ES2361808B1 - Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico o el pronóstico del c�?ncer colorrectal. - Google Patents

Abstract

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico o el pronóstico del cáncer colorrectal.#La presente invención se encuadra dentro del campo de la biomedicina. Específicamente, se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, el pronóstico o la monitorización de la evolución de un cáncer colorrectal (CCR), a un método de diagnóstico de un CCR, a un método de pronóstico de un CCR ya un kit para llevar a cabo dichos métodos.

Description

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico o el pronóstico del cáncer colorrectal.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biomedicina. Específicamente, se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, el pronóstico o la monitorización de la evolución de un cáncer colorrectal (CCR), a un método de diagnóstico de un CCR, a un método de pronóstico de un CCR y a un kit para llevar a cabo dichos métodos.

Estado de la técnica anterior

El cáncer colorrectal (CCR) es el segundo cáncer más prevalente en el mundo occidental. El desarrollo de la enfermedad se produce durante décadas e involucra múltiples eventos genéticos. A pesar de que el CCR es uno de los tumores sólidos mejor caracterizados desde un punto de vista genético sigue siendo una de las principales causas de mortalidad en países desarrollados por el diagnóstico tardío de los pacientes debido al tiempo de espera que transcurre para realizar ciertas pruebas diagnósticas, como la colonoscopia.

Hoy en día, existen pocas proteínas que hayan sido descritas como biomarcadores eficaces de CCR (antígeno carcinoembrionario (CEA), CA19.9 y CA125) (Crawford et al. 2003. Journal of surgical oncology 84 (4), 239-248; Duffy et al. 2007 Eur J Cancer 43 (9), 1348-1360) y no son lo suficiente específicas para screenings clínicos con vistas a detectar CCR (Locker et al. 2006. J Clin Oncol 24 (33), 5313-5327).

Los análisis proteómicos están siendo activamente utilizados para la identificación de nuevos biomarcadores. En diferentes estudios proteómicos previos se han identificado mediante el uso de microarrays de anticuerpos y 2D-DIGE proteínas diferencialmente expresadas en tejido de CCR, incluyendo isoformas y modificaciones posttranslacionales responsables de modificaciones en rutas de señalización (Alfonso et al. 2005. Proteomics 5 (10), 2602-2611; Kopf et al. 2005. Proteomics 5(9), 2412-2416; Madoz-Gurpide et al. 2007. Mol Cell Proteomics 6 (12), 2150-2164; Alfonso et al. 2008. Journal of proteome research 7 (10), 4247-4255). Estas dos aproximaciones permitieron la identificación de una amplia colección de potenciales marcadores tumorales de tejido de CCR que actualmente están siendo investigados.

Sin embargo, la implementación de métodos diagnósticos no invasivos y más simples que permitan la detección temprana del CCR debería basarse en la identificación de proteínas o anticuerpos detectables en el suero o el plasma (Hanash et al. 2008. Nature 452 (7187), 571-579; Hudson et al. 2007. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of América 104 (44), 17494-17499). La existencia de una respuesta inmune a cáncer en humanos se ha demostrado por la presencia de autoanticuerpos en el suero de pacientes con cáncer. Así, diferentes proteínas humanas (autoantígenos) se pueden ver afectadas antes o durante la formación del tumor pudiendo producir una respuesta inmune una vez liberadas (Hudson et al. 2007. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of América 104 (44), 17494-17499; Wang et al. 2005. The New England journal of medicine 353 (12), 1224-1235; Sreekumar et al. 2004. J Natl Cancer Inst 96 (11), 834-843). Dichos autoanticuerpos se pueden detectar en estadios tempranos de la enfermedad e incluso antes de que el cáncer pueda ser detectado mediante otras técnicas indicando su elevado potencial como biomarcadores de la enfermedad (). Estas proteínas tumorales pueden verse afectadas por mutaciones puntuales, tener un plegamiento anómalo, sobreexpresión, glicosilación aberrante, estar truncadas o bien, sufrir una degradación aberrante como es el caso de p53, HER2, NY-ESO1 o MUC1, respectivamente (Chen et al. 1997. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of América 94 (5), 19141918; Schubert et al. 2000. Nature 404 (6779), 770-774; Ulanet et al. 2003. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of América 100 (21), 12361-12366). De hecho, autoantígenos asociados a tumores (AATs) han sido previamente caracterizados en cáncer CCR utilizando otras aproximaciones (Scanlan et al. 1998. International Journal of cancer 76 (5), 652-658). No obstante, la validez diagnóstica de los autoanticuerpos asociados con CCR identificados hasta la fecha requiere aún de una validación independiente para su uso generalizado en el diagnóstico/pronóstico del CCR.

Existe, por tanto, la necesidad de disponer de biomarcadores que permitan el diagnóstico del CCR, su clasificación en los diferentes estadios de la progresión tumoral, el pronóstico de la evolución de la enfermedad, la evaluación de su respuesta a un determinado tratamiento y la detección de la recurrencia o la diseminación del CCR, mediante un método sencillo, eficaz y no invasivo.

Explicación de la invención

La presente invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, el pronóstico o la monitorización de la evolución de cáncer colorrectal (CCR), a un método de diagnóstico de CCR, a un método de pronóstico de CCRyaunkit para llevar a cabo dichos métodos.

La presente invención proporciona, por tanto, una respuesta a la necesidad de disponer de biomarcadores que permitan el diagnóstico del CCR, su clasificación en los diferentes estadios de la progresión tumoral, el pronóstico de la evolución de la enfermedad, la evaluación de su respuesta a un determinado tratamiento y la detección de la recurrencia o la diseminación del CCR, mediante un método sencillo, eficaz y no invasivo.

La sangre es normalmente el fluido biológico óptimo basado en métodos no invasivos para el screening masivo con fines diagnósticos de grandes poblaciones de pacientes. Por un lado, el suero y el plasma son fáciles de obtener y por otra parte, la circulación sanguínea facilita el contacto de la sangre con todos los tejidos del cuerpo humano, incluyendo en el caso de pacientes con cáncer el contacto con tejido tumoral y sus antígenos representativos. La liberación de estos antígenos asociados a tumor probablemente ocurre a muy baja concentración en plasma y probablemente sufren proteólisis en un corto periodo de tiempo. Por el contrario, los anticuerpos son moléculas muy estables y que han sido usadas durante años en diferentes inmunoensayos en clínica, lo cual facilita la estandarización de los ensayos. El uso de los autoanticuerpos es también beneficioso en el sentido que el sistema inmune amplifica la respuesta facilitando su identificación y cuantificación.

En la presente invención se ha examinado el suero de pacientes con CCR y sueros control con el fin de identificar una firma de autoanticuerpos producidos por los pacientes en respuesta a CCR y sus respectivas proteínas reactivas. Sueros de pacientes de CCR y sueros de pacientes control se testaron utilizando microarrays de proteínas de alta densidad. Los microarrays de proteínas ofrecen una serie de ventajas con respecto a otras aproximaciones empleadas para la identificación de ATTs: i) las proteínas impresas en el array son conocidas a priori evitando una posterior identificación y eliminando la posible selección de mimótopos y ii) no hay predisposición a seleccionar ninguna proteína ya que todas ellas se imprimen a una concentración similar. Esta combinación de factores resulta en una elevada sensibilidad para la identificación de biomarcadores.

La firma de autoanticuerpos identificada permitió diferenciar entre sueros de pacientes control y con cáncer. En total, 43 proteínas se reconocían diferencialmente por los sueros de pacientes con CCR y los sueros de referencia (p valor <0,04) en el array de proteínas. La combinación de los 6 mejores antígenos inmunoreactivos: Pim1, MAPKAPK3, STK4, SRC, FGFR4 y ACVR2B fue capaz de detectar el CCR con un 100% de especificidad y sensibilidad usando los datos obtenidos del array de proteínas. Los niveles de expresión aumentados o disminuidos de dichas proteínas se confirmaron mediante inmunodetección en membrana e inmunohistoquímica utilizando tanto líneas celulares y tejido tumoral de CCR como microarrays de tejido.

Finalmente, el predictor formado por las proteínas purificadas Pim1, MAPKAPK3 y ACVR2B se testó mediante ELISA utilizando sueros de pacientes y sueros control. El ELISA es una técnica sensible, sencilla, rápida y económica, por lo que es una de las más empleadas en diagnóstico. El ELISA permitió discernir entre sueros de pacientes con CCR y sueros control con una especificidad y sensibilidad del 73,9 y 83,3% (AUC=0,86).

Estos estudios permitieron determinar la presencia de una firma de autoanticuerpos específica de CCR revelando la presencia de nuevos biomarcadores específicos de la enfermedad con el potencial para diagnosticar CCR utilizando sueros de pacientes con mayor especificidad y sensibilidad que con los biomarcadores descritos hasta la fecha.

La técnica del ELISA es mucho más sensible que otras técnicas como la inmunodetección en membrana o la inmunohistoquímica. Esta elevada sensibilidad podría explicar el por qué la prevalencia de los autoanticuerpos en pacientes con cáncer es mucho mayor que en otros estudios previos, además, de la detección de reactividad en pacientes control. De hecho, el ensayo diagnóstico debería basarse en autoanticuerpos con elevada prevalencia dado que fue imposible encontrar autoantígenos con inmunoreactividad exclusiva en el suero de pacientes con CCR.

Un primer aspecto de la invención se refiere al uso de los autoanticuerpos frente a, al menos, una de las proteínas seleccionada de la lista que comprende: Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, como marcador de CCR. Preferiblemente, dichos autoanticuerpos son inmunoglobulinas G (IgGs).

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, el pronóstico o el seguimiento de la evolución del CCR (de aquí en adelante, método primero de la invención), que comprende:

a) obtener una muestra biológica aislada de un sujeto,

b) detectar la cantidad de autoanticuerpos frente a, al menos, una de las proteínas seleccionada de la lista que

comprende: Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, en la muestra obtenida en el paso (a);

y

c) comparar la cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, se detecta la cantidad de autoanticuerpos frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, se detecta la cantidad de autoanticuerpos frente a, al menos, una de las proteínas seleccionada de la lista que comprende: Pim1, MAPKAPK3 o ACVR2B.

En una realización más preferida de este aspecto de la invención, se detecta la cantidad de autoanticuerpos frente a MAPKAPK3 y/o ACVR2B. En una realización aún más preferida de este aspecto de la invención, se detecta la cantidad de autoanticuerpos frente a MAPKAPK3 y ACVR2B.

Preferiblemente, los pasos (b) y/o (c) del método primero de la invención pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (b) o la comparación computerizada en el paso (c).

Además de los pasos (a)-(b) especificados anteriormente, el método primero de la invención puede comprender otros pasos adicionales, por ejemplo relacionados con el pre-tratamiento de la muestra o la evaluación de los datos obtenidos mediante este método.

Los datos obtenidos mediante el método primero de la invención son útiles para diagnosticar la presencia del CCR, clasificarlo en estadios, pronosticar su evolución, evaluar su respuesta a un determinado tratamiento, detectar su recurrencia o predecir los sitios de su diseminación.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de diagnóstico del CCR (de aquí en adelante, método segundo de la invención) que comprende los pasos (a)-(c) del método primero de la invención, y que además comprende un paso (d) donde una cantidad de autoanticuerpos frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4 o STK4 detectada en el paso (b) mayor que la cantidad de referencia con la que se compara en el paso (c) o una cantidad de autoanticuerpos frente a la proteína o ACVR2B menor que la cantidad de referencia con la que se compara en el paso (c) es indicativa de la presencia del CCR.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de pronóstico del CCR (de aquí en adelante, método tercero de la invención) que comprende los pasos (a)-(c) del método primero de la invención, y que además comprende un paso (d) donde una cantidad de autoanticuerpos frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4 o STK4 detectada en el paso (b) mayor que la cantidad de referencia con la que se compara en el paso (c) o una cantidad de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B menor que la cantidad de referencia con la que se compara en el paso

(c) es indicativa de una menor supervivencia libre de recaída a distancia o una menor supervivencia global.

El término “proteína Pim1” se refiere a la proteína cuyo número de acceso es NP_002639 y su secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 1.

El término “proteína SRC” se refiere a la proteína cuyo número de acceso es NP_005408 y su secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 2.

El término “proteína MAPKAPK3” se refiere a la proteína cuyo número de acceso es NP_004626 y su secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 3.

El término “proteína FGFR4” se refiere a la proteína cuyo número de acceso es NP_002002 y su secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 4.

El término “proteína STK4” se refiere a la proteína cuyo número de acceso es NP_006273 y su secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 5.

El término “proteína ACVR2B” se refiere a la proteína cuyo número de acceso es NP_001097 y su secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 6).

El término “anticuerpo”, tal como se utiliza en la presente descripción, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con una proteína. Hay cinco isotipos o clases principales de inmunoglobulinas: inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina D (IgD), inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina A (IgA) e inmunoglobulina E (IgE).

El término “autoanticuerpo”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se aplica a un anticuerpo que reacciona con un antígeno presente en el propio organismo de un sujeto, incluso si la reacción ocurre solo in vitro, y tanto si causa efectos patológicos in vivo como si no los produce.

El término “autoanticuerpo frente a la proteína Pim1” se refiere a un autoanticuerpo capaz de reaccionar con la proteína Pim1, con una variante de la proteína Pim1 o con un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente. Preferiblemente, el término autoanticuerpos frente a la proteína Pim1 se refiere a IgGs.

El término “autoanticuerpo frente a la proteína SRC” se refiere a un autoanticuerpo capaz de reaccionar con la proteína SRC, con una variante de la proteína SRC o con un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente. Preferiblemente, el término autoanticuerpos frente a la proteína SRC se refiere a IgGs.

El término “autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3” se refiere a un autoanticuerpo capaz de reaccionar con la proteína MAPKAPK3, con una variante de la proteína MAPKAPK3 o con un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente. Preferiblemente, el término autoanticuerpos frente a la proteína MAPKAPK3 se refiere a IgGs.

El término “autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4” se refiere a un autoanticuerpo capaz de reaccionar con la proteína FGFR4, con una variante de la proteína FGFR4 o con un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente. Preferiblemente, el término autoanticuerpos frente a la proteína FGFR4 se refiere a IgGs.

El término “autoanticuerpo frente a la proteína STK4” se refiere a un autoanticuerpo capaz de reaccionar con la proteína STK4, con una variante de la proteína STK4 o con un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente. Preferiblemente, el término autoanticuerpos frente a la proteína STK4 se refiere a IgGs.

El término “autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B” se refiere a un autoanticuerpo capaz de reaccionar con la proteína ACVR2B, con una variante de la proteína ACVR2B o con un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente. Preferiblemente, el término autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B se refiere a IgGs.

En el sentido utilizado en esta descripción, el término “variante” se refiere a una proteína sustancialmente homóloga a la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos. El término variante incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones posttranslacionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación, fosforilación o metilación.

Tal como aquí se utiliza, una proteína es “sustancialmente homóloga a la proteína Pim1” cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferiblemente de, al menos un 90%, más preferiblemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferiblemente de, al menos, un 99%.

Tal como aquí se utiliza, una proteína es “sustancialmente homóloga a la proteína SRC” cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferiblemente de, al menos un 90%, más preferiblemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferiblemente de, al menos, un 99%.

Tal como aquí se utiliza, una proteína es “sustancialmente homóloga a la proteína MAPKAPK3” cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferiblemente de, al menos un 90%, más preferiblemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferiblemente de, al menos, un 99%.

Tal como aquí se utiliza, una proteína es “sustancialmente homóloga a la proteína FGFR4” cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferiblemente de, al menos un 90%, más preferiblemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferiblemente de, al menos, un 99%.

Tal como aquí se utiliza, una proteína es “sustancialmente homóloga a la proteína STK4” cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferiblemente de, al menos un 90%, más preferiblemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferiblemente de, al menos, un 99%.

Tal como aquí se utiliza, una proteína es “sustancialmente homóloga a la proteína ACVR2B” cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6, es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6, de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferiblemente de, al menos un 90%, más preferiblemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferiblemente de, al menos, un 99%.

El término “identidad”, tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de aminoácidos idénticos entre dos secuencias de aminoácidos que se comparan. El tanto por ciento de identidad existente entre dos secuencias puede ser identificado fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.

El término “fragmento”, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a una porción de la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B o una de sus variantes.

La expresión “funcionalmente equivalente”, tal como aquí se utiliza, significa que la proteína o el fragmento de la proteína en cuestión mantiene esencialmente las propiedades inmunológicas descritas en este documento. Dichas propiedades inmunológicas se pueden determinar mediante métodos convencionales tales como los descritos en los Ejemplos que acompañan a esta descripción.

El término “diagnóstico”, tal y como se emplea en la descripción de los métodos primero o segundo de la presente invención, se refiere a la capacidad de detectar la presencia del CCR, cuando se aplica un método de clasificación de muestras basado en la análisis de la cantidad de autoanticuerpos frente a, al menos, una de las proteínas seleccionada de la lista que comprende: Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, y en la comparación de la cantidad detectada con una cantidad de referencia. Esta detección tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es significativamente estadística puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.

El término “pronóstico”, tal y como se emplea en la descripción de los métodos primero o tercero de la presente invención, se refiere a la capacidad de asignar una probabilidad de que ocurran determinadas situaciones en el transcurso de la enfermedad del CCR, cuando se aplica un método de clasificación de muestras basado en el análisis de la cantidad de autoanticuerpos frente a, al menos, una de las proteínas seleccionada de la lista que comprende: Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, y en la comparación de la cantidad detectada con una cantidad de referencia. Esta asignación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es significativamente estadística puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos.

El término “pronóstico” tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere, por ejemplo, pero sin limitarse, a la probabilidad de la muerte debida al CRC o a la progresión del CRC, incluyendo recurrencia o capacidad de diseminación metastásica, así como a la predicción de respuesta a un determinado tratamiento del CCR.

El término “predicción”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere, pero no se limita, a la probabilidad de que un paciente responda favorable o desfavorablemente a un determinado tratamiento, y a la extensión de dichas respuestas, o de que el paciente sobreviva, tras la eliminación quirúrgica de un tumor primario y/o la quimioterapia por un periodo de tiempo sin que se produzca recurrencia del CRC.

El término “supervivencia libre de recaída a distancia” (SLRD), tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al tiempo transcurrido desde la fecha de la cirugía hasta la recaída a distancia o hasta la última visita. El término “supervivencia global” (SG), tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al tiempo transcurrido desde la fecha de la cirugía hasta la última visita o hasta el fallecimiento del sujeto.

Los métodos de la presente invención son útiles para predecir o evaluar la respuesta a un determinado tratamiento. El tratamiento del CCR principal habitualmente suele ser cirugía, por ejemplo, pero sin limitarse, escisión local o resección. Algunos pacientes antes de la cirugía reciben terapia “neoadyuvante” con el objetivo de reducir el tamaño del CCR, para posibilitar o facilitar la cirugía. Después de la cirugía, muchos pacientes reciben terapia adyuvante con el objetivo de prevenir la recaída del cáncer en el colon, en el recto o en otro lugar. En el tratamiento del CCR, la terapia adyuvante o neoadyuvante puede consistir, por ejemplo, pero sin limitarse, en radioterapia, quimioterapia

o terapia biológica. Algunos ejemplos de compuestos empleados en quimioterapia o terapia biológica son, pero sin limitarse, ácido fólico, fluorouracilo, irinotecán, oxaliplatino, leucovorina, levamisol, cetuximab o bevacizumab.

El término “seguimiento de la evolución”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere, a la supervisión del desarrollo de la enfermedad, como por ejemplo, pero sin limitarse, la evaluación de la respuesta a un determinado tratamiento o la detección de la recurrencia o de la diseminación del CCR.

La expresión “detección de la cantidad” en la muestra obtenida, tal y como se emplea en la descripción de los métodos primero, segundo o tercero de la presente invención, hace referencia a la medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa. La medida puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración de autoanticuerpos frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B basada en una señal que se obtiene directamente de dichos autoanticuerpos y que está correlacionada directamente con el número de moléculas de autoanticuerpo frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, respectivamente, presentes en la muestra. Dicha señal -a la que también podemos referirnos como señal de intensidad-puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de los autoanticuerpos frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario (por ejemplo, un componente distinto de los autoanticuerpos) o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, “etiquetas” o productos de reacción enzimática).

El término “cantidad”, tal y como se emplea en la descripción de los métodos primero, segundo o tercero de la presente invención, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los autoanticuerpos frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de estos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de los autoanticuerpos frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B obtenidos mediante medida directa, por ejemplo, valores de intensidad de espectroscopía de masas o resonancia magnética nuclear. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.

El término “comparación”, tal y como se emplea en la descripción de los métodos primero, segundo o tercero de la presente invención, se refiere pero no se limita, a la comparación de la cantidad de los autoanticuerpos frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de autoanticuerpos frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, respectivamente, de una muestra de referencia deseable descrita en otra parte de la presente descripción. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. La comparación del paso (c) de los métodos primero, segundo o tercero de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.

El término “cantidad de referencia”, tal y como se emplea en la descripción de los métodos primero, segundo o tercero de la presente invención, se refiere a la cantidad absoluta o relativa de los anticuerpos frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B que permite discriminar la presencia del CCR. La cantidad de referencia adecuada puede ser determinada por el método de la presente invención a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. Más preferiblemente, la cantidad de referencia puede derivarse de los límites de distribución normal de una cantidad fisiológica encontrada en una población de sujetos control. Dicha cantidad fisiológica puede ser determinada por varias técnicas bien conocidas, como por ejemplo, el cálculo de la media de la cantidad de anticuerpos frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B en una población de sujetos control determinado mediante el método de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, la detección de la cantidad de autoanticuerpos frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B puede ser llevada a cabo por cualquier método. En una realización preferida, la detección de la cantidad de los autoanticuerpos se realiza mediante un inmunoensayo. El término “inmunoensayo”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a cualquier técnica analítica que basada en la reacción de conjugación de la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, de sus variante o de un fragmento de las mismas con un anticuerpo que reconoce a la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, respectivamente.

Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluoresecencia, inmunohistoquímica o microarrays de proteína.

En una realización preferida de los métodos primero, segundo o tercero de la invención, el inmunoensayo es un microarray.Un microarray de proteínas consiste en una colección de proteínas inmovilizadas sobre un soporte sólido en una disposición regular y prefijada. Existen varios factores importantes a tener en cuenta en el diseño de microarrays de proteínas, como son, por ejemplo, la naturaleza del soporte sobre el cual inmovilizar, la técnica de inmovilización de las proteínas, el formato del microarray, el agente de captura empleado o el método de detección a emplear. Son conocidos en el estado de la técnica diferentes formatos, soportes y técnicas que pueden ser empleados para la realización de este aspecto preferido de los métodos primero, segundo o tercero de la invención.

En una realización más preferida de los métodos primero, segundo o tercero de la invención, el microarray comprende los siguientes pasos: (a) recubrir un soporte sólido con, al menos, una de las proteínas seleccionada de la lista que comprende: Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, una variante o un fragmento de las mismas;

(b) incubar el soporte recubierto del paso (a) con una muestra biológica aislada obtenida del sujeto en condiciones que permitan la formación de un inmunocomplejo del autoanticuerpo frente a la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B presente en la muestra con los antígenos de la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, de su variante o de su fragmento; y (c) incubar con un anticuerpo secundario, que reconoce al autoanticuerpo frente a la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, conjugado o unido a un compuesto marcador.

En otra realización preferida de los métodos primero, segundo o tercero de la invención, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno de la muestra biológica o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sándwich.

En una realización más preferida de los métodos primero, segundo o tercero de la invención, el ELISA es un ELISA indirecto, que comprende los siguientes pasos: (a) recubrir un soporte sólido con, al menos, una de las proteínas seleccionada de la lista que comprende: Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, una variante o un fragmento de las mismas; (b) incubar el soporte recubierto del paso (a) con una muestra biológica aislada obtenida del sujeto en condiciones que permitan la formación de un inmunocomplejo del autoanticuerpo frente a la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B presente en la muestra con los antígenos de la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, de su variante o de su fragmento; y (c) incubar con un anticuerpo secundario, que reconoce al autoanticuerpo frente a la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, conjugado o unido a un compuesto marcador.

El término “compuesto marcador”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección y cuantificación de la cantidad del autoanticuerpo frente a la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B. El compuesto marcador se selecciona de la lista que comprende radioisótopos, enzimas, fluoróforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto marcador puede unirse al anticuerpo directamente, o a través de otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se unen directamente son, pero sin limitarse, enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, isótopos radiactivos como 33P o 35S, fluorocromos como fluoresceína o partículas metálicas, para su detección directa mediante colorimetría, auto-radiografía, fluorimetría, o metalografía respectivamente.

El término “muestra biológica aislada”, tal y como se utiliza en la descripción se refiere, pero no se limita, a tejidos y/o fluidos biológicos de un sujeto, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la presente invención. El término “sujeto”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos.

Preferiblemente, la muestra biológica aislada en el paso (a) de los métodos primero, segundo o tercero de la invención es un fluido biológico. Más preferiblemente, el fluido biológico es sangre, plasma o suero sanguíneo.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del producto de la expresión de, al menos, uno de los genes seleccionados de la lista que comprende Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B como marcador de CCR.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, el pronóstico

o el seguimiento de la evolución del CCR (de aquí en adelante, método cuarto de la invención) que comprende:

a) obtener de una muestra biológica aislada de un sujeto,

b) detectar la cantidad del producto de la expresión de, al menos, uno de los genes seleccionados de la lista que comprende Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, en la muestra obtenida en el paso (a); y

c) comparar la cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, se detecta la cantidad del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, se detecta la cantidad del producto de la expresión de, al menos, uno de los genes seleccionados de la lista que comprende: Pim1, MAPKAPK3 o ACVR2B.

En una realización más preferida de este aspecto de la invención, se detecta la cantidad del producto de la expresión de los genes MAPKAPK3 y/o ACVR2B. En una realización aún más preferida de este aspecto de la invención, se detecta la cantidad del producto de la expresión de los genes MAPKAPK3 y ACVR2B.

Preferiblemente, los pasos (b) y/o (c) del método cuarto de la invención pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (b) o la comparación computerizada en el paso (c).

Además de los pasos (a)-(b) especificados anteriormente, el método cuarto de la invención puede comprender otros pasos adicionales, por ejemplo relacionados con el pre-tratamiento de la muestra o la evaluación de los datos obtenidos mediante este método.

Los datos obtenidos mediante el método cuarto de la invención son útiles para diagnosticar la presencia del CCR, clasificarlo en estadios, pronosticar su evolución, evaluar su respuesta a un determinado tratamiento, detectar su recurrencia o predecir los sitios de su diseminación.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de diagnóstico del CCR (de aquí en adelante, método quinto de la invención) que comprende los pasos (a)-(c) del método cuarto de la invención, y que además comprende un paso (d) donde una cantidad del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4o STK4 detectada en el paso (b) mayor que la cantidad de referencia con la que se compara en el paso (c) o una cantidad del producto de la expresión del gen ACVR2B menor que la cantidad de referencia con la que se compara en el paso (c) es indicativa de la presencia del CCR.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de pronóstico del CCR (de aquí en adelante, método sexto de la invención) que comprende los pasos (a)-(c) del método cuarto de la invención, y que además comprende un paso (d) donde una cantidad del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4o STK4 detectada en el paso (b) mayor que la cantidad de referencia con la que se compara en el paso (c) o una cantidad del producto de la expresión del gen ACVR2B menor que la cantidad de referencia con la que se compara en el paso (c) es indicativa de una menor supervivencia libre de recaída a distancia o una menor supervivencia global.

El término “gen Pim1” se refiere al gen o a la secuencia de ADN que codifica para la proteína Pim1, una variante de la proteína Pim1 o un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente.

El término “gen SRC” se refiere al gen o a la secuencia de ADN que codifica para la proteína Pim1, una variante de la proteína Pim1 o un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente.

El término “gen MAPKAPK3” se refiere al gen o a la secuencia de ADN que codifica para la proteína Pim1, una variante de la proteína Pim1 o un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente.

El término “gen FGFR4” se refiere al gen o a la secuencia de ADN que codifica para la proteína Pim1, una variante de la proteína Pim1 o un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente.

El término “gen STK4” se refiere al gen o a la secuencia de ADN que codifica para la proteína Pim1, una variante de la proteína Pim1 o un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente.

El término “gen ACVR2B” se refiere al gen o a la secuencia de ADN que codifica para la proteína Pim1, una variante de la proteína Pim1 o un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente.

El término “producto de la expresión”, tal y como se utiliza en la descripción, hace referencia al producto resultante de la transcripción (ARN) o de la expresión (proteína) de un gen o de una secuencia de ADN. O a cualquier forma resultante del procesamiento del producto resultante de la transcripción o de la expresión de un gen o de una secuencia de ADN.

El término “diagnóstico”, tal y como se emplea en la descripción de los métodos cuarto y quinto de la presente invención, se refiere a la capacidad de detectar la presencia del CCR, cuando se aplica un método de clasificación de muestras basado en el análisis de la cantidad del producto de la expresión de, al menos, uno de los genes seleccionados de la lista que comprende: Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, y en la comparación de la cantidad detectada con una cantidad de referencia. Esta detección tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es significativamente estadística puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.

El término “pronóstico”, tal y como se emplea en la descripción de los métodos cuarto y sexto de la presente invención, se refiere a la capacidad de asignar una probabilidad de que ocurran determinadas situaciones en el transcurso de la enfermedad del CCR, cuando se aplica un método de clasificación de muestras basado en el análisis de la cantidad del producto de la expresión de, al menos, uno de los genes seleccionados de la lista que comprende: Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, y en la comparación de la cantidad detectada con una cantidad de referencia. Esta asignación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es significativamente estadística puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos.

La expresión “detección de la cantidad” en la muestra obtenida, tal y como se emplea en la descripción de los métodos cuarto, quinto o sexto de la presente invención, hace referencia a la medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa. La medida puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B basada en una señal que se obtiene directamente de los productos de la expresión de dichos genes y que está correlacionada directamente con el número de moléculas de del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, respectivamente, presentes en la muestra. Dicha señal -a la que también podemos referirnos como señal de intensidad-puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario (por ejemplo, un componente distinto de los productos de la expresión de los genes) o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, “etiquetas” o productos de reacción enzimática).

El término “cantidad”, tal y como se emplea en la descripción de los métodos primero, segundo o tercero de la presente invención, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de estos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B obtenidos mediante medida directa, por ejemplo, valores de intensidad de espectroscopía de masas o resonancia magnética nuclear. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.

El término “comparación”, tal y como se emplea en la descripción de los métodos cuarto, quinto o sexto de la presente invención, se refiere pero no se limita, a la comparación de la cantidad del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, respectivamente, de una muestra de referencia deseable descrita en otra parte de la presente descripción. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. La comparación del paso (c) de los métodos cuarto, quinto o sexto de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.

El término “cantidad de referencia”, tal y como se emplea en la descripción de los métodos cuarto, quinto o sexto de la presente invención, se refiere a la cantidad absoluta o relativa del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B que permite discriminar la presencia del CCR. La cantidad de referencia adecuada puede ser determinada por el método de la presente invención a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. Más preferiblemente, la cantidad de referencia puede derivarse de los límites de distribución normal de una cantidad fisiológica encontrada en una población de sujetos control. Dicha cantidad fisiológica puede ser determinada por varias técnicas bien conocidas, como por ejemplo, el cálculo de la media de la cantidad del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B en una población de sujetos control determinado mediante el método de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, la detección de la cantidad de producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B puede ser llevada a cabo por cualquier método conocido en el estado de la técnica.

En una realización preferida de los métodos cuarto, quinto o sexto de la invención, la detección del producto de la expresión de los genes se realiza analizando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, donde el análisis del nivel de ARNm se puede realizar, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción encadena de la polimerasa (RT-PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de marcaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio.

En una realización preferida de los métodos cuarto, quinto o sexto de la invención, la detección de la cantidad de producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B en la muestra obtenida se realiza analizando el nivel de las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, de sus variantes o de fragmentos de las mismas, donde el análisis del nivel de dichas proteínas se puede realizar, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante inmunoensayo, mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica conocida en el estado de la técnica. En una realización preferida, la detección de la cantidad de las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, de sus variantes o de los fragmento de las mismas. se realiza mediante un inmunoensayo.

En una realización preferida, el inmunoensayo es un inmunoblot. Para llevar a cabo la técnica del inmunoblot, también llamada Western blot o inmunodetección en membrana, se obtiene un extracto de proteínas a partir de una muestra biológica aislada de un sujeto y se separan las proteínas mediante electroforesis en un medio de soporte capaz de retenerlas. Una vez separadas las proteínas se transfieren a un soporte diferente o membrana donde pueden ser detectadas mediante el uso de anticuerpos específicos que reconocen a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, a sus variantes o a los fragmentos de las mismas. Esta membrana se hibrida con un primer anticuerpo específico (o anticuerpo primario) que reconoce a la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, a su variante o a un fragmento de las mismas. A continuación, la membrana se hibrida con un segundo anticuerpo (o anticuerpo secundario) capaz de reconocer de manera específica al anticuerpo primario y que se encuentra conjugado o unido con un compuesto marcador. En una realización alternativa, es el anticuerpo que reconoce a la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, a su variante o al fragmento de las mismas el que está conjugado o unido a un compuesto marcador, y no es necesario el uso de un anticuerpo secundario. Son conocidos en el estado de la técnica diferentes formatos, soportes y técnicas que pueden ser empleados para la realización de este aspecto preferido de los métodos cuarto, quinto o sexto de la invención.

En otra realización preferida, el inmunoensayo es una inmunhistoquímica (IHQ). Las técnicas de inmunohistoquímica permiten la identificación, sobre muestras tisulares o citológicas de determinantes antigénicos característicos. El análisis mediante inmunohistoquímica se realiza sobre cortes de tejido, ya sea congelado o incluido en parafina, procedente de una muestra biológica aislada de un sujeto. Estos cortes se hibridan con un anticuerpo específico o anticuerpo primario que reconoce a anticuerpos específicos que reconocen a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, a sus variantes o a fragmentos de las mismas. A continuación, los cortes se hibridan con un anticuerpo secundario capaz de reconocer de manera específica el anticuerpo primario y que se encuentra conjugado

o unido con un compuesto marcador. En una realización alternativa, es el anticuerpo que reconoce a la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, a su variante o al fragmento de las mismas el que está conjugado o unido a un compuesto marcador, y no es necesario el uso de un anticuerpo secundario.

Preferiblemente, la muestra biológica aislada en el paso (a) de los métodos cuarto, quinto o sexto de la invención comprende células tumorales y, más preferiblemente, células tumorales de CCR. La muestra biológica que contiene células tumorales puede ser un tejido, por ejemplo, pero sin limitarse, una biopsia tumoral o un aspirado por aguja fina, o puede ser un fluido biológico, por ejemplo, pero sin limitarse, una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero, linfa, fluido ascítico, orina o exudado mamario. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, fresca, congelada, fijada o embebida en parafina.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para llevar a cabo los métodos primero, segundo o tercero de la invención que comprende los elementos necesarios para detectar la cantidad de autoanticuerpos frente a, al menos, una de las proteínas de la lista que comprende Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B en una muestra biológica aislada de un sujeto. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit además comprende los elementos necesarios para comparar la cantidad detectada la cantidad de autoanticuerpos frente a la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B con una cantidad de referencia.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para llevar a cabo los métodos cuarto, quinto o sexto de la invención que comprende los elementos necesarios para detectar la cantidad del producto de la expresión de, al menos, uno de los genes seleccionados de la lista que comprende Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B en una muestra biológica aislada de un sujeto. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit además comprende los elementos necesarios para comparar la cantidad detectada la cantidad del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B con una cantidad de referencia.

Dichos kits puede contener todos aquellos reactivos necesarios para detectar la cantidad de autoanticuerpos frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B o del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B por medio de cualquiera de los métodos descritos anteriormente en este documento como, por ejemplo, pero sin limitarse, a la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, una variante o un fragmento de las mismas purificados, anticuerpos capaces de reconocer específicamente a la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, cebadores, polimerasas, sondas o controles positivos y/o negativos. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado, el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Descripción de las figuras

Figura 1. Muestras el análisis de la expresión de ACVR2B, Pim1 y MAPKAPK3 en líneas celulares y tejido tumoral. A, Las inmunodetecciones en membrana se realizaron con anticuerpos comerciales obtenidos frente a ACVR2B, Pim1 y MAPKAPK3 utilizando anti-tubulina como control del ensayo. 50 μg de extractos celulares de 6 líneas celulares de CCR (Rko, Hct116, SW48, SW480, Hct15, Colo205) y 5 líneas celulares de otras enfermedades o normales se utilizaron como referencia en el ensayo ((BxPc3 (adenocarcinoma de páncreas), Molt4 (Linfoblastoide), Neut (Neutrófilos), MEF (fibroblastos murinos embrionarios) y Linf (linfocitos)) se corrieron por separado en geles SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. B, 50 μg de extracto proteico de tejidos pareados normales

(N) y tumorales (T) de seis pacientes con CCR (estadios de Duke A, B y C) se corrieron de la misma forma. La señal se desarrolló utilizando ECL (Amersham) o SuperSignal Femto (Pierce). C, Los niveles relativos de la expresión de los genes de FGFR4 (Notterman, Alon et al. 2001), MAPKAPK3 (Ki, Jeung et al. 2007), SRC (Ki, Jeung et al. 2007) y STK4 (Watanabe, Kobunai et al. 2006) se evaluaron utilizando la base de datos pública de DNA microarrays Oncomine (www.oncomine.org). D, Análisis de la expresión de Pim1 y ACVR2B en tejido utilizando TMA específicos de CCR. Las imágenes se tomaron a diferentes aumentos (100x y 400x). La expresión de Pim1 se observó en células epiteliales rodeando las criptas de tejido tumoral con tinción citoplasmática. La tinción de ACVR2B se localizó principalmente a nivel de membrana de las células epiteliales en el tejido normal con una clara disminución de su expresión en tejido tumoral.

Figura 2. Muestra la verificación de los AATs seleccionados mediante ELISA. Valores de ELISA de Pim1, MAP-KAPK3 y ACVR2B usando CEA y Anexina IV como controles. Las barras de error representan la desviación estándar del ensayo.

Figura 3. Muestra las curvas ROC de los AATs seleccionados. Representación gráfica del comportamiento de los AATs A, Curvas ROC utilizando los valores de ELISA de ACVR2B, Pim1 y MAPKAPK3 individualmente. B, Curvas ROC utilizando diferentes combinaciones de las proteínas seleccionadas. C, Curvas ROC utilizando de los controles CEA y Anexina IV.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

Ejemplo 1

Identificación de autoanticuerpos específicos de cáncer colorrectal

Doce sueros de pacientes con CCR en estadios avanzados y que desarrollaron diferentes tipos de metástasis hacia hígado (7 pacientes), hígado y pulmón (4 pacientes) e hígado y huesos (1 paciente)y8sueros de individuos sanos fueron testados usando microarrays de proteínas de alta densidad con el fin de identificar autoanticuerpos específicos de CCR y sus antígenos reactivos respectivos (Tabla 1). Los sueros control fueron seleccionados para tener exactamente la misma proporción de mujeres y hombres y la misma edad media de los pacientes con CCR (64,5 años). Los controles sanos y los pacientes con CCR mostraron un patrón de inmunoreactividad diferente. Después de cuantificar la intensidad de los diferentes puntos (proteínas) con el programa GenePix, los datos se normalizaron usando el método de los cuantiles y se procesaron utilizando el ProtoArray Prospector Analyser. Los arrays usados como control mostraron un excelente comportamiento, con un bajo nivel de ruido de fondo y reactividad específica.

Con el fin de estudiar la habilidad de la firma de autoanticuerpos para discriminar entre los diferentes tipos de metástasis se realizó un clúster no supervisado con los datos procesados utilizando el programa MeV. Las muestras mestastáticas se separaron en dos ramificaciones principales que correspondían a los pacientes con metástasis hacia hígado e hígado y pulmón y únicamente dos muestras no se clasificaron correctamente. Por otra parte, el análisis supervisado con los datos procesados de los pacientes con CCR mostró que los dos tipos de pacientes se podían separar satisfactoriamente. Así, una muestra de AATs con una prevalencia superior al 60% se asoció a los pacientes de CCR con metástasis hacia hígado (22 proteínas) o bien, metástasis hacia hígado y pulmón (15 proteínas) (Tabla 2).

TABLA 1

Información clínica de los pacientes con CCR testados en los microarrays de proteínas

TABLA 2

Proteínas reactivas a autoanticuerpos asociados a metástasis

TABLA 2 (continuación)

Ejemplo 2

Caracterización de los AATs más prevalentes en cáncer colorrectal

Las proteínas que mostraron capacidad discriminatoria entre pacientes normales y tumorales aparecen en la Tabla

3. El análisis se realizó utilizando el programa ProtoArray Prospector Analyser clasificando los datos en función del p valor calculado para cada proteína y la prevalencia de los autoanticuerpos en ambos grupos. El p valor se fijó para ser como máximo 0,04 y la prevalencia mayor de un 50% en la población de pacientes con cáncer colorrectal. En total, 432 proteínas mostraron inmunoreactividad a los autoanticuerpos presentes en el suero. Entre ellas, 43 proteínas poseían un p valor significativo menor de 0,04. En cuanto a su clasificación, 25 de ellas presentaban una mayor prevalencia en el suero de pacientes con CCR y 18 una prevalencia menor en pacientes respecto a individuos control. Seis proteínas -MAPKAPK3, Pim1, SRC, STK4, FGFR4 y ACVR2B-se seleccionaron según los datos de intensidad de señal de los microarrays. Dichas proteínas estaban entre las más prevalentes en el suero de pacientes con cáncer según el análisis usando el Prospector Analyser y mostraban una prevalencia en CCR entre el 50-70% y menor de un 20% de prevalencia en los sujetos control. Aunque había variaciones significativas en cuanto a la respuesta individual, MAPKAPK3, Pim1, SRC, STK4 y FGFR4 fueron reconocidas significativamente por pacientes con CCR. Por otro lado, ACVR2B mostró un reconocimiento diferente dado que lo reconocían principalmente los sujetos control.

TABLA 3

Proteínas reactivas a autoanticuerpos asociados a CCR*

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo 3

Análisis de la expresión diferencial de las proteínas seleccionadas AATs en líneas celulares y tejido tumoral de cáncer colorrectal

Un reconocimiento más elevado por los autoanticuerpos presentes en el suero de pacientes con CCR indicaría una sobreexpresión de aquellas proteínas en tejido tumoral de CCR, mientras que un reconocimiento más débil en el suero de pacientes con CCR que en los individuos normales indicaría una disminución de la expresión u otra modificación de dichas proteínas en el tumor. Con esta hipótesis de partida, tres autoantígenos: Pim1, MAPKAPK3 y ACVR2B se seleccionaron para la validación inicial.

En primer lugar, los niveles de expresión de las proteínas en extractos pareados normal/tumoral de tejido del mismo paciente con CCR se analizaron mediante inmunodetección en membrana (Figura 1A). Pim1 y MAPKAPK3 mostraron una mayor expresión en tejido tumoral, siendo su expresión más abundante en etapas avanzadas de la enfermedad. ACVR2B exhibía una débil expresión en tejido tumoral y, en general, más expresión en estadios tempranos de la enfermedad. Posteriormente, se analizaron los niveles de expresión de los autoantígenos en 6 líneas celulares de CCR en comparación con 5 líneas celulares usadas como referencia (Figura 1B). La expresión de Pim1 y MAPKAPK3 se detectó en prácticamente todas las líneas celulares de CCR, excepto MAPKAPK3 en la línea celular SW480. En cuanto a ACVR2B, en las líneas celulares de referencia incluyendo neutrófilos y linfocitos se observó su expresión, no así en las líneas celulares de cáncer de colon.

Con el fin de estudiar la correlación entre la respuesta humoral y la abundancia en tejido, se verificó la expresión diferencial de las 6 proteínas a nivel de mRNA y a nivel proteico. Para determinar los niveles de mRNA recurrimos a la base de datos Oncomine (Rhodes et al. 2004. Neoplasia New York, N.Y. 6 (1), 1-6), una página web que incluye una base de datos con los resultados de datos de expresión génica en cáncer utilizando microarrays. Los datos para FGFR4, MAPKAPK3, SRC y STK4 en CCR se muestran en la Figura 1C. Todos ellos mostraron unos niveles de expresión mayores en CCR. No se encontraron datos para Pim1 y ACVR2B en CCR. Para corroborar la expresión diferencial de las proteínas, utilizamos un microarray de tejidos de CCR con anticuerpos específicos de ACVR2B y Pim1, que eran los únicos disponibles comercialmente para esta técnica entre las 6 proteínas estudiadas (Figura 1D). Pim1 mostró una expresión aumentada en las células epiteliales que rodean las criptas de tejido tumoral, siendo la tinción principalmente citoplasmática. Además, tanto los linfocitos como los macrófagos se tiñeron de una forma muy importante. En cuanto a ACVR2B, la expresión estaba disminuida en pacientes con CCR, mientras que en tejido normal se observaba su expresión normal. En este caso, la tinción de ACVR2B se localizó principalmente en la membrana de las células epiteliales dado que actúa como receptor de membrana.

Ejemplo 4

Confirmación del uso de Pim1, ACVR2B y MAPKAPK3 como biomarcadores en cáncer colorrectal

La técnica de ELISA es ampliamente utilizada en clínica por su facilidad y sensibilidad. Con el fin de corroborar nuestros resultados previos decidimos realizar un ensayo de ELISA con las proteínas recombinantes Pim1, MAP-KAPK3 y ACVR2B expresadas en E. coli, ya que podría permitir discriminar fácilmente entre sueros de individuos sanos e individuos con cáncer. Como controles se utilizaron CEA comercial y Anexina IV recombinante expresada en células de mamífero. CEA por ser el marcador más usado en el diagnóstico de CCR (Duffy, M. J. 2001 Clinical chemistry 47 (4), 624-630) y Anexina IV por su sobreexpresión en tejido de CCR (Alfonso et al. 2005. Proteomics 5 (10), 2602-2611). Así, en este ensayo directo de ELISA se testaron 94 muestras de suero, 52 sueros de pacientes con CCR y 42 sueros de individuos sanos. Los resultados del ELISA fueron consistentes con los obtenidos en el array de proteínas y en la inmunodetección en membrana; los autoanticuerpos frente a Pim1, MAPKAPK3 y ACVR2B permitían discriminar entre pacientes con CCR y sueros control. Pim1 mostró una inmunoreactividad significativamente mayor en el suero de pacientes con CCR (media= 0,606, 95% Cl= 0,505 a 0,708, p<0,008) que en sujetos control (media = 0,439, 95% Cl= 0,369 a 0,510). Para MAPKAPK3 se obtuvieron resultados similares en sueros de pacientes con cáncer (media= 0,929, 95% Cl= 0,828 a 1,030, p<0,0001) y controles (media= 0,648, 95% Cl= 0,574 a 0,722) (Figura 2). En el caso de ACVR2B la inmunoreactividad fue superior en el suero de pacientes control (media= 0,863, 95% Cl= 0,744 a 0,981, p<0,026) que en el suero de individuos con cáncer de colon (media= 0,668, 95% Cl= 0,549 a 0,790), lo que confirmó los resultados previos obtenidos con los protoarrays. En cuanto a la inmunoreactividad de CEA y Anexina IV, no se observaron diferencias significativas entre muestras tumorales (CEA: media= 0,787, 95% Cl= 0,674 a 0,900, p<0,1); (Anexina IV: media= 0,421, 95% Cl= 0,360 a 0,481, p<0,16) y muestras control (CEA: media= 0,665, 95% Cl= 0,588 a 0,742; Anexina IV: media= 0,366, 95% Cl= 0,318 a 0,414).

Posteriormente, se investigó la capacidad de esta respuesta humoral como predictor para detectar CCR. Así, se obtuvieron las curvas ROC a partir de la respuesta de los autoanticuerpos frente a las proteínas Pim1, MAPKAPK3 y ACVR2B (Figura 3A). La especificidad y sensibilidad del ensayo para Pim1 fue del 83,3 y 48,1% (usando un cutoff de 0,534), respectivamente, y el área debajo de la curva fue AUC= 0,651 (95% Cl= 0,546 a 0,746). En el caso de MAPKAPK3, la especificidad fue 74% y la sensibilidad 72,7% (con un cut-off de 0,762), siendo AUC= 0,733 (95% Cl= 0,632 a 0,819). Para ACVR2B encontramos una especificidad y sensibilidad del 76,2% y 60%, respectivamente, (cut-off = 0,548) y AUC= 0,666 (95% Cl = 0,562 a 0,760). Las proteínas control CEA y Anexina IV dieron menores valores de especificidad y sensibilidad; especificidad de 59,5% y sensibilidad de 63,5% para CEA con un cut-off= 0,61 y AUC= 0,61 (95% Cl= 0,513 a 0,717). La Anexina IV dio un valor de AUC= 0,556 (95% Cl= 0,450 a 0,658) indicando la ausencia de autoanticuerpos específicos para esta proteína.

Finalmente, decidimos testar si diferentes combinaciones de estas proteínas mejorarían su capacidad diagnóstica. Los datos se ajustaron a una curva logística, se calcularon las regresiones logísticas y se obtuvieron diferentes modelos incorporando combinaciones de las proteínas (Figura 3C). El modelo inicial incluyó cuatro proteínas: Pim1, MAP-KAPK3, ACVR2B y CEA, sin embargo los test del método discriminante lineal mostraron que CEA y Pim-1 no tenían relevancia en el modelo. Esto se confirmó comparando el modelo completo con las cuatro proteínas (AUC=0,85) con un modelo que incluía solamente MAPKAPK3 y ACVR2B (AUC=0,86). Mientras que CEA no mejoraba el modelo, Pim1 incluso lo empeoraba ligeramente.

Así, se demostró que un modelo con la combinación de tan solo los autoanticuerpos frente a MAPKAPK3 y ACVR2B era un relevante predictor de CCR con una especificidad y sensibilidad del 73,9 y 83,3%, respectivamente, y un área debajo de la curva AUC= 0,86 (Figura 3D).

Materiales y Métodos

Información clínica y obtención de los sueros (ejemplos 1, 2 y 4). Los sueros de 12 pacientes con CCR se recogieron al realizarse su diagnóstico (Hospital Universitario de Salamanca). Estas muestras se seleccionaron por tener los pacientes CCR en estadios avanzados, además de desarrollar metástasis hacia hígado (7 pacientes), hígado y pulmón (4 pacientes) o bien, hígado y huesos (1 paciente). La edad media de estos pacientes fue de 64,5 años (entre 41 y 84 años). Ocho sueros control se obtuvieron de donantes sanos y fueron seleccionados para tener exactamente la misma media de edad de la población de pacientes con CCR y la misma proporción de hombres y mujeres. Los datos clínicos de los pacientes se muestran en la Tabla 1. Para la validación de los resultados mediante ELISA se utilizó un set independiente de 52 sueros de pacientes con CCR y 42 sueros normales.

Todos los sueros fueron procesados utilizando el mismo protocolo. Las muestras de sangre se dejaron a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir la formación del coágulo y, tras su centrifugación a 3,000g durante 10 minutos a 4ºC, los sueros fueron congelados y almacenados a -80ºC hasta su uso.

Arrays de Proteínas (ejemplos 1 y 2). 20 sueros (12 de pacientes con CCR y 8 de individuos sanos) (Tabla 1) se incubaron con el ProtoArrayTM Human Protein Microarrays v.4.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Este microarray contiene 8000 proteínas humanas fusionadas a GST, expresadas en células de insecto Sf9 e impresas por duplicado. Brevemente, los arrays se equilibraron a 4ºC durante 15 min y se bloquearon con el tampón de bloqueo (1% BSA en PBS-Tween 20 0,1%) durante 1 h a 4ºC con agitación suave. Un total de 150 μL de suero diluido 1:50 en tampón de bloqueo se aplicaron sobre la superficie del array. El array se selló con un CoverGlass (Corning) y se incubó durante 90 min a 4ºC. Los arrays se lavaron con tampón de incubación (1% BSA en PBS con 0,5 mM DTT, 5% glycerol y 0,05% Triton X100) y los autoanticuerpos del suero unidos a las proteínas del array se detectaron utilizando un anticuerpo secundario anti-human IgG (H+L) marcado con Alexa Fluor 647 (Invitrogen) diluido 1:2,000 en tampón de incubación a 4ºC durante 90 min. Los arrays se lavaron con PBS Tween 20 0,1% y se secaron por centrifugación a 1000 rpm durante 1 min. Finalmente, los slides se escanearon en un ScanArrayTM 5000 (Packard BioChip Tecnologías) usando los láseres de 635 nm y 532nm. El software de análisis de imagen GenePix Pro 5.1 se utilizó para la cuantificación.

Como controles, los Protoarrays v4.0 se incubaron con un anticuerpo anti-GST antes de incubar el array con un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con AlexaFluor 555 para testar la uniformidad y la cantidad de proteína impresa en el array. Otro array se incubó directamente con el anticuerpo secundario anti-human IgG (H+L) marcado con Alexa Fluor 647 para determinar los niveles de ruido en el ensayo.

Anticuerpos, proteínas y líneas celulares (ejemplos 3 y 4). Los anticuerpos y las proteínas se obtuvieron de diferentes fuentes. CEA se obtuvo de Calbiochem y la albúmina de suero humana (HSA) se obtuvo de la compañía Sigma.

El cDNA codificante de Pim1 humana se introdujo en el vector pET28a, el cual permite la fusión 6xHis-Pim1, y fue expresada en Escherichia coli usando la cepa BL21 (DE3). El cDNA de la ACVR2B humana se introdujo en el vector pDEST 527 que permite la fusión 6xHis-ACVR2B, usando el sistema Gateway y fue expresada en bacteria, mientras que la proteína MAPKAPK3 humana se introdujo en el vector de expresión pDEST565 que permite la fusión 6xHis-GST-MAPKAPK3 y se expresó en las mismas condiciones que ACVR2B y Pim1. Las proteínas así expresadas se purificaron mediante cromatografía de afinidad usando una columna HiTrap Chelating (GE Healthcare) seguida de un paso de purificación extra mediante una columna de penetrabilidad Superdex 200 column (GE Healthcare). El cDNA codificante de la Anexina IV humana se clonó en el vector de expresión pTT3 y se expresó en las células HEK293-EBNA. La proteína recombinante se expresó tras transfectar las células con lipofectamina (Sigma) y se purificó mediante una columna de afinidad de Ni-chelating resin (GE Healthcare).

Los anticuerpos frente a MAPKAPK3 y Pim1 utilizados en los ensayos de ELISA se compraron a la compañía Abnova. Los anticuerpos frente a MAPKAPK3, Pim1 y ACVR2B usados en inmunodetección en membrana y array de tejidos se compraron a la compañía Abcam.

Las líneas celulares de CCR (Rko, Hct116, Hct15, Sw45, Sw480, Colo 205), de adenocarcinoma pancreático BxPc3 y la línea linfoblastoide Molt4 se crecieron utilizando protocolos preestablecidos para dichas células. Los neutrófilos y linfocitos usados como controles se aislaron a partir de sangre periférica de un individuo sano. Los fibroblastos murinos embrionarios (MEF) se inmortalizaron infectando un cultivo primario con el virus Epstein-Barr y se crecieron utilizando protocolos preestablecidos para esta línea celular.

ELISA (ejemplo 4). Un ensayo de ELISA se desarrolló con el fin de testar la habilidad de los autoantígenos purificados para discriminar CCR usando suero de pacientes. Brevemente, se tapizaron 0,3 μg de las proteínas purificadas

o HSA como control negativo en placas Microtiter (Maxisorp, Nunc) en PBS durante toda la noche. El día después, las placas se lavaron 3 veces con PBS y se bloquearon con 3% de leche desnatada en PBS durante2ha temperatura ambiente. Tras un lavado adicional, las 94 muestras de suero (dilución 1:50 en 3% de leche desnatada en PBS) se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Tras lavar, se utilizó un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con HRP diluido 1:3, 000 (v:v) para la detección y TMB para el desarrollo de la señal. La reacción se detuvo con 1M de H2SO4 y la absorción se midió a 450 nm.

Inmunodetección en membrana (ejemplo 3). Los extractos proteicos de tejidos pareados de 6 pacientes con CCR (12 en total) se prepararon como se ha descrito previamente en (5). Brevemente, los extractos proteicos se obtuvieron tras lisarlos con 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1% desoxicolato sódico, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) suplementado con inhibidores de proteasas (Roche). La concentración de proteína se determinó utilizando el kit 2-D Quant (GE Healthcare) tras clarificarlo por centrifugación a 12000g durante 15 min.

Para la inmunodetección en membrana, 50 μg de los extractos proteicos de las 6 líneas celulares de cáncer de colon, las 5 líneas celulares de referencia y los tejidos pareados se corrieron en paralelo en un gel SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond-C extra) según protocolos estándar. Después del bloqueo, las membranas se incubaron con las diluciones óptimas de anticuerpos mono o policlonales frente a los antígenos seleccionados: Pim1 (dilución 1:100), MAPKAPK3 (dilución 1: 500) y ACVR2B (dilución 1:200). Como anticuerpos secundarios se utilizó un anti-IgG de cabra (DakoCytomation) a una dilución 1:5,000 para ACVR2B y 1:20,000 para Pim1 y MAPKAPK3 o bien un anti-IgG de pollo (Jackson ImmunoReasearch Laboratory) conjugado a HRP. La señal se detectó mediante ECL (GE Healthcare).

Inmunohistoquímica (ejemplo 3). Los microarrays de tejido (TMA) específicos de CCR con 45 muestras tumorales diferentes se prepararon como se ha descrito previamente (Madoz-Gurpide et al. 2007. Mol Cell Proteomics 6 (12), 2150-2164). Las secciones se cortaron a una anchura máxima de 3 μm y se secaron a 56ºC durante 16h antes de desparafinar en xileno y rehidratar en agua tras pasos previos en diferentes porcentajes de etanol. La exposición y recuperación de epítopos se realizó en 0,01 M tampón citrato sódico calentado durante 2 min en una olla a presión. Después del paso de calentamiento, los slides se lavaron con agua durante 5 min y nuevamente en tampón Tris salino (TBS) a pH 7,4.

Los TMAs se incubaron con un anticuerpo monoclonal frente a Pim1 (Abcam) y un anticuerpo policlonal frente a ACVR2B (Abcam). La unión específica se detectó mediante anti-IgG de cabra conjugado a biotina. La visualización de interacciones específicas se realizó con el sistema EnVisionHRP (DakoCytomation).

Análisis estadístico (ejemplo 1, 2 y 4). Los “slides” se analizaron con el software del fabricante -ProtoArray Prospector Analyser 4.0 (Invitrogen)-, que usa un test estadístico basado en el principio de la desigualdad de Chebyshev (Hudson et al. 2007. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of América 104 (44), 17494-17499). Después de la normalización por cuantiles, el algoritmo compara la señal de cada proteína a la señal de los controles negativos en el array y asigna un Cl p valor para cada proteína. El software identifica las señales significativas (las que se identifican como positivas sobre el ruido de fondo) y calcula unos valores Z que reflejan la intensidad de la señal en comparación con todas las proteínas. Finalmente, el programa compara los 2 grupos e identifica las proteínas que tienen una señal aumentada en uno de los 2 grupos y se calcula el p valor para cada proteína según la hipótesis de que no hay un aumento de señal en un grupo comparado con el otro.

Los clústeres supervisados se obtuvieron usando la distancia métrica y la correlación de Pearson para visualizar la discriminación entre los grupos utilizando el programa Multi Experiment Viewer (MeV) (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA). Para determinar si la media del grupo normal y la media del grupo tumoral eran estadísticamente diferentes se realizó un test no paramétrico de Wilcoxon con los datos obtenidos del ELISA. Posteriormente, cada marcador se evaluó de manera individual utilizando una curva ROC calculada con el programa JMP (SAS, NC, USA). Finalmente, se hizo un análisis discriminante usando modelos lineales para determinar el efecto de la combinación de los biomarcadores (Visintin et al. 2008. Clinical Cancer Research. 14 (4), 1065-1072).

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Uso de los autoanticuerpos frente a, al menos, una de las proteínas seleccionada de la lista que comprende: Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, como marcador de cáncer colorrectal.

2. 2. Uso de los autoanticuerpos según la reivindicación 1, donde los autoanticuerpos son inmunoglobulinas G.

3. 3.

   Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, el pronóstico o el seguimiento de la evolución del cáncer colorrectal que comprende:

   a) obtener una muestra biológica aislada de un sujeto,

   b) detectar la cantidad de autoanticuerpos frente a, al menos, una de las proteínas seleccionada de la lista que comprende: Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, en la muestra obtenida en el paso (a); y

   c) comparar la cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.
4. 4. Método de obtención de datos útiles según la reivindicación 3, donde en el paso (b) se detecta la cantidad de autoanticuerpos frente a, al menos, una de las proteínas seleccionada de la lista que comprende: Pim1, MAPKAPK3

   o ACVR2B.

5. 5.

   Método de obtención de datos útiles según la reivindicación 4, donde en el paso (b) se detecta la cantidad de autoanticuerpos frente a MAPKAPK3 y/o ACVR2B.

6. 6.

   Método de diagnóstico del cáncer colorrectal según cualquiera de las reivindicaciones3a5,que además comprende un paso (d) donde una cantidad de autoanticuerpos frente a las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4 o STK4 detectada en el paso (b) mayor que la cantidad de referencia con la que se compara en el paso (c) o una cantidad de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B menor que la cantidad de referencia con la que se compara en el paso

   (c) es indicativa de la presencia del cáncer colorrectal.

7. 7.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, donde la detección de la cantidad de autoanticuerpos del paso (b) se lleva a cabo mediante inmunoensayo.

8. 8. Método según la reivindicación 7, donde el inmunoensayo es un microarray de proteínas.

9. 9.

   Método según la reivindicación 7, donde el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

10. 10.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde en el inmunoensayo se emplea, al menos, una de las proteínas seleccionada de la lista que comprende: Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, una variante o un fragmento de las mismas unido a un sustrato sólido.

11. 11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, donde los autoanticuerpos son inmunoglobulinas

    G.

12. 12.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, donde la muestra biológica es un fluido biológico.

13. 13.

    Método según la reivindicación 12, donde el fluido biológico es sangre o suero o plasma sanguíneo.

14. 14.

    Uso del producto de la expresión de, al menos, uno de los genes seleccionados de la lista que comprende Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B como marcador de cáncer colorrectal.

15. 15.

    Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, el pronóstico o el seguimiento de la evolución del cáncer colorrectal que comprende:

    a) obtener de una muestra biológica aislada de un sujeto,

    b) detectar la cantidad del producto de la expresión de, al menos, uno de los genes seleccionados de la lista que comprende Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, en la muestra obtenida en el paso (a); y

    c) comparar la cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.
16. 16. Método de obtención de datos útiles según la reivindicación 15, donde en el paso (b) se detecta la cantidad del producto de la expresión de, al menos, uno de los genes seleccionados de la lista que comprende: Pim1, MAPKAPK3

    o ACVR2B.

17. 17.

    Método de obtención de datos útiles según la reivindicación 16, donde en el paso (b) se detecta la cantidad del producto de la expresión de los genes MAPKAPK3 y/o ACVR2B.

18. 18.

    Método de diagnóstico del cáncer colorrectal según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, que además comprende un paso (d) donde una cantidad del producto de la expresión de los genes Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4o STK4 detectada en el paso (b) mayor que la cantidad de referencia con la que se compara en el paso (c) o una cantidad del producto de la expresión del gen ACVR2B menor que la cantidad de referencia con la que se compara en el paso (c) es indicativa de la presencia del cáncer colorrectal.

19. 19.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, donde el producto de la expresión del gen Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B es la proteína Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, respectivamente, una variante o un fragmento de las mismas.

20. 20.

    Método según la reivindicación 19, donde la detección de la cantidad de la proteína del paso (b) se lleva a cabo mediante inmunoensayo.

21. 21.

    Método según la reivindicación 20, donde el inmunoensayo es un inmunoblot.

22. 22.

    Método según la reivindicación 20, donde el inmunoensayo es una inmunohistoquímica.

23. 23.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, donde la muestra biológica comprende células tumorales.

24. 24.

    Kit para llevar a cabo los métodos según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13 que comprende los elementos necesarios para detectar la cantidad de autoanticuerpos frente a, al menos, una de las proteínas de la lista que comprende Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B en una muestra biológica aislada de un sujeto.

25. 25.

    Kit para llevar a cabo los métodos según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23 que comprende los elementos necesarios para detectar la cantidad del producto de la expresión de, al menos, uno de los genes seleccionados de la lista que comprende Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B en una muestra biológica aislada de un sujeto.

26. 26.

    Kit según cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25, que además comprende los elementos necesarios para comparar la cantidad detectada con una cantidad de referencia.

    LISTA DE SECUENCIAS

    <110> CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIONES ONCOLÓGICAS CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENT�?FICAS (CSIC)

    <120> Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico o el pronóstico del cáncer colorrectal

    <130> ES1641.298

    <160> 6

    <170> PatentIn version 3.5

    <210> 1

    <211> 313

    <212> PRT

    <213> Homo sapiens

    <400> 1

    <210> 2

    <211> 536

    <212> PRT

    <213> Homo sapiens

    <400> 2

    <210> 3

    <211> 382

    <212> PRT

    <213> Homo sapiens

    <400> 3

    <210> 4

    <211> 802

    <212> PRT

    <213> Homo sapiens

    <400> 4

    <210> 5

    <211> 487

    <212> PRT

    <213> Homo sapiens

    <400> 5

    <210> 6

    <211> 512

    <212> PRT

    <213> Homo sapiens

    <400> 6

    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

    N.º solicitud: 200930203

    ESPAÑA

    Fecha de presentación de la solicitud: 25.05.2009

    Fecha de prioridad:

    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

    51 Int. Cl. : G01N33/574 (2006.01) C12Q1/68 (2006.01)

    DOCUMENTOS RELEVANTES

    Categoría

    Documentos citados Reivindicaciones afectadas

    A

    RAN, Y. et al., ‘Profiling tumor-associated autoantibodies for the detection of colon cancer.’, CLINICAL CANCER RESEARCH, 2008, Vol. 14, No. 9, páginas 2696-2700, ISSN 1078-0432, todo el documento. 1-25

    A

    EMADUDDIN, M. et al., ‘Cell growth, global phosphotyrosine elevation, and c-Met phosphorylation through Src family kinases in colorectal cancer cells.’ PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES (U S A), 2008, Vol. 105, No. 7, páginas 2358-2362, ISSN: 0027-8424, todo el documento. 1-25

    A

    SCANLAN, M.J. et al., ‘Cancer-related serological recognition of human colon cancer: identification of potential diagnostic and immunotherapeutic targets.’, CANCER RESEARCH, 2002, Vol. 62, No. 14, páginas 4041-4047, ISSN: 0008-5472, todo el documento. 1-25

    A

    HANASH, S.M. et al., ‘Mining the plasma proteome for cancer biomarkers.’, NATURE, 2008, Vol. 452, No. 7187, páginas 571-579, ISSN: 0028-0836, todo el documento. 1-25

    A

    WO 2008061104 A2 (INVITROGEN CORP.) 22.05.2008, todo el documento. 1-25

    A

    WO 2006056766 A2 (ST GEORGE’S ENTERPRISES LTD.) 01.06.2006, todo el documento. 1-25

    Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

    Fecha de realización del informe 23.05.2011

    Examinador J. Vizán Arroyo Página 1/4

    INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

    Nº de solicitud: 200930203

    Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) G01N, C12Q Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de

    búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, BIOSIS, MEDLINE, EBI

    Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

    OPINIÓN ESCRITA

    Nº de solicitud: 200930203

    Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 23.05.2011

    Declaración

    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-25 SI NO

    Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-25 SI NO

    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

    Base de la Opinión.-

    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

    Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

    OPINIÓN ESCRITA

    Nº de solicitud: 200930203

    1. Documentos considerados.-

    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

    Documento

    Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

    D01

    RAN, Y. et al., Clin. Cancer Res., (2008), 14(9): 2696-700 2008

    D02

    EMADUDDIN, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., (2008), 105(7): 2358-62 2008

    D03

    SCANLAN, M.J. et al., Cancer Res., (2002), 62(14): 4041-7 2002

    D04

    HANASH, S.M. et al., Nature, (2008), 452(7187): 571-9

    D05

    WO 2008061104 A2 (INVITROGEN CORP.) 22.05.2008

    D06

    WO 2006056766 A2 (ST GEORGE´S ENTERPRISES LTD.) 01.06.2006

    En D1-D3 se describen métodos de detección del cáncer colorrectal basados en el análisis de diferentes marcadores serológicos.

    D4 se analizan biomarcadores plasmáticos del cáncer.

    D5-D6 se describe Pim-1 como un biomarcadores del cáncer de próstata.
27. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

    1. NOVEDAD (Art. 4.1. y Art. 6.1. de la Ley de Patentes) y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 4.1. y Art. 8.1. de la Ley de Patentes).

    1.1. El objeto de las reivindicaciones independientes 1 y 3 consiste en el uso de autoanticuerpos frente a las proteínas PIM-1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B como biomarcadores de cáncer colorrectal y en un método para el diagnóstico, pronóstico o evolución del cáncer colorrectal basado en la detección de autoanticuerpos frente a PIM1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B. Análogamente, las reivindicaciones 14 y 15 re refieren al uso de los genes PIM-1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B como marcadores de cáncer colorrectal y a un método de diagnóstico, pronóstico o evolución del cáncer colorrectal basado en la detección del producto de la expresión de los genes PIM-1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B.

    En el estado de la técnica más próximo, constituido por los documentos D1-D6, no se han divulgado ni los usos ni los métodos reivindicados en la solicitud internacional. Además, dichos usos y métodos no se deducen de una manera obvia del estado de la técnica.

    1.2. La presente solicitud satisface el criterio establecido en el Art. 4.1. de la Ley de Patentes, pues el objeto de las reivindicaciones 1-25 es nuevo y tiene actividad inventiva de acuerdo con los Arts. 6.1. y 8.1. de la Ley de Patentes.

    Informe del Estado de la Técnica Página 4/4