadores" significa expresar la presencia de
dichos biomarcadores con un valor (por ejemplo un valor de
intensidad). La frase "indicativo de BTCC" significa que
variaciones encontradas en el valor de expresión de los
biomarcadores en una muestra test de orina respecto al
correspondiente valor estándar en orina normal prueban la presencia
de BTCC. "Variación" significa un cambio en el nivel de
expresión de una proteína.
Una "proteína expresada diferencialmente"
se refiere a una proteína cuyo patrón de expresión varía
(aumentando o disminuyendo) en la orina de un paciente de BTCC en
comparación con la orina de un individuo sano.
El "extracto de proteínas" corresponde al
sobrenadante obtenido después de la centrifugación de la muestra de
orina.
El término "individuo" se refiere a todas
las especies de animales clasificados como mamíferos e incluye,
aunque sin limitación, animales domésticos y de granja, primates y
humanos, y preferiblemente se refiere a un humano, macho o hembra
de cualquier edad o raza. Un "individuo sano" es un individuo
que no padece carcinoma transicional de vejiga y puede incluir
pacientes de otras enfermedades urológicas. El término
"previamente diagnosticado" se refiere a un individuo que ha
recibido un primer diagnóstico positivo de BTCC. El término "no
previamente diagnosticado" se refiere a un individuo que nunca
ha recibido un diagnóstico positivo de BTCC (diagnóstico de
novo).
El "valor estándar en orina normal" se
refiere a la cuantificación de la media del nivel de expresión de
los biomarcadores detectados en muestras individuales de orina de
individuos que no padecen BTCC.
"Diagnosis" de BTCC se refiere al proceso
de identificación o determinación de la naturaleza y causa de BTCC
mediante la evaluación de uno o más biomarcadores. El término
"prognosis" se refiere a la probable evolución o curso de la
enfermedad, es decir, la probabilidad de recuperación o
recurrencia. "Monitorizar" significa evaluar la presencia o
ausencia de BTCC en un individuo a diferentes tiempos.
"Tratamiento" se refiere a cualquier proceso, acción,
aplicación o similar, donde un individuo se somete a ayuda médica
con el objeto de mejorar su condición, directa o indirectamente.
El término "especificidad" se refiere a la
capacidad de un test de excluir la presencia de una enfermedad
cuando verdaderamente no está presente. La especificidad se expresa
como el número de individuos sanos para los cuales existe un test
negativo correcto (llamados verdaderos negativos) dividido por la
suma de los verdaderos negativos y el número de individuos sanos
para los cuales existe un test positivo incorrecto (llamados falsos
positivos). El término "sensibilidad" se refiere a la
capacidad de un test de detectar la presencia de una enfermedad
cuando está verdaderamente presente. La sensibilidad se expresa
como el número de pacientes enfermos para los cuales existe un test
positivo (llamados verdaderos positivos), dividido por la suma de
los verdaderos positivos y el número de pacientes para los cuales
existe un test negativo incorrecto (llamados falsos negativos).
"Robustez" define la capacidad de un método numérico para dar
el mismo resultado a pesar de la variabilidad de las muestras
iniciales.
El término "gen" se refiere a una región de
los desoxiribonucleótidos de doble hebra que codifica una proteína.
Puede representar una parte de una secuencia codificante o una
secuencia codificante completa. El término "proteína" indica
al menos una cadena molecular de aminoácidos unidos
intermolecularmente a través de enlaces covalentes o no covalentes.
El término incluye todas las formas de modificaciones
post-traduccionales, por ejemplo glicosilación,
fosforilación o acetilación. Los términos "péptido" y
"polipéptido" se refieren a cadenas moleculares de aminoácidos
que representan un fragmento de proteína. Los términos
"proteína" y "péptido" se usan indistintamente.
El término "anticuerpo" se refiere a una
proteína en forma de Y (conocida como inmunoglobulina) en la
superficie de células B que se secreta a la sangre o linfa en
respuesta a un estímulo antigénico, tal como una proteína exógena,
bacteria, virus, parásito u órgano transplantado, que presenta una
unión específica para una molécula diana llamada "antígeno". La
región de las inmunoglobulinas que se une al antígeno se puede
dividir tanto en fragmentos F(ab')_{2} como Fab. El
término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales o
policlonales, ya sean intactos o fragmentos derivados de los
mismos; e incluye anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y
anticuerpos de origen no humano. Un "anticuerpo
no-humano" es un anticuerpo generado por una
especie animal diferente de Homo sapiens. Un "anticuerpo
humanizado" es un anticuerpo diseñado genéticamente en el cual
la mínima parte de un anticuerpo de ratón se transplanta a un
anticuerpo humano. Generalmente, los anticuerpos humanizados tienen
un 5-10% de ratón y un 90-95% de
humano. Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo derivado de
ratones transgénicos que tienen genes de anticuerpos humanos o de
células humanas. Los "anticuerpos monoclonales" son poblaciones
homogéneas de anticuerpos altamente específicos dirigidos a un
único sitio antigénico o "determinante" de la molécula diana.
"Anticuerpos policlonales" incluyen poblaciones heterogéneas
de anticuerpos que se dirigen a diferentes determinantes
antigénicos de la molécula diana. El término "anticuerpo
específico" se refiere a un anticuerpo generado específicamente
contra una proteína (en este caso, contra un marcador particular de
cáncer de vejiga). El término "complejo
anticuerpo-proteína" se refiere a un complejo
formado por un antígeno y su anticuerpo específico. El término
"combibody" (anticuerpo combinatorial) se refiere a un
anticuerpo dispuesto en la superficie de fagos filamentosos, lo
cual permite el cribado directo de librerías de ADNc para la
expresión de anticuerpos reactivos de superficie celular, sin la
necesidad de producción y purificación usando bacterias o sistemas
de células eucariotas.
El término "anticuerpo Fab recombinante" se
refiere a un anticuerpo recombinante que sólo contiene el fragmento
Fab que es univalente y útil cuando el anticuerpo tiene una alta
afinidad por su antígeno. Pueden obtenerse recombinantemente si la
secuencia proteica es conocida. El término "fragmento de
anticuerpo ScFv " se refiere a un fragmento de una sola cadena
variable (scFv) que se puede expresar en cultivos de bacterias.
Un "epítopo" es un determinante antigénico
de una proteína; es la secuencia de aminoácidos de la proteína que
reconoce un anticuerpo específico. Dichos epítopos pueden
comprender una extensión contigua de aminoácidos (epítopo lineal) o
de aminoácidos no contiguos que se encuentran próximos en el
espacio gracias al plegamiento tridimensional de la cadena
polipetídica (epítopos discontinuos). El término "fase sólida"
se refiere a una matriz no acuosa a la cual puede unirse el
anticuerpo. Ejemplos de materiales para la fase sólida incluyen sin
limitación vidrio, polisacáridos (por ejemplo agarosa),
poliacrilamida, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas.
Ejemplos de formas en fase sólida son un pocillo o una columna de
purificación.
El término "dipstick" se refiere a un
dispositivo que se sumerge parcialmente (normalmente por un
extremo) dentro de un líquido para llevar a cabo un test que puede
determinar y/o cuantificar alguna propiedad del líquido (química,
física, etc). Este tipo de dipstick está usualmente fabricado en
papel o cartón y está impregnado con reactivos, cuyos cambios de
color indican alguna característica del líquido. El término
"soporte" se refiere al mecanismo o dispositivo por el cual se
conduce o se transporta algo. El término "embalaje" se refiere
al contenedor y envase previo a la venta con el objetivo primario de
facilitar la compra y el uso del producto.
El término "biochip" se refiere a una
multitud de dispositivos miniaturizados empleados para realizar
pruebas biológicas sobre un soporte sólido o fluido con una alta
capacidad de procesamiento.
Una realización particular de la invención se
refiere a una combinación de biomarcadores para la detección de
BTCC que comprende los biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP, STIP1,
AMYS y APOA1 o sus variantes transcripcionales o
post-traduccionales.
Otra realización particular se refiere a una
combinación de biomarcadores para la detección de BTCC que
comprende los biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP, STIP1, AMYS, APOA1
y PRDX2 o sus variantes transcripcionales o
post-traduccionales.
Otra realización particular se refiere a una
combinación de biomarcadores para la detección de BTCC que
comprende los biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP, STIP1, AMYS, APOA1
y TTHY o sus variantes transcripcionales o
post-traduccionales.
Otra realización particular se refiere a una
combinación de biomarcadores para la detección de BTCC que
comprende los biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP, STIP1, AMYS, APOA1,
PRDX2 y TTHY o sus variantes transcripcionales o
post-traduccionales.
En otra realización particular, la primera etapa
del método para evaluar cáncer de vejiga comprende detectar y
cuantificar la combinación de biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP,
STIP1, AMYS y APOA1 o sus variantes transcripcionales o
post-traduccionales.
En otra realización particular, la primera etapa
del método para evaluar cáncer de vejiga comprende detectar y
cuantificar la combinación de biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP,
STIP1, AMYS, APOA1 y PRDX2 o sus variantes transcripcionales o
post-traduccionales.
En otra realización particular, la primera etapa
del método para evaluar cáncer de vejiga comprende detectar y
cuantificar la combinación de biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP,
STIP1, AMYS, APOA1 y TTHY o sus variantes transcripcionales o
post-traduccionales.
En otra realización particular, la primera etapa
del método para evaluar cáncer de vejiga comprende detectar y
cuantificar la combinación de biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP,
STIP1, AMYS, APOA1, PRDX2 y TTHY o sus variantes transcripcionales
o post-traduccionales.
En otra realización particular, el método
permite determinar la progresión de la enfermedad cuando la misma
proteína o proteínas se compara con diferentes muestras obtenidas
del mismo paciente a diferentes tiempos durante la evolución de
BTCC.
En otra realización particular, la combinación
de biomarcadores puede ser utilizada para monitorizar la eficacia
del tratamiento farmacológico o quirúrgico.
En otra realización particular, la muestra a
analizar se obtiene de un individuo a quien no se le ha
diagnosticado previamente BTCC. En otra realización particular, la
muestra a analizar se obtiene de un individuo a quien se le ha
diagnosticado previamente BTCC. En otra realización particular, la
muestra a analizar se obtiene de un individuo que en la actualidad
está recibiendo tratamiento contra BTCC. En otra realización
particular, el método comprende la obtención del extracto de
proteínas de la muestra.
En otra realización particular, el método para
detectar cáncer comprende poner en contacto una muestra de orina
con una molécula que se une específicamente a un biomarcador de
cáncer de vejiga y cuantificar dicha unión.
En otra realización particular, la detección y
cuantificación de proteínas comprende una primera etapa, en la cual
el extracto de proteína de la muestra se pone en contacto con una
composición de anticuerpos específicos para uno o más epítopos de
la proteína o proteínas, y una segunda etapa, en la cual se
cuantifican los complejos formados por anticuerpos y proteínas.
En otra realización particular, los anticuerpos
específicos usados para la detección de proteínas son de origen
humano, humanizados o de origen no humano y seleccionados entre
anticuerpos monoclonales o policlonales, fragmentos de anticuerpos
intactos o recombinantes, combibodies y fragmentos de anticuerpo
Fab o scFv.
Otra realización de la invención se refiere al
uso conjunto de las secuencias peptídicas derivadas de los
biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP, STIP1, AMYS y APOA1 o sus
variantes transcripcionales o post-traduccionales,
donde los biomarcadores están presentes en orina.
\newpage
Otra realización de la invención se refiere al
uso conjunto de las secuencias peptídicas derivadas de los
biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP, STIP1, AMYS, APOA1 y PRDX2 o sus
variantes transcripcionales o post-traduccionales,
donde los biomarcadores están presentes en orina.
Otra realización de la invención se refiere al
uso conjunto de las secuencias peptídicas derivadas de los
biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP, STIP1, AMYS, APOA1 y TTHY o sus
variantes transcripcionales o post-traduccionales,
donde los biomarcadores están presentes en orina.
Otra realización de la invención se refiere al
uso conjunto de las secuencias peptídicas derivadas de los
biomarcadores CATD, GSTP1, RETBP, STIP1, AMYS, APOA1, PRDX2 y TTHY
o sus variantes transcripcionales o
post-traduccionales, donde los biomarcadores están
presentes en orina.
En otra realización, se usan conjuntamente al
menos 4 biomarcadores presentes en orina o sus variantes
transcripcionales o post-traduccionales. En otra
realización, se usan conjuntamente al menos 6 biomarcadores
presentes en orina o sus variantes transcripcionales o
post-traduccionales. En otra realización, se usan
conjuntamente al menos 7 biomarcadores presentes en orina o sus
variantes transcripcionales o post-traduccionales.
En otra realización, se usan conjuntamente al menos 8 biomarcadores
presentes en orina o sus variantes transcripcionales o post-
traduccionales.
traduccionales.
Otra realización particular de la invención se
refiere a un kit para llevar a cabo el método previamente descrito,
siendo empleado dicho kit para detectar la presencia de BTCC,
determinar el estadio o severidad de este cáncer, evaluar la falta
de enfermedad después de resección quirúrgica, establecer un
diagnóstico y/o pronóstico de este cáncer y/o monitorizar el efecto
del tratamiento administrado a un individuo que padece dicho
cáncer.
El kit puede comprender un contenedor donde se
ubican los agentes que se unen a los biomarcadores presentes en
orina e instrucciones de su uso para determinar el estadio de BTCC.
Además, el kit puede comprender un soporte compartimentalizado para
ubicar uno o más contenedores, por ejemplo viales, tubos o
similares. Por ejemplo, un contenedor puede contener una sonda que
es o puede estar marcada para ser posteriormente detectada. La
sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico para una
proteína de cáncer de vejiga o un gen de cáncer de vejiga,
respectivamente. Alternativamente, el kit puede comprender una
sonda de espectrometría de masas (MS). El kit puede incluir también
contenedores que contengan nucleátido(s) para amplificación
o silenciamiento de una secuencia de ácido nucléico diana, y/o un
contenedor que contenga medios reportadores, tal como una proteína
ligante de biotina, como por ejemplo, avidina o estreptavidina,
unida a una marca detectable, por ejemplo, una marca enzimática,
fluorescente o radioisotópica. El kit puede incluir la secuencia de
aminoácidos completa de los biomarcadores de cáncer de vejiga o
parte de ella, o una molécula de ácido nucleico que codifica tal
secuencia aminoacídica. El kit de la invención comprende
típicamente el contenedor descrito anteriormente y uno o más
contenedores que comprenden materiales deseables desde un punto de
vista comercial y de usuario, incluyendo tampones, diluyentes,
filtros, agujas, jeringas e instrucciones para el uso. Además,
puede contener una etiqueta en el contenedor para indicar que la
composición se usa para una aplicación terapéutica o no
terapéutica.
Otra realización de la invención se refiere a un
kit para llevar a cabo el método previamente descrito que comprende
un biochip.
Otra realización de la invención se refiere a un
kit que comprende un biochip, donde el biochip comprende
anticuerpos para la detección de biomarcadores o sus variantes
transcripcionales o post-traduccionales.
Como se ha indicado anteriormente, el método de
la invención comprende la monitorización del estadio del carcinoma
de vejiga mediante la cuantificación de proteínas solubles
expresadas diferencialmente en una muestra de orina a través de
anticuerpos específicos. Como será apreciado por un experto en la
materia, se contempla cualquier medio para identificar y cuantificar
estas proteínas.
Típicamente, la detección y cuantificación
comprende espectrometría o inmunoensayo. La espectrometría es
generalmente espectrometría de masas de desorción/ionización
mediante láser de superficie (SELDI) o espectrometría de masas de
desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI).
Los inmunoensayos utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpos
primarios) y anticuerpos marcados (anticuerpos secundarios). Estas
técnicas incluyen western blot, ELISA (ensayo inmunoabsorbente unido
a enzima), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo
enzimático competitivo), DAS-ELISA (ELISA sandwich
de doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas o
inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el uso de biochips o
microarrays de proteína que incluyen anticuerpos específicos,
ensayos basados en la precipitación de oro coloidal en formatos
tales como dipsticks; o técnicas de afinidad cromatográfica, ensayos
de unión a ligando y ensayos de unión a lectina. Las realizaciones
preferidas de este aspecto de la invención son microarrays de
proteínas y doble anticuerpo sandwich ELISA
(DAS-ELISA).
Las proteínas pueden cuantificarse con
anticuerpos tales como, por ejemplo: anticuerpos monoclonales,
anticuerpos policlonales, ya sean fragmentos intactos o
recombinantes de estos, combibodies y fragmentos de anticuerpos Fab
o scFv, específicos para proteínas. Estos anticuerpos pueden ser de
origen humano, humanizados o de origen animal. Por otro lado, pueden
ser marcados o no marcados y pueden usarse en un amplia variedad de
ensayos. Las moléculas marcadoras que pueden usarse para marcar
anticuerpos incluyen radionúclidos, enzimas, fluoróforos, reactivos
quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores
enzimáticos, partículas, colorantes y derivados. Cuanto más alta es
la especificidad de la unión del anticuerpo, menor es la
concentración requerida para que el antígeno pueda detectarse.
Como ejemplo de uno de los posibles formatos de
este ensayo, un anticuerpo monoclonal o policlonal, un fragmento
del mismo, o una combinación de estos ellos se ancla a la
superficie de un soporte de fase sólida; se contacta con la muestra
a analizar y se incuba durante un tiempo específico en condiciones
apropiadas para la formación de complejos
antígeno-anticuerpo. Posteriormente al lavado en
condiciones apropiadas para eliminar complejos no específicos, se
incuba un reactivo indicador, que consiste en un anticuerpo
monoclonal o policlonal, un fragmento del mismo, o una combinación
de ellos, ligado a una molécula generadora de una señal con los
complejos antígeno-anticuerpo en condiciones
apropiadas de tiempo y temperatura. Se detecta la presencia de una
proteína seleccionadas entre las proteínas de la invención en la
muestra a analizar y, si está presente, se cuantifica y se mide la
señal generada. Para evitar variación de señales debida a las
diferencias en la concentración total de proteína entre muestras,
todas las medidas son normalizadas.
A continuación, se describe el método
generalizado para obtener y analizar el contenido total de proteína
de muestras de orina humana (en adelante referidas como muestras).
El método comprende el procesado de las muestras, el uso de
electroforesis 2D para separar proteínas de la muestra, la
selección de proteínas expresadas diferencialmente mediante análisis
de imagen y estadística de diferentes muestras y el uso de una o
más proteínas expresadas diferencialmente para generar anticuerpos
específicos para usarse como marcadores de cáncer de vejiga.
El análisis proteómico comparativo se llevó a
cabo entre muestras obtenidas de individuos sanos (controles) y
pacientes diagnosticados con BTCC (Ta, T1-grado
bajo, T1-grado alto y T2) en un intento para
identificar proteínas expresadas diferencialmente en los diversos
estadios del cáncer y durante la progresión del mismo. Se eligieron
las proteínas cuya expresión diferencial cambió más de dos veces de
manera reproducible. Estas fueron identificadas mediante huella de
la masa peptídica usando espectrometría de masas y búsqueda en
bases de datos.
La presente invención se ilustra mediante los
siguientes ejemplos. Dichos ejemplos no deben considerarse
limitativos de la invención.
Con el fin de identificar proteínas expresadas
diferencialmente durante la progresión de cáncer de vejiga, se
compararon los perfiles de proteínas de orinas sanas con aquellas
de pacientes con tumor de vejiga en estadio temprano y avanzado
utilizando una aproximación proteómica.
Se obtuvieron muestras de orina (150 en total)
de individuos sanos y pacientes de carcinoma transicional de vejiga
de las unidades de Urología de hospitales pertenecientes a la Red
de la Salud Pública Española. Estas muestras se clasifican como
sigue:
a) No Carcinoma (63 muestras) incluyendo:
- -
- Controles (CV, 32 muestras): pacientes que habían tenido cáncer de vejiga a los que se aplicó una resección del tumor vesical y estaban siendo controlados (donde la cistoscopia negativa no mostró otras alteraciones).
- -
- Pacientes de otras enfermedades del tracto urológico (31 muestras, incluyendo entre otras hiperplasia benigna de próstata, cáncer de próstata).
b) Pacientes de BTCC (87 muestras): pacientes
diagnosticados con la enfermedad en diferentes estadios de
desarrollo incluyendo:
- -
- Ta (21 muestras)
- -
- T1-grado bajo (29 muestras)
- -
- T1-grado alto (19 muestras)
- -
- T2 (18 muestras)
El grupo de muestras de BTCC iba acompañado de
una biopsia que es la clave para su clasificación en los estadios
de desarrollo de cáncer de vejiga.
Se congelaron muestras de orina a -80ºC y se
transfirieron al laboratorio en hielo seco sin romper la cadena de
frío. Se mantuvieron las muestras a -80ºC hasta que se procesaron.
Las muestras fueron muy heterogéneas, desde orinas amarillas con
poco color hasta orinas rojas con grumos de sangre, transparentes o
conteniendo tejidos en suspensión. El volumen total también fue muy
variable, desde 5 hasta 100 mL. La concentración de proteína de las
muestras oscilaba entre 20 \mug/mL y 2 mg/mL (siendo el valor
medio 150 \mug/mL). Para obtener el contenido de proteína, las
muestras de orina se descongelaron en hielo y se centrifugaron a
2000xg durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se utilizó para
determinar la concentración de proteína. Se calculó el volumen
necesario para precipitar 100 \mug de proteína, teniendo en
cuenta que el rendimiento de la precipitación con ácido
tricloroacético (TCA) era del 75%. El resto de la muestra de orina
se congeló otra vez a -80ºC y se almacenó para posteriores
electroforesis 2D (en caso necesario). Tras mezclar el TCA y la
orina durante 1 hora en hielo, se centrifugó a 16000xg durante 20
minutos a 4ºC para obtener el pellet de las proteínas precipitadas.
Este pellet se lavó con acetona almacenada a -20ºC, y se secó por
evaporación del disolvente. Para llevar a cabo los experimentos de
electroforesis bidimensionales (2D), la primera dimensión fue IEF
(isoelectroenfoque) donde las proteínas se separaron en función de
su carga (pl); la segunda dimensión consistió en
SDS-PAGE, donde las proteínas se separaron en
función de su peso molecular. Para llevar a cabo la primera
dimensión, los pellets secados de proteínas se resuspendieron en 450
\mul de tampón de rehidratación (Urea 7M, Tiourea 2M, CHAPS 2%,
tampón IPG 2%, azul de bromofenol 0.002%) durante 1 hora a
temperatura ambiente. El tampón IPG (Amersham, ref#
17-600-88) se usó de manera que el
IEF se llevó a cabo en un rango de 3-10. Para el
IEF, EttanTM IPGforTM Isoelectric Focusing System de Amersham se
siguieron todas las recomendaciones del fabricante. El IEF se llevó
a cabo en geles de gradiente de pH inmovilizado, conocidos como IPG
strips, comercializados por Amersham (ref#
17-6002-45). Las proteínas
solubilizadas se enfocaron en el gel de la primera dimensión tras
un periodo de 16 horas de rehidratación activa del gel a 30
voltios. Entonces se comenzó a subir el voltaje hasta alcanzar los
8000 voltios, sin rebasar nunca una intensidad de corriente de 50
\muA por cada gel.
El IEF se paró aproximadamente a los 90000
voltios-hora.
Para la segunda dimensión, se polimerizaron
geles de acrilamida al 12.5% de 26 x 20 cm en el laboratorio
mediante Ettan DALT twelve Gel Caster de Amersham. Los geles
se corrieron mediante Large Format Vertical System siguiendo todos
los protocolos del fabricante hasta que el frente de electroforesis
salió del gel. Los geles se tiñeron con nitrato de plata, utilizando
el kit de tinción de Amersham
(17-1150-01), siguiendo el protocolo
del fabricante. Los geles se secaron y se almacenaron para el
análisis de imagen posterior de spots proteicos (Figura 1A).
Para algunas muestras de orina se corrió más de
un 2D-gel.
Cada gel se escaneó para obtener una mapa de
spots proteicos para el análisis de imagen. El software Progenesis
PG220 de Nonlinear Dynamics (UK) se utilizó para analizar archivos
de imágenes en formato 300 dpi (puntos por pulgada) y 8 bits/canal.
Para incrementar la resolución el análisis se llevó a cabo en áreas
discretas de los geles. De cada una de las 4 áreas, llamadas A
(Figura 1B), K (Figura 1C), R (Figura 1D) y S (Figura 1E), los
mejores geles fueron seleccionados y escaneados para análisis de
imagen. El software Progenesis PG220 transforma la información de
la imagen plana en una imagen tridimensional, donde la intensidad
de cada spot correlaciona con su volumen y con la cantidad relativa
de proteína correspondiente en la orina del individuo. Mediante
este software se obtuvieron unas tablas de intensidades de cada
spot en cada gel. Estos datos crudos fueron la base de posteriores
análisis estadísticos.
Para llevar a cabo el análisis estadístico de
cada spot individual y comparar su intensidad en dos grupos
diferentes (por ejemplo CV y Ta) hubo que comprobar que estos
conjuntos de datos seguía una distribución normal. Para comparar
los spots pertenecientes a dos grupos se aplicó un test t de
Student, y se obtuvo el valor p: este era el margen de error teórico
de la asignación de un valor de intensidad de este spot a un
subgrupo o a otro. Se seleccionaron solamente aquellos spots con
valores de p \leq0.05. Se calculó el fold change, ratio
media de dichos spots referida a 1) el volumen total de spots de la
muestra, esto es el contenido total de proteína, o a 2) una
proteína expresada de manera constante, cuya cantidad es constante
en todas las muestras; o a 3) una segunda proteína expresada
diferencialmente de la misma muestra.
También se tuvo en cuenta el valor n o
número de muestras.
La identificación de dichos spots se llevó a
cabo mediante espectroscopia MALDI-TOF
(espectrometría de masas de desorción/ionización mediante láser
asistida por matriz). Aquellas muestras de orina cuyas
electroforesis 2D habían mostrado spots estadísticamente
significativos fueron sometidas de nuevo a electroforesis 2D y los
spots fueron recortados del gel. Las proteínas se sometieron a
digestión y se analizaron mediante un espectrómetro
MALDI-TOF. La huella de la masa peptídica permitió
la identificación de CATD, GSTP1, RETBP, STIP1, AMYS, APOA1, PRDX2
y TTHY (ver tabla 1). Así, estas 8 proteínas, para las cuales se
había demostrado que se expresaban diferencialmente en pacientes
diagnosticados con BTCC, se identificaron como marcadores
biológicos con valor significativo para el diagnóstico, pronóstico
monitorización y tratamiento de la enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo, la Figura 2 muestra el spot R211 en
el área R de un gel de electroforesis bidimensional (2D) obtenido
de una muestra de orina de un individuo sano (Figura 2A), de un
paciente de cáncer en el estadio Ta (Figura 2B), de un paciente de
cáncer en el estadio T1-grado bajo (Figura 2C), de
un paciente de cáncer en el estadio T1-grado alto
(Figura 2D) y de un paciente de cáncer en el estadio T2 (Figura
2E). Puede observarse que la intensidad del spot R211 está
claramente disminuida en las muestras de pacientes con cáncer en
distintos estadios, cuando se compara con la muestra de orina sana.
Se demostró que estas diferencias eran significativas después de
llevar a cabo un análisis estadístico con Progenesis PG220
software. La Figura 3 muestra la intensidad del spot R211 en
muestras CV, Ta, T1-grado bajo,
T1-grado alto y T2. El número de muestras para cada
grupo está indicado entre paréntesis. La Figura 4 muestra la
robustez de la medición de la intensidad para el spot R211 en
diferentes muestras de orina. Ésta se expresa como el porcentaje de
geles que mantienen la presencia o ausencia del spot R211 en cada
gel analizado. El número de muestras para cada grupo se indica
entre paréntesis.
En la tabla 2 se muestra el valor de p y
el fold change de los análisis estadísticos para el spot R211 en
muestras de diferentes estadios de cáncer en comparación con una
orina de un individuo sin cáncer (CV). El fold change del spot R211
fue normalizado por el volumen total de spots (TSV) para cada gel
individual.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó la reactividad y sensibilidad de los
anticuerpos policlonales y monoclonales (ya fueran obtenidos
comercialmente o generados mediante protocolos de inmunización). El
método generalmente comprendió la preparación de una curva estándar
("dosis respuesta") para la proteína a monitorizar. Como se ha
indicado anteriormente, el desarrollo del estadio del cáncer puede
también evaluarse monitorizando las concentraciones de distintas
proteínas características de estadio en la muestra.
Se puede obtener antisuero policlonal contra una
proteína dada usando metodología estándar, tal como la descrita en
numerosos textos disponibles y conocidos por los expertos en la
materia. En este ejemplo se inmunizan conejos machos de raza New
Zealand White con preparaciones de proteína primero en
presencia de coadyuvante completo de Freud (Gibco, Grand Island,
N.Y.) y después cada mes con la proteína en presencia del
coadyuvante incompleto durante tres meses. Como antisuero policlonal
se utilizan sueros de conejo y de ratón previamente a la fusión y
demuestran ser reactivos con las preparaciones de proteína mediante
la técnica estándar de western
blot.
blot.
Se clonan y se expresan las proteínas
encontradas en los geles en cantidades demasiado pequeñas para la
inmunización en E. coli usando el vector de expresión
pET28b(+). Los extractos crudos se obtienen en condiciones ya
descritas (Boronat A., et al., J Bacteriol 1981,
147:181-85) y se corren en un gel
SDS-PAGE. Se recortan del gel las proteínas
recombinantes y se liberan de la acrilamida. Para la generación de
anticuerpos para las proteínas recombinantes, las proteínas
liberadas se usan directamente para inmunizar conejos como se ha
descrito anteriormente.
Muestras de proteína (20 \mug de proteína
total) se mezclaron con un tampón de carga SDS-PAGE
suplementado con 5% \beta-mercaptoetanol y se
incubaron a 100ºC durante 5 min, antes de ser cargados en un gel
del 6% de poliacrilamida. Mediante electroforesis, las proteínas se
transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Se corrieron geles y se
transfirieron por duplicado. Una membrana se incubó con anticuerpos
contra las 40 proteínas de la invención (Santa Cruz Biotech. Inc.,
Santa Cruz, CA, USA.) mientras que la segunda membrana se incubó
con un anticuerpo contra actina (Amersham, Little Chalfont, UK)
como control de carga de proteína. Finalmente, las membranas se
hibridaron con un segundo anticuerpo conjugado con peroxidasa
(Amersham) y se detectó la señal quimioluminiscente usando el
sistema ECL (Amersham) con una película quimioluminiscente de alta
sensibilidad (Hyperfilm ECL,
Amersham).
Amersham).
\vskip1.000000\baselineskip
Diversos biomarcadores fueron probados en 40
muestras ciegas de orina, que comprendían:
a) No Carcinomas (12 muestras)
b) BTCCs incluyendo: Ta (8 muestras),
T1-grado bajo (6 muestras), T1-grado
alto (6 muestras) y T2 (8 muestras).
Teniendo en cuenta que el resultado de la
validación es continuo entre los dos estados clínicos posibles
(sano, enfermo), es decir, que puede producirse un solapamiento
entre la partición real en sano/enfermo, y la obtenida a través de
un punto de corte elegido teórico, se utilizaron las curvas ROC
(Receiver Operating Characteristic) para evaluar la bondad de
la prueba. Las curvas ROC proporcionan una representación global de
la exactitud diagnóstica mediante una representación de los pares
(1-especificidad, sensibilidad) obtenidos al
considerar todos los posibles valores de corte de la prueba. Para
cada valor de corte, los valores de sensibilidad y especificidad se
obtienen mediante las siguientes fórmulas:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los valores de las curvas ROC de las distintas
combinaciones se muestran en la tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Gel de electroforesis bidimensional
(2D) obtenido de una muestra de orina y mostrando las 4 áreas
estudiadas A, K, R y S (Figura 1A), el área A (Figura 1B), el área
K (Figura 1C), el área R (Figura 1D) y el área S (Figura 1E).
Figura 2: Spot R211 en el área R de un gel de
electroforesis bidimensional (2D) obtenido de muestras de orina de
un individuo sano (Figura 2A), de un paciente de cáncer en el
estadio Ta (Figura 2B), de un paciente de cáncer en el estadio
T1-grado bajo (TI-LG, Figura 2C), de
un paciente de cáncer en el estadio T1-grado alto
(T1-HG, Figura 2D) y de un paciente de cáncer en el
estadio T2 (Figura 2E).
Figura 3: Intensidad del spot R211 en muestras
CV, Ta, T1-grado bajo (T1-LG),
T1-grado alto (T1-HG) y T2. El
número de muestras para cada grupo se indica entre paréntesis.
Figura 4: Robustez de la medición de intensidad
para el spot R211 en diferentes muestras de orina. Ésta se expresa
como el porcentaje de geles que mantienen la presencia o ausencia
del spot R211 en cada gel analizado. El número de muestras para
cada grupo se indica entre paréntesis.
<110> Laboratorios SALVAT, SA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método in vitro no invasivo
para detectar carcinoma transicional de vejiga
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> DIAG2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 412
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 208
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 3
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 543
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 496
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (1)..(1)
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<223> X puede representar cualquier
aminoácido natural
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 249
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 164
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 117
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 9
Claims (27)
1. Una combinación de biomarcadores para la
detección de BTCC que comprende los biomarcadores CATD (ID SEC 1,
ID SEC 2), GSTP1 (ID SEC 3), RETBP (ID SEC 4) y STIP1 (ID SEC 5) o
sus variantes transcripcionales o
post-traduccionales.
2. Combinación según la reivindicación 1 que
comprende además los biomarcadores AMYS (ID SEC 6), APOA1 (ID SEC
7) o sus variantes transcripcionales o
post-traduccionales.
3. Combinación según la reivindicación 2 que
comprende además el biomarcador PRDX2 (ID SEC 8) o sus variantes
transcripcionales o post-traduccionales.
4. Combinación según la reivindicación 2 ó 3 que
comprende además el biomarcador TTHY (ID SEC 9) o sus variantes
transcripcionales o post-traduccionales.
5. Un método in vitro no invasivo que
comprende: a) detectar y cuantificar la combinación de
biomarcadores definida en la reivindicación 1 en una muestra test
de orina de un individuo; y b) comparar el valor de expresión
obtenido en a) en la muestra test de orina con el correspondiente
valor estándar en orina normal, donde variaciones en el valor
obtenido en a) respecto al valor estándar en orina normal son
indicativas de carcinoma transicional de vejiga.
6. Método según la reivindicación 5, donde la
etapa a) comprende detectar y cuantificar la combinación de
biomarcadores definida en la reivindicación 2.
7. Método según la reivindicación 5, donde la
etapa a) comprende detectar y cuantificar la combinación de
biomarcadores definida en la reivindicación 3.
8. Método según la reivindicación 5, donde la
etapa a) comprende detectar y cuantificar la combinación de
biomarcadores definida en la reivindicación 4.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 8, donde el método se emplea para detectar la
presencia de BTCC, determinar el estadio o severidad de este
cáncer, evaluar la ausencia de enfermedad después de resección
quirúrgica, establecer un diagnóstico y/o pronóstico de este cáncer
y/o monitorizar el efecto de la tratamiento administrado a un
individuo que padece dicho cáncer.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 9, donde la muestra de orina a analizar se
obtiene de un individuo a quien no se le ha diagnosticado
previamente carcinoma transicional de vejiga.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 9, donde la muestra de orina a analizar se
obtiene de un individuo a quien se le ha diagnosticado previamente
carcinoma transicional de vejiga.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 9, donde la muestra de orina a analizar se
obtiene de un individuo que está recibiendo tratamiento en la
actualidad contra carcinoma transicional de vejiga.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 12, donde la detección y cuantificación de
proteínas comprende una primera etapa, en la cual el extracto de
proteína de la muestra se pone en contacto con una composición de
anticuerpos específicos para uno o más epítopos de las proteínas de
la reivindicación 1, y una segunda etapa, en la cual se cuantifican
los complejos anticuerpo-proteína.
14. Método según la reivindicación 13, donde los
anticuerpos son de origen humano, humanizados o de origen no humano
y seleccionados entre anticuerpos monoclonales o policlonales,
fragmentos de anticuerpos intactos o recombinantes, combibodies y
fragmentos de anticuerpo Fab o scFv.
15. Método según la reivindicación 13 ó 14,
donde la detección y cuantificación de los complejos
anticuerpo-proteína, las técnicas utilizadas se
seleccionan del grupo que comprende: western blot, ELISA (ensayo
inmunoabsorbente unido a enzima), RIA (radioinmunoensayo), EIA
competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo),
DAS-ELISA (ELISA sandwich de doble anticuerpo),
técnicas inmunocitoquímicas o inmunohistoquímicas, técnicas basadas
en el uso de biochips o microarrays de proteína que incluyen
anticuerpos específicos, ensayos basados en la precipitación de oro
coloidal en formatos tales como dipsticks; o por técnicas de
afinidad cromatográfica, ensayos de unión a ligando y ensayos de
unión a lectina.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 15, donde el método se utiliza para
monitorizar la eficacia del tratamiento farmacológico o
quirúrgico.
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 16, donde el método se utiliza para determinar
la progresión de la enfermedad cuando la misma proteína o proteínas
se comparan en diferentes muestras obtenidas de un mismo paciente a
diferentes tiempos durante la evolución del carcinoma transicional
de vejiga.
18. Uso in vitro de las secuencias
peptídicas derivadas de los biomarcadores de la combinación
definida en la reivindicación 1 para detectar la presencia de BTCC
mediante análisis de orina, determinar el estadio o severidad de
este cáncer, evaluar la ausencia de enfermedad después de resección
quirúrgica, establecer un diagnóstico y/o pronóstico de este cáncer
y/o monitorizar el efecto de la tratamiento administrado a un
individuo que padece dicho cáncer, donde los biomarcadores están
presentes en orina.
19. Uso según la reivindicación 18 de las
secuencias peptídicas derivadas de los biomarcadores de la
combinación definida en la reivindicación 2.
20. Uso según la reivindicación 18 de las
secuencias peptídicas derivadas de los biomarcadores de la
combinación definida en la reivindicación 3.
21. Uso según la reivindicación 18 de las
secuencias peptídicas derivadas de los biomarcadores de la
combinación definida en la reivindicación 4.
22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
18 a 21, donde variaciones en el nivel de expresión de uno o más
biomarcadores en una muestra test de orina respecto al
correspondiente valor estándar en orina normal son indicativas de
carcinoma transicional de vejiga.
23. Uso conjunto de los nucleótidos o secuencias
peptídicas derivados de los biomarcadores de la combinación
definida en la reivindicación 1, en métodos para cribar,
identificar, desarrollar y evaluar la eficiencia de compuestos en el
carcinoma transicional de vejiga.
24. Un kit para llevar a cabo el método
previamente descrito en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 17
que comprende 1) anticuerpos que reconocen específicamente la
combinación de biomarcadores definida en la reivindicación 1 y 2)
un soporte en un embalaje adecuado.
25. Un kit según la reivindicación 24 que se
emplea para detectar la presencia de carcinoma transicional de
vejiga, determinar el estadio o severidad de este cáncer, evaluar
la falta de enfermedad después de resección quirúrgica, establecer
un diagnóstico y/o pronóstico de este cáncer y/o monitorizar el
efecto del tratamiento administrado a un individuo que padece dicho
cáncer.
26. Un kit según la reivindicación 24 ó 25 que
comprende un biochip.
27. Un kit según la reivindicación 26, donde el
biochip comprende anticuerpos para la detección de proteínas de la
combinación de biomarcadores definida en la reivindicación 1.
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| LAFUENTE A. et al. Limitations in the use of Glutathione-S- transferase P1 in urine as a marker for bladder cancer. Anticancer Research. 1998, Vol. 18, páginas 3771-3772. ISSN 0250-7005. Todo el documento. * |
| RASMUSSEN H.H. et al. Towards a comprehensive database of proteins from the urine of patients with bladder cancer. The Journal of Urology. Junio 1996, Vol. 155, páginas 2113-2119. ISSN 0022-5347. Todo el documento. * |
| VLAHOU A. et al. Development of a novel proteomic approach for the detection of transitional cell carcinoma of the bladder in urine. American Journal of Pathology. Abril 2001, Vol. 158, N$^{o}$ 4, páginas 1491-1501. Todo el documento. * |
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