MX2008004723A - Metodo in vitro no invasivo para detectar carcinoma de celulas de transicion de la vejiga - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método in Vitro no invasivo para detectar un carcinoma de células de transición de la vejiga en un individuo vía análisis de orina, para determinr la etapa o severidad de este cáncer en un individuo o para monitorear el efecto de tratamiento administrado en un individuo que sufre de este cáncer.

Description

MÉTODO IN VITRO NO INVASIVO PARA DETECTAR CARCINOMA DE CÉLULAS DE TRANSICIÓN DE LA VEJIGA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método in Vitro no invasivo para detectar la presencia de carcinoma de células de transición de la vejiga en la orina de un individuo vía análisis de orina, así como el uso de las secuencias de péptidos derivados de las proteínas seleccionadas y a un equipo para realizar el método.

ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN El cáncer de vejiga es el cáncer más común del tractor urinario; también es el cuarto cáncer más común en los hombres y el octavo más común en mujeres. Incluye un amplio espectro de tumores de varios tipos histológicos incluyendo carcinoma de células de transición de la vejiga (BTCC, por sus siglas en ingles 90CF), carcinoma de células escamosas (7%), adenocarcinoma (2°) y carcinoma no diferenciado (1%) El grado y etapa del tumor son los mejores indicadores de pronóstico de BTCC. Los tumores de vejiga se gradúan citomorfológicamente de Gl (grado bajo) a G3 (grado alto) en estado decreciente de diferenciación y agresividad creciente de la enfermedad de acuerdo con la Organización Mundial de la Saludo (WHO, por sus siglas en inglés) . Con respecto a la etapa o mvasividad, BTCCss se clasifican como papilares superficiales (Ta y TI), invasiva del músculo (T2 a T4) o el carcinoma m situ o tumor m sito no comunes (TIS, por sus siglas en ingles) . Los tumores de bajo grado usualmente se confinan a la mucosa o capas superficiales infiltradas (etapa Ta y TI) . La mayoría de los tumores de alto grado se detectan por lo menos en la tapa TI (lamina propia invasora) . Aproximadamente el 75° de los casos de vejiga diagnosticados son superficiales. Los 25% restantes son invasivos del músculo en el momento del diagnóstico. Los pacientes con BTCc superficial tienen un buen pronostico pero tienen un riesgo del 70% de recurrencia. A pesar de este alto riesgo, los tumores de Ta tienden a ser de ajo grado y solo del 10-15% progresarán a la invasión del músculo en 2 años. Sin embargo, el porcentaje de tumores de TI que progresan a la etapa de T2 es superior (30-50%). Actualmente, el mejor sistema de diagnostico para cáncer de vejiga en individuos se establece por cistoscopia y biopsia transuretral o por resección, ambos representando procedimientos invasivos. Los citoscopios flexibles hacen menos agresiva a la técnica, peo permanece invasiva y altamente desfavorable, requiriendo aun alguna forma de anestesia.

La técnica no invasiva prevaleciente para diagnóstico de BTCC es para identificar las células neoplásticas por examen morfológico de las células en orina. Por lo tanto, la citología actualmente se utiliza para monitorear pacientes diagnosticados con y tratados para cáncer de vejiga. Aunque la citología de orina puede detectar tumores ín situ que no se pueden detectar por citoscopía así como tumores localizados en el extremo superior de la vejiga o el tracto urinario superior, es decir, uretra, pelvis y riñon, vanos estudios han mostrado que la citología tiene una sensibilidad muy baja en el diagnóstico ce cáncer de vejiga, faltando hasta el 50% de los tumores. Los hallazgos en citologías son débiles y pueden confundirse con procesos reactivos degenerativos. Los estudios de citología requieren evaluación de expertos individual que retarda la disponibilidad de los resultados e introduce además subjetividad y varianza a los resultados finales. Realmente, no hay un método altamenta sensible y no invasivo específico disponible para diagnosticar cáncer de vejiga (Boman H. y otros J Urol 2002, 167:80-83). Se han hecho muchos esfuerzos para mejorar la detección de cáncer no invasivo. Los avances recientes en la creación del perfil del expresión de células de cáncer por tecnologías proteómicas, electroforesis bidimensional de alta resolución y espectrometría de masas han hecho posible identificar proteínas candidatas como marcadores de tumores para cáncer de vejiga, tales como protema de matriz nuclear NMP22 (Solowa Y.S. y oros, J Uiol 1996, 156:363-367), ácido hialuronico y hialuronidasa (Pham H.T., y otros, Cáncer Res 1997,57:778-783), complejos de membrana de base ()BTA, Pode D. y otros, J Urol 1999, 161:443-446), antigeno carcinoembrionico (CEA, Halim A.B. y otros, Int J Biol Markers, 1992; 7:234-239), uroplaquina II (Wu X.T. y otros, Cáncer Res 1998; 58:1291-1297), factor de dispersión/factor de crecimiento de hepatocitos (SF/HGF, Gohji K. y otros, J Clin Oncol 200; 18:2963-2971), las proteínas de la familia de queratina/citoqueratina como citoqueratma 20 (Buchumensky V. y otros, J Urol 1998, 160:1971-1974), citoqueratina 18 (Sánchez-Carbayo M y otros, Clin. Cáncer Res 200, 6:2585-3594), proteina 8-Ka de tumor mamario (MAT-8, Morpson B.W., y otros, J. Biol Chem 1995, 270:2176-2182) y telomerasa (Lee D.H. y otros, Clinical Cáncer Research 1998, 4: 535-238). Memon A. A. y otros, (Cáncer Detect Prev 2005, 29:249-255) identifica siete proteínas expresadas diferencialmente en cáncer de vejiga de las lineas celulares y biopsias. Sin embargo, no se usa ningún control para comparación. Langbein, S. y otros Technol Cáncer Res Tetra 2006, 67-71) describe el perfil proteínas de las biopsias de pacientes con cáncer fe vejiga usando técnicas 2D-PAGE y SELI-TOF-MS.

Rasmussen H. H. y otros (J Urol 1996, 155:2113-2119) describe una base de datos de la mayoría de las proteínas abundantes presentes en la orina de pacientes con cáncer de vejiga. Celis J. E. y otros (Electrophoresis 1999, 300-309) describe una base de datos de proteínas presentes en las biopsias de pacientes con cáncer de vejiga. Sin embargo, no se han identificado marcadores en ninguna de estas referencias, dado que los autores no muestran un perfil de diferencial cuantificado de las proteínas en muestras saludables contra muestras tumorales. Además, no se ha mostrado que ningún marcador para predecir el pronóstico y grado de cáncer de vejiga haya sido útil en ensayos clínicos (Miyake H. y otros, J Urol 2002, 167:1282-1287) .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un método ín Vitro no invasivo eficiente y rápido, altamente sensible, que se refiere a proteínas asociadas con BTCC. Además se refiere a un método para el diagnóstico, pronostico y monitoreo de BTCC vía el análisis de muestras de orina. La presente invención sorprendentemente provee biomarcadores de cáncer de vejiga para la detección de BTCC vía análisis de orina. Una modalidad preferida de la invención se refiere a 40 biomarcadores de cáncer de vejiga para la detección de BTCC vía análisis de orina que tienen un valor significativo para la detección, diagnostico, pronostico y/o monitoreo de BTCC. Am?noac?lasa-1 (ACX1) es una enzima de unión de zinc, homodimepca, citosolica que cataliza la hidrólisis de aminoácidos L acilados a aminoácidos L y grupo acilo y se ha postulado para funcionar en el catabolismo y recuperación de amino cidos acilados. ACY1 se ha asignado al cromosoma 3p21.1, una región reducida a homocigosidad en cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC, por sus siglas en inglés) , y se ha reportado que su expresión be ha reducido o es indetectable en las lineas celulares de SCLC y tumores. ACY1 es eL primer miembro de una nueva familia de enzimas de unión de zinc. La reductasa aldehido (AKR1A1) pertenece a la familia aldo/ceto reductasa, esta implicado en la reducción de aldehidos biogenicos y xenobiotiocs y está presente virtualmente en cada tejido. Aldolasa (ALDOB) , también llamada 1-fosfato aldolsa, se produjo en el hígado, ríñones y cerebro. Se necesita para la descomposición de fructosa. El carcinoide alfa-amilasa (AMi , por sus siglas en inglés), alfa-amilasa pancreática y al fa amilasa ÍA pertenecen a la familia de glicosil hidrolasa 13 e hidrolizan las uniones de 1, 4-alfa-glucós?do en oligosacáridos y polisacáridos y por lo tanto cataliza el primer paso en digestión de almidón dietético y glicógeno. El genoma humano tiene un conjunto de varios genes de amilasa que se expresan a altos niveles en la glándula salivaría o páncreas. Anexma IV (ANXA4) pertenece a la familia anexma de proteínas de unión de fosfolipidos dependientes de calcio. Aunque sus funciones amonio se han definido claramente, varios miembros de la familia de anexiona se han implicado en los eventos relacionados con membranas ajunto con rutas exocitotica s y endocitoticas . ANXA4 casi se expresan exclusivamente en las células epiteliales. La Apolipoproteína A-l (APOA1) pertenece a la familia de apolipoproteína A1/A4/E y participa en el transporte inverso de colesterol de tejidos al hígado para la secreción promoviendo el flujo de colesterol de tejidos y actuando como un cofactor para la aciltransferasa de colesterol de lecitina (LCAT, por sus siglas en inglés) . La biliverdina reductasa A (BIEA, por sus siglas en ingles) pertenece a la familia gfo/idh/moca y la subfamilia de biliverdma reductasa y reduce el puente gama- eteno del tetrapirol abierto, biliverdina IX alfa, a bilirrubina con la oxidación concomitante de NADH o NADPH . La flavina reductasa (BLVRB) cataliza la transferencia de electrones de nucleótidos de indina reducida a flavinas asi como a azul de metileno, pirroliquinolina qumona, riboflavina o metemoglobina . BLVRB tiene un papel posible para proteger células de daño oxidito o para regular el metabolismo de hierro. En el hígado, convierte la biliverdina a bilirrubina. Se expresa predominantemente en el hígado y eritrocitos, y a niveles inveriores en el corazón, pulmón, glándula adrenal y cerebro . Catepsina D (CTD) es una proteasa acida que pertenece a la familia de peptidasa Al y activa la descomposición de la proteína intracelular . Está implicada en la patogénesis de varias enfermedades tales como cáncer de vejiga (Ozer E., y otros, Urology 1999, 54:50-5 y loaquima E., y otros, Anticancer Res 2002, 22:3383-8), cáncer de mama y posiblemente enfermedad de Alzheimer. Catepsina D se sintetiza como un precursor inactivo de 52 kDa, formado de dos polipéptidos de 14 kDa (CATD H) y uno de 34 kDa (cATD K) . El péptido inactivo se activa rola proteolisis de la terminación N que da como resultado la proteína enzimáticamente activa de 48 kDa. El precursor de complemento C3 (C03) juega un papel central en la activación del sistema de complemento. Su procesamiento por convertasa C3 es la reacción central en ambas rutas de complemento, C03 se ha relacionado a tumores urogenitales (Dunzendorfer U., y otros, Eur Urol 1980, 6:3232-6) .

La dipeptidasa no especifica citosólica (CPGL1) pertenece a la familia de peptidasa M20A y también se conoce como tejido de camosmasa y peptidasa A. Es una dipeptidasa no específica en lugar de una camosmasa selectiva. Alfa enolasa (ENOA) es una enzima multifuncional que, al igual que su papel en glicolisis, juega una parte en varios procesos tales como control de crecimiento, tolerancia a hipox a y respuestas alérgicas. También puede funcionar en el sistema intravascular y fíbrinolitico pericelular debido a su capacidad de servir como un receptor y activador de plasminógeno en la superficie celular de varios tipos de células tales como leucocitos y neuronas. La enolasa de mamíferos esta compuesta de 3 subunidades de isozíma, alfa, beta y gama, que pueden formar homodimeros o heterodímeros que son del tipo de células y específicos para el desarrollo. ENOA interactúa con PLG en la membrana de plasma neuronal y promueve su activación. Se usa como un marcador de diagnostico para muchos tumores y, en la forma heterodiméria, alfa/gama, como un marcador de daño al cerebro hipóxico después del arresto cardíaco. Se ha relacionado con cáncer de vejiga (Iczko ski K.A., y otros, Histopathology 1999, 35:150-6) . La cadena ligera de ferpnita (FRIL) pertenece a la familia de ferritma y es la proteína de almacenamiento de hierro intracelular principal en procariotes y eucariontes.

Esta compuesto de 24 subunidades de cadenas de ferritina pesadas y ligeras. La variación en la composición de la subunidad de ferritma puede afectar los regímenes de absorción y liberación de hierro en diferentes tejidos. Una función principal de ferptina es el almacenamiento de hierro en un estado soluble y no toxico. El inhibidor de disociación de Rab GDP beta (GDIB, por sus siglas en ingles) pertenece a la familia de gdi rab y regula la reacción de intercambio de GDP/GTP de los miembros de la familia, pequeñas proteínas de unión de GTP de la superfamilia ras que esta implicada en el trafico vesicular de moléculas entre organelos celulares. GDIB se expresa ubicuitamente . La peroxidasa de glutationa de plasma (GPX3) pertenece a la familia de peroxidasa glutationa y cataliza la reducción de peróxido de hidrogeno, hidroperoxido orgánico, y peróxidos de lipidos por glutationa reducida y funciona en la protección de células contra daño oxidativo. Se ha mostrado que la peroxidasa de glutationa de plasma humana es una enzima que contiene setenio. La expresión de GX3 parece ser específica para tejidos. La sintetasa glutationa (GSHB, por sus siglas en ingles) es importante para una variedad de funciones biológicas, incluyendo protección de células de daño oxidativo por radicales libres, destoxificacion de xenobioticos y transporte de membrana.

Gelsolina (GSN40 y GSN80) es una proteína moduladora de actma, regulada con calcio que se une a los extremos adicionales de monomeros de actina o filamentos, previniendo el intercambio de monomeros (bloqueo o coronamiento de extremos). Puede promover el ensamble de monómero sen los filamentos (nucleacion) , asi como filamentos existentes del servidor. Ademas, ebta proteina se une a actina y a fíbr?nectma . Se ha relacionado con cáncer de vejiga, aunque no se ha descrito como un bio arcador, es decir, su nivel de expresión no se ha comparado y cuantificado en individuos saludables contra pacientes de cáncer (Rasmussen, H.H. y otros, J Urol 1996, 155:2113-2119; Haga K. Hokkaido Igaku Zasshi 2003, 78:29-37; Celis A y otros, Electrophoresis 1999, 20:355-61). Glutationa S-transferasa (GSTP1) pertenece a una familia de enzimas que juegan un papel importante en la destoxificacion catalizando la conjugación de muchos compuestos hidrofobicos y electrofílicos con glutationa reducida . La isocitrato deshidrogenada citoplasmica (IHC, por sus siglas en ingles) pertenece a la familia de isocitrato e isopropilmalato deshidrogenada y cataliza la descarboxilación oxidativa de isocitrato para formar alfa-cetoglutarato. El precursor de proteína de membrana integral vesicular (VIPP36 (LMNN2) juega un papel como una lectma intracelular en la ruta secretora temprana. Interactua con N-acetil-D-galatosamina y glicanos del tipo de alto contenido de mañosa y también se pueden unir a glicanos 0-l?gados. Está implicado en el transporte y clasificación de glicoproteínas que portan glicanos del tipo de alto contenido de mañosa. El complejo 6 de antigeno de linfocitos, sitio 6 G6E (LY6G6E) pertenece a la superfamilia de anf?geno-6 de Lmfocitos. Los miembros de esta familia son ricos en cisterna, generalmente proteínas de superficie celular anclada con GPI, que tienen papeles relacionados inmunes definitivos o putativos. Su función especifica es desconocida. El precursor de lectina sepna proteasa 2 de de unión a mañanas (MaSP2) pertenece a la familia de peptidasa si y es una tripsina proteasa que juega presumiblemente un papel importante en la iniciación de la ruta de activación de complemento de lectina de unión a mañosa (MBL) . Después de la activación separa C4 que genra C4A y C4B. La pirofosfoplasa de nucleotidos nicotinato (NADC) pertenece a la familia de nadC/mod D y es un intermediario en la ruta de síntesis de novo de NAD de triptofano y actúa como una excitotoxina endógena potente a través de la hiperestimulacion de receptor de N-metilo D-aspartato (NMDA, por sus siglas en ingles) en la neurona. La elevación de niveles de NADC en el cerebro se ha ligado a la patogénesis de trastornos neurodegenerativos tales como epilepsia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Huntington. Aún no se ha relacionado al cáncer. Napsina A (NAPSA, por sus siglas en inglés) pertenecen a la familia de peptidasa al y se expresa a los niveles más altos en el riñon, a un nivel moderado ene. pulmón y a bajos niveles en el bazo y tejido adiposo. Puede estar implicado en el proceso de precursores de agente tensioactivo de neumo itos. La proteina asociada con proliferación 2G4 (PA2G4) es una sola proteína de unión de ADN de doble hebra que muestra la variación específica del ciclo celular en la localización nuclear, que pertenece a la familia de m24c de peptidasa. A medida que la proteína se expresa en respuesta a la estimulación de mitogeno, puede pertenecer a una gran familia de proteínas reguladoras del ciclo celular o proteínas de replicacion que mantienen las actividades del ciclo celular de células proliferativas . El oncogen DJ1 (PaRK7) se expresa altamente en páncreas, riñon, músculo esquelético, hígado, testículos y corazón y actúa como regulador positivo de transcripción dependiente de receptor de andrógeno. Puede funcionar como chaperon sensible a redox y como sensor para tensión oxidativa. Evita la agregación de SNCA y protege a las neuronas contra tensión oxidativa y muerte celular.

La proteina de unión de pol?(rc) 1 (PCRPB1) es una proteina de unión de acido nucleico de una hebra que se une preferiblemente a oligo dC . Puede dispararse entre el núcleo y el citoplasma. Se expresa abundantemente en el músculo esquelético, el timo y leucocitos de sangre periférica mientras se observa una expresión inferior en la próstata, bazo, testículos, ovario, intestino delgado, corazón, hígado, glándulas adrenales y tiroides. La proteina de interacción 6 de muerte celular programada (PDC6I) se expreso en el cerebro, corazón, placenta, pulmón, riñon, páncreas, hígado, músculo esquelético o choquela y puede jugar un papel en la regulación de apoptosis y proliferación celular. Interactua con PDCD6/ALG-2 y SH3KBP1. El precursor de fosfatasa de acido lisosomal (PPAL) pertenece a la familia de fosfatasa acida de histidina e hidroliza monoestres ortofosforicos a alcohol y fosfato. La peroxiredoxina 2 (PRDX2) pertenece a la familia de ahpc/tsa y esta implicada en la regulación de redox de la célula. Reduce los peróxidos con los equivalentes de reducción provistos a través del sistema de tioredoxina. NO puede recibir electrones de glutaredoxina. Puede jugar un papel importante en la eliminación de peróxidos generados durante el metabolismo. Puede participar en la cascada de señalamiento de factores de crecimiento y factor alfa de necrosis tumoral regulando las concentraciones intracelulares de H202. Aumenta la actividad de células asesinas natuiales (NK) . La ciclotransferasa de peptido de glutammilo (QPCT) es responsable de la biosmtesis de peptidos de piroglutamilo . Tiene una inclinación contra residuos ácidos y de triptofano adyacentes a un acido glutamico N-terminal. La protema de unión a retinol de plasma (RETBP) pertenece a la familia de lipocalcma y es el portador especifico para retíñalo (alcohol de vitamina A) en la sangre. Suministra el retmol de los almacenes del hígado a los tejidos periféricos. En el plasma, el complejo de RBP-retinol interactua con transtiretma, que evita su pérdida por la filtración a través de los glomerulos del riñon. Una deficiencia de vitamina A bloquea la secreción de la proteína de unión post-traslacionalmente y da como resultado el suministro defectuoso y provee las células epidérmicas. La proteina de unión de selenio (SBP1) pertenece a la familia de proteina de unión de selenio. El selenio es un nutriente esencial que exhibe propiedades anticarcmogenicas potentes; una deficiencia en setenio puede ocasionar ciertas enfermedades neurologicas . Se ha propuesto que los efectos en el selenio para prevenir cáncer y enfermedades neurológicas puede mediarse por proteínas de unión de selenio. La fosfoproteina 1 inducida por tensión (STIP1, por sus siglas en ingles) es un a proteina de adaptador que media la asociación de los chaperones moleculares HSC70 y HSP90 (HSPCA y HSPCB) . La transaldolasa (TALDO) pertenece a la familia de transaldolasa y es una enzima clave de la ruta de pentosa fosfato no oxidativa que provee r?bosa-5-fosfato para síntesis de acido nucleico y NADPH para biosintesis de lípidos. Esta ruta también puede mantener la glutationa en un estado reducido y por lo tanto protege los grupos sulfohidrilo e integridad celular de radicales oxígeno. Transtiretma (TTHI; micialmente prealbumina) es una de 3 proteínas de unión de hormona tiroide encontrada en la sangre de vertebrados. Se produce en el hígado y circula en el torrente sanguíneo, en donde une al retinol y tiroxina. La protema de repetición WD 1 (WDR1) pertenece a la familia de repetición de wd aipl e induce el desensamble de filamentos de actina junto con las proteínas de ADF/familia cofilma. El cáncer puede detectarse analizando el patrón de expresión de por lo menos un biomarcador de cáncer de vejiga en una muestra de orina de prueba. Por lo tanto, la detección de por lo menos una proteina expresada diferencialmente enana muestra de prueba de orina en comparación con la orina normal indica BTCC. Las muestras de orina son muy diversas en su composición. Por lo tanto, la normalización es esencial para tomar en cuenta las diferencias en la concentración de protema total y para remover la inclinación de muestra a muestra . Los niveles de expresión de una protema de control cuyo contenido en orina siempre es constante, puede usarse para normalizar niveles de señales. En la literatura hay muchos ejemplos de estas proteínas no variables. En la presente invención, se mostró que la transferina es una proteína no variable. Las proteínas cancerígenas de vejiga representativas o biomarcadores identificados en la presenete invención incluyen, ero no están limitados a TTHY, ACY1, AKR1A1, ALDOB, ANXA4 , BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTP1, IDHC, LMAN2, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7, PCBP1, PDC6I, PPAL, PRDX2, PTD012, QPCT, SBP1, STIP1, TALDO, WDR1, AMY, APOA1, GSN40, GSN80 y RETBP (también denominado como los biomarcadores de cáncer de vejiga 40) . Un aspecto de la presente invención se refiere a un método ín Vitro no invasivo que comprende: a) detectar y cuantificar uno o más biomarcadores presentes en una muestra de prueba de orina de un individuo; y b) comparar la medición de expresión obtenida en a) en la muestra de orina de prueba al valor estándar correspondiente en orina normal, en donde las variaciones en la medición obtenida en a) comparado con el valor estándar correspondiente en orina normal indican BTCC. Este método se puede adaptar para tamizado para detectar la presencia de BTCC, con el fin de determinar la etapa o severidad de este cáncer. Además, este método también se puede emplear para valuar la falta de enfermedad después de la resección quirúrgica, ara establecer el diagnostico y/o pronóstico de este cáncer y/o monitorear el efecto del tratamiento administrado a un individuo que sufre de dicho cáncer. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una o más secuencias de péptidos derivadas de biomarcadores presentes en orina para detectar la presencia de BTCC vía análisis de orina, para determinar la etapa o severidad de este cáncer, para evaluar la falta de enfermedad después de la resección quirúrgica, para establecer el diagnóstico y/o pronostico de este cáncer y/o para monitorear el efecto del tratamiento administrado a un individuo que sufre de dicho cáncer . Otro aspecto de la invención se refiere al uso de uno o más nucleótidos o secuencias de peptidos derivadas de los 40 biomarcadores de cáncer de vejiga o una variante transcripcional o post-traslacional, solo o en cualquier combinación, en métodos para tamizar, identificar, desarrollar y evaluar la eficacia de agentes terapéuticos para tratar BTCC.

La invención provee adicionalmente anticuerpos dirigidos contra dichos biomarcadores de cáncer de vejiga. Estos anticuerpos pueden proveerse en una variedad de formas, según se apropiado, para un uso particular, incluyendo, por ejemplo, en una forma soluble, inmovilizada en un sustrato o en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto de la invención se refiere a un equipo para realizar el método como se definió previamente comprendiendo 1) por lo menos un anticuerpo que reconoce específicamente un biomarcador de cáncer en orina y 2) un vehículo en un empaque adecuado. Otro aspecto de la invención se refiere a un perfil de expresión de referencia de BTCC comprendiendo un patrón de expresión de uno o más biomarcadores de cáncer de vejiga. Diferentes perfiles de expresión de referencia de BTCC pueden establecerse y correlacionarse a diferentes etapas del cáncer. Para los fines de la presente invención, se han usado las siguientes definiciones: El término "cáncer" se refiere a la enfermedad que normalmente se caracteriza por crecimiento de células anormales o no reguladas capaces de invadir tejidos adyacentes y diseminarse a órganos distantes. El término "carcinoma" se refiere al tejido que resulta de crecimiento de células anormales y no reguladas. El término "carcinoma de células transicionales de la vejiga" o si abreviatura "BTCC" se refiere a cualquier trastorno proliferativo maligno en las células epiteliales de vejiga. El término "tumor" se refiere a cualquier masa anormal de tejido generado por un proceso neoplástico, en donde ese es benigno (no canceroso) o maligno (canceroso) . El término "proteínas de cáncer de vejiga o biomarcadores" se refiere a proteínas expresadas diferencialmente en BTC, es decir, proteínas que se expresan diferencialmente en la orina de un individuo saludable comparado con la orina de un paciente que tiene BTCC. En la presente invención el grupo de proteínas comprendido por proteínas expresadas diferencialmente incluye los 40 biomarcadores seleccionados del grupo que comprende TTHY, ACY1, AKR1A1, ALDOB, ANXA4 , BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTP1, IDHC, LMAN2, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7, PCBP1, PDC6I, PPAL, PRDX2, PTD012, QPCT, SBP1, STIP1, TALDO, WDR1, AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP, así como a cualquier proteína de una muestra de orina cuya relación cambia por lo menos dos veces cuando se compara con dos muestras de orina diferentes: uno de un individuo saludable y no de un paciente de carcinoma de células de transición, esta cuantificación siendo llevada a cabo por un software analizador de imagen, por ejemplo software de Progenesis PG220. Los biomarcadores de cáncer de vejiga como se describió en la presente puede ser de cualquier longitud y además comprende secuencias adicionales derivadas de la proteina nativa y/o secuencias heterólogas, cualquier variante transcppcional o post-traslacional, así como cualquier secuencia con por lo menos una identidad del 95% con las secuencias descritas, en donde la identidad se definen como el porcentaje de residuos que son idénticos entre dos secuencias. Los expertos en la materia apreciarán que estas otras porciones o variantes también pueden es r útiles en el tratamiento y detección de cáncer. El término "detectar uno o más biomarcadores" significa determinar la existencia de uno o más biomarcadores, mientras que el termino "cuantificacion de uno o más biomarcadores" significa expresar la presencia de uno o más biomarcadores como un valor /por ejemplo como un valor de intensidad) . El termino "indicativo de BTCC" significa las variaciones encontradas en la medición de uno o más biomarcadores en una prueba de muestra de orina comparado con el valor normal correspondiente en la orina normal sirve como una prueba de la presencia de BTCC. El término "variación" se refiere a un cambio en el nivel de expresión de una proteína. El término "proteína expresada diferencialmente" se refiere a una proteína, cuyo patrón de expresión varía (se incrementa o disminuye) en la orina de un paciente que tiene BTCC comprado con la orina de un individuo saludable. El término "expresado inversamente" se refiere a dos proteínas expresadas diferencialmente cuyos patrones de expresión o son opuestos (es decir, en una muestra uno se sobre-expresa mientras el otro se reprime o viceversa) . El termino "extracto de proteina" corresponde al sobrenadante obtenido después de la centrifugación de la muestra de orina. El termino "individual" se refiere a todas las especies de animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no se restringe a, animales domésticos y de granja, primates y seres humanos y preferiblemente se refiere a una mujer u hombre de cualquier edad o raza. El término "individuo saludable" se refiere a un individuo que no sufre de BTCC y puede incluir pacientes que tienen otras enfermedades urológicas. El termino "diagnosticado previamente" se refiere a un individuo que ya ha recibido un primer diagnóstico positivo para BTCC. El término "no diagnosticado previamente" se refiere a un individuo quien nunca ha recibido un primer diagnostico positivo para BTCC (diagnóstico de novo=. El termino "valor estándar en orina normal" se refiere a la cuantificacion del nivel de expresión promedio de uno o mas biomarcadores detectados en una sola muestra de orina de individuos que se sabe que no sufren de BTCC.

El termino "diagnostico" de BTCC se refiere al proceso para identificar o determinar la naturaleza y causa de BTCC a través de la evaluación de uno o más biomarcadores de BTCC. El termino "pronóstico" se refiere al resultado probable o curso de una enfermedad que es la oportunidad de recuperación o recurrencia. El termino "monitorear" significa evaluar la presencia o ausencia de BTCC en un individuo indiferente momento. El término "tratamiento" se refiere a cualquier proceso, acción, aplicación o similares, en donde ese somete a un individuo a ayuda médica con el objeto de mejorar su condición, directa o indirectamente. El término "especificidad" se refiere a la capacidad de una prueba para excluir la presencia de una enfermedad cuando realmente no está presente. Especificidad se expresa como el numero de individuos saludables para quienes hay una prueba negativa correcta (este grupo siendo llamado negativos reales) , dividida por la suma de los negativos reales y el numero de individuos saludables para quienes hay una prueba positiva incorrecta (este grupo siendo llamado de positivos falsos). El termino "sensibilización" se refiere a la capacidad de una prueba para detectar una enfermedad cuando realmente esta presente. La sensibilidad se expresa como el número de pacientes enfermos para quines hay una prueba positiva correcta deste grupo siendo llamado negativos falsos) . El término "robustez" define la capacidad del método numérico para proveer el mismo resultado a pesar de la variabilidad en las muestras iniciales. El termino "gen" se refiere a una región de una cadena molecular de desoximbonucleot idos que codifica una proteina y puede representar una porción de una secuencia de codificación o una secuencia de codificación completa. El termino "proteina" se refiere a por lo menos una cadena molecular de aminoácido ligada mter olecularmente a través de enlaces covalentes o no covalentes . El termino incluye todas las formas de modificaciones de proteínas post-traslacionales, por e?emplo glicosilacion, fosforilación o acetilacion. Los términos "peptido" y "polipéptido" se refieren a cadenas moleculares de aminoácidos que representan un fragmento de proteínas. Los términos "proteina" y "peptido" son indistinguibles. El termino "anticuerpo" se refiere a una proteina en forma de Y (conocida como inmunoglobulina) en la superficie de células B que se secreta en la sangre o linfa en respuesta a un estimulo antigenico, tal como una proteina exogena, bacteria, virus, parásito u órgano transplantado, y que exhibe una actividad de unión especifica para una molécula blanco llamada un "antigeno". La región de unión de antigenos de inmunoglobulinas puede dividirse en F(ab')2 ° fragmentos de Fab. El termino "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales y policlonales , a sea intacto o fragmentos derivados de ellos; e incluye anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos de origen no humano. Un "anticuerpo no humano" es un anticuerpo generado por una especie de animal diferente a Homo sapiens. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo tratado genéticamente en el cual la parte de ratón mínima de un anticuerpo de murinos se fusiona a un anticuerpo humano. Generalmente, los anticuerpos humanizados son 5-10% ratones y 90-95% humano. Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo derivado de un ratón transgénico que porta genes de anticuerpos humanos o de células humana. Los "anticuerpos policlonales" incluyen poblaciones de anticuerpos heterogéneos que se dirigen contra diferentes determinantes antigénicas de la molécula blanco. El término "anticuerpo especifico" se refiere a un anticuerpo generado contra una proteina especifica (en este caso contra un marcador de cáncer de vejiga particular). El término "complejo de anticuerpo-proteina" se refiere a un complejo formado por un antígeno y su anticuerpo específico. El término "cuerpo-cornbi" (anticuerpo combinatorio) se refiere aun anticuerpo exhibido en fagos filamentosos, que permite el tamizado directo de bancos de ADNc para la expresión de anticuerpos reactivos en su superficie celular, sin la necesidad de producción y purificación de anticuerpos usando sistemas de células de bacterias o eucarióticas . El término "anticuerpo recombmante Fab" se refiere a un anticuerpo recombinante que solo contiene el fragmento Fab que es univalente y útil cuando el anticuerpo tiene una afinidad muy mala para su antígeno. Pueden obtenerse recombinantemente si se conoce la secuencia de proteina. El termino "fragmento de anticuerpo de ScFV" se refiere a un fragmento variable de una sola cadena (scFv) que puede expresarse en cultivos bacterianos . El termino "epitope" se refiere a una determinante antigénica de una proteina, que es la secuencia de aminoácidos de la proteina que reconoce un anticuerpo específico. Dichos epítopes pueden estar comprendidos de una extensión contigua de aminoácidos (epítope lineal) o de aminoácidos no contiguos que se acercan entre ellos en virtud del pliegue tridimensional de la cadena de polipéptidos (epítopes discontinuos). El termino "fase sólida" se refiere a una matriz no acuosa a la cual se puede unir el anticuerpo. Ejemplos de materiales para la fase solida incluyen pero no están limitados a vidrio, polisacaridos (por ejemplo azarosa) , poliacrilamida, poliestireno, alcohol polivinílico y silicones. Ejemplos de formas den fase sólida son el pozo de una placa o una columna de purificación. El término "tira de sumergimiento" se refiere a un dispositivo sumergido en un líquido para realizar alguna clase de prueba que puede determinar y/o cuantificar algunas propiedades del líquido (químico, físico, etc.). Esta clase de tira de sumergimiento usualmente está hecha de papel o cartón y se impregna con reactivos cuyo color cambia indican algún aspecto del líquido. El termino "vehículo" se refiere a un mecanismo o dispositivo por el cual se transporta o conduce algo. El termino "empaque" se refiere al contenido y empaque antes de la venta con el fin principal de facilitar la compra y uso de un producto. El termino "biomicrocircuito" se refiere a la recopilación de sitios de prueba miniaturizados (microdisposiciones ) dispuestos en un sustrato sólido que permite que se realicen muchas pruebas al mismo tiempo con el fin de lograr un paso y velocidad superiores. En una modalidad de la invención, el primer paso del método para evaluar cáncer en vejiga comprende medir uno o más biomarcadores seleccionados de TTHY, AC?l, AKR1A1, ALDOB, ANXA4, BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTP1, IDHC, LMAN2, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7, PCBPl, PDC6I, PPAL, PRDX2, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO, WDRl, AMi , APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP (también denominado cono los 40b?omarcadores de cáncer de vejiga) o una vanante transcripcional o post-traslacional del mismo en una muestra de prueba de orina de un individuo. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar el cáncer de vejiga comprende medir uno o más biomarcadores seleccionados de TTHY, ACY1, AKR1A1, ALDOB, ANXA4, BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTP1, IDHC, LMAN2, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7, PCBP1, PDC6I, PPAL, PRDX2, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO y WDRl o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo enana muestra de prueba de orina de un individuo. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir por lo menos dos biomarcadores o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo en la muestra de orina de la prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir por lo menos tres biomarcadores o una vanante transcppcional o post-traslacional del mismo en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir por lo menos cuatro biomarcadores o una variante transcppcional o post-traslacional del mismo en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir por lo menos cinco biomarcadores o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo en la prueba de orina . En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir uno o más biomarcadores seleccionados de TTHY, ACil, AKR1A1, ANXA , BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTP1, IDHC, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7, PCBP1, PRDX2, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP o una variante transcppcional o post-traslacional del mismo en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir uno o más biomarcadores seleccionados de TTHY, ACY1, AKR1A1, ANXA , BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTP1, IDHC, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7, PCBP1, PRDX2, PTD012, QPCT, SBPl y STIP1 o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir uno o más biomarcadores seleccionados de TTHY, CATD H, CATD K, ENOA, FRIL, GSHB, GSTP1, IDCH, MASP2, PRDX2, AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP o una variante transcripcional o post-traslacional en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir uno o más biomarcadores seleccionados de TTHi , CATD H, CATD K, ENOA, FRIL, GSHB, GSTP1, IDCH, MASP2 y PRDX2 o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo en la muestra de orina de prueba.

En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir uno o más biomarcadores seleccionados de TTHY, AMY, APOAl, GSN40 y GSN80 o una variante transc ipcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir APOAl y RETBP y GSN80 o una variante transcripcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir AMY, APOAl y GSN40 y GSN80 o una variante transcripcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir AMY, APOAl y ENOA y GSN80 o una variante transcripcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir APOAl, GSN40 y TTHY o una variante transcripcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir CATD K, GSN80 y IDHC o una vanante transcppcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba.

En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir AMY, APOAl, GSN40 y IDHC o una variante transcripcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir APOAl, GSN40, GSN80 y TTHY o una variante transcripcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir CATD H, ENOA, GSTP1 y PRDX2 o una variante transcppcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir CATD K, ENOA, PRDX2 y TTHY o una variante transcripcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir AMY, CATD K, ENOA, IDHC y PRDX2 o una variante transcripcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y TTHY o una variante transcripcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba.

En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir CATD H, ENOA, GSTPl, MASP2, PRDX2 y TTHY o una variante transcripcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir AMY, APOAl, CATD K, ENOA, IDHC, PRDX2 y TTHY o una variante transcripcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir AMY, APOAl, CATD K, ENOA, IDHC, PRDX2 y TTHY o una variante transcripcional o postraslacional en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir uno o más biomarcadores seleccionados de AMY, APOAl, GSN40, GSN80 o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo y uno o más biomarcadores seleccionados de TTHY, ACY1, AKR1A1, ALDOB, ANXA4, BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTPl, IDHC, LMAN2, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7 , PCBP1, PDC6I, PPAL, PRDX2, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO, WDRl y RETBP o una vanante transcppcional o post-traslacional del mismo en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir uno o más biomarcadores seleccionados de AMY, APOAl, GSN40, GSN80 o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo y uno o más biomarcadores seleccionados de TTHY, ACY1, AKR1A1, ALDOB, ANXA4, BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTPl, IDHC, LMAN2, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7 , PCBP1, PDC61, PPAL, PRDX2, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO y WDRl o una vanante transcripcional o post-traslacional del mismo en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir uno o más biomarcadores seleccionados de CATD H, CATD K, ENOA, GSHB, GSTPl, IDHC, PRDX2 y TTHY o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo y uno o más biomarcadores seleccionados de ACY1, AKR1A1, ALDOB, ANXA4, BIEA, BLVRB, C03, CPGL1, FRIL, GDIB, GPX3, LMAN2, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7 , PCBP1, PDC6I, PPAL, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO, WDRl, AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo en la muestra de orina de prueba. En otra modalidad, el primer paso del método para evaluar cáncer de vejiga comprende medir uno o más biomarcadores seleccionados de TTHY, CATD H, CATD K, ENOA, GSTPl, IDHC, MASP2, PRDX2, AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo.

Otra modalidad se refiere al método ín Vitro no invasivo que comprende cuantificar una o mas relaciones entre dos diferentes biomarcadores seleccionados de 40 biomarcadores de cáncer de vejiga o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo enana muestra de orina de prueba de un individuo y comprando la medición obtenida en la muestra de orina de prueba al valor estándar correspondiente en orina normal, en donde las variaciones indican BTCC. En otra modalidad el método permite determinar la progresión de la enfermedad cuando la misma proteína o proteínas se comparan de diferentes muestras obtenidas del mismo paciente en diferentes tiempos dentro de la evolución de BTCC. En otra modalidad, uno o más de los biomarcadores de la invención se puede usar para monitorear la eficacia de tratamiento farmacológico o quirúrgico. En otra modalidad, la muestra que será analizada se obtiene de un individuo al que no se la había diagnosticado previamente BTCC. En otra modalidad, la muestra que será analizada se obtiene de un individuo al que previamente se le ha diagnosticado con BTCC.

En otra modalidad la muestra que será analizada se obtiene de un individuo que actualmente recibe tratamiento contra BTCC. En otra modalidad el método comprende obtener un extracto de proteínas de la muestra. La medición normalmente comprende espectrometría o inmunoanálisis . La espectrometría normalmente es una espectrometría de masa de desorbcion /ionización de láser con superficie normalmente incrementada o espectrómetro de masas de desorbción/iomzacion de láser asistida en la matriz (MALDI). El inmunoanálisis incluye análisis Western, ELISA (análisis inmunoabsorbente ligado a enzima), RÍA (radioinmunoanalisis) , EIA Competitivo ( Inmunoanálisis de Enzima Competitivo) . DAS-ELISA (ELISA-Emparedado de Anticuerpo Doble) , técnicas inmunocitoquímicas o mmunohistoquimicas, técnicas basadas en el uso de biomicrocircuitos de microdisposiciones de proteínas que incluyen anticuerpos específicos, análisis basados en la precipitación de oro coloidal en formatos tales como tiras sumergibles; o por técnicas de cromat grafía de afinidad, análisis de unión de ligandos o an lisis de unión de lectinas . En otra modalidad el método para detectar cáncer comprende poner en contacto una muestra de orina con una molécula que se unen específicamente a un biomarcador de cáncer de vejiga y cuantificar esta unión. En otra modalidad, la detección y cuantificación de proteínas comprende un primer paso, en el cual el extracto de proteína de la muestra se pone en contacto con una composición de uno o más anticuerpos específicos contra uno o más epítopes de la proteína o proteínas, y un segundo paso, en el cual se cuantifican los complejos formados por los anticuerpos y las proteínas. En otra modalidad, los anticuerpos específicos usados para la detección de proteínas son de origen humano, humanizado o de origen no humano y se seleccionan de anticuerpos monoclonales o policlonales , fragmentos intactos o recombinantes de anticuerpos, cuerpo-cornbi y Fab o fragmentos de anticuerpos de scFv. Otra modalidad se refiere al uso de una o más secuencias de péptidos derivados de los biomarcadores seleccionados de TTHY, ACY1, AKR1A1, ALDOB, ANXA4 , BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTPl, IDHC, LMAN2, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7, PCBP1, PDCßl, PPAL, PRDX2, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO, WDRl, AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP o una variante transcripcional o postraslacional de los mismos, en donde los biomarcadores están presentes en orina.

Otra modalidad de la invención se refiere al uso de una o mas secuencias de peptidos derivadas de los biomarcadores seleccionados de TTHY, ACY1, AKR1A1, ALDOB, ANXA4, BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTPl, IDHC, LMAN2, L?6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7, PCBP1, PDC6I, PPAL, PRDX2, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO y WDRl o una vanante transcppcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de una o más secuencias de péptidos derivadas de biomarcadores de cáncer, en donde las variaciones en la medición de estos biomarcadores enana muestra de prueba de orina en comparación con el valor estándar correspondiente en orina normal indica BTCC. En otra modalidad, por lo menos se usan dos biomarcadores presentes en orina o una variante transcripcional o pos-traslacional . En otra modalidad, por lo menos se usan tres biomarcadores presentes en orina o una variante transcppcional o post-traslacional del mismo. En otra modalidad por lo menos se usan cuatro biomarcadores presentes en orina o una variante transcppcional o post-traslacional . En otra modalidad, se usan por lo menos cinco biomarcadores presentes en orina o una variante transcppcional o post-traslacional del mismo.

Otra modalidad de la invención se refiere al uso de una o más secuencias de peptidos derivadas de los biomarcadores seleccionados de TTH?, AC?l, AKR1A1, ANXA4 , BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTPl, IDHC, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7, PCBP1, PRDX2, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de uno o más secuencias de peptidos derivadas de los biomarcadores seleccionados de TTHY, ACY1, AKR1A1, ANXA4, BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTPl, IDHC, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7, PCBP1, PRDX2, PTD012, QPCT, SBPl y STIP1 o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de una o más secuencias de peptidos derivadas de los biomarcadores seleccionados de TTHY, CATD H, CATD K, ENOA, FRIL, GSHB, GSTPl, IDCH, MASP2, PRDX2, AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP, o una variante transcppcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina.

Otra modalidad de la invención se refiere al uso de una o mas secuencias de peptidos derivadas de los biomarcadores seleccionados de TTHY, CATD H, CATD K, ENOA, FRIL, GSHB, GSTPl, IDCH, MASP2 y PRDX2 o una vanante transcppcional o postraslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de una o mas secuencias de peptidos derivadas de los biomarcadores seleccionados de TTHY, AMY, APOAl, GSN40 y GSN80 o una variante transcppcional o postraslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de las secuencias de peptidos derivadas de APOAl y RETBP o una variante transcppcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de las secuencias de peptidos derivadas de AMY, APOAl y GSN40 o una variante transcppcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de las secuencias de peptidos derivadas de AMY, APOAl y ENOA o una variante transcppcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de las secuencias de peptidos derivadas de APOAl, GSN40 y TTHY o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de las secuencia^ de peptidos derivadas de CATD K, GSN80 y IDHC o una variante t ranscripcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores est n presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de las secuencias de peptidos derivadas de APOAl, GSN40, GSN80 y TTHY o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de las secuencias de peptidos derivadas de AM?, APOAl, GSN40 y IDHC o una variante transcppcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de las secuencias de peptidos derivadas de CATD H, ENOA, GSTPl y PRDX2 o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de las secuencias de peptidos derivadas de CATD K, ENOA, PRDX2 y TTHY o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de las secuencias de peptidos derivadas de AMY, CATD K, ENOA, IDHC y PRDX2 o una variante transcppcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de las secuencias de péptidos derivadas de AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y TTHY o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de las secuencias de péptidos derivadas de CATD H, ENOA, GSTPl, MASP2, PRDX2 y TTHY o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de las secuencias de péptidos derivadas de AMY, APOAl, CATD K, ENOA, IDHC, PRDX2 y TTHY o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de una o más secuencias de péptidos derivadas de los biomarcadores seleccionados de AMY, APOAl, GSN40 y GSN80 o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo y una o más secuencias de péptidos derivadas de biomarcadores seleccionados de TTHY, ACY1, AKR1A1, ALDOB, ANXA4 , BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTPl, IDHC, LMAN2, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7, PCBP1, PDC6I, PPAL, PRDX2 , PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO, WDRl y PETBP o una variante transen pcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de una o más secuencias de péptidos derivadas de los biomarcadores seleccionados de AMY, APOAl, GSN40 y GSN80 o una variante transcppcional o post-traslacional del mismo y una o más secuencias de péptidos derivadas de biomarcadores seleccionados de TTHY, ACY1, AKR1A1, ALDOB, ANXA4 , BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTPl, IDHC, LMAN2, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7, PCBP1, PDC6I, PPAL, PRDX2, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO y WDRl o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de una o más secuencias de peptidos derivadas de los biomarcadores seleccionados de CATD H, CATD K, ENOA, GSHB, GSTPl, IDHC, PPDX2 y TTHY o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo y una o más secuencias de péptidos derivadas de biomarcadores seleccionados de ACY1, AKR1A1, ALDOB, ANXA4 , BIEA, BLVRB, C03, CPGLl, FRIL, GDIB, GPX3, LMAN2, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7, PCBP1, PDC6I, PPAL, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO, WDRl, AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP o una vanante transcripcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad de la invención se refiere al uso de una o mas secuencias de peptidos derivadas de los biomarcadores seleccionados de TTHí, CATD H, CATD K, ENOA, GSTPl, IDHC, MASP2, PRDX2 , AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo, en donde los biomarcadores están presentes en orina. Otra modalidad se refiere a un equipo para llevar a cabo un método como se definió previamente comprendiendo 1) cualquier combinación de anticuerpos que reconoce especialmente una o mas de estas proteínas y 2) un vehículo en un empaque adecuado, el equipo siendo empleado para detectar la presencia de BTCC, para determinar la etapa o severidad de este cáncer, para evaluar la falta de enfermedad después de la resección quirúrgica, para establecer el diagnostico y/o pronostico de este cáncer y/o monitorear el efecto del tratamiento administrado a un individuo que sufre de dicho cáncer. El equipo puede comprender un contenedor para alojar por lo menos un agente que une un biomarcador presente en una muestra de orina; e instrucciones para usar por lo menos un agente para determinar el estado de BTCC. Dichos equipos pueden comprender un vehículo, paquete o contenedor que tiene compartimientos para recibir uno o más contenedores tales como frascos viales, tubos, y similares, cada uno de los contenedores comprendiendo uno de los elementos separados que serán usados en el método. Por ejemplo, los contenedores pueden comprender una sonada que es o puede marcarse y además detectarse. La sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico para una proteína de cáncer de vejiga o un gen de cáncer de vejiga, respectivamente. Alternativamente, el equipo puede comprender una sonda de espectrometría de masa (MS) . El equipo también puede incluir contenedores que contienen nucleótidos para amplificación o silenciamiento de una secuencia de ácidos nucleicos blanco, y/o un contenedor que comprende un medio reportero, tal como una proteína de unión de biotina, v.gr., avidita o estreptavidina, unido a una etiqueta detectable, v.gr., una etiqueta enzimática, fluorescente o radioisotópica . El equipo puede incluir otro o parte de la secuencia de aminoácidos de los biomarcadores de cáncer de vejiga o una molécula de ácidos nucleicos que codifica dichas secuencias de aminoácidos. El equipo de la invención normalmente comprenderá el contenedor descrito antes y uno o más contenedores que comprende materiales convenientes desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo soluciones reguladoras, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de empaques con instrucciones de uso. Además, una etiqueta puede proveerse en el contenedor para indicar la composición que se usa para una aplicación terapéutica o no terapéutica especifica y también puede incluir instrucciones de uso, tales como aquellas descritas antes. Las instrucciones y/u otra información también puede incluirse en un inserto que se incluye con el equipo. Otra modalidad se refiere a un equipo para llevar a cabo un método como se definió previamente comprendiendo un biomicrocircuito . Otra modalidad se refiere a un equipo para llevar a cabo un método como se definió previamente comprendiendo un biomicrocircuito, en donde el biomicrocircuito comprende anticuerpos para la detección de uno o más biomarcadores seleccionados de 40 biomarcadores de cáncer de vejiga o una variante transcppcional o postraslacional del mismo. Hay una amplia escala de análisis inmunológicos disponibles para detectar y/o cuantificar la formación de complejos de antígeno-anticuerpo competitivo o no competitivo; previamente se han descrito numerosos análisis de unión de proteína competitivos o no competitivos y un gran número de los mismos están comercialmente disponibles. Por lo tanto, las proteínas pueden cuantificarse con anticuerpos tales como, por ejemplo. Anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, ya sea intactos o fragmentos recombinantes de los mismos, cuerpo-combis y Fab o fragmentos de scFv de anticuerpos, específicos para proteínas. Estos anticuerpos pueden ser de origen humano, humanizados o de origen animal. Por otro lado, pueden ser marcados o no marcados y se pueden usar en un amplio rango de análisis. Las moléculas de marcadores que pueden usarse para etiquetar anticuerpos incluyen radionúclidos, enzimas, fluoroforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o co-factores, inhibidores enzimáticos. Partículas, colorantes y derivados. Mientras es mayor la especificidad de unión de anticuerpos, es inferior la concentración de antigeno que puede ser detectada. Existe una amplia variedad de análisis bien conocidos por los expertos en la materia que se pueden usar en la presente invención, la cual usa anticuerpos no marcados (principalmente anticuerpos) y anticuerpos marcados (anticuerpos secundarios); estas técnicas incluyen pero no se limitan al análisis Western o transferencia Western, ELISA (Análisis Inmunoabsorbente Ligado a Enzima) , RÍA (Radiommunoanalisis ) , EIA competitivo (inmunoanálisis de enzima competitivo) , DAS-ELISA (ELISA-emparedada de doble anticuerpo) , técnicas mmunocitoquímicas o inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el uso de biomicrocircuitos de microdisposiciones ele proteínas que incluyen anticuerpos específicos, análisis basados en la precipitación de oro coloidal en formatos tales como tiras sumergibles; o por técnicas de cromatografía de afinidad, análisis de unión de ligandos o análisis de unión de lectmas. Las modalidades preferidas de este aspecto de la invención son microdisposiciones de proteínas y ELISA de emparedado de anticuerpo doble (DAS-ELISA, por sus siglas en inglés). En este inmunoanálisis se puede usar cualquier anticuerpo, o combinación de anticuerpos, que son específicos contra uno o más epitopes de las 40 proteínas de la invención. Como un ejemplo de uno de los muchos formatos posibles de este análisis, un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento de este anticuerpo o una combinación de esos anticuerpos que reconoce uno o más epítopes de las 40 proteínas de la invención se conectan a la superficie de un soporte de fase sólida y se coloca en contacto con la muestra que será analizada e incubada durante un tiempo específico y en condiciones apropiadas para formar los complejos de antígeno-anticuerpo . Después de lavarse en condiciones apropiadas para elimina los complejos no específicos, un reactivo indicador, que consiste de un anticuerpo monoclonal o policlonal, o un fragmento de este anticuerpo, o una combinación de estos y que reconoce uno o más epítopes de las 40 proteínas de la invención, unido a una molécula que genera una señal, se incuba con los complejos de antígeno-anticuerpo en condiciones apropiadas de tiempo y temperatura. La presencia de una o más proteínas seleccionadas de las 40 proteínas de la invención en la muestra que sera analizada se detecto y cuantifico y se midió la señal generada. Con el fin de evitar la variación de señales debido a las diferencias en concentración de proteína total entre las muestras, se normalizando todas las mediciones . Como se indico antes, el método de la invención implica monitorear la etapa de carcinoma de vejiga cuantificando las proteínas solubles expresadas diferencialmente dentro de una muestra de orina a través de anticuerpos específicos. Como se apreciara por los expertos en la materia, se contemplan cualesquiera medios para identificar y cuantificar específicamente estas proteínas. En la siguiente descripción, se describe el método generalizado para obtener y analizar en contenido de proteína total de muestras de orina humanas (en la presente denominada como la muestra). El método implica procesar las muestras, el uso de electroforesis 2D para separar proteínas dentro de la muestra, la selección de proteínas expresadas diferencialmente por medio de análisis de imágenes y estática de diferentes muestras y el uso de una o más de las proteínas expresadas diferencialmente de la invención para generar anticuerpos específicos para proteínas que serán usados como marcadores de cáncer de vejiga. Los análisis de proteína comparativos se llevaron a cabo entre las muestras obtenidas de individuos saludables (controles) y pacientes diagnosticados con BTCC (Ta, grado TI bajo, grado TI alto y 12) . En un intento de identificar proteínas expresadas diferencialmente en las diferentes etapas de c ncer de vejiga y durante la progresión de cáncer de vejiga. Entre todas las proteínas que mostraron la expresión diferencial, 40 proteínas cambiaron más de dos veces su capacidad reproductiva. Se identificaron por huella digital de masa de peptidos usando espectrometría de masas y búsqueda en bases de datos. La presente invención se ilustrará más por los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se dan a manera de ilustración únicamente y no se consideran limitantes.

I . Identificación de proteínas expresadas diferencialmente Para identificar proteínas expresadas diferencialmente a lo largo de la progresión de cáncer de vejiga, los perfiles de proteínas de orinas saludables se compararon con aquellas de pacientes con tumor de vejiga en etapa temprana y avanzados usando un enfoque proteomico. Las muestras de orina (150 en total) se recopilaron de individuos saludables y de pacientes con cáncer de vejiga transicional visitando las unidades de urología de los Hospitales que pertenecen a la Red de Salud Pública Española. Estas muestras se clasificaron de la siguiente manera: a) Sin carcinoma (63 muestras) incluyendo: Controles (CV, 32 muestras! : pacientes que tuvieron cáncer de vejiga y tuvieron resección del tumor y se controlaron (la cistoscopia no mostró otras afectaciones). - Pacientes con otras enfermedades del tracto urológico (31 muestras, incluyendo entre otras hiperplasias benignas de próstata, cáncer de próstata) . b) BTCC (87 muestras): pacientes diagnosticados con la enfermedad en diferentes etapas de desarrollo incluyendo: - Ta (21 muestras) - TI de bajo grado (29muestras) - TI de alto grado (19 muestras) - T2 (18 muestras) El grupo de BTCC de las muestra se acompañó por una biopsia que fue la clave de su clasificación en las etapas de desarrollo de cáncer de vejiga.

A Proceso de muestras de orina y separación de proteínas Las muestras de orina se congelaron a -80°C y se embarcaron al laboratorio en hielo seco sin ruptura de la cadena fría. Las muestras se mantuvieron a -80°C hasta que se procesaron. Las muestras fueron muy heterogénicas, variando de orinas de color amarillo claro a rojas con coágulos de sangre, transparentes o conteniendo tejidos en suspensión. El volumen total también fue muy variable de 5 a 100 ml . La concentración de proteína de las muestras vano de 20 µg/ml a 2 mg/ml (150 µg/ml fue la concentración promed?o=. Ara obtener el contenido de proteínas, se descongelaron muestras en hielo y se centrifugaron a 2000 µg durante 5 min a 4°C. El sobrenadante se uso para determinar la concentración de proteínas. El volumen necesario para precipitar 100 µg de proteína se calculó tomando en cuenta que la eficacia de precipitación de proteína con 15% p/v de ácido tricloroacético (TCA) es del 75%. El resto de la muestra de orina se congeló de nuevo a -80°C y se almaceno para electroforesis 2D adicional (si es necesario). TCA y orina se mezclaron durante 1 hora en hielo y luego se centrifugó a 16000 µg durante 20 in a 4°C para obtener la pella de proteínas precipitadas. Esta pella se lavó con acetona, se almacenó a -20°C y se secó por evaporación de solvente. Para llevar a cabo los experimentos de electroforesis bidimensionales (2D) , la primera dimensión fue IEF (enfoque isoeléctrico) , en donde las proteínas se separan por su carga (pl); la segunda dimensión fue SDS-PAGE en donde las proteínas se separaron por su peso molecular. Para llevar a cabo la primera dimensión, la pella seca de proteínas se resuspendió con 450 µl de solución reguladora de rehidratación (Urea 7M, tiourea 2M, CHAPS 2%, solución reguladora de IPG 2%, azul de bromofenol 0.002%) durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución reguladora de IPG (Amersham, ref. # 17-600-88) se usó de manera que IEF varió de pH 3-10. Para IEF, el Sistema de Enfoque Isoeléctrico Ettan™ IPGphor™ de Amersham se usó siguiendo las instrucciones del fabricante. IEF se llevó a cabo en gradientes de pH inmovilizados, nombrados tiras de IPG, comprado a Amersham (Ref # 17-6002-45) . Las proteínas solubilizadas enfocadas en la primera dimensión en las tiras después de 16 horas de rehidratación activa del gel a 30B. Luego el voltaje se incrementó a 8000 V, la intensidad nunca fue mayor a 50 µA por gel. IEF terminó cuando el voltaje alcanzó 90000 Vhora . Para la segunda dimensión, 26 x 20 cm 12.5% de acrilamida se polimerizaron en el laboratorio usando el Gel de Ricino doce de Ettan DALT de Amersham. Los geles se operaron en el Sistema Vetical de Formato Grande doce DALT y siguiendo las instrucciones del fabricante hasta el extremo frontal izquierdo de electroforesis de gel. Los eles se colorean de nitrato de plata usando el equipo de colorante de Amersham (17-1150-01) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los geles se secaron y almacenaron para análisis de imágenes subsiguientes de los puntos de proteína (Figura ÍA) . Para algunas muestras de orina se operaron más de uno de gel 2D.

B. An lisis de los puntos de proteina en los qeles Cada gel se escaneo para obtener el mapa de puntos para análisis de imágenes. El software Progenesis PG220 de Nonlinear Dynamics (UK) se uso para analizar archivos de imágenes en un formato de 300 dpi (punto por pulgada) y 8 bit/canal. Para incrementar la resolución, se llevaron a cabo los análisis en áreas discretas de geles. Para cada área, nombradas como A (GIGURA 2B) , K (FIGURA 1C) , R (FIGURA ID) y S (FIGURA 1E) , los mejores geles se seleccionaron y escanearon para análisis de imágenes. El software Progenesis PG220 transformó la información de la imagen plana en una imagen 3D, en donde la intensidad de cada punto se correlacionó con su volumen y con la cantidad relativa de la proteina correspondiente en la orina del individuo. Con las tablas de software, las intensidades de cada punto se obtuvieron en cada gel. Estos datos crudos fueron la base para los análisis estadísticos subsiguientes. Para realizar los análisis estadísticos de cada punto individual y comparar su intensidad en dos grupos diferentes (por ejemplo, CV y Ta) , una distribución normal tuvo que probarse en estos bloques de datos. Para comparar los puntos que pertenecen a dos grupos, una prueba Estudiante t se aplico y se obtuvo un valor p: este fue el error teórico para asignar un punto a un subgrupo o a otro. Solo se seleccionaron los puntos con valores p =0.05. El campo o relación promedio de estos puntos se calculó denominándose cada uno como 1) el volumen de puntos total de la muestra, es decir, el contenido de proteína tota teórico, o 2) la proteina expresada constantemente, la cantidad del cual es constante en cada muestra, ? 3) una segunda proteína expresada diferencialmente de la misma muestra. También el valor n o número de muestras se tomó en cuenta. 40 proteínas mostraron significancia estadística y fuerza en su cambio de veces cuando se compara con las muestras de orina de pacientes de control con las muestras de orina de pacientes diagnosticados con cáncer de vejiga transicional . La identificación de los puntos se llevo a cabo por espectroscopia MALDI-TOF (Tiempo de Vuelo de Desorbción/Ionizacion de Láser Asistida por Matriz). Las muestras de orina cuya electroforesis 2D mostró puntos estadísticamente importantes sometidos de nuevo a electroforesis 2D y los puntos tomados del gel. Las proteínas se digirieron y analizaron por el espectrómetro MALDI-TOF. La huella digital de la masa de peptidos permitió la identificación de 40 proteínas, que se identificaron como TTHY, ACY1, AKR1A1, ALDOB, ANXA , BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03, CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTPl, IDHC, LMAN2, LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7 , PCBP1, PDC6I, PPAL, PRDX2, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO, WDRl, AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP (véase tabla 1) . Por lo tanto, estas 40 proteínas, que se probo que se expresan diferencialmente en pacientes diagnosticados con BTCC, se identificaron como marcadores biológicos de valor significante para el diagnostico, pronostico, monitoreo y tratamiento de la enfermedad.

Tabla 1 Como un ejemplo, la Figura 2 muestra el punto R211 que corresponde a BIEA en el área R del gel de electroforesis bidimensional (2D) obtenido de muestras de orina de un individuo saludable (Figura 2A) , de un paciente que sufre de cáncer en la etapa de Ta (Figura 2B) , de un paciente que sufre de cáncer en la etapa de grado de TI bajo (Figura 2C) , de un paciente que sufre de cáncer en la etapa de grado de TI alto (Figura 2D) y de un paciente que sufre de cáncer en la etapa T2 (Figura 2E) . Se puede observar que la intensidad del punto R211 se disminuye claramente en las muestras de los pacientes con cáncer en diferentes etapas, cuando se compara con la muestra de orina saludable. Se mostró que estas diferencias importantes después del análisis estadístico con el software Progenesis PG220. La Figura 3 muestra la intensidad del punto R211 en las muestras CV. Ta, grado de Ti bajo, grado de TI alto y T2. El número de muestras para cada grupo se indica en paréntesis. La Figura 4 muestra la fuerza de la medición de intensidad del punto R211 en diferentes muestras de orina. Esta se expresa como el porcentaje de los geles que mantienen la presencia o ausencia del punto R211 en cada gel analizado. El número de muestras para cada grupo de nuevo se indica en paréntesis. La Tabla 2 muestra p y los valores de veces que cambia del análisis estadístico para el punto R211 en las muestras de diferentes etapas de cáncer en comparación con una muestra de un individuo sin cáncer (CV) . El cambio de veces del punto R211 se normalizó por el volumen de puntos total (TSV) para cada gel individual.

II. Desarrollo de anticuerpo para las proteínas encontradas en la muestra de orina Se probaron los anticuerpos policlonales y/o monoclonales disponibles (ya sea comercialmente comprado o generado siguiendo el protocolo de inmunización) para reactividad y sensibilidad, el método implicando generalmente la preparación de una curva estándar ("respuesta de dosis") para la proteína que será monitoreada.

A. Protocolos de inmunización 1. Anticuerpos Policlonales Los antisueros policlonales que pueden surgir contra una proteína dada usando metodologías normales, tales como las descritas en numerosos textos disponibles en la materia y conocidos pos los expertos en la materia. En este ejemplo, se inmunizaron conejos machos blancos de Nueva Zelanda con las preparaciones de proteínas primero en adyuvante completo de Freund (Gibco, Grand Island, N.Y.) y cada mes con la proteína con adyuvante incompleto durante tres meses. Los sueros de conejo y suero de ratones antes de la fusión se usan como antisuero policlonal y se muestran por la técnica de análisis Western normal para ser reactiva con las preparaciones de proteínas. 2. Generación de Proteínas Recombinantes Las proteínas encontradas en los geles en cantidades muy bajas para inmunización se clonaron y expresaron en E. coli usando el vector de clonación ?ET28b(+). Los extractos crudos se obtuvieron como se describió previamente (Boronat A., y otros, J. Bacterial. 1981, 147:181-85) y corre en un gel de SDS-PAGE. Para la generación de anticuerpos contra proteínas recombmantes, las proteínas liberadas se usan directamente para inmunizar conejos como se describió antes.

B. Experimentos de Análisis Western Las muestras de proteínas (20 µg de proteína total) se mezclaron con solución reguladora de carga de gel SDS-PAGE con 5% de ß-mercaptoetanol y se incubó 100°C durante 5 minutos, antes de cargarse en 6-f de gel de poliacrilamida . Después se transfirieron las proteínas de electroforesis a membranas de nitrocelulosa . Los geles por duplicado se corrieron y graficaron. Se probó una membrana con anticuerpos surgidos contra una o mas de las 40 proteínas seleccionadas de la invención (Santa Cruz Biotech. Inc., Santa Cruz, CA, EUA) mientras se probo la segunda membrana con un anticuerpo surgido contra actina (Amersham, Little Chalfont, UK) como un control para cargar proteina. Finalmente, las membranas se hibpdizaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Amersham) y la señal quimiolummiscente se detectó usando el sistema de ECL (Amersham) con película de quimiolummiscencia de alto desempeño (Hyperfilm ECL, Amersham) .

III. Validación de muestras de prueba de orina usando experimentos de análisis Western Varios biomarcadores se probaron en 340 muestras de orina ciegas comprendiendo: a) Sin Carcinoma (12 muestras) b) BTCC incluyendo: Ta (8 muestras), grado bajo de TI (6 muestras), grado alto TI (6 muestras) y T2 (8 muestras) Los valores obtenidos de sensibilidad, especificidad y precisión se muestran en la tabla 3. Los valores de sensibilidad, especificidad y precisión se calcularon usando estas formulas: (negativos reales + positivos reales) Precisión = Número de muestras (positivos reales) Precisión = Numero de muestras (negativos reales) Precisión = Número de muestras Por ejemplo, el biomarcador AMY muestra sensibilidad del89% y especificidad de 75o para un valor de precisión de 85°.

Tabla 3 Por una regresión de logística binomial de los datos obtenidos en estos experimentos fue posible obtener diferentes combinaciones de biomarcadores que incrementaron generalmente la sensibilidad y especificidad del método de diagnóstico, como se muestra en la tabla 4.

Tabla DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figuras ÍA a 1E : Gel de electroforesis bidimensional (2D) obtenido de una muestra de orina y mostrando las cuatro áreas diferentes estudiadas A, K, R y S (Figura ÍA) , área A (Figura IB) , área K (Figura 1C) , ÁREA r (Figura ID) y área S (Figura 1E) Figuras 2A a 2E: Punto R211 que corresponde a BIEA en el área R de gel de electroforesis bidimensional (2D) obtenido de muestras de orina de un individuo saludable (figura 2A) , de un paciente que sufre de cáncer en la etapa Ta (Figura 2B) , de un paciente que sufre de cáncer en la etapa de grado bajo de TI (Tl-LG, Figura 2C) de un paciente que sufre de cáncer en la etapa de grado alto de TI (Tl-HG, Figura 2D) y a un paciente que sufre de cáncer en la etapa T2 (Figura 2E) . Figura 3: Intensidad de punto R211 en las muestras de CV, Ta, grado bajo de TI (Tl-LG) , grado alto de TI (Tl-HG) y T2. El número de muestras para cada grupo se indica en paréntesis. Figura 4 : La fuerza de la medición de intensidad para el punto R211 en diferentes muestras de orina. Esto se expresa como el porcentaje de los geles que mantienen la presencia o ausencia del punto R211 en cada gel analizado. El número de muestras para cada grupo se indica en paréntesis.

Claims (44)

REIVINDICACIONES

1.- Un método m Vi tro no invasivo comprende: a) detectar y cuantificaí por lo menos dos biomarcadores en una muestra de prueba de orina de un individuo; donde por lo menos dos de los biomarcadores son seleccionados de un grupo que consiste de TTHY (SEC ID 1) ,

ACY1 (SEC ID 2) , AKR1A1 (SEC ID 3 ) , ALDOB (SEC ID 4 ) , ANXA4

(SEC ID 5) , BIEA (SEC ID 6) , BLVRB (SEC ID 7) , CATD H (SEC ID 8), CATD K (SEC ID 9), C03 (SEC ID 10, SEC ID 11), CPGL1 (SEC ID 12), ENOA (SEC ID 13, SEC ID 14), FRIL (SEC ID 15), GDIB (SEC ID 16), GPX3 (SEC ID 17), GSHB (SEC ID 18), GSTPl (SEC ID 19) , IDHC (SEC ID 20) , LMAN2 (SEC ID 21) , LY6G6E (SEC ID 22), MASP2 (SEC ID 23), NADC (SEC ID 24), NAPSA (SEC ID 25), PA2G4 (SEC ID 26), PARK7 (SEC ID 27), PCBP1 (SEC ID 28), PDC6I (SEC ID 29) , PPAL (SEC ID 30) , PRDX2 (SEC ID 31) , PTD012 (SEC ID 32), QPCT (SEC ID 33), SBPl (SEC ID 34), STIP1 (SEC ID 35) , TALDO (SEC ID 36) , WDRl (SEC ID 37) , AMY (SEC ID 38, SEC ID 39, SEC ID 40), APOAl (SEC ID 41), GSN40 (SEC ID 42), GSN80 (SEC ID 43) y RETBP (SEC ID 44) ó una variante transcripcional ó transnacional del mismo; y b) comprende la medida de expresión obtenida en: a) En la muestra de prueba de orina al valor estándar correspondiente en la muestra de prueba de orina, en donde las variaciones en la medida obtenida en a) comparado con el valor estándar correspondiente en la orina normal son indicativos del carcinoma de la célula de transición de la vej íga . 2.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el paso a) comprende detectar y cuantificar por lo menos dos biomarcadores seleccionados de TTHY, ACY1 , AKR1A1 , ALDOB, ANXA4, BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03 , CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3 , GSHB, GSTPl, IDHC, LMAN2 , LY6G6E, MASP2 , NADC, NAPSA, PA2G4 , PARK7 , PCBP1 , PDC6I, PPAL, PRDX2 , PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO y WDRl o una variante transcppcional o post-traslacional del mismo. 3.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el paso a) comprende detectar y cuantificar por lo menos dos biomarcadores seleccionados de TTHY, AMY, APOAl, GSN40 y GSN80 o una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo.

4.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el paso a) comprende detectar y cuantificar por lo menos dos biomarcadores seleccionados de AMY, APOAl, GSN40 y GSN80 o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo y uno o mas biomarcadores seleccionados de TTHY, ACY1, AKR1A1, ALDOB, ANXA4 , BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03 , CPGL1, ENOA, FRIL, GDIB, GPX3 , GSHB, GSTPl, IDHC, LMAN2 , LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4 , PARK7 , PCBP1, PDC6I, PPAL, PRDX2, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO y WDRl ó una variante transcppcional ó post-traslacional del mismo.

5.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el paso a) comprende detectar y cuantificar por lo menos dos biomarcadores seleccionados de CATD H, CATD K, ENOA, GSHB, GSTPl, IDHC, PRDX2 y TTHY ó una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo y uno o mas biomarcadores seleccionados de ACY1 , AKR1A1 , ALDOB, ANXA4 , BIEA, BLVRB, C03 , CPGL1 , FRIL, GDIB, GPX3 , LMAN2 , LY6G6E, MASP2, NADC, NAPSA, PA2G4 , PARK7 , PCBP1 , PDC6I, PPAL, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO, WDRl, AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP ó una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo .

6.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el paso a) comprende detectar y cuantificar por lo menos dos biomarcadores seleccionados de TTHY, CATD H, CATD K, ENOA, GSTPl, IDHC, MASP2 , PRDX2 , AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP ó una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo.

7. - El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en donde el paso a) comprende detectar y cuantificar por lo menos tres biomarcadores seleccionados del grupo como se definió en la reivindicación 1.

8.- El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en donde el paso a) comprende detectar y cuantificar por lo menos cuatro biomarcadores seleccionados del grupo como se definió en la reivindicación 1.

9.- El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en donde el paso a) comprende detectar y cuantificar por lo menos cinco biomarcadores seleccionados del grupo como se definió en la reivindicación 1.

10.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el paso a) comprende detectar y cuantificar los biomarcadores APOAl, GSN40 y TTHY ó una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo.

11.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el paso a) comprende detectar y cuantificar los biomarcadores APOAl, GSN40, GSN80 y TTHY ó una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo.

12.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el paso a) comprende detectar y cuantificar los biomarcadores APOAl, GSN40, GSN80 y TTHY ó una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo.

13.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el paso a) comprende detectar y cuantificar los biomarcadores CATDH, ENOA, GSTPl, MASP2, PRDX2 y TTHY ó una variante transcripcional o post-traslacional del mismo.

14.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el paso a) comprende detectar y cuantificar los biomarcadores AMY, APOAl, CATD K, ENOA, IDHC, PRDX2 y TTHY ó una variante transcripcional o post-traslacional del mismo.

15.- El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, se utilizan para detectar la presencia del carcinoma de la célula de transición de la vejiga, para determinar la estación ó severidad de este cáncer, para valorar la falta de la enfermedad después de resección quirúrgica, para establecer el diagnostico y/o pronostico de este cáncer y/o para monitorear el efecto del tratamiento administrado al individuo que sufre de dicho cáncer .

16.- El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 15, en donde la muestra de orina que se va a analizar fue obtenida de un individuo previamente no diagnosticado con el carcinoma de las células de transición de la vejiga.

17.- El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 15, en donde la muestra de orina que se va a analizar fue obtenida de un individuo fue previamente diagnosticado con el carcinoma de las células de transición de la vejiga.

18.- El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 15, en donde la muestra de orina que se va a analizar fue obtenida de un individuo que recibe un tratamiento contra el carcinoma de las células de transición de la vejiga.

19.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizadas porque la detección y cuantificacion de los biomarcadores comprendel primer paso, el cual el extracto de proteina de la muestra de orina es puesta en contacto con la composición de por lo menos dos anticuerpos específicos a uno o mas epitopes de los biomarcadores de la reivindicación 1, y el segundo paso, en el cual los complejos de la proteina-anticuerpo resultantes son cuantificados .

20.- El método de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque los anticuerpos dichos son de origen humano, humanizados o de origen no humano y seleccionado de anticuerpos monoclonales o policlonales, intactos ó fragmentos recombinados de anticuerpos, cuerpos combinados y fragmentos de anticuerpos Fab o scFv.

21.- El método de acuerdo con la reivindicación 19 o 20, caracterizado porque en la detección y cuantificacion de los complejos de proteina-anticuerpo resultantes, las técnicas usadas son seleccionadas de un grupo que consiste de: análisis Western, ELISA (Ensayo Inmunoabsorvente de enzimas vinculadas), EIA Competitivo ( Inmunoanálisis de Enzima Competitiva), DAS-ELISA (ELISA-emparedado de anticuerpo doble), técnicas inmunocitoquimicas o mmunohistoquimicas, técnicas basadas en el uso de biomicrocircuitos o micro rayos de proteina que incluyen anticuerpos específicos, ensayos basado en la precipitación de oro coloidal en formatos tales como tiras sumergibles; ó por técnicas cromatograficas por afinidad, ensayos de unión de ligaciones ó ensayos de unión de lectma.

22.- El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 21, en donde el método se usa para monitorear la eficacia de tratamientos farmacológicos ó quirúrgicos administrados a un individuo que sufra del carcinoma de célula de transición de la vejiga.

23.- El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a la 22, en donde el método es usado para determinar la progresión de la enfermedad cuando por lo menos dos biomarcadores son comparados de muestras de orina diferentes del mismo paciente obtenidas a diferente tiempo dentro de la evolución del carcinoma de célula de transición de la vejiga.

24.- El uso In Vi tro de por lo menos dos secuencias de peptidos derivadas de los biomarcadores como se definió en la reivindicación 1, en la orina para detectar la presencia de carcinoma de célula de transición de la vejiga por el análisis de orina, para determinar la estación o severidad de este cáncer, para valorar la falta de la enfermedad después de resección quirúrgica, para establecer el diagnostico y/o pronostico de este cáncer y/o para monitorear el efecto del tratamiento administrado al individuo que sufre del cáncer dicho.

25.- El uso de acuerdo con la reivindicación 24 de por lo menos dos secuencias de péptido derivadas de los biomarcadores seleccionados de TTHY (SEC ID 1) , ACY1 (SEC ID 2), AKR1A1 (SEC ID 3), ALDOB (SEC ID 4 ) , ANXA4 (SEC ID 5), BIEA (SEC ID 6), BLVRB (SEC ID 7), CATD H (SEC ID 8), CATD K (SEC ID 9), C03 (SEC ID 10, SEC ID 11), CPGL1 (SEC ID 12), ENOA (SEC ID 13, SEC ID 14), FRIL (SEC ID 15), GDIB (SEC ID 16), GPX3 (SEC ID 17), GSHB (SEC ID 18), GSTPl (SEC ID 19), IDHC (SEC ID 20) , LMAN2 (SEC ID 21) , LY6G6E (SEC ID 22) , MASP2 (SEC ID 23), NADC (SEC ID 24), NAPSA (SEC ID 25), PA2G4 (SEC ID 26) , PARK7 (SEC ID 27) , PCBP1 (SEC ID 28) , PDC6I (SEC ID 29) , PPAL (SEC ID 30) , PRDX2 (SEC ID 31) , PTD012 (SEC ID 32), QPCT (SEC ID 33), SBPl (SEC ID 34), STIP1 (SEC ID 35), TALDO (SEC ID 36), WDRl (SEC ID 37), AMY (SEC ID 38, SEC ID 39, SEC ID 40), APOAl (SEC ID 41), GSN40 (SEC ID 42), GSN80 (SEC ID 43) y RETBP (SEC ID 44) o una variante transcripcional o post-traslacional del mismo.

26.- El uso de acuerdo con la reivindicación 25, de por lo menos dos secuencias de peptido derivadas de los biomarcadores seleccionados de TTHY, ACY1 , AKR1A1 , ALDOB, ANXA4, BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03 , CPGL1 , ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTPl, IDHC, LMAN2 , LY6G6E, MASP2 , NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7 , PCBP1, PDC6I, PPAL, PRDX2 , PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO y WDRl o una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo.

27.- El uso de acuerdo con la reivindicación 25, de por lo menos dos secuencias de peptido derivadas de los biomarcadores seleccionados de TTHY, AMY, APOAl, GSN40 y GSN80 ó una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo .

28.- El uso de acuerdo con la reivindicación 25, de una o mas secuencias de polipéptido derivadas de los biomarcadores seleccionados de AMY, APOAl, GSN40 y GSN80 ó una variante transcppcional ó post-traslacional del mismo y una o mas secuencias de péptido derivadas de los biomarcadores seleccionados de TTHY, ACY1 , AKR1A1 , ALDOB, ANXA4, BIEA, BLVRB, CATD H, CATD K, C03 , CPGL1 , ENOA, FRIL, GDIB, GPX3, GSHB, GSTPl, IDHC, LMAN2 , LY6G6E, MASP2 , NADC, NAPSA, PA2G4, PARK7 , PCBP1, PDC6I, PPAL, PRDX2 , PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO y WDRl ó una variante transcppcional ó post-traslacional del mismo.

29.- El uso de acuerdo con la reivindicación 25, de una o mas secuencias de peptido derivadas de los biomarcadores seleccionados de CATD H, CATD K, ENOA, GSHB, GSTPl, IDHC, PRDX2 y TTHY ó una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo y una o mas secuencias de péptido derivadas de los biomarcadores seleccionados de ACY1, AKR1A1 , ALDOB, ANXA4, BIEA, BLVRB, C03 , CPGL1 , FRIL, GDIB, GPX3 , LMAN2, LY6G6E, MASP2 , NADC, NAPSA, PA2G4 , PARK7 , PCBP1, PDC6I, PPAL, PTD012, QPCT, SBPl, STIP1, TALDO, WDRl, AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP ó una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo.

30.- El uso de acuerdo con la reivindicación 25, de por lo menos dos secuencias de pépticos derivadas de los biomarcadores seleccionados de TTHY, CATD H, CATD K, ENOA, GSTPl, IDHC, MASP2, PRDX2 , AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y RETBP ó una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo.

31.- El uso de acuerdo con la reivindicación de cualquiera de las reivindicaciones 25 a la 30, en donde las variaciones en las medidas de por lo menos dos biomarcadores en la muestra de la prueba de orina en comparación con los valores de estándar correspondiente en la orina normal son indicativos del carcinoma de célula de transición de la vej iga .

32.- El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25 a la 30, de por lo menos tres secuencias de péptidos.

33.- El uso de acuerdo con las reivindicaciones 25 a la 30, de por lo menos cuatro secuencias de péptidos.

34.- El uso de acuerdo con las reivindicaciones 25 a la 30, de por lo menos cinco secuencias de péptidos.

35.- El uso de acuerdo con la reivindicación 25, de las secuencias de péptidos derivadas de APOAl, GSN40 y TTHY ó una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo.

36.- El uso de acuerdo con la reivindicación 25, de las secuencias de péptidos derivadas de APOAl, GSN40, GSN80 y TTHY ó una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo .

37.- El uso de acuerdo con la reivindicación 25, de las secuencias de peptido derivadas de AMY, APOAl, GSN40, GSN80 y TTHY o una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo.

38.- El uso de acuerdo con la reivindicación 25, de las secuencias de péptido derivadas de CATD H, ENOA, GSTPl, MASP2, PRDX2 y TTHY ó una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo.

39.- El uso de acuerdo con la reivindicación 25, de las secuencias de péptido derivadas de CATD H, ENOA, GSTPl, MASP2, PRDX2 y TTHY o una variante transcripcional ó post-traslacional del mismo.

40.- El uso de uno o mas nucleótidos o secuencias de péptidos derivadas de uno o mas biomarcadores seleccionados del grupo como se definió en la reivindicación 1, solo ó en cualquier combinación, en métodos para mostrara, identificar, desarrollar y/o evaluar la eficacia de agentes terapéuticos para tratar el carcinoma de células de transición de la vejiga.

41.- Un paquete para llevar a cabo un método como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que comprende 1) por lo menos dos anticuerpos que reconocen específicamente independientemente uno de los biomarcadores de la reivindicación 1 y 2) una carrera en un paquete adecuado .

42.- Un paquete de acuerdo con la reivindicación 41, que se usa para detectar la presencia del carcinoma de célula de transición de la vejiga, para determinar la estación o severidad de este cáncer, para valorar la falta de la enfermedad después de resección quirúrgica, para establecer el diagnostico y/o pronostico de este cáncer y/o para monitorear el efecto del tratamiento administrado al individuo que sufre del cáncer dicho.

43.- Un paquete de acuerdo con las reivindicaciones 41 o 42, comprenden un biomicrocircuito .

44.- Un paquete de acuerdo con la reivindicación 43, en donde el biomicrocurcuito comprende anticuerpos para la detección de biomarcadores seleccionados de un grupo como se definió en la reivindicación 1.