WO2010136629A9 - Métodos para el diagnóstico o pronóstico del cáncer colorrectal - Google Patents

Métodos para el diagnóstico o pronóstico del cáncer colorrectal Download PDF

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Definitions

  • the present invention falls within the field of biomedicine.
  • CRC colorectal cancer
  • CRC Colorectal cancer
  • Proteomic analyzes are being actively used for the identification of new biomarkers.
  • two-dimensional difference gel electrophoresis have been identified through the use of antibody microarrays and 2D-DIGE (differential two-dimensional gel electrophoresis), proteins differentially expressed in RCC tissue, including isoforms and post-translational modifications responsible for modifications in signaling pathways (Alfonso et al. 2005. Proteomics 5 (10), 2602-261 1; Kopf et al. 2005. Proteomics 5 (9), 2412-2416; Madoz-Gurpide et al. 2007. Mol CeIl Proteomics 6 (12), 2150-2164; Alfonso et al. 2008. Journal of Proteome Research 7 (10), 4247-4255). These two approaches allowed the identification of a wide collection of potential tumor markers of CCR tissue that are currently being investigated.
  • tumor proteins can be affected by point mutations, have an abnormal folding, overexpression, aberrant glycosylation, be truncated or suffer aberrant degradation such as p53, HER2, NY-ESOl or MUCl, respectively (Chen et al. 1997. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94 (5), 1914-1918; Schubert et al. 2000. Nature 404 (6779), 770-774; Ulanet et al. 2003. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100 (21), 12361-12366).
  • AATs tumor-associated autoantigens
  • have been characterized in RCC using other approaches Scanlan et al. 1998. International Journal of Cancer 76 (5), 652-658.
  • the diagnostic validity of the autoantibodies associated with CRC identified To date, it still requires an independent validation for its general use in the diagnosis / prognosis of CRC.
  • the present invention relates to a method for the detection of autoantibodies against said proteins (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B) potentially useful as CCR markers as well as data collection methods, methods for the diagnosis, prognosis or monitoring of the evolution of RCC, and with methods for the diagnosis or prognosis of lung or liver metastases in patients with RCC, and with a suitable kit for the implementation of these methods and their applications.
  • the present invention therefore provides a response to the need for biomarkers that allow the diagnosis of CRC, its classification at different stages of tumor progression, the prognosis of disease progression, the evaluation of its response to a certain treatment and the detection of the recurrence or spread (metastasis) of the RCC, by means of a simple, effective and non-invasive method.
  • Blood is normally the optimal biological fluid used in non-invasive methods for mass screening for diagnostic purposes of large populations of subjects.
  • serum and plasma are easy to obtain, and, on the other hand, the Blood circulation facilitates blood contact with all tissues of the human body, including in the case of cancer patients, contact with tumor tissue and its representative antigens.
  • the release of these AATs probably occurs at a very low concentration in plasma and probably undergo proteolysis in a short period of time.
  • antibodies are very stable molecules, which have been used for years in different clinical immunoassays, which facilitates the standardization of the assays.
  • the use of autoantibodies is also beneficial in the sense that the immune system amplifies the response by facilitating its identification and quantification.
  • the serum of patients with CRC and sera of subjects without CRC has been examined in order to identify a signature (trace) of autoantibodies produced by patients suffering from CRC in response to said CCR and its respective reactive proteins.
  • sera from patients with CRC and control sera were tested using high density protein microarrays.
  • Protein microarrays offer a number of advantages over other approaches used for the identification of AATs: i) proteins printed in the array are known a priori avoiding subsequent identification and eliminating the possible selection of mimotopes, and ii) there is no predisposition to select any protein since all of them are printed at a similar concentration. This combination of factors results in a high sensitivity for the identification of biomarkers.
  • the autoantibody signature identified allowed differentiating between sera of patients with CRC and control subjects. In total, 43 proteins were identified that presented a differential expression in sera of patients with CRC and in control sera (p ⁇ 0.04) in the protein array.
  • the combination of the 6 best immunoreactive antigens: Piml, MAPKAPK3, STK4, SRC, FGFR4 and ACVR2B was able to detect CCR with 100% specificity and sensitivity using data obtained from the protein array. Expression levels, increased or decreased, of said proteins were confirmed by membrane immunodetection and immuno-histochemistry using both cell lines and tumor tissue of CCR and tissue microarrays.
  • the combination formed by the purified proteins Piml, MAPKAPK3 and ACVR2B was tested by an ELISA using sera from patients with CRC and sera control.
  • the ELISA technique is much more sensitive than other techniques such as membrane immunodetection or immunohistochemistry. This high sensitivity could explain why the prevalence of autoantibodies in cancer patients is much higher than in previous studies, in addition to the detection of reactivity in control subjects. In fact, the diagnostic test could be based on autoantibodies with high prevalence since no autoantigens with exclusive immunoreactivity were found in the serum of patients with CRC.
  • the invention relates to a method for the detection of an autoantibody against a protein comprising: a) contacting a biological sample with said protein or with a fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody; and b) detecting the formation of an autoantibody-protein complex or fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody; wherein said protein is selected from the group formed by the proteins Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B and combinations thereof.
  • the invention in another aspect, relates to a method of obtaining data in a biological sample of a subject comprising detecting at least one autoantibody against a protein, wherein said autoantibody is selected from the group consisting of a autoantibody against Piml protein, an autoantibody against SRC protein, an autoantibody against MAPKAPK3 protein, an autoantibody against FGFR4 protein, an autoantibody against STK4 protein, and an autoantibody against ACVR2B protein, and, if desired , determine the level of said autoantibody in said sample.
  • said autoantibody is selected from the group consisting of a autoantibody against Piml protein, an autoantibody against SRC protein, an autoantibody against MAPKAPK3 protein, an autoantibody against FGFR4 protein, an autoantibody against STK4 protein, and an autoantibody against ACVR2B protein, and, if desired , determine the level of said autoantibody in said sample.
  • the invention in another aspect, relates to a method of obtaining data in a biological sample of a subject comprising detecting at least one product of expression of a gene, wherein said gene is selected from the group consisting of the genes Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B, and, if desired, quantify the level of expression of said expression product of said gene in said sample.
  • the invention relates to a method for diagnosing whether a subject suffers from colorectal cancer (CRC), which comprises comparing the level of at least one autoantibody to a protein, wherein said autoantibody is selected from the group consisting of an autoantibody against the Piml protein, an autoantibody against the SRC protein, an autoantibody against the MAPKAPK3 protein, an autoantibody against the FGFR4 protein, an autoantibody against the STK4 protein, and an autoantibody against the ACVR2B protein, in a biological sample of said subject, with the reference level for said autoantibody, wherein if the level of said autoantibody against Piml protein, or said autoantibody against SRC protein, or said autoantibody against MAPKAP K3 protein , or of said autoantibody against the FGFR4 protein, or of said autoantibody against the STK4 protein, in said sample, is greater than the ref level corresponding interference for said autoantibodies, and / or if the level of the autoantibody against AC
  • the invention in another aspect, relates to a method for diagnosing whether a subject suffers from colorectal cancer (CRC), which comprises comparing the level of expression of at least one expression product of a gene, wherein said gene is selected from the group formed by the genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 and ACVR2B, in a sample of said subject, with the reference level for said expression product of said gene, where if the level of said gene expression product Piml, or of said expression product of the SRC gene, or of said expression product of the MAPKAPK3 gene, or of said expression product of the FGFR4 gene, or of said expression product of the STK4 gene, is greater than the corresponding reference level for said expression products of said genes and / or if the level of the ACVR2B gene expression product is lower than the reference level for said expression product of said gene, said subject is diagnosed with RCC.
  • CRC colorectal cancer
  • the invention in another aspect, relates to a method for evaluating the prognosis or monitoring of the evolution of a patient suffering from colorectal cancer (CRC), which it comprises comparing the level of at least one autoantibody to a protein, wherein said autoantibody is selected from the group consisting of an autoantibody against the Piml protein, an autoantibody against the SRC protein, an autoantibody against the MAPKAP K3 protein , an autoantibody against the FGFR4 protein, an autoantibody against the STK4 protein, and an autoantibody against the ACVR2B protein, in a biological sample of said patient suffering from CRC, with the reference level for said autoantibody, where if the level of said autoantibody against Piml protein, or said autoantibody against SRC protein, or said autoantibody against MAPKAPK3 protein, or said autoantibody against FGFR4 protein, or said autoantibody against STK4 protein, in said sample, it is greater than the corresponding reference level for said autoantibodies, and / or
  • the invention relates to a method for evaluating the prognosis or monitoring of the evolution of a patient suffering from colorectal cancer (CRC), which comprises comparing the level of expression of at least one gene expression product.
  • said gene is selected from the group formed by the genes Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B, in a sample of said patient suffering from RCC, with the reference level for said expression product of said gene, in wherein if the level of said expression product of the Piml gene, or of said expression product of the SRC gene, or of said expression product of the MAPKAPK3 gene, or of said expression product of the FGFR4 gene, or of said expression product of the STK4 gene, is greater than the corresponding reference level for said expression products of said genes and / or if the level of the ACVR2B gene expression product is lower than the reference level for said dich expression product or gene, said patient undergoes a CRC with poor prognosis or presents a CRC
  • the invention in another aspect, relates to a method for diagnosing lung metastases in a patient suffering from colorectal cancer (CRC), which comprises comparing the level of at least one autoantibody to a protein in a biological sample of said patient.
  • said protein is a protein selected from the group of proteins mentioned in Table 2, with the reference level for said autoantibody, wherein, if the level of autoantibody against said protein in said biological sample of said patient is greater than the reference level for said autoantibody, the RCC patient has lung metastases.
  • the invention in another aspect, relates to a method for diagnosing liver metastases in a patient suffering from colorectal cancer (CRC) which comprises comparing the level of at least one autoantibody to a protein in a biological sample of said patient, wherein said protein is a protein selected from the group of proteins mentioned in Table 3, with the reference level for said autoantibody, wherein, if the level of autoantibody against said protein in said biological sample of said patient is greater than the reference level for said autoantibody, the CRC patient has liver metastases.
  • CRC colorectal cancer
  • the invention in another aspect, relates to a kit comprising:
  • an autoantibody selected from the group consisting of an autoantibody against the Piml protein, an autoantibody against the SRC protein, an autoantibody against the MAP KAP K3 protein, an autoantibody against the FGFR4 protein, an autoantibody against the STK4 protein, and an autoantibody against the ACVR2B protein, or, alternatively
  • the invention relates to the use of said kit to detect an autoantibody against a protein selected from the group formed by proteins.
  • Figure 1 Shows the analysis of the expression of Piml, MAPKAPK3 and ACVR2B, in cell lines and tumor tissue.
  • A 50 ⁇ g of protein extract from normal (N) and tumor (T) paired tissues of 6 patients with CRC (Duke stages A, B and C) were run separately in 10% SDS-PAGE gels and transferred to nitrocellulose membranes; membrane immunodetections were performed with commercial antibodies obtained against Piml, MAPKAPK3 and ACVR2B, using anti-tubulin as the control of the assay.
  • the signal was developed using ECL (Amersham) or SuperSignal Femto (Pierce).
  • the signal was developed using ECL. (Amersham) or SuperSignal Femto (Pierce).
  • C The relative levels of FGFR4 gene expression (Notterman, Alón, Sierk, and Levine, (2001) Cancer Res. 61, 3124-3130), MAPKAPK3 (Ki, Jeung et al. 2007 Int. J. Cancer 121, 2005-2012), SRC (Ki, Jeung et al. 2007 Int. J. Cancer 121, 2005-2012) and STK4 (Watanabe, Kobunai et al. 2006 Cancer Res. 66, 9804-9808) were evaluated using the Oncomine DNA microarray public database
  • Figure 2 Shows the verification of the selected AATs (Piml, MAPKAPK3 and ACVR2B) by ELISA.
  • Figure 3 It shows the ROC curves of the selected AATs and consists of a graphic representation of the behavior of said AATs.
  • A ROC curves using the ELISA values of ACVR2B, Piml and MAPKAPK3 individually.
  • B ROC curves using different combinations of the selected proteins [(MAPKAPK3 and ACVR2B and Pim 1) and (MAPKAPK3 and ACVR2B)].
  • C ROC curves using the CEA and Annex IV controls. [ADC: Area under the curve; Sens: Sensitivity; Spec: Specificity].
  • FIG. 4 Immunohistochemical analysis of Piml and ACVR2B.
  • A Result of the immunohistochemical analysis of Piml and ACVR2B in CCR tissue and normal adjacent mucosa of 45 patients with RCC quantified by 2 independent researchers on different days, according to the following criteria: O, without dizziness; 1, weak tide; 2, normal tide; 3, strong tide. Error bars represent the S. S. of each trial.
  • B Statistical analysis of TMA results. Sample size, mean, 95% CI for mean, standard deviation and T-test are indicated.
  • FIG. 5 Correlation of autoantibodies to MAPKAPK3 and ACVR2B in serum of subjects with CRC.
  • a and B show the distribution of the signal intensity of both markers in serum of patients with CRC [CRC serum (tumor)] and in serum healthy subjects [healthy control serum (normal)].
  • C shows the graph of the signal in each serum (tumor and normal) of MAPKAPK3 and ACVR2B, where the absence of correlation between the signal of both markers can be observed. The higher the signal for ACVR2B, the greater the possibility of belonging to the normal group; the opposite situation is observed for MAPKAPK3.
  • FIG. 6 Analysis based on an ELISA of serum samples using an ELISA with the AATs STK4 and FGFR4.
  • a total of 94 serum samples (52 patients with CRC and 42 controls) were used for implementation and analysis based on an ELISA of AATs recombinant CEA and Annex IV were used as controls.
  • the results show the average absorbance values obtained for SRC, STK4, FGFR4, HSA and Annexin IV in serum of reference populations (controls) and with CCR. Error bars represent the DS of the test.
  • the serum CEA concentration was determined using a specific kit for immunoassays (MP Biomedicals).
  • FIG. 7 Validation of SRC, STK4 and FGFR4 as potential biomarkers in CCR.
  • A SRC, STK4 and FGFR4 chart discriminating between serum of patients with CRC and serum of reference subjects (controls) independently in a validation group of a total of 94 samples (52 of patients with CRC and 42 controls).
  • B specificity (Spec) and sensitivity (Sens) obtained using the HAS and Annex IV controls to independently discriminate patients with CRC from different subjects.
  • C specificity and sensitivity obtained from the analysis of ROC curves using an optimal combination of biomarkers (MAPKAPK3, ACVR2B, Piml and FGFR4).
  • FIG. 8 Validation of a combination of markers for the diagnosis of CRC.
  • CEA paper alone and with an optimal combination of markers for the diagnosis of CRC (MAPKAPK3, ACVR2B, Piml and FGFR4).
  • the combination of the autoantibodies against MAPKAPK3, ACVR2B, Piml and FGFR4 and CEA is also shown by independently discriminating serum from patients with serum CRC from reference subjects (controls) in a validation group from a total of 94 samples (52 from patients with CCR and 42 controls), indicating that the markers provided by this invention in combination with CEA significantly improve the detection of CCR.
  • FIG. 10 Graph of the values obtained by an ELISA of the concentration of MAPKAPK3, Piml, SRC, FGFR4 and STK4 and CEA in serum of patients with CRC.
  • concentration of CEA was higher in late stages of CRC than in early stages of CRC (where its concentration was quite low).
  • the presence of serum autoantibodies of patients with CRC against the selected biomarkers provided by this invention was constant during all stages, allowing a better diagnosis of CRC not only in late stages but also in early CRC stages.
  • antibody refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immuno globulin molecules, that is, molecules that contain an antigen binding site that specifically binds (immunoreacts) with an antigen. , such as, for example, a protein.
  • immunoglobulin M immunoglobulin M
  • IgD immunoglobulin D
  • IgG immunoglobulin G
  • IgA immunoglobulin A
  • IgE immunoglobulin E
  • autoantibody is applied to an antibody that reacts with an antigen present in a subject's own organism, even if the reaction occurs only in vitro, and whether it causes pathological effects in vivo or if It does not produce them.
  • autoantibody against the Piml protein refers to an autoantibody capable of reacting with the Piml protein, or with a variant or with a fragment of said protein, as long as said variant or said fragment is functionally equivalent, that is, capable of being recognized by said autoantibody.
  • said autoantibody against the protein Piml is an IgG; In another particular embodiment, said autoantibody against the Piml protein is an IgM.
  • auto antibody against SRC protein refers to a car antibody capable of reacting with the SRC protein, or with a variant or with a fragment of said protein, as long as said variant or said fragment is functionally equivalent, that is, capable of being recognized by said autoantibody.
  • said autoantibody against the SRC protein is an IgG; In another particular embodiment, said autoantibody against the SRC protein is an IgM.
  • autoantibody against the MAPKAPK3 protein refers to an autoantibody capable of reacting with the MAP KAP K3 protein, or with a variant or with a fragment of said protein, as long as said variant or said fragment is functionally equivalent, that is, capable of being recognized by said autoantibody.
  • said autoantibody against the MAPKAPK3 protein is an IgG; In another particular embodiment, said autoantibody against the MAPKAPK3 protein is an IgM.
  • autoantibody against the FGFR4 protein refers to an autoantibody capable of reacting with the FGFR4 protein, or with a variant or with a fragment of said protein, as long as said variant or said fragment is functionally equivalent, that is, capable of being recognized by said autoantibody.
  • said autoantibody against the FGFR4 protein is an IgG; In another particular embodiment, said autoantibody against the FGFR4 protein is an IgM.
  • autoantibody against the STK4 protein refers to an autoantibody capable of reacting with the STK4 protein, or with a variant or with a fragment of said protein, as long as said variant or said fragment is functionally equivalent, that is, capable of being recognized by said autoantibody.
  • said autoantibody against the STK4 protein is an IgG; In another particular embodiment, said autoantibody against the STK4 protein is an IgM.
  • autoanticueroo against ACVR2B protein refers to an autoantibody capable of reacting with the STK4 protein, or with a variant or with a fragment of said protein, as long as said variant or said fragment is functionally equivalent, that is, capable of being recognized by said autoantibody.
  • said autoantibody against the STK4 protein is an IgG;
  • said autoantibody against the STK4 protein is an IgM.
  • autoanticueroo against ACVR2B protein is an autoantibody against ACVR2B protein.
  • said autoantibody against ACVR2B protein is an IgG; In another particular embodiment, said autoantibody against ACVR2B protein is an IgM.
  • colon cancer or "CCR”.
  • colon cancer includes any type of neoplasms of the colon, rectum and appendix as well as any histological subtype that typically appears in colon cancer, eg, transitional cell carcinoma, squamous cell carcinoma and adenocarcinoma , any clinical subtype, eg, superficial, invasive muscle or cancer of metastatic disease, or any TNM stage including T0-T4, N0-N2 and MO-Ml tumors.
  • Patients can be classified into different groups with respect to the stage of the tumor.
  • the classification of colon cancer is an estimate of the penetration of a particular cancer. It is carried out for research, diagnosis and to determine the best method of treatment.
  • the system for the classification of colorectal cancers depends on the extent of the local invasion, the degree of lymph nodes involved and whether there are distal metastases.
  • the most common classification system is the TNM system (for tumors / nodules / metastases) of the "American Joint Committee on Cancer” (AJCC).
  • the TNM system assigns a number based on three categories. "T” indicates the degree of invasion of the intestinal wall, "N” the degree of lymph node involvement and "M” the degree of metastasis.
  • the broadest stage of cancer is normally cited as a number I, II, III, IV derived from the TNM value grouped by the prognosis, a higher number indicates a more advanced cancer and a worse prognosis. Table 1 shows system details.
  • quantify refers to the measurement of the quantity or concentration, preferably in a quantitative, semi-quantitative or relative manner of a product, for example, autoantibodies against a given protein (eg, Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, etc., or against the proteins mentioned in Tables 2 and 3), expression products (eg, RNA or protein) of the genes encoding a particular protein (eg, Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, etc.), etc.
  • the quantification of a product can be carried out directly or indirectly.
  • Direct measurement refers to the measurement of the quantity or concentration of said product based on the signal that is obtained directly from said product and that is directly correlated with the number of molecules of the product in question present in the analyzed sample.
  • Said signal (which can also be referred to as an intensity signal) can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of the product in question.
  • the indirect measurement of the quantity or concentration of a product includes the measurement obtained from a secondary component (eg, a component other than autoantibodies) or a biological measurement system (eg, the measurement of cellular responses, ligands, "tags", enzymatic reaction products, etc.).
  • the quantification of the expression level of an expression product of a gene can be carried out directly or indirectly.
  • Direct measurement refers to the measure of the quantity or concentration of an expression product of a gene based on the signal that is obtained directly from the expression product of said gene and that is directly correlated with the number of molecules of expression product of said gene present in the analyzed sample.
  • Said signal which can also be referred to as an intensity signal, can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of the expression product of the gene in question (eg, Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4, ACVR2B, etc.).
  • the indirect measurement of the quantity or concentration of an expression product of a gene includes the measurement obtained from a secondary component (eg, a component other than the expression products of the gene in question) or a biological measurement system (eg, measurement of cellular responses, ligands, "tags", enzymatic reaction products, etc.).
  • a secondary component eg, a component other than the expression products of the gene in question
  • a biological measurement system eg, measurement of cellular responses, ligands, "tags", enzymatic reaction products, etc.
  • diagnosis refers, in general, to the process by which a disease, nosological entity, syndrome, or any health-disease condition is identified.
  • diagnosis of colorectal cancer or CRC refers to the ability to identify or detect the presence of CRC; This detection, as understood by one skilled in the art, is not intended to be correct in 100% of the samples analyzed. However, it requires that a statistically significant amount of the analyzed samples be classified correctly. The amount that is significantly statistical can be established by a person skilled in the art by using different statistical tools; Illustrative, non-limiting examples of such statistical tools include the determination of confidence intervals, the determination of the p-value, the Student test or the discriminant functions of Fisher, etc.
  • the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98% or at least 99%.
  • the p-value is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • the teachings of the present invention allow to correctly detect the disease (CRC) in at least 60%, in at least 70%, in at least 80%, or in at least 90% of the subjects of a given group or population analyzed.
  • fragment applied to a protein, as used herein, refers to a portion of a protein, for example, a protein selected from the group consisting of the Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B proteins or their variants.
  • fragment of a protein capable of being recognized by an autoantibody that recognizes said protein refers to a fragment of a protein that is recognized by an autoantibody against said protein, so that It forms a stable autoantibody-protein fragment complex.
  • said protein may be a protein selected from the group of proteins formed by the proteins Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B.
  • variants or fragments of proteins as used herein, means that the variant or fragment of the protein in question essentially maintains the immunological properties of said protein in question.
  • immunological properties can be determined by conventional methods such as those described in the Examples that accompany this description (e.g., by ELISA assays, etc.).
  • Piml gene refers to the gene or nucleic acid sequence encoding the Piml protein, as defined herein, and also includes, by extension, the nucleic acid sequence encoding a fragment of said functionally Piml protein equivalent.
  • SRC gene refers to the gene or nucleic acid sequence encoding the SRC protein, as defined herein, and also includes, by extension, the nucleic acid sequence encoding a fragment of said functionally equivalent SRC protein.
  • MAPKAPK3 gene refers to the gene or nucleic acid sequence encoding the MAPKAPK3 protein, as defined herein, and also includes, by extension, the nucleic acid sequence encoding a functionally equivalent MAPKAPK3 protein fragment.
  • FGFR4 gene refers to the gene or nucleic acid sequence encoding the FGFR4 protein, as defined herein, and also includes, by extension, the nucleic acid sequence encoding a fragment of said functionally FGFR4 protein equivalent.
  • STK4 gene refers to the gene or nucleic acid sequence encoding the STK4 protein, as defined herein, and also includes, by extension, the nucleic acid sequence encoding a fragment of said functionally STK4 protein. equivalent.
  • ACVR2B 'gene ⁇ refers to the gene or nucleic acid sequence encoding the ACVR2B protein, as defined herein, and also includes, by extension, the nucleic acid sequence encoding a fragment of said functionally equivalent ACVR2B protein.
  • identity refers to the proportion of identical amino acids between 2 amino acid sequences that are compared.
  • the degree of identity (usually expressed as a percentage (%) of identity) between 2 amino acid sequences can be easily identified by one skilled in the art, for example, with the help of an appropriate computer program to compare sequences; by way of illustration, not limitation, the degree of identity between two amino acid sequences can be determined by conventional methods, for example, by computer methods and algorithms known to those skilled in the art; By way of illustration, the degree of identity between 2 amino acid sequences can be determined by using the BLAST algorithm (BLAST Manual, Altschul et al.,
  • immunoensavo refers to any analytical technique based on a conjugation reaction between an antigen, for example, a protein or an appropriate fragment thereof, and an antibody that recognizes said antigen.
  • said protein may be a protein selected from the group of proteins formed by the proteins Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B or by the proteins mentioned in Tables 2 and 3.
  • fragments of said proteins may be used , that is, fragments of proteins that can be recognized by antibodies that recognize the proteins in question; by way of illustration, said protein fragments can be fragments of the Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B proteins, or of the proteins mentioned in Tables 2 and 3, which can be recognized by the autoantibodies that recognize said proteins .
  • marker refers to an indicator reagent that allows an antigen-antibody type complex to be detected, such as an enzyme that catalyzes a detectable reaction, a compound that generates a signal when it is part of said complex, etc.
  • said marker can be an enzyme (eg, peroxidase, glycosidase, alkaline phosphatase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucuronidase, etc.), a fluorescent compound or fluorophore (eg, fluorescein, rhodamine, etc.), a luminescent compound (chemo) (eg, dioxetans, acridiniums, phenanthridines, ruthenium, luminol, etc.), a radioactive element (sulfur, iodine, etc.), etc.
  • said marker is a peroxidase.
  • the selection of a particular marker is not critical, as long as it is capable of producing a signal by itself or in conjunction with one or more additional substances.
  • tumor refers to the process by which a tumor, in this case CCR, extends to tissues of the organism other than the primary site of origin of the tumor.
  • biological sample refers to, but is not limited to, tissues and / or biological fluids of a subject, obtained by any method known to a person skilled in the art that serves to carry out any of the methods provided by the present invention; that is, said biological sample must be a sample capable of containing antibodies, eg, autoantibodies against Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and / or ACVR2B proteins as well as against the proteins mentioned in Tables 2 and 3, or capable of containing the expression products (RNA or proteins) of the genes encoding the Piml, SRC, MAPKAPK3 proteins, FGFR4, STK4 and ACVR2B.
  • said biological sample may be a sample of blood, urine, saliva, serum, plasma, a buccal or pharyngeal smear, a surgical specimen, a specimen obtained from a biopsy or autopsy, etc.
  • level refers, in general, to a quantifiable, semi-quantifiable, or relative amount of a product, for example, autoantibodies, gene expression products, etc., as well as any another value or parameter related to said expression product or that may be derived from it.
  • Said values or parameters comprise values of signal strength obtained from any of the physical or chemical properties of the product in question.
  • the levels of a product can be based on quantitative and / or semi-quantitative analyzes; By way of illustration, quantitative methods can be used to determine a relative or absolute quantity of a particular product in the biological sample tested, and semi-quantitative methods can be used to establish the level of said specific product above a baseline value without the need for assign an absolute or relative numerical value.
  • the "level of an autoantibody” against a protein refers , but is not limited, to the quantifiable, semi-quantifiable, or relative amount of autoantibodies to said proteins (eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, and proteins mentioned in Tables 2 and 3), as well as to any other value or parameter related to said autoantibodies or that may be derived from them.
  • Said values or parameters comprise values of signal intensity obtained from any of the physical or chemical properties of the autoantibodies against said proteins (eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, and proteins mentioned in the Tables 2 and 3) obtained either by direct measurement, eg, intensity values of mass spectroscopy, nuclear magnetic resonance, etc., or by indirect measurement, eg, by any of the measurement systems described herein, for example, by the measurement obtained from a secondary component (eg, a component other than autoantibodies) or a biological measurement system (eg, the measurement of cellular responses, ligands, "tags” or enzymatic reaction products).
  • a secondary component eg, a component other than autoantibodies
  • a biological measurement system eg, the measurement of cellular responses, ligands, "tags” or enzymatic reaction products.
  • the determination of the level of an autoantibody against a protein can be performed using any available method known to the person skilled in the art, for example, by an immunoassay.
  • the level of an autoantibody against a protein eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, or against the proteins mentioned in Tables 2 and 3
  • a protein eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, or against the proteins mentioned in Tables 2 and 3
  • the level of said autoantibody in the subject's biological sample is at least 1.5 times, 5 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times or even more, with respect to the reference level of said autoantibody.
  • the level of an autoantibody against a protein eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, or against the proteins mentioned in Tables 2 and 3
  • the level of said autoantibody in the subject's biological sample is at least 1.5 times, 5 times, 10 times , 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times, or even more, lower than the reference level of said autoantibody.
  • the "level of expression of an expression product" of a gene or, in other words, amount of expression product of a gene, as used herein, refers to, but not is limited to the quantifiable, semi-quantifiable, or relative amount of an expression product of a particular gene (eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B), as well as any other value or parameter related to said product of expression or that may be derived from it.
  • a particular gene eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B
  • Said values or parameters comprise values of signal intensity obtained from any of the physical or chemical properties of the expression product of said gene (eg, Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 or ACVR2B) obtained either by direct measurement, or by indirect measure.
  • the expression level of a gene expression product eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B
  • the expression level of an expression product of a gene (eg, Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 or ACVR2B), determined in a biological sample from the subject under study is said to be "greater” than the reference level of said expression product of said gene when, according to the invention, the level of said expression product of said gene in the biological sample of the subject It is at least 1.5 times, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times or even more, with respect to the reference level of said expression product of said gene.
  • a gene eg, Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 or ACVR2B
  • the expression level of an expression product of a gene (eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2E), determined in a biological sample from the subject under study is said to be "less" than the reference level of said expression product of said gene when, according to the invention, the level of said expression product in said biological sample of the subject is at least 1.5 times, 5 times, 10 times, 20 times , 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times, or even more, lower than the reference level for said expression product of said gene.
  • a gene eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2E
  • reference level refers, in general, to the level of a product, for example, autoantibodies against proteins (eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, as well as against the proteins mentioned in Tables 2 and 3), gene expression products (eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B, etc.), etc., present in control subjects.
  • autoantibodies against proteins eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, as well as against the proteins mentioned in Tables 2 and 3
  • gene expression products eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B, etc.
  • said control subjects are subjects that do not suffer from a certain disease (eg, CRC), while in another particular embodiment, said control subject is the subject under study itself, which is particularly useful for assessing the follow-up of a disease (eg, CCR) or to evaluate the efficacy of a treatment against said disease (eg, CCR), etc., for which the reference level of a given product may be the level of said product determined in a sample of the same subject under study but taken a few days, weeks, months or even years before in order to evaluate the follow-up of the disease, or taken one before, for example, the application to the subject of a treatment against said disease with the In order to evaluate its effectiveness.
  • a disease eg, CCR
  • CCR efficacy of a treatment against said disease
  • the reference level of a given product may be the level of said product determined in a sample of the same subject under study but taken a few days, weeks, months or even years before in order to evaluate the follow-up of the disease, or taken one before, for example, the
  • the reference level could be obtained from a set of samples from a population of healthy subjects (eg, subjects not suffering from CRC) and calculating the average level of the product in question (autoantibody or expression product of a gene) in said population of healthy subjects.
  • the reference level of a given product for example, autoantibodies against proteins (eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, as well as against the proteins mentioned in Tables 2 and 3), expression products of genes (eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B, etc.), etc.
  • a reference sample that can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, together with the sample biological of the subject under study (sample problem).
  • the reference level can be derived from the normal distribution limits of a physiological amount found in a population of control subjects. Said physiological amount can be determined by several well known techniques, depending on the nature of the product in question (autoantibody, expression product of a gene, etc.), as described in this description.
  • Said reference level allows discriminating the presence of CRC and, therefore, can be used in the diagnosis, prognosis or monitoring of the evolution of a CRC.
  • prediction refers to, but is not limited to, the probability that a patient, such as a patient suffering from CRC, responds favorably or unfavorably to a certain treatment, and to the extent of such responses, or that the patient survives, after the surgical removal of a primary tumor and / or chemotherapy for a period of time without recurrence of CRC.
  • expression product of a gene refers to the product resulting from transcription (RNA) or expression (protein) of said gene or sequence of nucleic acid, as well as any form resulting from the processing of the product resulting from the transcription or expression of said gene or nucleic acid sequence.
  • prognosis refers, in general, to the set of data that medical science possesses about the likelihood of certain situations occurring over the course of time or natural history of a disease; that is, it is the prediction of the events that will occur in the development of a disease in statistical terms.
  • CCR forecast refers to the set of data that allows assigning a probability of certain situations occurring during the course of the CCR.
  • the present invention includes the ability to assign a probability of certain situations occurring in the course of RCC disease, when a sample classification method is applied based well on the comparison of the level of autoantibodies against at least one of the proteins selected from the group consisting of the proteins Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B, or against all or part of the proteins mentioned in Tables 2 and 3, with the level of reference for said autoantibodies, or in comparing the level of at least one expression product of a gene selected from the group consisting of the genes Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B, with the reference level for said gene expression product.
  • the p-value is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • prognosis refers to the probability of death due to CRC or progression of CRC, including recurrence or metastatic dissemination capacity, as well as the prediction of response to a certain treatment of the CCR.
  • the evolution of the disease can be continued using any assessment criteria used in the field of cancer and known to the person skilled in the art. Valuation parameters useful for describing the evolution of a disease include, without limitation: disease-free evolution, which, as used herein, describes the proportion of patients in complete remission who have not had relapse of the disease during the time period under study;
  • TTP evolution time
  • DSF disease-free survival
  • PFS6 - 6 month evolution without survival
  • MS median survival
  • SLRD free relapse-free survival
  • OS overall survival
  • Piml protein includes the Piml protein of a subject, preferably, of a human being, and variants thereof; In a particular embodiment, said Piml protein is the protein whose accession number is NP 002639 and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • SRC protein includes the SRC protein of a subject, preferably, of a human being, and variants thereof; in one embodiment
  • said SRC protein is the protein whose accession number is NP 005408 and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • MAPKAPK3 protein includes the MAPKAPK3 protein of a subject, preferably, of a human being, and variants thereof;
  • said SRC protein is the protein whose accession number is NP 004626 and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 3.
  • FGFR4 protein includes the FGFR4 protein of a subject, preferably, of a human being, and variants thereof; In a particular embodiment, said FGFR4 protein is the protein whose accession number is NP 002002 and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • STK4 protein includes the STK4 protein of a subject, preferably, of a human being, and variants thereof; In a particular embodiment, said STK4 protein is the protein whose accession number is NP_006273 and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 5.
  • ACVR2B pro teine includes protein
  • ACVR2B of a subject preferably, of a human being, and variants thereof;
  • said ACVR2B protein is the protein whose accession number is NP OO 1097 and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • volution monitoring refers to the supervision of the development of a disease, for example, but not limited to, the evaluation of the response to a certain treatment against said disease (eg, CCR) or the detection of recurrence or dissemination of the CCR.
  • subject refers to an animal, preferably a mammal, and, more preferably, a human being.
  • CRC patients subjects suffering from CRC are sometimes referred to in this description as “CRC patients” or by a similar expression.
  • a protein is "substantially homologous" to a given protein when its amino acid sequence has a good alignment with the amino acid sequence of said particular protein, for example, when its degree of identity with respect to said particular protein is at least one 50%, typically at least 70%, advantageously at least 80%, preferably at least 85%, more preferably of at least 90%, even more preferably of at least 95%, and still more preferably of at least 99%.
  • a protein is substantially homologous to the Piml protein when its amino acid sequence has a degree of identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, of at least , 50%, typically of at least 70%, advantageously of at least 80%, preferably of at least 85%, more preferably of at least 90%, even more preferably of, at least 95%, and, still more preferably, at least 99%.
  • the proteins substantially homologous to the SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B proteins can be defined in the same way but replacing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively.
  • variant refers to a protein substantially homologous to another protein, for example, the Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B protein.
  • a variant includes additions, deletions or substitutions of amino acids.
  • the term variant also includes proteins resulting from post-translational modifications such as, for example, but not limited to glycosylation, phosphorylation or methylation. Said variants, according to the present invention, are recognized by autoantibodies against the protein in question.
  • the invention relates to a method for the detection of an autoantibody against a protein, hereinafter "method of detecting autoantibodies of the invention", which comprises
  • the biological sample will be a sample capable of containing antibodies, from a subject, and can be obtained by conventional methods, known to those skilled in the art, depending on the nature of the sample.
  • said biological sample is a blood, serum or plasma sample, which can be obtained by any conventional method, for example, by a blood draw, etc.
  • Blood is normally the optimal biological fluid to be used in non-invasive methods for mass screening for diagnostic purposes of large populations of subjects.
  • serum and plasma are easy to obtain, and, on the other hand, blood circulation facilitates blood contact with all tissues of the human body, including in the case of cancer patients contact with tumor tissue and its representative antigens.
  • the autoantibody detection method of the invention in general, can be performed by an immunoassay;
  • immunoassays known in the state of the art include immunoblotting, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), linear immunoassay (LIA), radioimmunoassay (RIA), immunofluorescence (IF), immunohistochemistry (IHQ), protein microarrays, etc.
  • step a) of the autoantibody detection method of the invention a biological sample is contacted in which it is desired to analyze the presence of autoantibodies against Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and / or ACVR2B proteins, with said proteins or with fragments thereof capable of being recognized by said autoantibodies, under conditions that allow the formation of an autoantibody-protein complex or fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody. If the biological sample contains autoantibodies against said proteins, then said autoantibody-protein complex or fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody will be formed; otherwise, said complex will not be formed. Suitable conditions for the formation of the autoantibody-protein complex or fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody are known to those skilled in the art.
  • said proteins could be together in the same medium, in practice, it is advantageous that said Proteins are separated from each other.
  • Said proteins may be in solution or suspension in an appropriate medium, or, alternatively, they may be deposited or supported on a support (eg, a microtiter plate, beads (magnetic or non-magnetic), columns, matrices, membranes, etc.
  • these Materials can be used in convenient forms, such as films, sheets, plates, etc., or can be used to coat inert carriers (eg, paper, glass, plastic films, etc.)
  • said biological sample it is contacted with said proteins Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and / or ACVR2B, or with fragments thereof capable of being recognized by said autoantibodies, separated from each other, and deposited on a suitable support.
  • the autoantibodies against said proteins are identified independently, while, in another particular embodiment, the autoantibodies against said proteins are identified simultaneously.
  • the biological sample to be studied is contacted with a single protein selected from the Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B proteins, or with a fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody, with in order to identify autoantibodies against said protein.
  • said biological sample is contacted with two or more of said Piml proteins, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B, or fragments thereof capable of being recognized by said autoantibodies, separated from each other, optionally deposited. on a suitable support, in order to identify autoantibodies against said proteins.
  • Step b) of the autoantibody detection method of the invention comprises detecting the formation of an autoantibody-protein complex or fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody.
  • This step can be carried out by conventional methods, known to those skilled in the art, for the detection of the formation of antibody-antigen complexes (in this case, autoantibody-protein or fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody ).
  • a conjugate comprising an antibody that recognizes the autoantibody and a label (labeled secondary antibody) can be added under conditions that allow the formation of a complex (autoantibody -protein or fragment thereof liable to be recognized by said autoantibody) -antibody / marker and detect the formation of said complex.
  • the autoantibody-protein complex or fragment thereof capable of being recognized by said protein autoantibody whereby, when said complex is contacted with said conjugate comprising the antibody and the label, under suitable conditions, the complex is formed (autoantibody-protein or fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody ) - antibody / label, which will be visualized by the appropriate technique depending on the marker used, as mentioned below; whereas, otherwise, that is, when the biological sample does not contain autoantibodies against said protein (s) then said complex (autoantibody protein or fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody) will not be formed.
  • -antibody / marker The suitable conditions for the formation of the latter complex to take place are known to those skilled in the art.
  • any indicator reagent that allows detecting said complex (autoantibody-protein or fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody) -antibody / label can be used in the practice of the present invention; by way of illustration, not limitation, said marker can be an enzyme that catalyzes a detectable reaction (eg, peroxidase, glycosidase, alkaline phosphatase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucuronidase, etc.) , a compound that generates a signal when it is part of said complex (eg, a fluorescent or fluorophore compound, such as fluorescein, rhodamine, etc .; a luminescent compound (chemo), such as a dioxetane, an acridinium, a phenanthridium, ruthenium , luminol, etc.), etc., a radioactive
  • said marker is a peroxidase.
  • the selection of a particular marker is not critical, as long as it is capable of producing a signal by itself or in conjunction with one or more additional substances.
  • the complex (autoantibody-protein or fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody) - antibody / marker formed can be detected or visualized by any appropriate technique, depending on the chosen marker, known to those skilled in the art. , using the appropriate devices, for example, by techniques based on colorimetric, fluorimetric, luminescent (chemo), radioactive, etc. methods, all known to those skilled in the art.
  • the conjugate comprising said antibody that recognizes said autoantibody and said label can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art.
  • the detection of the complex in question can be carried out by contacting said complex with an appropriate substrate and, optionally, with the appropriate enzymatic activators and / or amplifying agents.
  • suitable substrates include:
  • Chromogenic substrates based on p-nitrophenyl phosphate (p-NPP), 5-bromo-4- chloro-3-indolyl phosphate / nitroblue tetrazolium (BCIP / NPT), etc.
  • DMAB 3-methyl-2-benzothiazolinhydrazone
  • AEC 3-amino-9-ethylcarbazole
  • DAB 3,3'-diaminobenzidine tetrachloride
  • Fluorogenic 4-hydroxy-3-methoxyphenylacetic acid, reduced phenoxazines and reduced benzothiazines, including the Amplex ® Red reagent, Amplex UltraRed, reduced dihydroxanthenes, etc.
  • Chromogenic substrates based on o-nitrophenyl- ⁇ -D-galactoside (o-NPG), p-nitrophenyl- ⁇ -D-galactoside and 4-methylumbelliphenyl- ⁇ -D-galactoside (MUG) for ⁇ -D-galactosidase, etc. .
  • Fluorogenic resorufin ⁇ -D-galactopyranoside, fluorescein digalactoside (FD G), fluoro s ce ⁇ n dig lucuró nest, 4-methylumbeliferyl beta-D-galactopyranoside, carboxymbelliferyl beta-D-galactopyranoside, coumarine beta-D-galactios, etc.
  • said marker is a peroxidase, such as a peroxidase and the chromogenic substrate is TMB.
  • the method of detection of autoantibodies of the invention it is possible to detect and obtain an autoantibody selected from the group consisting of an autoantibody against the Piml protein, an autoantibody against the SRC protein, an autoantibody against to MAPKAPK3 protein, an autoantibody against the FGFR4 protein, an autoantibody against the STK4 protein, an autoantibody against the ACVR2B protein, and combinations of said autoantibodies.
  • the autoantibodies identified by the autoantibody detection method of the invention are specific, that is, they recognize the protein in question (or fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody) with a preference over others. proteins or fragments 2 or more times, more than 3 times, more than 10 times, more than 20 times, more than 100 times, or even more times.
  • the autoantibody-protein complex or fragment thereof can be isolated that can be recognized by said autoantibody formed, for example, by using immunoprecipitation techniques, etc., and subsequently sequencing the sequence of the autoantibody responsible for binding to the protein or fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody, using standard proteomics methods described in the art, such as the determination of the peptide fingerprint or the MS / MS analysis (Vikas Dhingraa, et al. 2005. International Journal of Pharmaceutics 299 (1-2): pp. 1-18 .; Hanash SM et al. Nature. 2008 Apr 3; 452 (7187): 571-
  • the method for the detection of autoantibodies of the invention can also be used to determine the level or quantity (quantify) of autoantibodies against said proteins (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and / or ACVR2B) present in the low biological sample I study because, with many markers, eg enzymes, the amount of autoantibody present in the biological sample is proportional to the signal generated.
  • the detection of the autoantibody-protein complex or fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody is indicative of the presence of specific autoantibodies against said protein (s) in the biological sample and, in addition, if desired, it can quantify the amount of autoantibodies against said proteins present in said biological sample.
  • Said information within the context of the present invention, can be used in the diagnosis, prognosis or monitoring of the evolution of diseases, in particular, colorectal cancer (CRC), in a subject.
  • CRC colorectal cancer
  • the invention relates to a method of obtaining data in a biological sample of a subject, hereinafter "method of obtaining data 1 of the invention", which comprises detecting at least one autoantibody against a protein , wherein said autoantibody is selected from the group consisting of an autoantibody against the Piml protein, an autoantibody against the SRC protein, an autoantibody against the MAPKAPK3 protein, an autoantibody against the FGFR4 protein, an autoantibody against the STK4 protein , and an autoantibody against the ACVR2B protein, and, if desired, determine the level of said autoantibody in said biological sample.
  • method of obtaining data 1 of the invention which comprises detecting at least one autoantibody against a protein , wherein said autoantibody is selected from the group consisting of an autoantibody against the Piml protein, an autoantibody against the SRC protein, an autoantibody against the MAPKAPK3 protein, an autoantibody against the FGFR4 protein, an autoantibody against the STK4 protein
  • the detection of said autoantibodies can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art;
  • the detection of said autoantibodies is carried out by an immunoassay (eg, immunoblot, ELISA, LIA, RIA, IF, IHQ, protein microarrays, etc.), such as a suitable immunoassay to detect and identify said autoantibodies to Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and / or ACVR2B proteins, for example, as described in relation to the autoantibody detection method of the invention.
  • said immunoassay is a protein microarray or an ELISA.
  • a protein microarray consists of a collection of proteins immobilized on a solid support in a regular and preset arrangement. There are several important factors to consider in the design of protein microarrays, among which they find, for example, the nature of the support on which to immobilize the proteins (or appropriate fragments thereof), the protein immobilization technique, the microarray format, the capture agent employed or the detection method to be used. Different formats, supports and techniques that can be used for the realization of this inventive aspect are known in the state of the art.
  • the detection of autoantibodies against Piml, SRC, MAPKAP K3, FGFR4, STK4 and / or ACVR2B, by means of protein microarrays comprises the following steps: (a) coating a solid support with one or more proteins, preferably separated from each other, selected from the group formed by the proteins Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B, or with fragments thereof capable of being recognized by the autoantibodies against the corresponding proteins; (b) incubating the coated support of step (a) with a biological sample from a subject under conditions that allow the formation of an autocomplex of the autoantibody against the Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B protein present in said sample with the corresponding antigenic determinants present in said proteins Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B, or in their fragments capable of being recognized by said autoantibodies; and
  • the ELISA is based on the premise that an immunoreactive (biological sample antigen or antibody) can be immobilized on a solid support, then bringing that system into contact with a fluid phase containing the complementary reagent that can bind to a marker compound .
  • immunoreactive biological sample antigen or antibody
  • MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and / or ACVR2B is carried out by means of an ELISA, preferably, by means of an indirect ELISA, which comprises the following steps: (a) coating a solid support with one or more proteins, preferably separated from each other, selected from the group formed by the proteins Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B, or with fragments thereof capable of being recognized by the autoantibodies against the corresponding proteins; (b) incubate the coated support of the step (a) with a biological sample from a subject under conditions that allow the formation of an autoantibody immunocomplex against the Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B protein present in said biological sample with the corresponding antigenic determinants present in said Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B proteins, or in their fragments capable of being recognized by said autoantibodies; and (c) add
  • Said marker is a compound capable of giving rise to a chromogenic, fluorogenic, radioactive and / or chemiluminescent signal that allows the detection, identification and, optionally, quantification of the amount of the autoantibody against the Piml protein. , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B. present in the analyzed sample.
  • said marker compound is selected from the group consisting of radioisotopes, enzymes, fluorophores or any molecule capable of being conjugated with another molecule or detected and / or quantified directly. This marker compound can bind to the autoantibody directly, or through another compound.
  • Illustrative, non-limiting examples of said marker compounds that bind directly to the autoantibody include enzymes, such as alkaline phosphatase, peroxidase, etc., radioactive isotopes, such as 32 P, 35 S, etc., fluorochromes, such as fluorescein, etc., or metal particles, for direct detection by colorimetry, autoradiography, fluorimetry, or metallography, respectively.
  • enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase, etc.
  • radioactive isotopes such as 32 P, 35 S, etc.
  • fluorochromes such as fluorescein, etc.
  • metal particles for direct detection by colorimetry, autoradiography, fluorimetry, or metallography, respectively.
  • the method of obtaining data 1 of the invention comprises, in addition to detecting at least one autoantibody selected from the group of autoantibodies formed by autoantibodies against the Piml protein, a autoantibody against the SRC protein, a autoantibody against the MAPKAPK3 protein, an autoantibody against the FGFR4 protein, an autoantibody against the STK4 protein, and an autoantibody against the ACVR2B protein, the step of determining the level or amount (quantify) of said autoantibody in said low biological sample I study because, with many markers, eg enzymes, the amount of autoantibody present in the biological sample is proportional to the signal generated.
  • the signal obtained using the Different methods described above to detect autoantibodies can be analyzed and quantified by conventional methods that allow quantification of said signal.
  • the method for the detection of autoantibodies of the invention can also be used to determine the amount (quantify) of autoantibodies against said proteins (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and / or ACVR2B) present in the biological sample under study. that, with many markers, eg enzymes, the amount of autoantibody present in the biological sample is proportional to the signal generated.
  • the detection of the autoantibody-protein complex or fragment thereof capable of being recognized by said autoantibody is indicative of the presence of specific autoantibodies against said protein (s) in the biological sample and, in addition, if desired, it can quantify the amount of autoantibodies against said proteins present in said biological sample.
  • Said information can be used in the diagnosis, prognosis or monitoring of the evolution of diseases, in particular, colorectal cancer (CRC), in a subject.
  • the level of autoantibodies to the Piml protein is detected and, optionally, quantified; In another particular embodiment, the level of autoantibodies against the Piml protein is detected and, optionally, and, in addition, the level of autoantibodies against one or more of the following SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and / or proteins. ACVR2B, according to the previously mentioned combinations. Additionally, if desired, it is possible to detect and, optionally, determine the level of autoantibodies against other proteins, for example, against proteins potentially useful in the diagnosis of CRC, such as CEA, etc.
  • the level of autoantibodies to the SRC protein is detected and, optionally, quantified; in another particular embodiment, it is detected and, optionally, the level of autoantibodies against the SRC protein is quantified, and, in addition, the level of autoantibodies against one or more of the following Piml proteins, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and / or ACVR2B, according to the aforementioned combinations. Additionally, if desired, it is possible to detect and, optionally, determine the level of autoantibodies against other proteins, for example, against proteins potentially useful in the diagnosis of CRC, such as CEA, etc.
  • the level of autoantibodies to the MAPKAPK3 protein is detected and, optionally, quantified; In another particular embodiment, the level of autoantibodies against the MAPKAPK3 protein is detected and, optionally, and, in addition, the level of autoantibodies against one or more of the following Piml, SRC, FGFR4, STK4 and / or proteins ACVR2B, according to the previously mentioned combinations. Additionally, if desired, it is possible to detect and, optionally, determine the level of autoantibodies against other proteins, for example, against proteins potentially useful in the diagnosis of CRC, such as CEA, etc.
  • the level of autoantibodies against the FGFR4 protein is detected and optionally; In another particular embodiment, the level of autoantibodies against the FGFR4 protein is detected and, optionally, and, in addition, the level of autoantibodies against one or more of the following Piml, SRC, MAPKAPK3, STK4 and / or proteins ACVR2B, according to the previously mentioned combinations. Additionally, if desired, it is possible to detect and, optionally, determine the level of autoantibodies against other proteins, for example, against proteins potentially useful in the diagnosis of CRC, such as CEA, etc.
  • the level of autoantibodies against the STK4 protein is detected and optionally; In another particular embodiment, the level of autoantibodies against the STK4 protein is detected and, optionally, and, in addition, the level of autoantibodies against one or more of the following Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, and / or ACVR2B, according to the previously mentioned combinations. Additionally, if desired, it is possible to detect and, optionally, determine the level of autoantibodies against other proteins, for example, against proteins potentially useful in the diagnosis of CRC, such as CEA, etc.
  • the level of autoantibodies to the ACVR2B protein is detected and, optionally, quantified; In another particular embodiment, the level of autoantibodies against the ACVR2B protein is detected and, optionally, and, in addition, the level of autoantibodies against one or more of the following Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4 and / or proteins STK4, according to the previously mentioned combinations. Additionally, if desired, it is possible to detect and, optionally, determine the level of autoantibodies against other proteins, for example, against proteins potentially useful in the diagnosis of CRC, such as CEA, etc.
  • the level of autoantibodies against Piml protein, the level of autoantibodies against protein is detected and optionally quantified.
  • MAPKAPK3 or the level of autoantibodies against the ACVR2B protein preferably, the level of autoantibodies against the MAPKAPK3 protein or the level of autoantibodies against the ACVR2B protein.
  • the level of autoantibodies against the MAPKAPK3 protein and the level of autoantibodies against the ACVR2B protein is detected and, optionally, and, optionally, the level of autoantibodies against the FGFR4 protein.
  • the level of autoantibodies against Piml protein, the level of autoantibodies against MAPKAPK3 protein and the level of autoantibodies against ACVR2B protein, and, optionally, the level of autoantibodies against the FGFR4 protein are provided.
  • the data obtained in accordance with the method of obtaining data 1 of the invention related to the detection and, optionally, quantification of autoantibodies against one or more of the Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and / or ACVR2B proteins, within the context of the present invention, they can be used in the diagnosis, prognosis or monitoring of disease progression, in particular, colorectal cancer (CRC), in a subject.
  • CRC colorectal cancer
  • the invention in another aspect, relates to a method of obtaining data in a biological sample of a subject, hereinafter "method of obtaining data 2 of the invention", which comprises detecting at least one product of expression of a gene, wherein said gene is selected from the group formed by the genes Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B, and, if desired, quantify the level of expression of said expression product of said gene in said biological sample.
  • the biological sample used for the implementation of the method of obtaining data 2 of the invention is a biological sample comprising tumor cells, preferably, CCR tumor cells.
  • said biological sample comprising tumor cells may be a sample of a biological fluid or, preferably, a sample of a tissue, e.g., a tumor biopsy, a fine needle aspirate, etc.
  • the biological sample can be, for example, but not limited to, fresh, frozen, fixed or embedded in paraffin.
  • said biological sample is a tumor biopsy comprising CRC tumor cells from a patient suffering from CRC or a biopsy of colon or rectum tissue from a subject under study in order, for example, to assess whether suffer or not CCR.
  • the detection of the expression product of a particular gene is carried out by analyzing the level of mRNA derived from its transcription; in this case, the mRNA level analysis can be performed, by way of illustration, not limitation, by an enzymatic amplification process, for example, by polymerase chain reaction (PCR), back transcription in combination with the reaction in polymerase chain (RT- PCR), retrotranscription in combination with the ligase chain reaction (RT-LCR), or any other nucleic acid amplification method; DNA microarrays made with oligonucleotides deposited by any mechanism; DNA microarrays made with oligonucleotides synthesized in situ by photolithography or by any other mechanism; in situ hybridization using specific probes labeled with any method of marking; by electrophoresis gels; by membrane transfer and hybridization with a specific probe; by nuclear magnetic resonance or any
  • this method of obtaining data 2 of the invention may include performing an extraction step in order to obtain the total RNA, which can be performed by conventional techniques (Chomczynski et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532). Additional information on methods for detecting and quantifying the expression levels of a gene expression product can be found, for example, in Sambrook et al., 2001 "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3rd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, NY, VoI. 1-3.
  • the quantification of the expression levels of the genes identified above is carried out by means of a quantitative multiplex PCR or by an array of DNA or RNA.
  • the detection, and, optionally, quantification of the expression level of said expression product of the Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B genes in the sample to be analyzed is performed by analyzing the level of Piml proteins , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B, or fragments thereof; in this case, the analysis of the level of said proteins can be performed, by way of illustration, not limitation, by an immunoassay, by nuclear magnetic resonance or by any other appropriate technique known in the state of the art.
  • the determination of the amount of Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B proteins, or their fragments is performed by an immunoassay.
  • said immunoassay is an immunoblot (Western blot or membrane immunodetection). To do this, briefly, a protein extract is obtained from an isolated biological sample of a subject and the proteins are separated by electro foresis in a support medium capable of retaining them.
  • the proteins are transferred to a different support or membrane where they can be detected through the use of specific antibodies that recognize the proteins in question (eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B) or functionally equivalent fragments from the same.
  • Said membrane is hybridized with a first specific antibody (or primary antibody) that recognizes the protein in question (eg, Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B) or a functionally equivalent fragment thereof.
  • the membrane is then hybridized with a second antibody (or secondary antibody) capable of specifically recognizing the primary antibody and which is conjugated or bound with a marker compound.
  • it is the antibody that recognizes the protein Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B, or the functionally equivalent fragment thereof, which is conjugated or bound to a marker compound, and it is not necessary to use of a secondary antibody.
  • Different formats, supports and techniques are known that can be used for the realization of this preferred aspect of the method of obtaining data 2 of the invention.
  • the immunoassay comprises an immunohistochemical assay.
  • Immunohistochemical techniques allow the identification, on tissue or cytological samples, of characteristic antigenic determinants.
  • the analysis by immunohistochemistry (IHQ) is performed on tissue cuts, either frozen or included in paraffin, from an isolated biological sample of a subject.
  • tissue cuts either frozen or included in paraffin, from an isolated biological sample of a subject.
  • IHQ immunohistochemistry
  • These sections hybridize with a specific antibody or primary antibody that recognizes specific antibodies that recognize the Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B proteins, or functionally equivalent fragments thereof.
  • the sections are then hybridized with a secondary antibody capable of specifically recognizing the primary antibody and which is conjugated or bound with a marker compound.
  • it is the antibody that recognizes the protein Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B, or the functionally equivalent fragment of the same as that which is conjugated or bound to a marker compound, and the use of a secondary antibody is not necessary.
  • the expression level of a single gene expression product selected from the group of genes formed by Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 and ACVR2B is detected and, optionally.
  • the level of an expression product of two or more genes of the group formed by the genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 and ACVR2B is quantified and, optionally.
  • expression products of 2, 3, 4, 5 or 6 of said genes can be detected and, if you wish to quantify.
  • the level of a Piml gene expression product, the level of a gene expression product is quantified and optionally quantified.
  • MAPKAPKS or the level of an ACVR2B gene expression product preferably, the level of an MAPKAPKS gene expression product or the level of an ACVR2B gene expression product.
  • the level of an expression product of the MAPKAPKS gene and the level of an expression product of the ACVR2B gene, and, optionally, the level of an expression product of the FGFR4 gene is detected and optionally quantified.
  • the level of an expression product of the Piml gene, the level of an expression product of the MAPKAPKS gene and the level of an expression product of the ACVR2B gene, and, optionally, is quantified and optionally level of an expression product of the FGFR4 gene.
  • the data obtained in accordance with the method of obtaining data 2 of the invention related to the detection and, optionally, quantification of expression products of one or more of the genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 and / or ACVR2B , within the context of the present invention, they can be used in the diagnosis, prognosis or monitoring of disease progression, in particular, colorectal cancer (CRC), in a subject.
  • CRC colorectal cancer
  • the invention relates to a method for diagnosing whether a subject suffers from colorectal cancer (CRC), hereinafter "diagnostic method 1 of the ", which comprises comparing the level of at least one autoantibody to a protein, wherein said autoantibody is selected from the group consisting of an autoantibody against the Piml protein, an autoantibody against the SRC protein, an autoantibody against to the MAPKAPK3 protein, an autoantibody against the FGFR4 protein, an autoantibody against the STK4 protein, and an autoantibody against the ACVR2B protein, in a biological sample of said subject, with the reference level for said autoantibody, where yes the level of said autoantibody against Piml protein, or said autoantibody against SRC protein, or said autoantibody against MAPKAPK3 protein, or said autoantibody against FGFR4 protein, or said autoantibody against STK4 protein , in said sample, is greater than the corresponding reference level for said autoantibodies, and / or if the level
  • the diagnostic method 1 of the invention comprises, previously, determining the level of at least one autoantibody against a protein, wherein said autoantibody is selected from the group consisting of a autoantibody against the Piml protein, a autoantibody against the SRC protein, an autoantibody against the MAP KAP K3 protein, an autoantibody against the FGFR4 protein, an autoantibody against the STK4 protein, and an autoantibody against the ACVR2B protein, in a biological sample of the subject in question.
  • said biological sample is a blood, plasma or serum sample of said subject.
  • the level of said autoantibodies can be determined as previously indicated in relation to the autoantibody detection method of the invention or with the method of obtaining data 1 of the invention.
  • the diagnostic method 1 of the invention comprises comparing the level of said autoantibody (or autoantibodies) with the reference level for said autoantibody (or with the reference levels for the autoantibodies in question), where if the level of said autoantibody against the Piml protein, or said autoantibody against the SRC protein , or of said autoantibody against MAPKAPK3 protein, or of said autoantibody against FGFR4 protein, or of said autoantibody against protein STK4, in said sample, is greater than the corresponding reference level for said autoantibodies, and / or if the level of the autoantibody against ACVR2B in said sample is lower than the reference level for said autoantibody, then said subject is diagnosed with CRC .
  • said reference level is the level or amount of autoantibodies against said proteins (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, and ACVR2B) in a control sample, such as, for example, a sample of blood, serum or plasma, from a population of control subjects (that is, not suffering from CRC).
  • a control sample such as, for example, a sample of blood, serum or plasma, from a population of control subjects (that is, not suffering from CRC).
  • the level of an autoantibody against a protein in the biological sample of the subject under study is considered to be "higher” than the reference level of said autoantibody when the The level of said autoantibody in the subject's biological sample is at least 1.5 times, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times or even more, the reference level of said autoantibody.
  • the level of an autoantibody against a protein in the biological sample of the subject under study will be considered “lower” than the reference level of said autoantibody when the level of said autoantibody in the
  • the subject's biological sample is at least 1.5 times, 5 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times, or even more , lower than the reference level of said autoantibody.
  • the level of autoantibodies against a single protein is quantified, for example, against the Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B protein in the sample of the subject to be analyzed and compared with the reference level of autoantibodies against said protein.
  • the level of autoantibodies against two or more proteins of the group formed by the proteins Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B in the sample of the subject to be analyzed is quantified and the levels obtained are compared with the levels of reference of the autoantibodies against the corresponding proteins.
  • autoantibodies can be quantified against 2, 3, 4, 5 and 6 proteins selected from the group consisting of Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B, as mentioned in the List of Combinations mentioned above.
  • the level of autoantibodies against Piml protein, the level of autoantibodies against MAPKAPK3 protein or the level of autoantibodies against ACVR2B protein is preferably quantified and compared with its reference level, preferably, the level of autoantibodies against MAPKAPK3 protein or the level of autoantibodies against ACVR2B protein.
  • the level of autoantibodies against MAPKAPK3 protein and the level of autoantibodies against ACVR2B protein, and, optionally, the level of autoantibodies against FGFR4 protein is quantified and compared with its reference level.
  • the level of autoantibodies against Piml protein, the level of autoantibodies against MAPKAPK3 protein and the level of autoantibodies against ACVR2B protein, and, optionally, the level is quantified and compared with its reference level of autoantibodies against the FGFR4 protein.
  • the diagnostic method 1 of the invention makes it possible to diagnose if a subject suffers CRC with a high degree of reliability since it allows to correctly detect said disease (CRC) in at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90% of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • Said method can be used at any stage of the CCR.
  • the subject is a patient suffering from CRC in early stages, such as stages 0, 1 and II.
  • the invention relates to a method for diagnosing whether a subject suffers from colorectal cancer (CRC), hereinafter “diagnostic method 2 of the invention", which comprises comparing the level of expression of at least one product of expression of a gene, wherein said gene is selected from the group consisting of the genes Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B, in a sample of said subject, with the reference level for said expression product of said gene, wherein if the level of said expression product of the Piml gene, or of said expression product of gene 57?
  • diagnosis method 2 of the invention comprises comparing the level of expression of at least one product of expression of a gene, wherein said gene is selected from the group consisting of the genes Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B, in a sample of said subject, with the reference level for said expression product of said gene, wherein if the level of said expression product of the Piml gene, or of said expression product
  • the diagnostic method 2 of the invention comprises, previously, determining the expression level of at least one expression product (eg, RNA or protein) of a gene selected from the group consisting of the Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4 genes , STK4 and ACVR2B, in a biological sample of the subject in question.
  • said biological sample is a sample of colon or rectum tissue, or of tumor tissue (if any), blood, plasma or serum of said subject.
  • the level of said expression product can be determined, depending on its nature (RNA or protein) as previously indicated in relation to the method of obtaining data 2 of the invention.
  • the diagnostic method 2 of the invention comprises comparing the level of said expression product (or expression products) with the reference level for said expression product (or with the reference levels for the expression products in question), where the level of said expression product of the Piml gene, or of said expression product of the SRC gene, or of said expression product of the MAPKAPKS gene, or of said expression product of the FGFR4 gene, or of said expression product of the STK4 gene, is greater than the corresponding reference level for said products of expression of said genes and / or if the level of the ACVR2B gene expression product is lower than the reference level for said expression product of said gene, then said subject is diagnosed of CCR
  • said reference level is the level or amount of expression product of said gene (Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4, and ACVR2B) in a biological sample, preferably of colon, of a population of control subjects (that is, subjects that do not suffer from CRC).
  • the level of an expression product of a gene in the sample of the subject under study is considered to be "greater" than the reference level of said expression product when the ratio between the level of the expression product of the gene in question determined in the subject's biological sample is at least 1.5 times, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times or even more, the reference level of said expression product of said gene.
  • the level of an expression product of a gene (eg, ACVR2B) in the biological sample of the subject under study shall be considered to be "lower” than the reference level of said expression product of said gene when the level of said autoantibody in the subject's biological sample is at least 1.5 times, 5 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times, or even more, lower than the reference level of said expression product of said gene.
  • only the expression level of a single gene expression product (eg, Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 or ACVR2E) in the sample of the subject to be analyzed is quantified and compared with the level of reference of said expression product of said gene.
  • a single gene expression product eg, Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 or ACVR2E
  • the expression levels of expression products of two or more genes of the group formed by the genes Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B in the sample of the subject to be analyzed are quantified and the levels obtained are compared with the corresponding reference levels of said expression products of the genes in question.
  • expression products of 2, 3, 4, 5 and 6 genes selected from the group consisting of the genes Piml, SRC, MAPKAPKd ,, FGFR4, STK4 and ACVR2B can be quantified, such as, for example, expression products of:
  • the level of an expression product of the Piml gene, the level of an expression product of the MAPKAPK3 gene or the level of an expression product of the ACVR2B gene is preferably quantified and compared with its reference level, preferably, level of an expression product of the MAPKAPK3 gene or the level of an expression product of the A CVR2B gene.
  • the level of an expression product of the MAPKAPK3 gene and the level of an expression product of the ACVR2B gene, and, optionally the level of an expression product of the FGFR4 gene is quantified and compared with its reference level.
  • the level of an expression product of the Piml gene, the level of an expression product of the MAPKAPK3 gene and the level of an expression product of the A gene CVR2B, and, are quantified and compared with its reference level; optionally the level of an expression product of the FGFR4 gene.
  • the diagnostic method 2 of the invention makes it possible to diagnose if a subject suffers CRC with a high degree of reliability since it allows to correctly detect said disease (CRC) in at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least the 90% of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • Said method can be used at any stage of the CCR.
  • the subject is a patient suffering from CRC in early stages, such as stages 0, 1 and II. Forecasting / Tracking Methods
  • the teachings of the present invention are also useful for predicting or evaluating the response to a particular treatment.
  • the treatment of the main RCC is usually surgical (surgery), for example, but not limited, by local excision or resection.
  • Some RCC patients before surgery receive "neoadjuvant" therapy with the objective of reducing the size of the RCC, to enable or facilitate surgery.
  • adjuvant or neoadjuvant therapy may consist, for example, but not limited to radiotherapy, chemotherapy or biological therapy.
  • Some examples of compounds used in chemotherapy or biological therapy include, but are not limited to, folic acid, fluorouracil, irinotecan, oxaliplatin, leucovorin, levamisole, cetuximab or bevacizumab.
  • the invention relates to a method for evaluating the prognosis or monitoring of the evolution of a patient suffering from colorectal cancer (CRC), hereinafter "diagnostic method 1 of the invention", which comprises comparing the level of at least one autoantibody against a protein, wherein said autoantibody is selected from the group consisting of an autoantibody against the Piml protein, an autoantibody against the SRC protein, an autoantibody against the MAPKAPK3 protein, an autoantibody against the FGFR4 protein, an autoantibody against the STK4 protein, and an autoantibody against the ACVR2B protein, in a biological sample of said patient suffering from CRC, with the reference level for said autoantibody, where the level of said autoantibody against the Piml protein, or said autoantibody against the SRC protein, or said autoantibody against the MAPKAPK3 protein, or said autoantibody rpo against the FGFR4 protein, or of said autoantibody against the STK4 protein, in said sample, is
  • the prognostic method 1 of the invention comprises, previously, determining the level of at least one autoantibody against a protein, wherein said autoantibody is selected from the group formed by a autoantibody against the Piml protein, a autoantibody against the SRC protein, an autoantibody against the MAPKAPK3 protein, an autoantibody against the FGFR4 protein, an autoantibody against the STK4 protein, and an autoantibody against the ACVR2B protein, in a biological sample of the patient suffering from CCR in question.
  • said biological sample is a blood, plasma or serum sample of said patient suffering from CRC in order to assess the monitoring of disease progression (CRC).
  • the level of said autoantibodies can be determined as previously indicated in relation to the autoantibody detection method of the invention or with the method of obtaining data 1 of the invention.
  • the prognostic method 1 of the invention comprises comparing the level of said autoantibody (or autoantibodies) with the reference level for said autoantibody (or with the reference levels for the autoantibodies in question), where if the level of said autoantibody against the Piml protein, or said autoantibody against the SRC protein , or of said autoantibody against MAPKAPK3 protein, or of said autoantibody against FGFR4 protein, or of said autoantibody against STK4 protein, in said sample, is greater than the corresponding reference level for said autoantibodies, and / or if the level of the autoantibody against ACVR2B in said sample is lower than the reference level for said autoantibody, then said patient undergoes a CRR with poor prognosis or presents a CCR with an unfavorable evolution.
  • said reference level is the level or amount of autoantibodies against said proteins (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, and ACVR2B) in a sample, preferably serum, of subjects that do not have CCR
  • said reference level is the level or amount of autoantibodies against said proteins (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, and ACVR2B) in a sample, preferably serum, of the same patient suffering from CRC obtained before, for example, before the administration of a treatment against CRC, in order to be able to evaluate the efficacy of said treatment.
  • the level of an autoantibody against a protein in the biological sample of the subject under study is considered to be "higher” than the reference level of said autoantibody when the The level of said autoantibody in the subject's biological sample is at least 1.5 times, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times or even more, the reference level of said autoantibody.
  • the level of an autoantibody against a protein in the biological sample of the subject under study will be considered “lower” than the reference level of said autoantibody when the level of said autoantibody in the
  • the subject's biological sample is at least 1.5 times, 5 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times, or even more , lower than the reference level of said autoantibody.
  • the level of autoantibodies against a single protein is quantified, for example, against the Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B protein in the sample of the subject to be analyzed and compared with the reference level of autoantibodies against said protein.
  • the level of autoantibodies against two or more proteins of the group formed by the proteins Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B in the sample of the subject to be analyzed is quantified and the levels obtained are compared with the levels of reference of the autoantibodies against the corresponding proteins.
  • the autoantibodies against 2, 3, 4, 5 and 6 proteins selected from the group consisting of the Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B proteins can be quantified, as mentioned in the List of Protein Combinations previously mentioned.
  • the level of autoantibodies against Piml protein, the level of autoantibodies against MAPKAPK3 protein or the level of autoantibodies against ACVR2B protein is quantified and compared with its reference level. preferably, the level of autoantibodies against the MAPKAPK3 protein or the level of autoantibodies against the ACVR2B protein.
  • the level of autoantibodies against MAPKAPK3 protein and the level of autoantibodies against ACVR2B protein, and, optionally, the level of autoantibodies against FGFR4 protein is quantified and compared with its reference level.
  • the level of autoantibodies against Piml protein, the level of autoantibodies against MAPKAPK3 protein and the level of autoantibodies against ACVR2B protein, and, optionally, the level of autoantibodies against the FGFR4 protein are provided.
  • the prognostic method 1 of the invention allows to evaluate the prognosis of a patient suffering from CRC and / or following the evolution of said patient suffering from CRC, that is, if it has a good prognosis and will evolve favorably or if it has a poor prognosis and will evolve unfavorably.
  • Said method can be used at any stage of the CCR.
  • the subject is a patient suffering from CRC in early stages, such as stages 0, 1 and II.
  • the invention in another aspect, relates to a method for evaluating the prognosis or monitoring of the evolution of a patient suffering from colorectal cancer (CRC), hereinafter "prognostic method 2 of the invention", which comprises comparing the level of expression of at least one expression product of a gene, wherein said gene is selected from the group consisting of the genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 and ACVR2B, in a sample of said patient suffering from CRC, with the level reference for said expression product of said gene, where whether the level of said expression product of the Piml gene, or of said expression product of gene 57?
  • prognostic method 2 of the invention which comprises comparing the level of expression of at least one expression product of a gene, wherein said gene is selected from the group consisting of the genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 and ACVR2B, in a sample of said patient suffering from CRC, with the level reference for said expression product of said gene,
  • C or of said expression product of the MAPKAPK3 gene, or of said expression product of the FGFR4 gene, or of said expression product of the STK4 gene, is greater than the corresponding reference level for said expression products of said genes and / or if the level of the expression product of the ACVR2B gene is lower than the reference level for said expression product of said gene, said patient undergoes a CRC with poor prognosis or presents a CCR with an unfavorable evolution.
  • the forecast method 2 of the invention comprises, previously, determining the expression level of at least one expression product (eg, RNA or protein) of a gene selected from the group consisting of the Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4 genes , STK4 and ACVR2B, in a biological sample of the patient suffering from CRC in question.
  • said biological sample is a sample of colon or rectum tissue adjacent to the tumor, tumor tissue, blood, plasma or serum of said patient suffering from CRC.
  • the level of said expression product can be determined, depending on its nature (RNA or protein) as previously indicated in relation to the method of obtaining data 2 of the invention.
  • the diagnostic method 2 of the invention comprises comparing the level of said expression product (or expression products) in the sample of the patient suffering from CRC with the reference level for said expression product (or with the reference levels for the expression products in question), where the level of said Piml gene expression product, or said SRC gene expression product, or said MAPKAPKS gene expression product, or said FGFR4 gene expression product, or said STK4 gene expression product, is greater than the corresponding reference level for said expression products of said genes and / or if the level of the ACVR2B gene expression product is lower than the reference level for said expression product of said gene, then said patient undergoes a CRC with poor prognosis or presents a CRC with an unfavorable evolution.
  • said reference level is the level or amount of expression product of said gene (Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4, and ACVR2B) in a biological sample, preferably of colon, of a population of control subjects (that is, they do not suffer from CRC).
  • said reference level is the level or amount of expression product of said gene (Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4, and ACVR2B) in a biological sample, preferably of tumor tissue or tissue of the colon or rectum obtained, for example, from an area adjacent to or adjacent to the non-cancerous tumor of the same patient suffering from CRC obtained earlier, by For example, before the administration of a treatment against CRC, in order to evaluate the effectiveness of said treatment.
  • said gene Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4, and ACVR2B
  • the level of an expression product of a gene in the sample of the subject under study is considered to be "greater" than the reference level of said expression product when the ratio between the level of the expression product of the gene in question determined in the subject's biological sample is at least 1.5 times, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times or even more, the reference level of said expression product of said gene.
  • the level of an expression product of a gene (eg, ACVR2E) in the biological sample of the subject under study shall be considered to be "lower” than the reference level of said expression product of said gene when the level of said autoantibody in the subject's biological sample is at least 1.5 times, 5 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times, or even more, lower than the reference level of said expression product of said gene.
  • a single gene expression product eg, Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 or ACVR2E
  • a single gene expression product eg, Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 or ACVR2E
  • the expression levels of expression products of two or more genes of the group formed by the genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 or ACVR2B in the sample of the subject to be analyzed are quantified and the levels obtained are compared with the corresponding reference levels of said expression products of the genes in question.
  • expression products of 2, 3, 4, 5 and 6 genes selected from the group consisting of the Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 and ACVR2B genes can be quantified, such as, for example, expression products of the gene combinations mentioned in the List of gene combinations previously indicated.
  • the level of an expression product of the Piml gene, the level of an expression product of the Piml gene is quantified and compared with its reference level MAPKAPK3 gene or the level of an ACVR2B gene expression product, preferably, the level of an MAPKAPK3 gene expression product or the level of an ACVR2B gene expression product.
  • the level of an expression product of the MAPKAPK3 gene and the level of an expression product of the ACVR2B gene, and, optionally the level of an expression product of the FGFR4 gene is quantified and compared with its reference level.
  • the level of an expression product of the Piml gene, the level of an expression product of the MAPKAPK3 gene and the level of an expression product of the ACVR2B gene are quantified and compared with its reference level, and, optionally the level of an expression product of the FGFR4 gene.
  • the prognostic method 2 of the invention allows to evaluate the prognosis of a patient suffering from CRC and / or following the evolution of said patient suffering from CRC, that is, if it has a good prognosis and will evolve favorably or if it has a poor prognosis and will evolve unfavorably.
  • Said method can be used at any stage of the CCR.
  • the subject is a patient suffering from CRC in early stages, such as stages 0, 1 and II.
  • teachings of the present invention are also useful for analyzing the possibility of a patient suffering from CRC developing lung or liver metastases.
  • the invention relates to a "method for diagnosing lung metastases in a patient suffering from colorectal cancer (CRC)" which comprises comparing the level of at least one autoantibody to a protein in a sample of said patient, wherein said protein is a protein selected from the group of proteins mentioned in Table 2, with the reference level for said autoantibody, where, if the level of autoantibody against said protein in said sample is greater than At the reference level for said autoantibody, the CRC patient has lung metastases.
  • CRC colorectal cancer
  • the method of diagnosing lung metastases in a patient suffering from CRC comprises, previously, determining the level of at least one autoantibody against a protein selected from the proteins mentioned in Table 2, in a biological sample. of the patient suffering from CRC in question.
  • said biological sample is a blood, plasma or serum sample of said patient suffering from CRC.
  • the level of said autoantibodies can be determined as previously indicated in relation to the autoantibody detection method of the invention or with the method of obtaining data 1 of the invention but applied to the proteins of Table 2 instead of on the proteins mentioned there (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B).
  • the method of diagnosing lung metastases in a patient suffering from CRC comprises comparing the level of said autoantibody (or autoantibodies) with the reference level for said autoantibody (or with the reference levels for the autoantibodies in question), where if the level of autoantibody (s) against said protein (s) in said sample is greater than At the reference level for said autoantibody (s), the CRC patient has lung metastases.
  • said reference level is the level or amount of autoantibodies against said proteins mentioned in Table 2 in a sample, preferably serum, of subjects who do not have CRC.
  • said sample comes from patients suffering from CRC but who do not have metastases.
  • the level of an autoantibody against a protein in the sample of the patient suffering from CRC to be analyzed is considered to be "higher” than the reference level of said autoantibody when the
  • the level of said autoantibody in the subject's biological sample is at least 1.5 times, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times or even more, the reference level of said autoantibody.
  • only the level of autoantibodies against a single protein of those mentioned in Table 2 is quantified in the sample of the patient suffering from CRC to be analyzed and compared with the reference level of autoantibodies against said protein.
  • the level of autoantibodies against two or more proteins of the group formed by the proteins mentioned in Table 2 in the sample is quantified of the patient suffering from CRC to be analyzed and the levels obtained are compared with the reference levels of the autoantibodies against the corresponding proteins.
  • autoantibodies can be quantified against 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 and 15 proteins selected from the group consisting of the proteins shown in Table 2 .
  • the method of diagnosing lung metastases in a patient suffering from CRC allows to assess whether a CRC patient has lung metastases.
  • the invention in another aspect, relates to a "method for diagnosing liver metastases in a patient suffering from colorectal cancer (CRC)" which comprises comparing the level of at least one autoantibody to a protein in a sample of said patient.
  • said protein is a protein selected from the group of proteins mentioned in Table 3, with the reference level for said autoantibody, where, if the level of autoantibody against said protein in said sample is greater than the reference level for said autoantibody, the CRC patient has liver metastases.
  • the method of diagnosing liver metastases in a patient suffering from CRC comprises, previously, determining the level of at least one autoantibody against a protein selected from the proteins mentioned in Table 3, in a biological sample. of the patient suffering from CRC in question.
  • said biological sample is a blood, plasma or serum sample of said patient suffering from CRC.
  • the level of said autoantibodies can be determined as previously indicated in relation to the autoantibody detection method of the invention or with the method of obtaining data 1 of the invention but applied to the proteins of Table 3 instead of on the proteins mentioned there (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B).
  • the method of diagnosing liver metastases in a patient suffering from CRC comprises comparing the level of said autoantibody (or autoantibodies ) with the reference level for said autoantibody (or with the reference levels for the autoantibodies in question), in where if the level of autoantibody (s) against said protein (s) in said sample is higher than the reference level for said autoantibody (s), the CRC patient has liver metastases.
  • said reference level is the level or amount of autoantibodies against said proteins mentioned in Table 3 in a sample, preferably serum, of subjects who do not have CRC.
  • said sample comes from patients suffering from CRC but who do not have metastases.
  • the level of an autoantibody against a protein in the sample of the patient suffering from CRC to be analyzed is considered to be "higher” than the reference level of said autoantibody when the
  • the level of said autoantibody in the subject's biological sample is at least 1.5 times, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times or even more, the reference level of said autoantibody.
  • only the level of autoantibodies against a single protein of those mentioned in Table 3 is quantified in the sample of the patient suffering from CRC to be analyzed and compared with the reference level of autoantibodies against said protein.
  • the level of autoantibodies against two or more proteins of the group formed by the proteins mentioned in Table 3 is quantified in the sample of the patient suffering from CRC to be analyzed and the levels obtained are compared with the reference levels of the autoantibodies against the corresponding proteins.
  • autoantibodies can be quantified against 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 and 22 proteins selected from the group consisting of the proteins shown in Table 3.
  • kit of the invention which comprises
  • an autoantibody selected from the group consisting of an autoantibody against the Piml protein, an autoantibody against the SRC protein, an autoantibody against the MAPKAPK3 protein, an autoantibody against the FGFR4 protein, an autoantibody against the STK4 protein, and an autoantibody against the ACVR2B protein, or, alternatively
  • the kit of the invention further comprises the elements necessary to compare the amount of autoantibodies against at least one of the Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B proteins with a reference amount.
  • the kit of the invention further comprises the elements necessary to compare the amount of autoantibodies against a protein mentioned in Table 2 with a reference amount.
  • the kit of the invention further comprises the elements necessary to compare the amount of autoantibodies against a protein mentioned in Table 3 with a reference amount.
  • the kit of the invention comprises the elements necessary to detect the amount of the product of the expression of at least one of the genes selected from the list comprising Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B in a biological sample isolated from a subject.
  • the kit of the invention further comprises the elements necessary to compare the detected amount of the product of the expression of the Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 or ACVR2B genes with an amount reference.
  • the kit of the invention may also contain all those reagents necessary to detect the amount of autoantibodies against Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 or ACVR2B proteins, or against the proteins mentioned in Tables 2 or 3, or of the product of the expression of the genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 or ACVR2B, by means of any of the methods described hereinabove as, for example, but not limited to,
  • the kit of the invention may also include, without any limitation, buffers, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit of the invention can include all the supports and containers necessary for its implementation and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the method of the invention.
  • the invention relates to the use of the kit of the invention to: detect an autoantibody against a protein selected from the group consisting of Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 and ACVR2B proteins; or for
  • CRC colorectal cancer
  • control sera Twelve sera from patients with CRC in advanced stages and who developed different types of metastases to the liver (7 patients), liver and lung (4 patients) and liver and bones (1 patient) and 8 sera from healthy individuals [ie, from individuals without CCR] (control sera) were tested using high density protein microarrays in order to identify specific CCR autoantibodies and their respective reactive antigens (Table 4). Control sera were selected to have exactly the same proportion of women and men and the same average age of patients with CRC (64.5 years). Healthy controls and patients with CRC showed a different immunoreactivity pattern.
  • the proteins that showed discriminatory capacity between normal and tumor patients appear in Table 7.
  • the analysis was performed using the ProtoArray Prospector Analyzer program, classifying the data according to the calculated p-value for each protein and the prevalence of autoantibodies in both groups.
  • the p-value was set to be 0.04 maximum and the prevalence greater than 50% in the population of patients with CRC.
  • 432 proteins showed immunoreactivity to autoantibodies present in the serum.
  • 43 proteins had a significant p-value less than 0.04.
  • 25 of them had a higher prevalence in the serum of patients with CRC and 18 a lower prevalence in patients with CRC compared to control individuals.
  • Six proteins -MAPKAPK3, Piml, SRC, STK4, FGFR4 and ACVR2B- were selected according to the signal strength data of the microarray.
  • ACVR2B exhibited weak expression in tumor tissue and, in general, more expression in the early stages of the disease. Subsequently, the expression levels of the autoantigens in 6 CCR cell lines were analyzed in comparison to 5 cell lines used as reference ( Figure IB). Piml and MAPKAPK3 expression was detected in virtually all CCR cell lines, except MAPKAPK3 in the SW480 cell line. As for ACVR2B, its expression was observed in reference cell lines including neutrophils and lymphocytes, but not in colon cancer cell lines.
  • Piml showed an increased expression in the epithelial cells surrounding the crypts of tumor tissue, the staining being mainly cytoplasmic. In addition, both lymphocytes and macrophages were stained in a very important way.
  • FIG. 1 shows the result of the immunohistochemical analysis of Piml and ACVR2B in CCR tissue and normal adjacent mucosa of 45 patients with RCC. As can be seen, the level of Piml protein appears to be increased in the CCR samples while that of ACVR2B appears to be decreased.
  • CEA for being the most used marker in the diagnosis of CRC (Duffy, MJ 2001 Clinical chemistry 47 (4), 624-630) and Annex IV for its overexpression in CRC tissue (Alfonso et al. 2005. Proteomics 5 (10) , 2602-
  • Figure 6 shows an ELISA based analysis of serum samples using a
  • Figure 7C shows how the combination of the measurement of autoantibodies against MAPKAPK3, ACVR2B, Piml and FGFR4 results in an optimal predictive combination. Also, in the case of early stages of RCC, the combination of MAPKAPK3, ACVR2B, Piml and FGFR4 also results in optimal specificity and sensitivity.
  • Figure 8 shows how the combination of CEA with an optimal combination of autoantibodies (autoantibodies against MAPKAPK3, ACVR2B, Piml and FGFR4 proteins) does not improve the prediction capacity for the diagnosis of CRC, indicating that the combination of The markers of the invention is more suitable for the diagnosis of early stage CRC than CEA alone.
  • ProtoArray TM Human Protein Microarrays v.4.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). This microarray contains 8,000 human proteins fused to GST (glutathione-S-transferase), expressed in Spodoptera frugiperda Sf9 insect cells and printed in duplicate. Briefly, arrays were equilibrated at 4 0 C for 15 minutes and blocked with blocking buffer (1% bovine serum albumin (BSA) in phosphate buffered saline (PBS) - polysorbate 20 (Tween® 20) 0.1%) for 1 hour at 4 0 C with gentle agitation.
  • BSA bovine serum albumin
  • PBS phosphate buffered saline
  • a total of 150 ⁇ L of serum diluted 1: 50 in blocking buffer was applied on the surface of the array.
  • the array was sealed with a CoverGlass (Corning) and incubated for 90 minutes at 4 0 C.
  • the arrays were washed with incubation buffer (1% BSA in PBS with 0.5 mM dithiothreitol (DTT), 5% glycerol and 0.05% Triton X-100) and serum autoantibodies bound to array proteins were detected using a secondary anti-human IgG antibody (H + L) labeled with Alexa Fluor 647 (Invitrogen) diluted 1: 2,000 in incubation buffer at 4 0 C for 90 minutes.
  • incubation buffer 1% BSA in PBS with 0.5 mM dithiothreitol (DTT), 5% glycerol and 0.05% Triton X-100
  • the arrays were washed with 0.1% PBS-T ween® 20 and dried by centrifugation at 1,000 rpm for 1 minute. Finally, the slides were scanned on a ScanArray TM 5000 (Packard BioChip Technologies) using the 635 nm and 532 nm lasers. GenePix Pro 5.1 image analysis software was used for quantification. As controls, Protoarrays v4.0 were incubated with an anti-GST antibody before incubating the array with an anti-mouse IgG antibody labeled with AlexaFluor 555 to test for uniformity and the amount of protein printed in the array. Another array was incubated directly with the secondary anti-human IgG antibody (H + L) labeled with Alexa Fluor 647 to determine the noise levels in the assay.
  • H + L secondary anti-human IgG antibody
  • CEA was obtained from Calbiochem and human serum albumin (HSA) was obtained from the Sigma company.
  • the human Piml coding cDNA was introduced into the vector pET28a, which allows 6xHis-Piml fusion, and was expressed in Escherichia coli using strain BL21 (DE3).
  • the human ACVR2B cDNA was introduced into the pDEST 527 vector that allows 6xHis-ACVR2B fusion, using the Gateway system and was expressed in bacteria, while the human MAPKAPK3 protein was introduced into the pDEST565 expression vector that allows 6xHis fusion - GST-MAPKAPK3 and expressed under the same conditions as ACVR2B and Piml.
  • the proteins thus expressed were purified by affinity chromatography using a HiTrap Chelating column (GE Healthcare) followed by an extra purification step by means of a Superdex 200 column (GE Healthcare) penetrability column.
  • the human Annexin IV coding cDNA was cloned into the pTT3 expression vector and expressed in HEK293-EBNA cells.
  • the recombinant protein was expressed after transfecting the cells with lipofectamine (Sigma) and purified by an Nichelating resin (GE Healthcare) affinity column.
  • the antibodies against MAPKAPK3 and Piml used in the ELISA assays were purchased from the company Abnova.
  • Antibodies against MAPKAPK3, Pim and ACVR2B used in membrane and tissue array immunodetection were purchased from Abcam.
  • the CCR cell lines (Rko, Hct ll or, Hct l 5, Sw45, Sw480, Coló 205), BxPc3 pancreatic adenocarcinoma and the Molt4 lymphoblastoid line were grown using pre-established protocols for said cells.
  • Neutrophils and lymphocytes used as controls were isolated from peripheral blood of a healthy individual.
  • Embryonic murine fibroblasts (MEF) were immortalized by infecting a primary culture with the Epstein-Barr virus and were grown using pre-established protocols for this cell line.
  • ELISA Example 4
  • An ELISA trial was developed in order to test the ability of purified autoantigens to discriminate CRC using serum from 30 patients. Briefly, 0.3 ⁇ g of the purified proteins or HSA were upholstered as a negative control on Microtiter plates (Maxisorp, Nunc) in PBS overnight. The day after, the plates were washed 3 times with PBS and blocked with 3% skim milk in PBS for 2 hours at room temperature. After further washing, the 94 serum samples (1: 50 dilution in 3% skim milk in PBS) were incubated for 2 hours at room temperature.
  • Protein extracts from paired tissues of 6 patients with CRC (12 in total) were prepared as previously described in Alfonso, P. et al. (2005) Proteomic expression analysis of colorectal cancer by two-dimensional differential gel electrophoresis. Proteomic 5, 2602-2611). Briefly, protein extracts were obtained after use with 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Tris-HCl 1 O mM (pH 7.2) supplemented with protease inhibitors (Roche). The protein concentration was determined using the Quant 2-D kit (GE Healthcare) after clarification by centrifugation at 12.00Og for 15 minutes.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Triton X-100 1% sodium deoxycholate
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic
  • membrane immunodetection 50 ⁇ g of the protein extracts of the 6 colon cancer cell lines, the 5 reference cell lines and the paired tissues were run in parallel on a 10% SDS-PAGE gel and transferred to membranes nitrocellulose (extra Hybond-C) according to standard protocols. After blocking, the membranes were incubated with the optimal dilutions of mono or polyclonal antibodies against the selected antigens: Piml (1: 100 dilution), MAPKAPK3 (1: 500 dilution) and ACVR2B (1: 200 dilution).
  • Tissue microarray specific for CRC with 45 different tumor samples were prepared as previously described (Madoz-Gurpide et al. 2007. Mol CeIl Proteomics 6 (12), 2150-2164). Sections were cut to a width of 3 microns and dried at 56 0 C for 16 h before dewaxed in xylene and rehydrated in water after previous steps in different percentages of ethanol. The exposure and recovery of epitopes was performed in 0.01 M sodium citrate buffer heated for 2 minutes in a pressure cooker. After the heating step, the slides were washed with water for 5 minutes and again in Tris saline buffer (TBS) at pH 7.4.
  • TMS Tris saline buffer
  • TMAs were incubated with a monoclonal antibody against Piml (Abcam) and a polyclonal antibody against ACVR2B (Abcam). Specific binding was detected by goat anti-IgG conjugated to biotin. The visualization of specific interactions was carried out with the EnVision HRP system (DakoCytomation).
  • Analyzer 4.0 (Invitrogen) -, which uses a statistical test based on the principle of Chebyshev inequality (Hudson et al. 2007. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104 (44), 17494-17499) .
  • the algorithm compares the signal of each protein to the signal of the negative controls in the array and assigns a pa CI value for each protein.
  • the software identifies significant signals (those that are identified as positive over background noise) and calculates Z values that reflect the intensity of the signal compared to all proteins.
  • the program compares the 2 groups and identifies the proteins that have an increased signal in one of the 2 groups and the p-value is calculated for each protein according to the hypothesis that there is no signal increase in one group compared to the other. .
  • Supervised clusters were obtained using the metric distance and Pearson's correlation to visualize the discrimination between groups using the Multi program

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Abstract

Se describen unos autoanticuerpos frente a diversas proteínas útiles como biomarcadores para el diagnóstico, pronóstico o monitorización de la evolución de un cáncer colorrectal (CCR).

Description

MÉTODOS PARA EL DIAGNOSTICO O PRONOSTICO DEL CÁNCER
COLORRECTAL
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuadra dentro del campo de la biomedicina.
Específicamente, se relaciona con la obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico o monitorización de la evolución de un cáncer colorrectal (CCR), así como con métodos para el diagnóstico o pronóstico de CCR basados en unos autoanticuerpos frente a unas proteínas o en los productos de expresión de los genes que codifican dichas proteínas, así como con un método para diagnosticar metástasis en pacientes con CCR. La invención también se relaciona con un kit adecuado para la puesta en práctica de dichos métodos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El cáncer colorrectal (CCR) es el segundo cáncer más prevalente en el mundo occidental. El desarrollo de la enfermedad se produce durante décadas e involucra múltiples eventos genéticos. A pesar de que el CCR es uno de los tumores sólidos mejor caracterizados desde un punto de vista genético, sigue siendo una de las principales causas de mortalidad en países desarrollados por el diagnóstico tardío de los pacientes debido, entre otras razones, a que algunas pruebas diagnósticas, tales como la colonoscopia, se realizan tarde.
Hoy en día, existen pocas proteínas que hayan sido descritas como biomarcadores eficaces de CCR, entre las que se encuentran en antígeno carcinoembrionario (CEA), CA19.9 y CA125 (Crawford et al. 2003. Journal of Surgical Oncology 84 (4), 239-248; Duffy et al. 2007 Eur J Cáncer 43 (9), 1348-1360) y no son lo suficientemente específicas como para realizar rastreos ("screenings") clínicos con vistas a detectar CCR (Locker et al. 25 2006. J Clin Oncol 24 (33), 5313-5327).
Los análisis proteómicos están siendo activamente utilizados para la identificación de nuevos biomarcadores. En diferentes estudios proteómicos previos se han identificado, mediante el uso de microarrays de anticuerpos y 2D-DIGE (electroforesis en gel bidimensional diferencial, del inglés "Two-dimensional difference gel electrophoresis"), proteínas expresadas diferencialmente en tejido de CCR, incluyendo isoformas y modificaciones post-traduccionales responsables de modificaciones en rutas de señalización (Alfonso et al. 2005. Proteomics 5(10), 2602-261 1 ; Kopf et al. 2005. Proteomics 5(9), 2412-2416; Madoz-Gurpide et al. 2007. Mol CeIl Proteomics 6 (12), 2150-2164; Alfonso et al. 2008. Journal of Proteome Research 7 (10), 4247-4255). Estas dos aproximaciones permitieron la identificación de una amplia colección de potenciales marcadores tumorales de tejido de CCR que actualmente están siendo investigados.
Sin embargo, la implementación de métodos diagnósticos no invasivos y más simples que permitan la detección temprana del CCR debería basarse en la identificación de proteínas o anticuerpos detectables en suero o plasma (Hanash et al. 2008. Nature 452 (7187), 571-579; Hudson et al. 2007. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104 (44), 17494-17499).
La existencia de una respuesta inmune frente a cáncer y tumores en humanos ha quedado demostrada por la presencia de autoanticuerpos en el suero de pacientes con cáncer. Así, diferentes proteínas humanas (autoantígenos) se pueden ver afectadas antes o durante la formación del tumor pudiendo producir una respuesta inmune una vez liberadas (Hudson et al. 2007. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104 (44), 17494-17499; Wang et al. 2005. The New England Journal of Medicine 353 (12), 1224-1235; Sreekumar et al. 2004. J Nati Cáncer Inst 96 (11), 834-843). Dichos autoanticuerpos se pueden detectar en estadios tempranos de la enfermedad e incluso antes de que el cáncer pueda ser detectado mediante otras técnicas indicando su elevado potencial como biomarcadores de la enfermedad. Estas proteínas tumorales pueden verse afectadas por mutaciones puntuales, tener un plegamiento anómalo, sobreexpresión, glicosilación aberrante, estar truncadas o bien, sufrir una degradación aberrante como es el caso de p53, HER2, NY-ESOl o MUCl, respectivamente (Chen et al.1997. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94 (5), 1914-1918; Schubert et al. 2000. Nature 404 (6779), 770-774; Ulanet et al. 2003. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100 (21), 12361-12366). De hecho, se han caracterizado autoantígenos asociados a tumores (AATs) en CCR utilizando otras aproximaciones (Scanlan et al. 1998. International Journal of Cáncer 76 (5), 652-658). No obstante, la validez diagnóstica de los autoanticuerpos asociados con CCR identificados hasta la fecha requiere aún de una validación independiente para su uso generalizado en el diagnóstico/pronóstico del CCR.
Existe, por tanto, la necesidad de disponer de biomarc adores que permitan el diagnóstico del CCR, su clasificación en los diferentes estadios de la progresión tumoral, el pronóstico de la evolución de la enfermedad, la evaluación de su respuesta a un determinado tratamiento y la detección de la recurrencia o la diseminación del CCR, mediante un método sencillo, eficaz y no invasivo.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Diversos ensayos realizados por los inventores han permitido identificar que autoanticuerpos frente a las proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, así como los productos de expresión de los genes que codifican dichas proteínas pueden ser utilizados como biomarcadores de cáncer colorrectal (CCR). Además, también han podido identificar que autoanticuerpos frente a las proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3 (véase más adelante) pueden ser utilizados como biomarcadores de metástasis en pulmón o en hígado en pacientes con CCR.
Por tanto, la presente invención se relaciona con un método para la detección de autoanticuerpos frente a dichas proteínas (Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B) potencialmente útiles como marcadores de CCR así como con métodos de obtención de datos, métodos para el diagnóstico, pronóstico o seguimiento de la evolución de CCR, y con métodos para el diagnóstico o pronóstico de metástasis en pulmón o en hígado en pacientes con CCR, y con un kit adecuado para la puesta en práctica de dichos métodos y sus aplicaciones.
La presente invención proporciona, por tanto, una respuesta a la necesidad de disponer de biomarcadores que permitan el diagnóstico del CCR, su clasificación en los diferentes estadios de la progresión tumoral, el pronóstico de la evolución de la enfermedad, la evaluación de su respuesta a un determinado tratamiento y la detección de la recurrencia o la diseminación (metástasis) del CCR, mediante un método sencillo, eficaz y no invasivo.
La sangre es normalmente el fluido biológico óptimo utilizado en métodos no invasivos para el screening masivo con fines diagnósticos de grandes poblaciones de sujetos. Por un lado, el suero y el plasma son fáciles de obtener, y, por otro lado, la circulación sanguínea facilita el contacto de la sangre con todos los tejidos del cuerpo humano, incluyendo en el caso de pacientes con cáncer el contacto con tejido tumoral y sus antígenos representativos. La liberación de estos AATs probablemente ocurre a muy baja concentración en plasma y probablemente sufren proteólisis en un corto periodo de tiempo. Por el contrario, los anticuerpos son moléculas muy estables, que han sido usadas durante años en diferentes inmunoensayos en clínica, lo que facilita la estandarización de los ensayos. El uso de los auto anticuerpos es también beneficioso en el sentido de que el sistema inmune amplifica la respuesta facilitando su identificación y cuantificación.
En la presente invención se ha examinado el suero de pacientes con CCR y sueros de sujetos sin CCR (sueros control o sueros de referencia) con el fin de identificar una firma (huella) de auto anticuerpos producidos por los pacientes que sufren CCR en respuesta a dicho CCR y sus respectivas proteínas reactivas. Para ello, se testaron sueros de pacientes con CCR y sueros control utilizando microarrays de proteínas de alta densidad. Los microarrays de proteínas ofrecen una serie de ventajas con respecto a otras aproximaciones empleadas para la identificación de AATs: i) las proteínas impresas en el array son conocidas a priori evitando una posterior identificación y eliminando la posible selección de mimótopos, y ii) no hay predisposición a seleccionar ninguna proteína ya que todas ellas se imprimen a una concentración similar. Esta combinación de factores da como resultado una elevada sensibilidad para la identificación de biomarcadores.
La firma de auto anticuerpos identificada permitió diferenciar entre sueros de pacientes con CCR y sujetos control. En total, se identificaron 43 proteínas que presentaban una expresión diferencial en sueros de pacientes con CCR y en sueros control (p<0,04) en el array de proteínas. La combinación de los 6 mejores antígenos inmunoreactivos: Piml, MAPKAPK3, STK4, SRC, FGFR4 y ACVR2B fue capaz de detectar CCR con un 100% de especificidad y sensibilidad usando los datos obtenidos del array de proteínas. Los niveles de expresión, aumentados o disminuidos, de dichas proteínas fueron confirmados mediante inmunodetección en membrana e inmuno-histoquímica utilizando tanto líneas celulares y tejido tumoral de CCR como microarrays de tejido.
La combinación formada por las proteínas purificadas Piml , MAPKAPK3 y ACVR2B fue testada mediante un ELISA utilizando sueros de pacientes con CCR y sueros control. El ELISA permitió discernir entre sueros de pacientes con CCR y sueros control con una especificidad y sensibilidad del 73,9% y 83,3%, respectivamente (AUC=0,86).
Estos estudios permitieron determinar la presencia de una firma de autoanticuerpos específica de CCR revelando la presencia de nuevos biomarcadores específicos de la enfermedad con potencial para diagnosticar CCR utilizando sueros de pacientes con CCR con mayor especificidad y sensibilidad que con los biomarcadores de CCR descritos hasta la fecha.
La técnica del ELISA es mucho más sensible que otras técnicas como la inmunodetección en membrana o la inmunohistoquímica. Esta elevada sensibilidad podría explicar el por qué la prevalencia de los autoanticuerpos en pacientes con cáncer es mucho mayor que en otros estudios previos, además, de la detección de reactividad en sujetos control. De hecho, el ensayo diagnóstico podría basarse en autoanticuerpos con elevada prevalencia dado que no se encontraron autoantígenos con inmunorreactividad exclusiva en el suero de pacientes con CCR.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un método para la detección de un autoanticuerpo frente a una proteína que comprende: a) poner en contacto una muestra biológica con dicha proteína o con un fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo; y b) detectar la formación de un complejo autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo; en donde dicha proteína se selecciona del grupo formado por las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B y combinaciones de las mismas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de obtención de datos en una muestra biológica de un sujeto que comprende detectar, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína, en donde dicho autoanticuerpo se selecciona del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml, un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, y, si se desea, determinar el nivel de dicho autoanticuerpo en dicha muestra.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de obtención de datos en una muestra biológica de un sujeto que comprende detectar, al menos, un producto de expresión de un gen, en donde dicho gen se selecciona del grupo formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, y, si se desea, cuantificar el nivel de expresión de dicho producto de expresión de dicho gen en dicha muestra.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para diagnosticar si un sujeto sufre cáncer colorrectal (CCR), que comprende comparar el nivel de, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína, en donde dicho autoanticuerpo se selecciona del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml , un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, en una muestra biológica de dicho sujeto, con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, en donde si el nivel de dicho autoanticuerpo frente a la proteína Piml , o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína SRC, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAP K3, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína STK4, en dicha muestra, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos autoanticuerpos, y/o si el nivel del autoanticuerpo frente a ACVR2B en dicha muestra es menor que el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, entonces dicho sujeto es diagnosticado de CCR.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para diagnosticar si un sujeto sufre cáncer colorrectal (CCR), que comprende comparar el nivel de expresión de, al menos, un producto de expresión de un gen, en donde dicho gen se selecciona del grupo formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 y ACVR2B, en una muestra de dicho sujeto, con el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen, en donde si el nivel de dicho producto de expresión del gen Piml, o de dicho producto de expresión del gen SRC, o de dicho producto de expresión del gen MAPKAPK3, o de dicho producto de expresión del gen FGFR4, o de dicho producto de expresión del gen STK4, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos productos de expresión de dichos genes y/o si el nivel del producto de expresión del gen ACVR2B es menor que el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen, dicho sujeto es diagnosticado de CCR.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para evaluar el pronóstico o seguimiento de la evolución de un paciente que sufre cáncer colorrectal (CCR), que comprende comparar el nivel de, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína, en donde dicho autoanticuerpo se selecciona del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml, un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAP K3, un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, en una muestra biológica de dicho paciente que sufre CCR, con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, en donde si el nivel de dicho autoanticuerpo frente a la proteína Piml , o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína SRC, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína STK4, en dicha muestra, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos autoanticuerpos, y/o si el nivel del autoanticuerpo frente a ACVR2B en dicha muestra es menor que el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, entonces dicho paciente sufre un CCR con mal pronóstico o presenta un CCR con una evolución desfavorable.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para evaluar el pronóstico o seguimiento de la evolución de un paciente que sufre cáncer colorrectal (CCR), que comprende comparar el nivel de expresión de, al menos, un producto de expresión de un gen, en donde dicho gen se selecciona del grupo formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, en una muestra de dicho paciente que sufre CCR, con el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen, en donde si el nivel de dicho producto de expresión del gen Piml, o de dicho producto de expresión del gen SRC, o de dicho producto de expresión del gen MAPKAPK3, o de dicho producto de expresión del gen FGFR4, o de dicho producto de expresión del gen STK4, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos productos de expresión de dichos genes y/o si el nivel del producto de expresión del gen ACVR2B es menor que el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen, dicho paciente sufre un CCR con mal pronóstico o presenta un CCR con una evolución desfavorable.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para diagnosticar metástasis en pulmón en un paciente que sufre cáncer colorrectal (CCR), que comprende comparar el nivel de, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína en una muestra biológica de dicho paciente, en donde dicha proteína es una proteína seleccionada del grupo de proteínas mencionadas en la Tabla 2, con el nivel de referencia para dicho auto anticuerpo, en donde, si el nivel de auto anticuerpo frente a dicha proteína en dicha muestra biológica de dicho paciente es mayor que el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, el paciente de CCR presenta metástasis en pulmón.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para diagnosticar metástasis en hígado en un paciente que sufre cáncer colorrectal (CCR) que comprende comparar el nivel de, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína en una muestra biológica de dicho paciente, en donde dicha proteína es una proteína seleccionada del grupo de proteínas mencionadas en la Tabla 3, con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, en donde, si el nivel de autoanticuerpo frente a dicha proteína en dicha muestra biológica de dicho paciente es mayor que el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, el paciente de CCR presenta metástasis en hígado.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende:
los elementos necesarios para detectar, al menos, un autoanticuerpo seleccionado del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml , un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la proteína MAP KAP K3, un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, o, alternativamente
los elementos necesarios para detectar, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína seleccionada entre las proteínas mencionadas en la Tabla 2, o, alternativamente los elementos necesarios para detectar, al menos, un autoanticuerpo frente a una pro teína seleccionada entre las proteínas mencionadas en la Tabla 3, o, alternativamente los elementos necesarios para detectar, al menos, un producto de expresión de un gen seleccionado del grupo formado por los genes Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 yACVR2B.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicho kit para detectar un autoanticuerpo frente a una proteína seleccionada del grupo formado por las proteínas
Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, o por las proteínas de las Tablas 2 y
3; o para obtener datos; o para diagnosticar si un sujeto sufre CCR; o para evaluar el pronóstico o seguimiento de la evolución de un paciente que sufre CCR; o para diagnosticar metástasis en pulmón en un paciente que sufre CCR; o para diagnosticar metástasis en hígado en un paciente que sufre CCR.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Las siguientes figuras forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar además ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor mediante referencia a una o más de estas figuras en combinación con la descripción detallada de formas de realización específicas presentadas aquí.
Figura 1. Muestra el análisis de la expresión de Piml, MAPKAPK3 y ACVR2B, en líneas celulares y tejido tumoral. A, 50 μg de extracto proteico de tejidos pareados normales (N) y tumorales (T) de 6 pacientes con CCR (estadios de Duke A, B y C) se corrieron por separado en ge les SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa; las inmunodetecciones en membrana se realizaron con anticuerpos comerciales obtenidos frente a Piml , MAPKAPK3 y ACVR2B, utilizando anti-tubulina como control del ensayo. La señal se desarrolló utilizando ECL (Amersham) o SuperSignal Femto (Pierce). B, Las inmunodetecciones en membrana se realizaron con anticuerpos comerciales obtenidos frente a ACVR2B, Piml y MAPKAPK3 utilizando anti-tubulina como control del ensayo. 50 μg de extractos celulares de 6 líneas celulares de CCR (Rko, Hctl ló, SW48, SW480, Hctl5, Colo205) y 5 líneas celulares de otras enfermedades o normales se utilizaron como referencia en el ensayo [(BxPc3 (adenocarcinoma 25 de páncreas), Molt4 (Linfoblastoide), Neut (Neutro filos), MEF (fibroblastos murinos embrionarios) y Linf (linfocitos)] se corrieron por separado en geles SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. La señal se desarrolló utilizando ECL (Amersham) o SuperSignal Femto (Pierce). C, Los niveles relativos de la expresión de los genes de FGFR4 (Notterman, Alón, Sierk, and Levine, (2001) Cáncer Res. 61, 3124-3130), MAPKAPK3 (Ki, Jeung et al. 2007 Int. J. Cáncer 121, 2005-2012), SRC (Ki, Jeung et al. 2007 Int. J. Cáncer 121, 2005-2012) y STK4 (Watanabe, Kobunai et al. 2006 Cáncer Res. 66, 9804-9808) se evaluaron utilizando la base de datos pública de DNA microarrays Oncomine
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D, Análisis de la expresión de Piml y ACVR2B en tejido utilizando microarrays de tejido (TMA) específicos de CCR. Las imágenes se tomaron a diferentes aumentos (10Ox y 40Ox). La expresión de Piml se observó en células epiteliales rodeando las criptas de tejido tumoral con tinción citoplasmática. La tinción de ACVR2B se localizó principalmente a nivel de membrana de las células epiteliales en el tejido normal con una clara disminución de su expresión en tejido tumoral.
Figura 2. Muestra la verificación de los AATs seleccionados (Piml, MAPKAPK3 y ACVR2B) mediante ELISA. Valores de ELISA de Piml , MAPKAPK3 y ACVR2B usando CEA y Anexina IV como controles. Las barras de error representan la desviación estándar (D. S.) del ensayo.
Figura 3. Muestra las curvas ROC de los AATs seleccionados y consiste en una representación gráfica del comportamiento de dichos AATs. A, Curvas ROC utilizando los valores de ELISA de ACVR2B, Piml y MAPKAPK3 individualmente. B, Curvas ROC utilizando diferentes combinaciones de las proteínas seleccionadas [(MAPKAPK3 y ACVR2B y Pim 1) y (MAPKAPK3 y ACVR2B)]. C, Curvas ROC utilizando los controles CEA y Anexina IV. [ADC: Área bajo la curva; Sens: Sensibilidad; Espec: Especificidad].
Figura 4. Análisis inmunohistoquímico de Piml y ACVR2B. A, Resultado del análisis inmunohistoquímico de Piml y ACVR2B en tejido de CCR y mucosa adyacente normal de 45 pacientes con CCR cuantificados por 2 investigadores independientes en diferentes días, de acuerdo con los siguientes criterios: O, sin mareaje; 1, mareaje débil; 2, mareaje normal; 3, mareaje fuerte. Las barras de error representan la D. S. de cada ensayo. B, Análisis estadístico de los resultados del TMA. Se indica el tamaño de la muestra, la media, la 95% IC para la media, la desviación estándar y el T-test.
Figura 5. Correlación de autoanticuerpos frente a MAPKAPK3 y ACVR2B en suero de sujetos con CCR. A y B, muestran la distribución de la intensidad de señal de ambos marcadores en suero de pacientes con CCR [suero CCR (tumoral)] y en suero se sujetos sanos [suero control sano (normal)]. C, muestra el gráfico de la señal en cada suero (tumoral y normal) de MAPKAPK3 y ACVR2B, donde se puede observar la ausencia de correlación entre la señal de ambos marcadores. Cuanto más alta sea la señal para ACVR2B mayor es la posiblidad de pertenecer al grupo normal; la situación contraria se observa para MAPKAPK3.
Figura 6. Análisis basado en un ELISA de muestras de suero usando un ELISA con los AATs STK4 y FGFR4. Se utilizaron un total de 94 muestras de suero (52 de pacientes con CCR y 42 controles) para la implementación y el análisis basado en un ELISA de AATs recombinantes. Como controles se utilizaron CEA y Anexina IV. Los resultados muestran la media de los valores de absorbancia obtenidos para SRC, STK4, FGFR4, HSA y Anexina IV en suero de poblaciones de referencia (controles) y con CCR. Las barras de error representan la D. S. del ensayo. La concentración del CEA en suero se determinó usando un kit específico para inmunoensayos (MP Biomedicals).
Figura 7. Validación de SRC, STK4 y FGFR4 como biomarcadores potenciales en CCR. A, gráfico de SRC, STK4 y FGFR4 discriminando entre suero de pacientes con CCR y suero de sujetos de referencia (controles) independientemente en un grupo de validación de un total de 94 muestras (52 de pacientes con CCR y 42 controles). B, especificidad (Espec) y sensibilidad (Sens) obtenida usando los controles HAS y Anexina IV para discriminar independientemente pacientes con CCR de diferentes sujetos. C, especificidad y sensibilidad obtenida del análisis de curvas ROC utilizando una combinación óptima de biomarcadores (MAPKAPK3, ACVR2B, Piml y FGFR4). D, especificidad y sensibilidad de una combinación óptima de biomarcadores para los estadios tempranos de CCR (MAPKAPK3, ACVR2B, Piml y FGFR4). [AUC: Área bajo la curva; Sens: Sensibilidad; Espec: Especificidad].
Figura 8. Validación de una combinación de marcadores para el diagnóstico del CCR. Papel de CEA solo y con una combinación óptima de marcadores para el diagnóstico de CCR (MAPKAPK3, ACVR2B, Piml y FGFR4). También se muestra la combinación de los autoanticuerpos frente a MAPKAPK3, ACVR2B, Piml y FGFR4 y CEA discriminando independientemente suero de pacientes con CCR de suero de sujetos de referencia (controles) en un grupo de validación de un total de 94 muestras (52 de pacientes con CCR y 42 de controles), indicando que los marcadores proporcionados por esta invención en combinación con CEA mejoran significativamente la detección de CCR.
Figura 9. Validación de una combinación de marcadores para el diagnóstico de
CCR en estadios tempranos. Papel de CEA sólo y con una combinación óptima de marcadores para el diagnóstico de CCR (MAPKAPK3, ACVR2B, Piml y FGFR4) para discriminar CCR en estadio temprano usando 20 sujetos control sanos y 20 sueros de pacientes con CCR en estadios A y B. La combinación de los autoanticuerpos frente a MAPKAPK3, ACVR2B, Piml y FGFR4 y CEA no mejoró la capacidad de predicción para el diagnóstico de CCR, indicando que dicha combinación de marcadores proporcionados por esta invención es más adecuada para el diagnóstico de CCR en estadios tempranos que CEA sólo.
Figura 10. Gráfico de los valores obtenidos mediante un ELISA de la concentración de MAPKAPK3, Piml, SRC, FGFR4 y STK4 y CEA en suero de pacientes con CCR. La concentración de CEA rué mayor en estadios tardíos de CCR que en estadios tempranos de CCR (donde su concentración fue bastante baja). La presencia de autoanticuerpos en suero de pacientes con CCR frente a los biomarcadores seleccionados proporcionados por esta invención fue constante durante todas las etapas permitiendo un mejor diagnóstico de CCR no solo en estadios tardíos sino también en estadios CCR tempranos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
Para facilitar su comprensión, a continuación se indica el significado de algunos términos y expresiones tal como se utilizan en la presente descripción.
El término "anticuerpo", tal como aquí se utiliza, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmuno globulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con un antígeno, tal como, por ejemplo, una proteína. Hay 5 isotipos o clases principales de inmunoglobulinas: inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina D (IgD), inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina A (IgA) e inmunoglobulina E (IgE).
El término "autoanticuerpo", tal como aquí se utiliza, se aplica a un anticuerpo que reacciona con un antígeno presente en el propio organismo de un sujeto, incluso si la reacción ocurre solo in vitro, y tanto si causa efectos patológicos in vivo como si no los produce.
El término "autoanticuerpo frente a la proteína Piml", tal como aquí se utiliza, se refiere a un autoanticuerpo capaz de reaccionar con la proteína Piml, o con una variante o con un fragmento de dicha proteína, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente, es decir, susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo. En una realización particular, dicho autoanticuerpo frente a la proteína Piml es una IgG; en otra realización particular, dicho auto anticuerpo frente a la proteína Piml es una IgM.
El término "auto anticuerpo frente a la proteína SRC", tal como aquí se utiliza, se refiere a un auto anticuerpo capaz de reaccionar con la proteína SRC, o con una variante o con un fragmento de dicha proteína, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente, es decir, susceptible de ser reconocido por dicho auto anticuerpo. En una realización particular, dicho auto anticuerpo frente a la pro teína SRC es una IgG; en otra realización particular, dicho autoanticuerpo frente a la proteína SRC es una IgM.
El término "autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3", tal como aquí se utiliza, se refiere a un autoanticuerpo capaz de reaccionar con la proteína MAP KAP K3, o con una variante o con un fragmento de dicha proteína, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente, es decir, susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo. En una realización particular, dicho autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3 es una IgG; en otra realización particular, dicho autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3 es una IgM.
El término "autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4". tal como aquí se utiliza, se refiere a un autoanticuerpo capaz de reaccionar con la proteína FGFR4, o con una variante o con un fragmento de dicha proteína, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente, es decir, susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo. En una realización particular, dicho autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4 es una IgG; en otra realización particular, dicho autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4 es una IgM.
El término "autoanticuerpo frente a la proteína STK4". tal como aquí se utiliza, se refiere a un autoanticuerpo capaz de reaccionar con la proteína STK4, o con una variante o con un fragmento de dicha proteína, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente, es decir, susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo. En una realización particular, dicho autoanticuerpo frente a la proteína STK4 es una IgG; en otra realización particular, dicho autoanticuerpo frente a la proteína STK4 es una IgM. El término "autoanticueroo frente a la proteína ACVR2B". tal como aquí se utiliza, se refiere a un autoanticuerpo capaz de reaccionar con la proteína ACVR2B, o con una variante o con un fragmento de dicha proteína, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente, es decir, susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo. En una realización particular, dicho autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B es una IgG; en otra realización particular, dicho autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B es una IgM.
El término "cáncer colorrectal" o "CCR". también llamado cáncer de colon, tal como aquí se utiliza, incluye cualquier tipo de neoplasias del colon, recto y apéndice así como cualquier subtipo histológico que aparece típicamente en el cáncer de colon, e.g., carcinoma de células transicional, carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma, cualquier subtipo clínico, e.g., superficial, músculo invasivo o cáncer de enfermedad metastática, o cualquier estadio TNM incluyendo tumores T0-T4, N0-N2 y MO-Ml. Los pacientes pueden ser clasificados en diferentes grupos con respecto al estadio del tumor. La clasificación del cáncer de colon es una estimación de la penetración de un cáncer particular. Se lleva a cabo con fines de investigación, diagnóstico y para determinar el mejor método de tratamiento. El sistema para la clasificación de cánceres colorrectales depende de la extensión de la invasión local, del grado de nodos linfáticos implicados y de si existe metástasis distal. El sistema más común de clasificación es el sistema TNM (para tumores/nódulos/metástasis), del "American Joint Committee on Cáncer" (AJCC). El sistema TNM asigna un número basado en tres categorías. "T" indica el grado de invasión de la pared intestinal, "N" el grado de afectación de nodulos linfáticos y "M" el grado de metástasis. El estadio más amplio del cáncer es normalmente citado como un número I, II, III, IV derivado del valor TNM agrupado por el pronóstico, un número más alto indica un cáncer más avanzado y un peor pronóstico. En la Tabla 1 se indican detalles del sistema.
Tabla 1
Sistema TNM para la clasificación de CCR
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El término "cuantifícar", tal como aquí se utiliza, se refiere a la medida de la cantidad o concentración, preferiblemente de manera cuantitativa, semi-cuantitativa o relativa de un producto, por ejemplo, autoanticuerpos frente a una proteína determinada (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, etc., o frente a las proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3), productos de expresión (e.g., ARN o proteína) de los genes que codifican una proteína determinada (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, etc.), etc. La cuantificación de un producto puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o concentración de dicho producto basada en la señal que se obtiene directamente de dicho producto y que está correlacionada directamente con el número de moléculas del producto en cuestión presentes en la muestra analizada. Dicha señal (a la que también se puede uno referir como señal de intensidad) puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física del producto en cuestión. La medida indirecta de la cantidad o concentración de un producto incluye la medida obtenida de un componente secundario (e.g., un componente distinto a los autoanticuerpos) o un sistema de medida biológica (e.g., la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas", productos de reacción enzimática, etc.).
La cuantificación del nivel de expresión de un producto de expresión de un gen puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o concentración de un producto de expresión de un gen basada en la señal que se obtiene directamente del producto de expresión de dicho gen y que está correlacionada directamente con el número de moléculas de producto de expresión de dicho gen presentes en la muestra analizada. Dicha señal, a la que también se puede hacer referencia como señal de intensidad, puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física del producto de expresión del gen en cuestión (e.g., Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4, ACVR2B, etc.). La medida indirecta de la cantidad o concentración de un producto de expresión de un gen incluye la medida obtenida de un componente secundario (e.g., un componente distinto de los productos de expresión del gen en cuestión) o un sistema de medida biológica (e.g., la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas", productos de reacción enzimática, etc.).
El término "diagnóstico", tal como aquí se utiliza, se refiere, en general, al proceso por el cual se identifica una enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier condición de salud-enfermedad. En particular, el término "diagnóstico de cáncer colorrectal o CCR" se refiere a la capacidad de identificar o detectar la presencia de CCR; esta detección, tal y como es entendida por un experto en la materia, no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es significativamente estadística puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas; ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas herramientas estadísticas incluyen la determinación de intervalos de confianza, la determinación del valor p, el test de Student o las funciones discriminantes de Fisher, etc. (véase, por ejemplo, Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 ó de 0,0001. Preferiblemente, las enseñanzas de la presente invención permiten detectar correctamente la enfermedad (CCR) en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
El término "fragmento" aplicado a una proteína, tal como aquí se utiliza, se refiere a una porción de una proteína, por ejemplo, una proteína seleccionada del grupo formado por las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B o sus variantes.
La expresión "fragmento de una proteína susceptible de ser reconocido por un autoanticuerpo que reconoce a dicha proteína", tal como aquí se utiliza, se refiere a un fragmento de una proteína que es reconocido por un autoanticuerpo frente a dicha proteína, de manera que se forma un complejo estable de autoanticuerpo-fragmento de proteína. A modo ilustrativo, no limitativo, dicha proteína puede ser una proteína seleccionada del grupo de proteínas formado por las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B.
La expresión "funcionalmente equivalente" aplicada a variantes o fragmentos de proteínas, tal como aquí se utiliza, significa que la variante o el fragmento de la proteína en cuestión mantiene esencialmente las propiedades inmunológicas de dicha proteína en cuestión. Dichas propiedades inmunológicas se pueden determinar mediante métodos convencionales tales como los descritos en los Ejemplos que acompañan a esta descripción (e.g., mediante ensayos ELISA, etc.).
El término "gen Piml". tal como aquí se utiliza, se refiere al gen o a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína Piml, tal como aquí se define, e incluye, además, por extensión, la secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento de dicha proteína Piml funcionalmente equivalente.
El término "gen SRC\ tal como aquí se utiliza, se refiere al gen o a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SRC, tal como aquí se define, e incluye, además, por extensión, la secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento de dicha proteína SRC funcionalmente equivalente. El término "gen MAPKAPK3", tal como aquí se utiliza, se refiere al gen o a la secuencia de ácido nucleico que codiñca la proteína MAPKAPK3, tal como aquí se define, e incluye, además, por extensión, la secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento de dicha proteína MAPKAPK3funcionalmente equivalente.
El término "gen FGFR4". tal como aquí se utiliza, se refiere al gen o a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína FGFR4, tal como aquí se define, e incluye, además, por extensión, la secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento de dicha proteína FGFR4 funcionalmente equivalente.
El término "gen STK4". tal como aquí se utiliza, se refiere al gen o a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína STK4, tal como aquí se define, e incluye, además, por extensión, la secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento de dicha proteína STK4 funcionalmente equivalente.
El término "gen ACVR2B'\ tal como aquí se utiliza, se refiere al gen o a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína ACVR2B, tal como aquí se define, e incluye, además, por extensión, la secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento de dicha proteína ACVR2B funcionalmente equivalente.
El término "identidad", aplicado en la comparación entre las secuencias de aminoácidos de 2 proteínas, tal como aquí se utiliza, se refiere a la proporción de aminoácidos idénticos entre 2 secuencias de aminoácidos que se comparan. El grado de identidad (normalmente expresado en porcentaje (%) de identidad) existente entre 2 secuencias de aminoácidos puede ser identificado fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias; a modo ilustrativo, no limitativo, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede ser determinado por métodos convencionales, por ejemplo, mediante métodos y algoritmos informáticos conocidos por los expertos en la técnica; a modo ilustrativo, el grado de identidad entre 2 secuencias de aminoácidos puede determinarse mediante el uso del algoritmo BLAST (BLAST Manual, Altschul et al.,
NCBl NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410).
El término "inmunoensavo". tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier técnica analítica basada en una reacción de conjugación entre un antígeno, por ejemplo, una proteína o un fragmento apropiado de la misma, y un anticuerpo que reconoce a dicho antígeno. A modo ilustrativo, dicha proteína puede ser una proteína seleccionada del grupo de proteínas formado por las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B o por las proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3. Alternativamente pueden utilizarse fragmentos apropiados de dichas proteínas, es decir, fragmentos de proteínas susceptibles de ser reconocidos por anticuerpos que reconocen a las proteínas en cuestión; a modo ilustrativo, dichos fragmentos de proteínas pueden ser fragmentos de las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, o de las proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3, susceptibles de ser reconocidos por los autoanticuerpos que reconocen a dichas proteínas.
El término "marcador", tal como aquí se utiliza, se refiere a un reactivo indicador que permite detectar un complejo de tipo antígeno-anticuerpo, tal como una enzima que cataliza una reacción detectable, un compuesto que genera una señal cuando forma parte de dicho complejo, etc. A modo ilustrativo, no limitativo, dicho marcador puede ser una enzima (e.g., peroxidasa, glicosidasa, fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, β-galactosidasa, β-glucosidasa, β-glucuronidasa, etc.), un compuesto fluorescente o fluoróforo (e.g., fluoresceína, rhodamina, etc.), un compuesto (quimio)luminiscente (e.g., dioxetanos, acridinios, fenantridinios, rutenio, luminol, etc.), un elemento radiactivo (azufre, iodo, etc.), etc. En una realización particular, dicho marcador es una peroxidasa. La selección de un marcador particular no es crítica, siempre y cuando sea capaz de producir una señal por sí mismo o conjuntamente con unas o más sustancias adicionales.
El término "metástasis", tal como aquí se utiliza, se refiere al proceso por el que un tumor, en este caso CCR, se extiende a tejidos del organismo distintos al sitio primario de origen del tumor.
El término "muestra biológica", tal como aquí se utiliza, se refiere, pero no se limita, a tejidos y/o fluidos biológicos de un sujeto, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para llevar a cabo cualquiera de los métodos proporcionados por la presente invención; es decir, dicha muestra biológica debe ser una muestra susceptible de contener anticuerpos, e.g., autoanticuerpos frente a las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B así como frente a las proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3, o susceptible de contener los productos de expresión (ARN o proteínas) de los genes que codifican las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B. A modo ilustrativo, no limitativo, dicha muestra biológica puede ser una muestra de sangre, orina, saliva, suero, plasma, un frotis bucal o buco- faríngeo, un espécimen quirúrgico, un espécimen obtenido de una biopsia o autopsia, etc.
El término "nivel", tal como aquí se utiliza, se refiere, en general, a una cantidad cuantificable, semicuantificable, o relativa de un producto, por ejemplo, autoanticuerpos, productos de expresión de los genes, etc., así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con dicho producto de expresión o que pueda derivarse del mismo. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas del producto en cuestión. En general, los niveles de un producto pueden basarse en análisis cuantitativos y/o semicuantitativos; a modo ilustrativo, los métodos cuantitativos pueden utilizarse para determinar una cantidad relativa o absoluta de un producto concreto en la muestra biológica ensayada, y los métodos semicuantitativos se pueden utilizar para establecer el nivel de dicho producto concreto por encima de un valor basal sin necesidad de asignar un valor numérico absoluto o relativo.
A modo ilustrativo, no limitativo, el "nivel de un autoanticuerpo" frente a una proteína (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, así como frente a las proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3), se refiere, pero no se limita, a la cantidad cuantificable, semicuantificable, o relativa de los autoanticuerpos frente a dichas proteínas (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, y proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3), así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con dichos autoanticuerpos o que pueda derivarse de los mismos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de los autoanticuerpos frente a dichas proteínas (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, y proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3) obtenidos bien mediante medida directa, e.g., valores de intensidad de espectroscopia de masas, resonancia magnética nuclear, etc., o bien mediante medida indirecta, e.g., mediante cualquiera de los sistemas de medida descritos en este documento, por ejemplo, mediante la medida obtenida de un componente secundario (e.g., un componente distinto a los autoanticuerpos) o un sistema de medida biológica (e.g., la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática). La determinación del nivel de un autoanticuerpo frente a una proteína (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, así como frente a las proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3), se puede realizar utilizando cualquier método disponible conocido por el experto en la materia, por ejemplo, mediante un inmunoensayo. El nivel de un autoanticuerpo frente a una proteína (e.g., Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, o frente a las proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3), determinado en una muestra biológica procedente del sujeto sometido a estudio se dice que es "mayor" que el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo cuando, de acuerdo con la invención, el nivel de dicho autoanticuerpo en la muestra biológica del sujeto es de, al menos 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más, con respecto al nivel de referencia de dicho autoanticuerpo. Análogamente, el nivel de un autoanticuerpo frente a una proteína (e.g., Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, o frente a las proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3), determinado en una muestra biológica procedente del sujeto sometido a estudio se dice que es "menor" que el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo cuando, de acuerdo con la invención, el nivel de dicho autoanticuerpo en la muestra biológica del sujeto es de, al menos 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, o incluso más, más bajo que el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo.
Asimismo, a modo ilustrativo, no limitativo, el "nivel de expresión de un producto de expresión" de un gen o, en otras palabras, cantidad de producto de expresión de un gen, tal como aquí se utiliza, se refiere a, pero no se limita a, la cantidad cuantificable, semicuantificable, o relativa de un producto de expresión de un gen determinado (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B), así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con dicho producto de expresión o que pueda derivarse del mismo. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas del producto de expresión de dicho gen (e.g., Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 o ACVR2B) obtenidos bien mediante medida directa, o bien mediante medida indirecta. La determinación del nivel de expresión de un producto de expresión de un gen (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B) se puede realizar utilizando cualquier método disponible conocido por el experto en la materia. El nivel de expresión de un producto de expresión de un gen (e.g., Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 o ACVR2B), determinado en una muestra biológica procedente del sujeto sometido a estudio se dice que es "mayor" que el nivel de referencia de dicho producto de expresión de dicho gen cuando, de acuerdo con la invención, el nivel de dicho producto de expresión de dicho gen en la muestra biológica del sujeto es de, al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más, con respecto al nivel de referencia de dicho producto de expresión de dicho gen. Análogamente, el nivel de expresión de un producto de expresión de un gen (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2E), determinado en una muestra biológica procedente del sujeto sometido a estudio se dice que es "menor" que el nivel de referencia de dicho producto de expresión de dicho gen cuando, de acuerdo con la invención, el nivel de dicho producto de expresión en dicha muestra biológica del sujeto es de, al menos 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, o incluso más, más bajo que el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen.
El término "nivel de referencia", tal como aquí se utiliza, se refiere, en general, al nivel de un producto, por ejemplo, autoanticuerpos frente a proteínas (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, así como frente a las proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3), productos de expresión de los genes (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3 , FGFR4, STK4 o ACVR2B, etc.), etc., presentes en sujetos control. En una realización particular, dichos sujetos control son sujetos que no sufren una determinada enfermedad (e.g., CCR), mientras que en otra realización particular, dicho sujeto control es el propio sujeto bajo estudio, lo que resulta particularmente útil para evaluar el seguimiento de una enfermedad (e.g., CCR) o para evaluar la eficacia de un tratamiento frente a dicha enfermedad (e.g., CCR), etc., para lo cual el nivel de referencia de un producto dado puede ser el nivel de dicho producto determinado en una muestra del mismo sujeto bajo estudio pero tomada unos días, semanas, meses o incluso años antes con el fin de evaluar el seguimiento de la enfermedad, o bien tomada un antes de, por ejemplo, la aplicación al sujeto de un tratamiento frente a dicha enfermedad con el fin de evaluar su eficacia.
Debido a la variabilidad que pueda producirse entre los diferentes sujetos en cuanto a la producción de autoanticuerpos frente a proteínas (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, así como frente a las proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3), o en cuanto a la producción de productos de expresión de genes (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, etc.), el nivel de referencia podría obtenerse a partir de un conjunto de muestras procedente de una población de sujetos sanos (e.g., sujetos que no sufren CCR) y calculando el nivel medio del producto en cuestión (autoanticuerpo o producto de expresión de un gen) en dicha población de sujetos sanos.
El nivel de referencia de un determinado producto, por ejemplo, autoanticuerpos frente a proteínas (e.g., Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B, así como frente a las proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3), productos de expresión de los genes (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, etc.), etc., puede ser determinado a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica del sujeto bajo estudio (muestra problema). Generalmente, el nivel de referencia puede derivarse de los límites de distribución normal de una cantidad fisiológica encontrada en una población de sujetos control. Dicha cantidad fisiológica puede ser determinada por varias técnicas bien conocidas, dependiendo de la naturaleza del producto en cuestión (autoanticuerpo, producto de expresión de un gen, etc.), tal como se describe en esta descripción.
Dicho nivel de referencia, de acuerdo con la presente invención, permite discriminar la presencia de CCR y, por tanto, puede ser utilizado en el diagnóstico, pronóstico o seguimiento de la evolución de un CCR.
El término "predicción", tal como aquí se utiliza, se refiere, pero no se limita, a la probabilidad de que un paciente, tal como un paciente que sufre CCR, responda favorable o desfavorablemente a un determinado tratamiento, y a la extensión de dichas respuestas, o de que el paciente sobreviva, tras la eliminación quirúrgica de un tumor primario y/o la quimioterapia por un periodo de tiempo sin que se produzca recurrencia del CCR.
El término "producto de expresión" de un gen (o de una secuencia de ácido nucleico), tal como aquí se utiliza, se refiere al producto resultante de la transcripción (ARN) o de la expresión (proteína) de dicho gen o secuencia de ácido nucleico, así como a cualquier forma resultante del procesamiento del producto resultante de la transcripción o de la expresión de dicho gen o secuencia de ácido nucleico.
El término "pronóstico", tal como aquí se utiliza, se refiere, en general, al conjunto de datos que posee la ciencia médica sobre la probabilidad de que ocurran determinadas situaciones en el transcurso del tiempo o historia natural de una enfermedad; es decir, es la predicción de los sucesos que ocurrirán en el desarrollo de una enfermedad en términos estadísticos. En particular, el término "pronóstico de CCR", tal como aquí se utiliza, se refiere al conjunto de datos que permite asignar una probabilidad de que ocurran determinadas situaciones en el transcurso del CCR. Así, de acuerdo con la presente invención, incluye la capacidad de asignar una probabilidad de que ocurran determinadas situaciones en el transcurso de la enfermedad del CCR, cuando se aplica un método de clasificación de muestras basado bien en la comparación del nivel de auto anticuerpos frente a, al menos, una de las proteínas seleccionada del grupo formado por las proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, o frente a la totalidad o parte de las proteínas mencionadas en las Tablas 2 y 3, con el nivel de referencia para dichos autoanticuerpos, o bien en la comparación del nivel de, al menos, un producto de expresión de un gen seleccionada del grupo formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPK3 , FGFR4, STK4 y ACVR2B, con el nivel de referencia para dicho producto de expresión génica. Esta asignación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es significativamente estadística puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, e.g., mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student, funciones discriminantes de Fisher, etc. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor p es menor de 0,1 , de 0,05, de 0,01 , de 0,005 o de 0,0001.
A modo ilustrativo, no limitativo, el término pronóstico, tal como aquí se utiliza, se refiere a la probabilidad de la muerte debida al CCR o a la progresión del CCR, incluyendo recurrencia o capacidad de diseminación metastásica, así como a la predicción de respuesta a un determinado tratamiento del CCR. La evolución de la enfermedad se puede seguir utilizando cualquier criterio de valoración usado en el campo del cáncer y conocido por el experto en la materia. Los parámetros de valoración útiles para describir la evolución de una enfermedad incluyen, sin limitación: evolución libre de enfermedad, que, tal como aquí se usa, describe la proporción de pacientes en remisión completa que no han tenido recaída de la enfermedad durante el período de tiempo en estudio;
respuesta objetiva, que, tal como aquí se usa, describe la proporción de sujetos de una población tratada en la que se observa una respuesta completa o parcial; tiempo de evolución (TTP, "time to progression "), que es una medida del tiempo después de que la enfermedad se diagnostica o trata hasta que la enfermedad empeora; se considera que la enfermedad ha progresado si los síntomas del cáncer, incluyendo aumento de la masa tumoral, metástasis, aumento de la metástasis, etc., han empeorado con relación a las medidas iniciales;
supervivencia libre de enfermedad (DSF), que, tal como aquí se usa, se define como el tiempo después del tratamiento en el que un paciente sobrevive sin signos de empeoramiento;
- supervivencia sin evolución de 6 meses o tasa "PFS6" que, tal como aquí se usa, se refiere al porcentaje de gente en el que la enfermedad no evoluciona en los primeros 6 meses después del inicio de la terapia;
supervivencia mediana (MS) que, tal como aquí se usa, se refiere al tiempo en el que la mitad de los pacientes inscritos en el estudio están todavía vivos; - supervivencia libre de recaída a distancia (SLRD) que, tal como aquí se usa, se refiere al tiempo transcurrido desde la fecha de la cirugía hasta la recaída a distancia o hasta la última visita; y
supervivencia global (SG) que, tal como aquí se utiliza, se refiere al tiempo transcurrido desde la fecha de la cirugía hasta la última visita o hasta el fallecimiento del sujeto.
El término "pro teína Piml", tal como aquí se utiliza, incluye la proteína Piml de un sujeto, preferentemente, de un ser humano, y variantes de la misma; en una realización particular, dicha proteína Piml es la proteína cuyo número de acceso es NP 002639 y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 1.
El término "proteína SRC", tal como aquí se utiliza, incluye la proteína SRC de un sujeto, preferentemente, de un ser humano, y variantes de la misma; en una realización particular, dicha proteína SRC es la proteína cuyo número de acceso es NP 005408 y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 2.
El término "proteína MAPKAPK3", tal como aquí se utiliza, incluye la proteína MAPKAPK3 de un sujeto, preferentemente, de un ser humano, y variantes de la misma; en una realización particular, dicha proteína SRC es la proteína cuyo número de acceso es NP 004626 y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 3.
El término "proteína FGFR4". tal como aquí se utiliza, incluye la proteína FGFR4 de un sujeto, preferentemente, de un ser humano, y variantes de la misma; en una realización particular, dicha proteína FGFR4 es la proteína cuyo número de acceso es NP 002002 y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 4.
El término "pro teína STK4", tal como aquí se utiliza, incluye la proteína STK4 de un sujeto, preferentemente, de un ser humano, y variantes de la misma; en una realización particular, dicha proteína STK4 es la proteína cuyo número de acceso es NP_006273 y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 5.
El término "pro teína ACVR2B", tal como aquí se utiliza, incluye la proteína
ACVR2B de un sujeto, preferentemente, de un ser humano, y variantes de la misma; en una realización particular, dicha proteína ACVR2B es la proteína cuyo número de acceso es NP OO 1097 y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 6.
El término "seguimiento de la evolución", tal como aquí se utiliza, se refiere, a la supervisión del desarrollo de una enfermedad como, por ejemplo, pero sin limitarse a, la evaluación de la respuesta a un determinado tratamiento frente a dicha enfermedad (e.g., CCR) o la detección de la recurrencia o de la diseminación del CCR.
El término "sujeto", tal como aquí se utiliza, se refiere a un animal, preferentemente un mamífero, y, más preferentemente, un ser humano. Por motivos de claridad, a los sujetos que sufren CCR se les denomina en esta descripción, en ocasiones, "pacientes de CCR" o mediante una expresión similar.
Una proteína es "sustancialmente homologa" a una proteína determinada cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con la secuencia de aminoácidos de dicha proteína determinada, por ejemplo, cuando su grado de identidad respecto a dicha proteína determinada es de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 70%, ventajosamente de, al menos, un 80%, preferiblemente de, al menos, un 85%, más preferiblemente de, al menos un 90%, aún más preferiblemente de, al menos, un 95%, y, todavía más preferiblemente de, al menos, un 99%. A modo ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, una proteína es sustancialmente homologa a la proteína Piml cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 , de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 70%, ventajosamente de, al menos, un 80%, preferiblemente de, al menos, un 85%, más preferiblemente de, al menos un 90%, aún más preferiblemente de, al menos, un 95%, y, todavía más preferiblemente de, al menos, un 99%. Las proteínas sustancialmente homologas a las proteínas SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B pueden definirse de la misma manera pero reemplazando la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 por las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente.
El término "variante", tal como aquí se utiliza, se refiere a una proteína sustancialmente homologa a otra proteína, por ejemplo, a la proteína Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos. El término variante incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones post-traduccionales tales como, por ejemplo, pero sin limitarse a ellas, glicosilación, fosforilación o metilación. Dichas variantes, de acuerdo con la presente invención, son reconocidas por auto anticuerpos frente a la proteína en cuestión.
Método de detección de autoanticuerpos
En un aspecto, la invención se relaciona con un método para la detección de un autoanticuerpo frente a una proteína, en adelante "método de detección de autoanticuerpos de la invención", que comprende
a) poner en contacto una muestra biológica con dicha proteína o con un fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo; y
b) detectar la formación de un complejo autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo;
en donde dicha proteína se selecciona del grupo formado por las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B y combinaciones de las mismas. En general, la muestra biológica será una muestra susceptible de contener anticuerpos, procedente de un sujeto, y puede ser obtenida por métodos convencionales, conocidos por los técnicos en la materia, dependiendo de la naturaleza de la muestra. En una realización particular, dicha muestra biológica es una muestra de sangre, suero o plasma, que puede obtenerse por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante una extracción de sangre, etc. La sangre es normalmente el fluido biológico óptimo a utilizar en métodos no invasivos para el screening masivo con fines diagnósticos de grandes poblaciones de sujetos. Por un lado, el suero y el plasma son fáciles de obtener, y, por otro lado, la circulación sanguínea facilita el contacto de la sangre con todos los tejidos del cuerpo humano, incluyendo en el caso de pacientes con cáncer el contacto con tejido tumoral y sus antígenos representativos.
El método de detección de auto anticuerpos de la invención, en general, se puede realizar mediante un inmunoensayo; ejemplos ilustrativos, no limitativos, de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica incluyen el inmunoblot, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), el inmunoensayo lineal (LIA) , el radioinmunoensayo (RIA), la inmunofluorescencia (IF), la inmunohistoquímica (IHQ), los microarrays de proteínas, etc.
En la etapa a) del método de detección de autoanticuerpos de la invención se pone en contacto una muestra biológica en la que se desea analizar la presencia de autoanticuerpos frente a las proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B, con dichas proteínas o con fragmentos de las mismas susceptibles de ser reconocidos por dichos autoanticuerpos, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho auto anticuerpo. Si la muestra biológica contiene autoanticuerpos frente a dichas proteínas, entonces se formará dicho complejo autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo; en caso contrario, no se formará dicho complejo. Las condiciones adecuadas para que tenga lugar la formación del complejo autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo son conocidas por los expertos en la materia.
Aunque dichas proteínas (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B) podrían estar juntas en un mismo medio, en la práctica, resulta ventajoso que dichas proteínas estén separadas entre sí. Dichas proteínas pueden estar en solución o suspensión en un medio apropiado, o, alternativamente, pueden estar depositadas o soportadas sobre un soporte (e.g., una placa de microtitulación, perlas (magnéticas o no magnéticas), columnas, matrices, membranas, etc. Estos materiales se pueden utilizar en las formas convenientes, tales como películas, hojas, placas, etc., o pueden utilizarse para recubrir portadores inertes (e.g., papel, cristal, películas de plástico, etc.). En una realización particular, dicha muestra biológica se pone en contacto con dichas proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B, o con fragmentos de las mismas susceptibles de ser reconocidos por dichos autoanticuerpos, separadas entre sí, y depositadas sobre un soporte adecuado.
En una realización particular, se identifican los autoanticuerpos frente a dichas proteínas de forma independiente, mientras que, en otra realización particular, se identifican los autoanticuerpos frente a dichas proteínas de forma simultánea.
En una realización particular, la muestra biológica a estudiar se pone en contacto con una única proteína seleccionada entre las proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, o con un fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo, con el fin de identificar autoanticuerpos frente a dicha proteína. En otra realización particular, dicha muestra biológica se pone en contacto con dos o más de dichas proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, o fragmentos de las mismas susceptibles de ser reconocidos por dichos autoanticuerpos, separadas entre sí, opcionalmente depositadas sobre un soporte adecuado, con el fin de identificar autoanticuerpos frente a dichas proteínas.
La etapa b) del método de detección de autoanticuerpos de la invención comprende detectar la formación de un complejo autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo. Esta etapa puede llevarse a cabo por métodos convencionales, conocidos por los técnicos en la materia, para la detección de la formación de complejos de anticuerpo-antígeno (en este caso, autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo).
En una realización particular, a modo ilustrativo, no limitativo, para la detección de dicho complejo, puede añadirse un conjugado que comprende un anticuerpo que reconoce al autoanticuerpo y un marcador (anticuerpo secundario marcado) bajo condiciones que permiten la formación de un complejo (autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo)-anticuerpo/marcador y detectar la formación de dicho complejo. Si la muestra biológica contiene autoanticuerpos frente a una o más de dichas proteínas (Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B) entonces se habrá formado previamente el complejo autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho auto anticuerpo, con lo que, cuando se pone en contacto dicho complejo con dicho conjugado que comprende el anticuerpo y el marcador, en las condiciones adecuadas, se forma el complejo (autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo)- anticuerpo/marcador, que será visualizado mediante la técnica apropiada dependiendo del marcador utilizado, tal como se menciona más adelante; mientras que, en caso contrario, es decir, cuando la muestra biológica no contiene autoanticuerpos frente a dicha(s) proteína(s) entonces no se formará dicho complejo (autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo)-anticuerpo/marcador. Las condiciones adecuadas para que tenga lugar la formación de este último complejo son conocidas por los expertos en la materia.
Prácticamente cualquier reactivo indicador que permita detectar dicho complejo (autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo)-anticuerpo/marcador puede ser utilizado en la puesta en práctica de la presente invención; a modo ilustrativo, no limitativo, dicho marcador puede ser una enzima que cataliza una reacción detectable (e.g., peroxidasa, glicosidasa, fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, β-galactosidasa, β-glucosidasa, β-glucuronidasa, etc.), un compuesto que genera una señal cuando forma parte de dicho complejo (e.g., un compuesto fluorescente o fluoróforo, tal como fluoresceína, rhodamina, etc.; un compuesto (quimio)luminiscente, tal como un dioxetano, un acridinio, un fenantridinio, rutenio, luminol, etc.), etc., un elemento radiactivo (e.g., azufre, iodo, etc.), etc. En una realización particular, dicho marcador es una peroxidasa. La selección de un marcador particular no es crítica, siempre y cuando sea capaz de producir una señal por sí mismo o conjuntamente con unas o más sustancias adicionales. De este modo, el complejo (autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo)- anticuerpo/marcador formado puede ser detectado o visualizado por cualquier técnica apropiada, dependiendo del marcador elegido, conocida por los técnicos en la materia, utilizando los dispositivos apropiados, por ejemplo, mediante técnicas basadas en métodos colorimétricos, fluorimétricos, (quimio)luminiscentes, radiactivos, etc., todas ellas conocidas por los técnicos en la materia.
El conjugado que comprende dicho anticuerpo que reconoce a dicho auto anticuerpo y dicho marcador puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia.
A modo ilustrativo, cuando el marcador es una enzima, la detección del complejo en cuestión puede llevarse a cabo poniendo en contacto dicho complejo con un sustrato apropiado y, opcionalmente, con los activadores y/o agentes de amplificación enzimáticos apropiados. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos sustratos incluyen:
• Para la fosfatasa alcalina:
Cromogénico: sustratos basados en p-nitrofenil fosfato (p-NPP), 5-bromo-4- cloro-3-indolil fosfato/nitroblue tetrazolium (BCIP/NPT), etc.
Fluorogénico: fosfato de 4-metilumbelifenilo (4-MUP), 2-(5'-cloro-2'- fosforiloxifenil)-6-cloro-4-(3H)-quinazolinona (CPPCQ), 3,6-fluoresceín- difosfato (3,6-FDP), etc.
• Para pero xidasas:
Cromogénico: sustratos basados en ácido 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6- sulfónico) (ABTS), o-fenilendiamina (OPT), 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), o-dianisidina, ácido 5-aminosalicílico, ácido 3-dimetilaminobenzoico
(DMAB) y 3-metil-2-benzotiazolinhidrazone (MBTH), 3-amino-9- etilcarbazol (AEC) y tetracloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB), etc.
Fluorogénico: ácido 4-hidroxi-3-metoxifenilacético, fenoxazinas reducidas y benzotiazinas reducidas, incluyendo el reactivo Amplex® Red, Amplex UltraRed, dihidroxantenos reducidos, etc.
• Para glicosidasas:
Cromogénico: sustratos basados en o-nitrofenil-β-D-galactósido (o-NPG), p- nitrofenil-β-D-galactósido y 4-metilumbelifenil-β-D-galactósido (MUG) para β-D-galactosidasa, etc. Fluorogénico: resorufin β-D-galactopiranósido, fluoresceín digalactósido (FD G) , fluore s ce ín dig lucuró nido , 4-metilumbeliferyl beta-D- galactopiranósido, carboxiumbeliferil beta-D-galactopiranósido, cumarin beta-D- galactopiranósidos fiuorados, etc.
En una realización particular, dicho marcador es una peroxidasa, tal como una peroxidasa y el sustrato cromogénico es TMB.
Por tanto, mediante la puesta en práctica del método de detección de autoanticuerpos de la invención, es posible detectar y obtener un autoanticuerpo seleccionado del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml , un autoanticuerpo frente a la pro teína SRC, un autoanticuerpo frente a la pro teína MAPKAPK3, un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, y combinaciones de dichos autoanticuerpos. En una realización particular, los autoanticuerpos identificados mediante el método de detección de autoanticuerpos de la invención son específicos, es decir, reconocen a la proteína en cuestión (o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo) con una preferencia frente a otras proteínas o fragmentos de 2 ó más veces, más de 3 veces, más de 10 veces, más de 20 veces, más de 100 veces, o incluso un mayor número de veces.
Opcionalmente, si se desea, se puede aislar el complejo autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo formado, por ejemplo, mediante el empleo de técnicas de inmunoprecipitación, etc., y, posteriormente, secuenciar la secuencia del autoanticuerpo responsable de la unión a la proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo, mediante el empleo de métodos de proteómica estándar descritos en la técnica, tales como la determinación de la huella peptídica o el análisis MS/MS (Vikas Dhingraa, et al. 2005. International Journal of Pharmaceutics 299 (1-2): pp.1-18.; Hanash SM et al. Nature. 2008 Apr 3;452(7187):571-
9).
El método para la detección de autoanticuerpos de la invención también puede ser utilizado para determinar el nivel o cantidad (cuantificar) de autoanticuerpos frente a dichas proteínas (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B) presentes en la muestra biológica bajo estudio ya que, con muchos marcadores, e.g., enzimas, la cantidad de autoanticuerpo presente en la muestra biológica es proporcional a la señal generada. La detección del complejo autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo es indicativa de la presencia de autoanticuerpos específicos frente a dicha(s) proteína(s) en la muestra biológica y, además, si se desea, se puede cuantificar la cantidad de autoanticuerpos frente a dichas proteínas presentes en dicha muestra biológica. Dicha información, dentro del contexto de la presente invención, puede ser utilizada en el diagnóstico, pronóstico o seguimiento de la evolución de enfermedades, en particular, el cáncer colorrectal (CCR), en un sujeto.
Métodos de obtención de datos
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de obtención de datos en una muestra biológica de un sujeto, en adelante "método de obtención de datos 1 de la invención", que comprende detectar, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína, en donde dicho autoanticuerpo se selecciona del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml, un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, y, si se desea, determinar el nivel de dicho autoanticuerpo en dicha muestra biológica.
Mediante el método de obtención de datos 1 de la invención se puede detectar e identificar, y, si se desea cuantificar el nivel de, uno o más de los autoanticuerpos arriba mencionados.
La detección de dichos autoanticuerpos puede llevarse a cabo por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia; en una realización particular, la detección de dichos autoanticuerpos se lleva a cabo mediante un inmunoensayo (e.g., inmunoblot, ELISA, LIA, RIA, IF, IHQ, microarrays de proteínas, etc.), tal como un inmunoensayo adecuado para detectar e identificar dichos autoanticuerpos frente a las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B, por ejemplo, como se ha descrito en relación con el método de detección de autoanticuerpos de la invención. En una realización particular, dicho inmunoensayo es un microarray de proteínas o un ELISA.
Un microarray de proteínas consiste en una colección de proteínas inmovilizadas sobre un soporte sólido en una disposición regular y prefijada. Existen varios factores importantes a tener en cuenta en el diseño de microarrays de proteínas, entre los que se encuentran, por ejemplo, la naturaleza del soporte sobre el que inmovilizar las proteínas (o fragmentos apropiados de las mismas), la técnica de inmovilización de las proteínas, el formato del microarray, el agente de captura empleado o el método de detección a emplear. Son conocidos en el estado de la técnica diferentes formatos, soportes y técnicas que pueden ser empleados para la realización de este aspecto inventivo.
En una realización particular, la detección de autoanticuerpos frente a Piml, SRC, MAPKAP K3, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B, mediante microarrays de proteínas comprende los siguientes pasos: (a) recubrir un soporte sólido con una o más proteínas, preferentemente separadas entre sí, seleccionadas del grupo formado por las proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, o con fragmentos de las mismas susceptibles de ser reconocidos por los autoanticuerpos frente a las proteínas correspondientes; (b) incubar el soporte recubierto del paso (a) con una muestra biológica procedente de un sujeto bajo condiciones que permitan la formación de un inmunocomplejo del autoanticuerpo frente a la proteína Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B presente en dicha muestra con los determinantes antigénicos correspondientes presentes en dichas proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, o en sus fragmentos susceptibles de ser reconocidos por dichos autoanticuerpos; y (c) añadir un anticuerpo secundario, que reconoce al autoanticuerpo frente a la proteína Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, conjugado o unido a un compuesto marcador.
El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno de la muestra biológica o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sandwich.
En otra realización particular, la detección de autoanticuerpos frente a Piml, SRC,
MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B, se lleva a cabo mediante un ELISA, preferentemente, mediante un ELISA indirecto, que comprende los siguientes pasos: (a) recubrir un soporte sólido con una o más proteínas, preferentemente separadas entre sí, seleccionadas del grupo formado por las proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, o con fragmentos de las mismas susceptibles de ser reconocidos por los autoanticuerpos frente a las proteínas correspondientes; (b) incubar el soporte recubierto del paso (a) con una muestra biológica procedente de un sujeto bajo condiciones que permitan la formación de un inmunocomplejo del autoanticuerpo frente a la proteína Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B presente en dicha muestra biológica con los determinantes antigénicos correspondientes presentes en dichas proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, o en sus fragmentos susceptibles de ser reconocidos por dichos autoanticuerpos; y (c) añadir un anticuerpo secundario, que reconoce al autoanticuerpo frente a la proteína Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, conjugado o unido a un marcador.
Dicho marcador, tal como se ha mencionado previamente, es un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección, identificación y, opcionalmente, cuantificación de la cantidad del autoanticuerpo frente a la proteína Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B. presente en la muestra analizada. En una realización particular, dicho compuesto marcador se selecciona del grupo formado por radioisótopos, enzimas, fluoróforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantifícada de forma directa. Este compuesto marcador puede unirse al autoanticuerpo directamente, o a través de otro compuesto. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos compuestos marcadores que se unen directamente al autoanticuerpo incluyen enzimas, tales como la fosfatasa alcalina, la peroxidasa, etc., isótopos radiactivos, tales como el 32P, el 35S, etc., fluorocromos, tales como fluoresceína, etc., o partículas metálicas, para su detección directa mediante colorimetría, auto-radiografía, fluorimetría, o metalografía, respectivamente.
En una realización particular, el método de obtención de datos 1 de la invención comprende, además de detectar, al menos, un autoanticuerpo seleccionado del grupo de autoanticuerpos formado por autoanticuerpos frente a la proteína Piml, un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, la etapa de determinar el nivel o cantidad (cuantificar) de dicho autoanticuerpo en dicha muestra biológica bajo estudio ya que, con muchos marcadores, e.g., enzimas, la cantidad de autoanticuerpo presente en la muestra biológica es proporcional a la señal generada. En ese caso, la señal obtenida usando los diferentes métodos arriba expuestos para detectar los autoanticuerpos puede ser analizada y cuantifícada por métodos convencionales que permiten la cuantifícación de dicha señal.
El método para la detección de autoanticuerpos de la invención también puede ser utilizado para determinar la cantidad (cuantificar) de autoanticuerpos frente a dichas proteínas (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B) presentes en la muestra biológica bajo estudio ya que, con muchos marcadores, e.g., enzimas, la cantidad de autoanticuerpo presente en la muestra biológica es proporcional a la señal generada.
La detección del complejo autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo es indicativa de la presencia de autoanticuerpos específicos frente a dicha(s) proteína(s) en la muestra biológica y, además, si se desea, se puede cuantificar la cantidad de autoanticuerpos frente a dichas proteínas presentes en dicha muestra biológica. Dicha información, dentro del contexto de la presente invención, puede ser utilizada en el diagnóstico, pronóstico o seguimiento de la evolución de enfermedades, en particular, el cáncer colorrectal (CCR), en un sujeto.
En una realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifíca únicamente el nivel de autoanticuerpos frente a una sola proteína, por ejemplo, frente a la proteína
Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B. En otra realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifíca el nivel de autoanticuerpos frente a dos o más proteínas del grupo formado por las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y
ACVR2B. A modo ilustrativo, pueden detectarse y, si desea cuantificar, combinaciones de
2, 3, 4, 5 ó 6 autoanticuerpos frente a las proteínas seleccionadas del grupo formado por las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B. Así, a modo ilustrativo, se puede detectar y, opcionalmente, cuantificar el nivel de, autoanticuerpos frente a las combinaciones de dichas proteínas mencionadas en la Lista de Combinaciones siguiente:
Lista de Combinaciones (proteínas)
Piml, SRC
Piml, MAPKAPK3
Piml, FGFR4
Piml, STK4
Piml, ACVR2B SRC, MAPKAPK3
SRC, FGFR4
SRC, STK4
SRC, ACVR2B
MAPKAPK3, FGFR4
MAPKAPK3, STK4
MAPKAPK3, ACVR2B
FGFR4, STK4
FGFR4, ACVR2B
STK4 , ACVR2B
Piml, SRC, MAPKAPK3
Piml, SRC, FGFR4
Piml, SRC, STK4
Piml, SRC, ACVR2B
Piml , MAPKAPK3, FGFR4
Piml, MAPKAPK3, STK4
Piml, MAPKAPK3, ACVR2B
Piml, FGFR4, STK4
Piml, FGFR4, ACVR2B
Piml, STK4, ACVR2B
SRC, MAPKAPK3, FGFR4
SRC, MAPKAPK3, STK4
SRC, MAPKAPK3, ACVR2B
SRC, FGFR4, STK4
SRC, FGFR4, ACVR2B
SRC, STK4 , ACVR2B
MAPKAPK3, FGFR4, STK4
MAPKAPK3, FGFR4, ACVR2B
MAPKAPK3, STK4, ACVR2B FGFR4, STK4, ACVR2B
Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4 Piml, SRC, MAPKAPK3, STK4
Piml, SRC, MAPKAPK3, ACVR2B
Piml, SRC, FGFR4, STK4
Piml, SRC, FGFR4, ACVR2B
Piml , SRC, STK4, ACVR2B
Piml, MAPKAPK3, FGFR4, STK4
Piml, MAPKAPK3, FGFR4, ACVR2B
Piml, MAPKAPK3, STK4, ACVR2B
Piml, FGFR4, STK4, ACVR2B
SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4
SRC, MAPKAPK3, FGFR4, ACVR2B
SRC, MAPKAPK3, STK4, ACVR2B
SRC, FGFR4, STK4, ACVR2B
MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B
Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4
Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, ACVR2B
Piml, SRC, MAPKAPK3, STK4, ACVR2B
Piml, SRC, FGFR4, STK4, ACVR2B
Piml, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B
SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B
Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B
En una realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifíca el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína Piml ; en otra realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifíca el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína Piml , y, además, el nivel de autoanticuerpos frente a una o más de las siguientes proteínas SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B, según las combinaciones previamente mencionadas. Adicionalmente, si se desea, se puede detectar y, opcionalmente, determinar el nivel de autoanticuerpos frente a otras proteínas, por ejemplo, frente a proteínas potencialmente útiles en el diagnóstico de CCR, tales como CEA, etc.
En otra realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifíca el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína SRC; en otra realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifica el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína SRC, y, además, el nivel de autoanticuerpos frente a una o más de las siguientes proteínas Piml, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B, según las combinaciones previamente mencionadas. Adicionalmente, si se desea, se puede detectar y, opcionalmente, determinar el nivel de autoanticuerpos frente a otras proteínas, por ejemplo, frente a proteínas potencialmente útiles en el diagnóstico de CCR, tales como CEA, etc.
En una realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifica el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína MAPKAPK3; en otra realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifica el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína MAPKAPK3, y, además, el nivel de autoanticuerpos frente a una o más de las siguientes proteínas Piml, SRC, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B, según las combinaciones previamente mencionadas. Adicionalmente, si se desea, se puede detectar y, opcionalmente, determinar el nivel de autoanticuerpos frente a otras proteínas, por ejemplo, frente a proteínas potencialmente útiles en el diagnóstico de CCR, tales como CEA, etc.
En una realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifica el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína FGFR4; en otra realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifica el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína FGFR4, y, además, el nivel de autoanticuerpos frente a una o más de las siguientes proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3 , STK4 y/o ACVR2B, según las combinaciones previamente mencionadas. Adicionalmente, si se desea, se puede detectar y, opcionalmente, determinar el nivel de autoanticuerpos frente a otras proteínas, por ejemplo, frente a proteínas potencialmente útiles en el diagnóstico de CCR, tales como CEA, etc.
En una realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifica el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína STK4; en otra realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifica el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína STK4, y, además, el nivel de autoanticuerpos frente a una o más de las siguientes proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, y/o ACVR2B, según las combinaciones previamente mencionadas. Adicionalmente, si se desea, se puede detectar y, opcionalmente, determinar el nivel de autoanticuerpos frente a otras proteínas, por ejemplo, frente a proteínas potencialmente útiles en el diagnóstico de CCR, tales como CEA, etc. En una realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifíca el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B; en otra realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifíca el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B, y, además, el nivel de autoanticuerpos frente a una o más de las siguientes proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4 y/o STK4, según las combinaciones previamente mencionadas. Adicionalmente, si se desea, se puede detectar y, opcionalmente, determinar el nivel de autoanticuerpos frente a otras proteínas, por ejemplo, frente a proteínas potencialmente útiles en el diagnóstico de CCR, tales como CEA, etc.
En una realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifíca el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína Piml , el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína
MAPKAPK3 o el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B, preferentemente, el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína MAPKAPK3 o el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B.
En otra realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifíca el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína MAPKAPK3 y el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B, y, opcionalmente, el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína FGFR4.
En otra realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifíca el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína Piml , el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína MAPKAPK3 y el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B, y, opcionalmente, el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína FGFR4.
Los datos obtenidos de acuerdo con el método de obtención de datos 1 de la invención, relativos a la detección y, opcionalmente, cuantificación de autoanticuerpos frente a una o más de las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B, dentro del contexto de la presente invención, pueden ser utilizados en el diagnóstico, pronóstico o seguimiento de la evolución de enfermedades, en particular, el cáncer colorrectal (CCR), en un sujeto.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de obtención de datos en una muestra biológica de un sujeto, en adelante "método de obtención de datos 2 de la invención", que comprende detectar, al menos, un producto de expresión de un gen, en donde dicho gen se selecciona del grupo formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, y, si se desea, cuantifícar el nivel de expresión de dicho producto de expresión de dicho gen en dicha muestra biológica.
Mediante el método de obtención de datos 2 de la invención se puede detectar e identificar, y, si se desea cuantifícar el nivel de, un producto de expresión de uno o más de los genes arriba mencionados, permitiendo de este modo la posibilidad de establecer la presencia o ausencia, de un producto de expresión de uno o más de los genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B, y, en su caso, si se desea, cuantifícar el nivel de expresión de dicho producto de expresión.
En una realización particular, la muestra biológica utilizada para la puesta en práctica del método de obtención de datos 2 de la invención es una muestra biológica que comprende células tumorales, preferentemente, células tumorales de CCR. A modo ilustrativo, no limitativo, dicha muestra biológica que comprende células tumorales puede ser una muestra de un fluido biológico o, preferentemente, una muestra de un tejido, e.g., una biopsia tumoral, un aspirado por aguja fina, etc. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, fresca, congelada, fijada o embebida en parafina.
En una realización particular, dicha muestra biológica es una biopsia tumoral que comprende células tumorales de CCR procedente de un paciente que sufre CCR o una biopsia de tejido de colon o recto procedente de un sujeto bajo estudio con el fin, por ejemplo, de evaluar si padece o no CCR.
Los métodos para la detección y cuantifícación de un producto de expresión de un gen son ampliamente conocidos por un experto en la materia e incluyen numerosas alternativas. Prácticamente cualquier método que permita la detección, y, si se desea, su cuantifícación, de un producto de expresión de un gen seleccionado del grupo de genes formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 y ACVR2B, puede ser utilizado en la puesta en práctica del método de obtención de datos 2 de la invención.
Así, en una realización particular, la detección del producto de expresión de un gen determinado (e.g., Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 o ACVR2B) se lleva a cabo analizando el nivel de ARNm derivado de su transcripción; en este caso, el análisis del nivel de ARNm se puede realizar, a modo ilustrativo, no limitativo, mediante un proceso de amplificación enzimática, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT- PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. Adicionalmente, este método de obtención de datos 2 de la invención puede incluir la realización de una etapa de extracción con el fin de obtener el ARN total, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales (Chomczynski y cois., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15:532). Información adicional sobre métodos para detectar y cuantificar los niveles de expresión de un producto de expresión de un gen puede encontrarse, por ejemplo, en Sambrook y cois., 2001 "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3rd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., VoI. 1-3. En una realización particular del método de obtención de datos 2 de la invención, la cuantificación de los niveles de expresión de los genes arriba identificados (Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 o ACVR2B) se lleva a cabo mediante una PCR cuantitativa multiplex o mediante un array de ADN o ARN.
En otra realización particular, la detección, y, opcionalmente, cuantificación del nivel de expresión de dicho producto de expresión de los genes Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B en la muestra a analizar se realiza analizando el nivel de las proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, o fragmentos de las mismas; en este caso, el análisis del nivel de dichas proteínas se puede realizar, a modo ilustrativo, no limitativo, mediante un inmunoensayo, mediante resonancia magnética nuclear o mediante cualquier otra técnica apropiada conocida en el estado de la técnica. En una realización preferida, la determinación de la cantidad de las proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, o de sus fragmentos, se realiza mediante un inmunoensayo. En una realización particular y preferida, dicho inmunoensayo es un inmunoblot (Western blot o inmunodetección en membrana). Para ello, brevemente, se obtiene un extracto de proteínas a partir de una muestra biológica aislada de un sujeto y se separan las proteínas mediante electro foresis en un medio de soporte capaz de retenerlas. Una vez separadas las proteínas se transfieren a un soporte diferente o membrana donde pueden ser detectadas mediante el uso de anticuerpos específicos que reconocen a las proteínas en cuestión (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B) o a los fragmentos funcionalmente equivalentes de las mismas. Dicha membrana se híbrida con un primer anticuerpo específico (o anticuerpo primario) que reconoce a la proteína en cuestión (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B) o a un fragmento funcionalmente equivalente de la misma. A continuación, la membrana se híbrida con un segundo anticuerpo (o anticuerpo secundario) capaz de reconocer de manera específica al anticuerpo primario y que se encuentra conjugado o unido con un compuesto marcador. En una realización alternativa, es el anticuerpo que reconoce a la proteína Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, o al fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, el que está conjugado o unido a un compuesto marcador, y no es necesario el uso de un anticuerpo secundario. Se conocen diferentes formatos, soportes y técnicas que pueden ser empleados para la realización de este aspecto preferido del método de obtención de datos 2 de la invención.
En otra realización particular y preferida, el inmunoensayo comprende un ensayo inmunohistoquímico. Las técnicas de inmunohistoquímica permiten la identificación, sobre muestras tisulares o citológicas, de determinantes antigénicos característicos. El análisis mediante inmunohistoquímica (IHQ) se realiza sobre cortes de tejido, ya sea congelado o incluido en parafina, procedente de una muestra biológica aislada de un sujeto. Estos cortes se hibridan con un anticuerpo específico o anticuerpo primario que reconoce a anticuerpos específicos que reconocen a las proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, o a fragmentos funcionalmente equivalentes de las mismas. A continuación, los cortes se hibridan con un anticuerpo secundario capaz de reconocer de manera específica el anticuerpo primario y que se encuentra conjugado o unido con un compuesto marcador. En una realización alternativa, es el anticuerpo que reconoce a la proteína Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, o al fragmento funcionalmente equivalente de las mismas el que está conjugado o unido a un compuesto marcador, y no es necesario el uso de un anticuerpo secundario.
En una realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifica el nivel de expresión de un producto de expresión de un único gen seleccionado del grupo de genes formados por Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 y ACVR2B. En otra realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifica el nivel de un producto de expresión de dos o más genes del grupo formado por los genes Piml , SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 y ACVR2B. A modo ilustrativo, pueden detectarse y, si desea cuantificar, productos de expresión de 2, 3, 4, 5 ó 6 de dichos genes.
En una realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifica el nivel de un producto de expresión del gen Piml, el nivel de un producto de expresión del gen
MAPKAPKS o el nivel de un producto de expresión del gen ACVR2B, preferentemente, el nivel de un producto de expresión del gen MAPKAPKS o el nivel de un producto de expresión del gen ACVR2B.
En otra realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifica el nivel de un producto de expresión del gen MAPKAPKS y el nivel de un producto de expresión del gen ACVR2B, y, opcionalmente el nivel de un producto de expresión del gen FGFR4.
En otra realización particular, se detecta y, opcionalmente, se cuantifica el nivel de un producto de expresión del gen Piml, el nivel de un producto de expresión del gen MAPKAPKS y el nivel de un producto de expresión del gen ACVR2B, y, opcionalmente el nivel de un producto de expresión del gen FGFR4.
Los datos obtenidos de acuerdo con el método de obtención de datos 2 de la invención, relativos a la detección y, opcionalmente, cuantificación de productos de expresión de uno o más de los genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B, dentro del contexto de la presente invención, pueden ser utilizados en el diagnóstico, pronóstico o seguimiento de la evolución de enfermedades, en particular, el cáncer colorrectal (CCR), en un sujeto.
Métodos de diagnóstico
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para diagnosticar si un sujeto sufre cáncer colorrectal (CCR), en adelante "método de diagnóstico 1 de la invención", que comprende comparar el nivel de, al menos, un auto anticuerpo frente a una proteína, en donde dicho autoanticuerpo se selecciona del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml, un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, en una muestra biológica de dicho sujeto, con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, en donde si el nivel de dicho autoanticuerpo frente a la proteína Piml, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína SRC, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína STK4, en dicha muestra, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos autoanticuerpos, y/o si el nivel del autoanticuerpo frente a ACVR2B en dicha muestra es menor que el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, entonces dicho sujeto es diagnosticado de CCR.
El método de diagnóstico 1 de la invención comprende, previamente, determinar el nivel de, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína, en donde dicho autoanticuerpo se selecciona del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml , un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la proteína MAP KAP K3, un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, en una muestra biológica del sujeto en cuestión. En una realización particular, dicha muestra biológica es una muestra de sangre, plasma o suero de dicho sujeto. El nivel de dichos autoanticuerpos puede ser determinado tal como se ha indicado previamente en relación con el método de detección de autoanticuerpos de la invención o con el método de obtención de datos 1 de la invención.
Una vez determinado el nivel de uno o más de los autoanticuerpos frente a las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, y/o ACVR2B, en dicha muestra biológica, el método de diagnóstico 1 de la invención comprende comparar el nivel de dicho autoanticuerpo (o autoanticuerpos) con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo (o con los niveles de referencia para los autoanticuerpos en cuestión), en donde si el nivel de dicho autoanticuerpo frente a la proteína Piml , o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína SRC, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína STK4, en dicha muestra, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos autoanticuerpos, y/o si el nivel del autoanticuerpo frente a ACVR2B en dicha muestra es menor que el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, entonces dicho sujeto es diagnosticado de CCR.
En una realización particular de la invención, dicho nivel de referencia es el nivel o cantidad de autoanticuerpos frente a dichas proteínas (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, y ACVR2B) en una muestra control, tal como por ejemplo, una muestra de sangre, suero o plasma, de una población de sujetos control (es decir, que no sufren CCR). En general, se considerará que el nivel de un autoanticuerpo frente a una proteína (e.g., Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4 o STK4) en la muestra biológica del sujeto bajo estudio es "mayor" que el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo cuando el nivel de dicho autoanticuerpo en la muestra biológica del sujeto es de, al menos 1 ,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más, el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo. Análogamente, en general, se considerará que el nivel de un autoanticuerpo frente a una proteína (e.g., ACVR2B) en la muestra biológica del sujeto bajo estudio es "menor" que el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo cuando el nivel de dicho autoanticuerpo en la muestra biológica del sujeto es de, al menos 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, o incluso más, más bajo que el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo.
En una realización particular, se cuantifica el nivel de autoanticuerpos frente a una sola proteína, por ejemplo, frente a la proteína Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B en la muestra del sujeto a analizar y se compara con el nivel de referencia de autoanticuerpos frente a dicha proteína.
En otra realización particular, se cuantifica el nivel de autoanticuerpos frente a dos o más proteínas del grupo formado por las proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B en la muestra del sujeto a analizar y se comparan los niveles obtenidos con los niveles de referencia de los autoanticuerpos frente a las proteínas correspondientes. A modo ilustrativo, pueden cuantifϊcarse los autoanticuerpos frente a 2, 3, 4, 5 y 6 proteínas seleccionadas del grupo formado por las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, tal como se menciona en Lista de Combinaciones previamente mencionada.
Así, en una realización particular, se cuantifíca y compara con su nivel de referencia el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína Piml , el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína MAPKAPK3 o el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B, preferentemente, el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína MAPKAPK3 o el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B.
En otra realización particular, se cuantifíca y compara con su nivel de referencia el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína MAPKAPK3 y el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B, y, opcionalmente, el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína FGFR4.
En otra realización particular, se cuantifíca y compara con su nivel de referencia el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína Piml, el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína MAPKAPK3 y el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B, y, opcionalmente, el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína FGFR4.
El método de diagnóstico 1 de la invención permite diagnosticar si un sujeto sufre CCR con un elevado grado de fíabilidad ya que permite detectar correctamente dicha enfermedad (CCR) en al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, o al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada. Dicho método puede ser usado en cualquier estadio del CCR. En una realización particular, el sujeto es un paciente que sufre CCR en estadios iniciales, tales como estadios 0, 1 y II.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para diagnosticar si un sujeto sufre cáncer colorrectal (CCR), en adelante "método de diagnóstico 2 de la invención", que comprende comparar el nivel de expresión de, al menos, un producto de expresión de un gen, en donde dicho gen se selecciona del grupo formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, en una muestra de dicho sujeto, con el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen, en donde si el nivel de dicho producto de expresión del gen Piml, o de dicho producto de expresión del gen 57? C, o de dicho producto de expresión del gen MAPKAPK3, o de dicho producto de expresión del gen FGFR4, o de dicho producto de expresión del gen STK4, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos productos de expresión de dichos genes y/o si el nivel del producto de expresión del gen ACVR2B es menor que el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen, dicho sujeto es diagnosticado de CCR.
El método de diagnóstico 2 de la invención comprende, previamente, determinar el nivel de expresión de, al menos, un producto de expresión (e.g., ARN o proteína) de un gen seleccionado del grupo formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 y ACVR2B, en una muestra biológica del sujeto en cuestión. En una realización particular, dicha muestra biológica es una muestra de tejido de colon o recto, o de tejido tumoral (en su caso), sangre, plasma o suero de dicho sujeto. El nivel de dicho producto de expresión puede ser determinado, en función de su naturaleza (ARN o pro teína) tal como se ha indicado previamente en relación con el método de obtención de datos 2 de la invención.
Una vez determinado el nivel de expresión de uno o más de los productos de expresión de los genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 y ACVR2B, en dicha muestra biológica, el método de diagnóstico 2 de la invención comprende comparar el nivel de dicho producto de expresión (o productos de expresión) con el nivel de referencia para dicho producto de expresión (o con los niveles de referencia para los productos de expresión en cuestión), en donde si el nivel de dicho producto de expresión del gen Piml, o de dicho producto de expresión del gen SRC, o de dicho producto de expresión del gen MAPKAPKS , o de dicho producto de expresión del gen FGFR4, o de dicho producto de expresión del gen STK4, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos productos de expresión de dichos genes y/o si el nivel del producto de expresión del gen ACVR2B es menor que el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen, entonces dicho sujeto es diagnosticado de CCR.
En una realización particular de la invención, dicho nivel de referencia es el nivel o cantidad de producto de expresión de dicho gen (Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4, y ACVR2B) en una muestra biológica, preferentemente de colon, de una población de sujetos control (es decir, sujetos que no sufren CCR). En general, se considerará que el nivel de un producto de expresión de un gen (e.g., Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4 o STK4) en la muestra del sujeto bajo estudio es "mayor" que el nivel de referencia de dicho producto de expresión cuando la relación entre el nivel del producto de expresión del gen en cuestión determinado en la muestra biológica del sujeto es de, al menos, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más, el nivel de referencia de dicho producto de expresión de dicho gen. Análogamente, en general, se considerará que el nivel de un producto de expresión de un gen un gen (e.g., ACVR2B) en la muestra biológica del sujeto bajo estudio es "menor" que el nivel de referencia de dicho producto de expresión de dicho gen cuando el nivel de dicho auto anticuerpo en la muestra biológica del sujeto es de, al menos 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, o incluso más, más bajo que el nivel de referencia de dicho producto de expresión de dicho gen.
En una realización particular, se cuantifíca únicamente el nivel de expresión de un producto de expresión de un único gen (e.g., Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 o ACVR2E) en la muestra del sujeto a analizar y se compara con el nivel de referencia de dicho producto de expresión de dicho gen.
En otra realización particular, se cuantifícan los niveles de expresión de productos de expresión de dos o más genes del grupo formado por los genes Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B en la muestra del sujeto a analizar y se comparan los niveles obtenidos con los niveles de referencia correspondientes de dichos productos de expresión de los genes en cuestión. A modo ilustrativo, pueden cuantificarse productos de expresión de 2, 3, 4, 5 y 6 genes seleccionados del grupo formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPKd,, FGFR4, STK4 yACVR2B, tal como, por ejemplo, productos de expresión de:
Lista de combinaciones de genes
Piml, SRC
Piml, MAPKAPKS
Piml, FGFR4
Piml, STK4
Piml, ACVR2B
SRC, MAPKAPKS
SRC, FGFR4
SRC, STK4
SRC, ACVR2B
MAPKAPKS, FGFR4
MAPKAPKS, STK4 MAPKAPK3, ACVR2B
FGFR4, STK4
FGFR4, ACVR2B
STK4 , ACVR2B
Piml, SRC, MAPKAPK3
Piml, SRC, FGFR4
Piml, SRC, STK4
Piml, SRC, ACVR2B
Piml, MAPKAPK3, FGFR4 Piml, MAPKAPK3, STK4
Piml, MAPKAPK3, ACVR2B Piml, FGFR4, STK4
Piml, FGFR4, ACVR2B
Piml, STK4, ACVR2B
SRC, MAPKAPK3, FGFR4
SRC, MAPKAPK3, STK4
SRC, MAPKAPK3, ACVR2B SRC, FGFR4, STK4
SRC, FGFR4, ACVR2B
SRC, STK4 , ACVR2B
MAPKAPK3, FGFR4, STK4 MAPKAPK3, FGFR4, ACVR2B MAPKAPK3, STK4, ACVR2B FGFR4, STK4, ACVR2B
Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4
Piml, SRC, MAPKAPK3, STK4 Piml, SRC, MAPKAPK3, ACVR2B Piml, SRC, FGFR4, STK4 Piml, SRC, FGFR4, ACVR2B Piml, SRC, STK4, ACVR2B
Piml, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 Piml, MAPKAPK3, FGFR4, ACVR2B
Piml, MAPKAPK3, STK4, ACVR2B
Piml, FGFR4, STK4, ACVR2B
SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4
SRC, MAPKAPK3, FGFR4, ACVR2B
SRC, MAPKAPK3, STK4, ACVR2B
SRC, FGFR4, STK4, ACVR2B
MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B
Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4
Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, A CVR2B
Piml, SRC, MAPKAPK3, STK4, ACVR2B
Piml, SRC, FGFR4, STK4, ACVR2B
Piml, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B
SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B
Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B
En una realización particular, se cuantifíca y compara con su nivel de referencia el nivel de un producto de expresión del gen Piml, el nivel de un producto de expresión del gen MAPKAPK3 o el nivel de un producto de expresión del gen ACVR2B, preferentemente, el nivel de un producto de expresión del gen MAPKAPK3 o el nivel de un producto de expresión del gen A CVR2B.
En otra realización particular, se cuantifíca y compara con su nivel de referencia el nivel de un producto de expresión del gen MAPKAPK3 y el nivel de un producto de expresión del gen ACVR2B, y, opcionalmente el nivel de un producto de expresión del gen FGFR4.
En otra realización particular, se cuantifíca y compara con su nivel de referencia el nivel de un producto de expresión del gen Piml, el nivel de un producto de expresión del gen MAPKAPK3 y el nivel de un producto de expresión del gen A CVR2B, y, opcionalmente el nivel de un producto de expresión del gen FGFR4.
El método de diagnóstico 2 de la invención permite diagnosticar si un sujeto sufre CCR con un elevado grado de fíabilidad ya que permite detectar correctamente dicha enfermedad (CCR) en al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, o al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada. Dicho método puede ser usado en cualquier estadio del CCR. En una realización particular, el sujeto es un paciente que sufre CCR en estadios iniciales, tales como estadios 0, 1 y II. Métodos de pronóstico/seguimiento
Las enseñanzas de la presente invención también son útiles para predecir o evaluar la respuesta a un determinado tratamiento. El tratamiento del CCR principal habitualmente suele ser quirúrgico (cirugía), por ejemplo, pero sin limitarse, mediante escisión local o resección. Algunos pacientes de CCR antes de la cirugía reciben terapia "neoadyuvante" con el objetivo de reducir el tamaño del CCR, para posibilitar o facilitar la cirugía. Después de la cirugía, muchos pacientes reciben terapia adyuvante con el objetivo de prevenir la recaída del cáncer en el colon, en el recto o en otro lugar. En el tratamiento del CCR, la terapia adyuvante o neoadyuvante puede consistir, por ejemplo, pero sin limitarse, en radioterapia, quimioterapia o terapia biológica. Algunos ejemplos de compuestos empleados en quimioterapia o terapia biológica incluyen, pero sin limitarse, ácido fólico, fluorouracilo, irinotecán, oxaliplatino, leucovorina, levamisol, cetuximab o bevacizumab.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para evaluar el pronóstico o seguimiento de la evolución de un paciente que sufre cáncer colorrectal (CCR), en adelante "método de diagnóstico 1 de la invención", que comprende comparar el nivel de, al menos, un auto anticuerpo frente a una proteína, en donde dicho autoanticuerpo se selecciona del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml , un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, un autoanticuerpo frente a la pro teína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, en una muestra biológica de dicho paciente que sufre CCR, con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, en donde si el nivel de dicho autoanticuerpo frente a la proteína Piml , o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína SRC, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína STK4, en dicha muestra, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos autoanticuerpos, y/o si el nivel del autoanticuerpo frente a ACVR2B en dicha muestra es menor que el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, entonces dicho paciente sufre un CCR con mal pronóstico o presenta un CCR con una evolución desfavorable.
El método de pronóstico 1 de la invención comprende, previamente, determinar el nivel de, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína, en donde dicho autoanticuerpo se selecciona del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml, un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, en una muestra biológica del paciente que sufre CCR en cuestión. En una realización particular, dicha muestra biológica es una muestra de sangre, plasma o suero de dicho paciente que sufre CCR con el fin de evaluar el seguimiento de la evolución de la enfermedad (CCR). El nivel de dichos autoanticuerpos puede ser determinado tal como se ha indicado previamente en relación con el método de detección de autoanticuerpos de la invención o con el método de obtención de datos 1 de la invención.
Una vez determinado el nivel de uno o más de los autoanticuerpos frente a las proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, y/o ACVR2B, en dicha muestra biológica, el método de pronóstico 1 de la invención comprende comparar el nivel de dicho autoanticuerpo (o autoanticuerpos) con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo (o con los niveles de referencia para los autoanticuerpos en cuestión), en donde si el nivel de dicho autoanticuerpo frente a la proteína Piml, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína SRC, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína STK4, en dicha muestra, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos autoanticuerpos, y/o si el nivel del autoanticuerpo frente a ACVR2B en dicha muestra es menor que el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, entonces dicho paciente sufre un CCR con mal pronóstico o presenta un CCR con una evolución desfavorable.
En una realización particular de la invención, dicho nivel de referencia es el nivel o cantidad de autoanticuerpos frente a dichas proteínas (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, y ACVR2B) en una muestra, preferentemente de suero, de sujetos que no presentan CCR. En otra realización particular de la invención, dicho nivel de referencia es el nivel o cantidad de autoanticuerpos frente a dichas proteínas (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, y ACVR2B) en una muestra, preferentemente de suero, del mismo paciente que sufre CCR obtenida antes, por ejemplo, antes de la administración de un tratamiento frente al CCR, con el fin de poder evaluar la eficacia de dicho tratamiento. En general, se considerará que el nivel de un autoanticuerpo frente a una proteína (e.g., Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4 o STK4) en la muestra biológica del sujeto bajo estudio es "mayor" que el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo cuando el nivel de dicho autoanticuerpo en la muestra biológica del sujeto es de, al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más, el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo. Análogamente, en general, se considerará que el nivel de un autoanticuerpo frente a una proteína (e.g., ACVR2B) en la muestra biológica del sujeto bajo estudio es "menor" que el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo cuando el nivel de dicho autoanticuerpo en la muestra biológica del sujeto es de, al menos 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, o incluso más, más bajo que el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo.
En una realización particular, se cuantifica el nivel de autoanticuerpos frente a una sola proteína, por ejemplo, frente a la proteína Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B en la muestra del sujeto a analizar y se compara con el nivel de referencia de autoanticuerpos frente a dicha proteína.
En otra realización particular, se cuantifica el nivel de autoanticuerpos frente a dos o más proteínas del grupo formado por las proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B en la muestra del sujeto a analizar y se comparan los niveles obtenidos con los niveles de referencia de los autoanticuerpos frente a las proteínas correspondientes. A modo ilustrativo, pueden cuantificarse los autoanticuerpos frente a 2, 3, 4, 5 y 6 proteínas seleccionadas del grupo formado por las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, tal como se menciona en Lista de Combinaciones de proteínas previamente mencionada.
Así, en una realización particular, se cuantifica y compara con su nivel de referencia el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína Piml , el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína MAPKAPK3 o el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B, preferentemente, el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína MAPKAPK3 o el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B.
En otra realización particular, se cuantifíca y compara con su nivel de referencia el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína MAPKAPK3 y el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B, y, opcionalmente el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína FGFR4.
En otra realización particular, se cuantifíca y compara con su nivel de referencia el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína Piml, el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína MAPKAPK3 y el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína ACVR2B, y, opcionalmente el nivel de autoanticuerpos frente a la proteína FGFR4.
El método de pronóstico 1 de la invención permite evaluar el pronóstico de un paciente que sufre CCR y/o seguir la evolución de dicho paciente que sufre CCR, es decir, si tiene un buen pronóstico y evolucionará de forma favorable o si tiene un mal pronóstico y evolucionará de forma desfavorable. Dicho método puede ser usado en cualquier estadio del CCR. En una realización particular, el sujeto es un paciente que sufre CCR en estadios iniciales, tales como estadios 0, 1 y II.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para evaluar el pronóstico o seguimiento de la evolución de un paciente que sufre cáncer colorrectal (CCR), en adelante "método de pronóstico 2 de la invención", que comprende comparar el nivel de expresión de, al menos, un producto de expresión de un gen, en donde dicho gen se selecciona del grupo formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 y ACVR2B, en una muestra de dicho paciente que sufre CCR, con el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen, en donde si el nivel de dicho producto de expresión del gen Piml, o de dicho producto de expresión del gen 57? C, o de dicho producto de expresión del gen MAPKAPK3, o de dicho producto de expresión del gen FGFR4, o de dicho producto de expresión del gen STK4, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos productos de expresión de dichos genes y/o si el nivel del producto de expresión del gen ACVR2B es menor que el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen, dicho paciente sufre un CCR con mal pronóstico o presenta un CCR con una evolución desfavorable. El método de pronóstico 2 de la invención comprende, previamente, determinar el nivel de expresión de, al menos, un producto de expresión (e.g., ARN o proteína) de un gen seleccionado del grupo formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 y ACVR2B, en una muestra biológica del paciente que sufre CCR en cuestión. En una realización particular, dicha muestra biológica es una muestra de tejido de colon o recto adyacente al tumor, tejido tumoral, sangre, plasma o suero de dicho paciente que sufre CCR. El nivel de dicho producto de expresión puede ser determinado, en función de su naturaleza (ARN o proteína) tal como se ha indicado previamente en relación con el método de obtención de datos 2 de la invención.
Una vez determinado el nivel de expresión de uno o más de los productos de expresión de los genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 y ACVR2B, en dicha muestra biológica, el método de diagnóstico 2 de la invención comprende comparar el nivel de dicho producto de expresión (o productos de expresión) en la muestra del paciente que sufre CCR con el nivel de referencia para dicho producto de expresión (o con los niveles de referencia para los productos de expresión en cuestión), en donde si el nivel de dicho producto de expresión del gen Piml, o de dicho producto de expresión del gen SRC, o de dicho producto de expresión del gen MAPKAPKS , o de dicho producto de expresión del gen FGFR4, o de dicho producto de expresión del gen STK4, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos productos de expresión de dichos genes y/o si el nivel del producto de expresión del gen ACVR2B es menor que el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen, entonces dicho paciente sufre un CCR con mal pronóstico o presenta un CCR con una evolución desfavorable.
En una realización particular de la invención, dicho nivel de referencia es el nivel o cantidad de producto de expresión de dicho gen (Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4, y ACVR2B) en una muestra biológica, preferentemente de colon, de una población de sujetos control (es decir, que no sufren CCR). En otra realización particular de la invención, dicho nivel de referencia es el nivel o cantidad de producto de expresión de dicho gen (Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4, y ACVR2B) en una muestra biológica, preferentemente de tejido tumoral o de tejido de colon o recto obtenida, por ejemplo, de una zona colindante o adyacente al tumor no cancerosa del mismo paciente que sufre CCR obtenida antes, por ejemplo, antes de la administración de un tratamiento frente al CCR, con el fin de poder evaluar la eficacia de dicho tratamiento.
En general, se considerará que el nivel de un producto de expresión de un gen (e.g., Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4 o STK4) en la muestra del sujeto bajo estudio es "mayor" que el nivel de referencia de dicho producto de expresión cuando la relación entre el nivel del producto de expresión del gen en cuestión determinado en la muestra biológica del sujeto es de, al menos, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más, el nivel de referencia de dicho producto de expresión de dicho gen. Análogamente, en general, se considerará que el nivel de un producto de expresión de un gen un gen (e.g., ACVR2E) en la muestra biológica del sujeto bajo estudio es "menor" que el nivel de referencia de dicho producto de expresión de dicho gen cuando el nivel de dicho autoanticuerpo en la muestra biológica del sujeto es de, al menos 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, o incluso más, más bajo que el nivel de referencia de dicho producto de expresión de dicho gen.
En una realización particular, se cuantifica únicamente el nivel de expresión de un producto de expresión de un único gen (e.g., Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 o ACVR2E) en la muestra del sujeto a analizar y se compara con el nivel de referencia de dicho producto de expresión de dicho gen.
En otra realización particular, se cuantifícan los niveles de expresión de productos de expresión de dos o más genes del grupo formado por los genes Piml , SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 o ACVR2B en la muestra del sujeto a analizar y se comparan los niveles obtenidos con los niveles de referencia correspondientes de dichos productos de expresión de los genes en cuestión. A modo ilustrativo, pueden cuantifϊcarse productos de expresión de 2, 3, 4, 5 y 6 genes seleccionados del grupo formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 y ACVR2B, tal como, por ejemplo, productos de expresión de las combinaciones de genes mencionadas en la Lista de combinaciones de genes previamente indicada.
En una realización particular, se cuantifica y compara con su nivel de referencia el nivel de un producto de expresión del gen Piml, el nivel de un producto de expresión del gen MAPKAPK3 o el nivel de un producto de expresión del gen ACVR2B, preferentemente, el nivel de un producto de expresión del gen MAPKAPK3 o el nivel de un producto de expresión del gen ACVR2B.
En otra realización particular, se cuantifica y compara con su nivel de referencia el nivel de un producto de expresión del gen MAPKAPK3 y el nivel de un producto de expresión del gen ACVR2B, y, opcionalmente el nivel de un producto de expresión del gen FGFR4.
En otra realización particular, se cuantifica y compara con su nivel de referencia el nivel de un producto de expresión del gen Piml, el nivel de un producto de expresión del gen MAPKAPK3 y el nivel de un producto de expresión del gen ACVR2B, y, opcionalmente el nivel de un producto de expresión del gen FGFR4.
El método de pronóstico 2 de la invención permite evaluar el pronóstico de un paciente que sufre CCR y/o seguir la evolución de dicho paciente que sufre CCR, es decir, si tiene un buen pronóstico y evolucionará de forma favorable o si tiene un mal pronóstico y evolucionará de forma desfavorable. Dicho método puede ser usado en cualquier estadio del CCR. En una realización particular, el sujeto es un paciente que sufre CCR en estadios iniciales, tales como estadios 0, 1 y II.
Métodos de diagnóstico de metástasis
Las enseñanzas de la presente invención también son útiles para analizar la posibilidad de que un paciente que sufre CCR desarrolle metástasis a pulmón o hígado.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un "método para diagnosticar metástasis en pulmón en un paciente que sufre cáncer colorrectal (CCR)" que comprende comparar el nivel de, al menos, un auto anticuerpo frente a una proteína en una muestra de dicho paciente, en donde dicha proteína es una proteína seleccionada del grupo de proteínas mencionadas en la Tabla 2, con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, en donde, si el nivel de autoanticuerpo frente a dicha proteína en dicha muestra es mayor que el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, el paciente de CCR presenta metástasis en pulmón. Tabla 2
Proteínas relacionadas con la metástasis hacia el pulmón.
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Bases de datos: UniProtKB/TrEMBL - UniProtKB/Swiss-Prot
El método de diagnóstico de metástasis en pulmón en un paciente que sufre CCR proporcionado por esta invención comprende, previamente, determinar el nivel de, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína seleccionada entre las proteínas mencionadas en la Tabla 2, en una muestra biológica del paciente que sufre CCR en cuestión. En una realización particular, dicha muestra biológica es una muestra de sangre, plasma o suero de dicho paciente que sufre CCR. El nivel de dichos autoanticuerpos puede ser determinado tal como se ha indicado previamente en relación con el método de detección de autoanticuerpos de la invención o con el método de obtención de datos 1 de la invención pero aplicado sobre las proteínas de la Tabla 2 en lugar de sobre las proteínas allí mencionadas (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B).
Una vez determinado el nivel de uno o más de los autoanticuerpos frente a dichas proteínas, en dicha muestra biológica, el método de diagnóstico de metástasis en pulmón en un paciente que sufre CCR proporcionado por esta invención comprende comparar el nivel de dicho auto anticuerpo (o autoanticuerpos) con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo (o con los niveles de referencia para los autoanticuerpos en cuestión), en donde si el nivel de autoanticuerpo(s) frente a dicha(s) proteína(s) en dicha muestra es mayor que el nivel de referencia para dicho(s) autoanticuerpo(s), el paciente de CCR presenta metástasis en pulmón.
En una realización particular de la invención, dicho nivel de referencia es el nivel o cantidad de autoanticuerpos frente a dichas proteínas mencionadas en la Tabla 2 en una muestra, preferentemente de suero, de sujetos que no presentan CCR. En otra realización particular, dicha muestra procede de pacientes que sufren CCR pero que no tienen metástasis. En general, se considerará que el nivel de un autoanticuerpo frente a una proteína (e.g., las proteínas mencionadas en la Tabla 2) en la muestra del paciente que sufre CCR a analizar es "mayor" que el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo cuando el nivel de dicho autoanticuerpo en la muestra biológica del sujeto es de, al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más, el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo.
En una realización particular, se cuantifica únicamente el nivel de autoanticuerpos frente a una sola proteína de las mencionadas en la Tabla 2 en la muestra del paciente que sufre CCR a analizar y se compara con el nivel de referencia de autoanticuerpos frente a dicha proteína.
En otra realización particular, se cuantifica el nivel de autoanticuerpos frente a dos o más proteínas del grupo formado por las proteínas mencionadas en la Tabla 2 en la muestra del paciente que sufre CCR a analizar y se comparan los niveles obtenidos con los niveles de referencia de los autoanticuerpos frente a las proteínas correspondientes. A modo ilustrativo, pueden cuantifícarse los autoanticuerpos frente a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12, 13, 14 y 15 proteínas seleccionadas del grupo formado por las proteínas mostradas en la Tabla 2.
El método de diagnóstico de metástasis en pulmón en un paciente que sufre CCR proporcionado por esta invención permite evaluar si un paciente de CCR presenta metástasis en pulmón.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un "método para diagnosticar metástasis en hígado en un paciente que sufre cáncer colorrectal (CCR)" que comprende comparar el nivel de, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína en una muestra de dicho paciente, en donde dicha proteína es una proteína seleccionada del grupo de proteínas mencionadas en la Tabla 3, con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, en donde, si el nivel de autoanticuerpo frente a dicha proteína en dicha muestra es mayor que el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, el paciente de CCR presenta metástasis en hígado.
Tabla 3
Proteínas relacionadas con la metástasis hacia el hígado
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El método de diagnóstico de metástasis en hígado en un paciente que sufre CCR proporcionado por esta invención comprende, previamente, determinar el nivel de, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína seleccionada entre las proteínas mencionadas en la Tabla 3, en una muestra biológica del paciente que sufre CCR en cuestión. En una realización particular, dicha muestra biológica es una muestra de sangre, plasma o suero de dicho paciente que sufre CCR. El nivel de dichos autoanticuerpos puede ser determinado tal como se ha indicado previamente en relación con el método de detección de autoanticuerpos de la invención o con el método de obtención de datos 1 de la invención pero aplicado sobre las proteínas de la Tabla 3 en lugar de sobre las proteínas allí mencionadas (Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B).
Una vez determinado el nivel de uno o más de los autoanticuerpos frente a dichas proteínas, en dicha muestra biológica, el método de diagnóstico de metástasis en hígado en un paciente que sufre CCR proporcionado por esta invención comprende comparar el nivel de dicho autoanticuerpo (o autoanticuerpos) con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo (o con los niveles de referencia para los autoanticuerpos en cuestión), en donde si el nivel de autoanticuerpo(s) frente a dicha(s) proteína(s) en dicha muestra es mayor que el nivel de referencia para dicho(s) autoanticuerpo(s), el paciente de CCR presenta metástasis en hígado.
En una realización particular de la invención, dicho nivel de referencia es el nivel o cantidad de autoanticuerpos frente a dichas proteínas mencionadas en la Tabla 3 en una muestra, preferentemente de suero, de sujetos que no presentan CCR. En otra realización particular, dicha muestra procede de pacientes que sufren CCR pero que no tienen metástasis. En general, se considerará que el nivel de un autoanticuerpo frente a una proteína (e.g., las proteínas mencionadas en la Tabla 3) en la muestra del paciente que sufre CCR a analizar es "mayor" que el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo cuando el nivel de dicho autoanticuerpo en la muestra biológica del sujeto es de, al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más, el nivel de referencia de dicho autoanticuerpo.
En una realización particular, se cuantifíca únicamente el nivel de autoanticuerpos frente a una sola proteína de las mencionadas en la Tabla 3 en la muestra del paciente que sufre CCR a analizar y se compara con el nivel de referencia de autoanticuerpos frente a dicha proteína.
En otra realización particular, se cuantifíca el nivel de autoanticuerpos frente a dos o más proteínas del grupo formado por las proteínas mencionadas en la Tabla 3 en la muestra del paciente que sufre CCR a analizar y se comparan los niveles obtenidos con los niveles de referencia de los autoanticuerpos frente a las proteínas correspondientes. A modo ilustrativo, pueden cuantifϊcarse los autoanticuerpos frente a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22 proteínas seleccionadas del grupo formado por las proteínas mostradas en la Tabla 3.
El método de diagnóstico de metástasis en hígado en un paciente que sufre CCR proporcionado por esta invención permite evaluar si un paciente de CCR presenta metástasis en hígado. Kits y aplicaciones En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit, en adelante "kit de la invención", que comprende
los elementos necesarios para detectar, al menos, un autoanticuerpo seleccionado del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml , un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, o, alternativamente
los elementos necesarios para detectar, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína seleccionada entre las proteínas mencionadas en la Tabla 2, o, alternativamente - los elementos necesarios para detectar, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína seleccionada entre las proteínas mencionadas en la Tabla 3, o, alternativamente los elementos necesarios para detectar, al menos, un producto de expresión de un gen seleccionado del grupo formado por los genes Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 yACVR2B.
En una realización particular, el kit de la invención comprende, además, los elementos necesarios para comparar la cantidad de autoanticuerpos frente a, al menos, una de las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B con una cantidad de referencia.
En otra realización particular, el kit de la invención comprende, además, los elementos necesarios para comparar la cantidad de autoanticuerpos frente a una proteína mencionada en la Tabla 2 con una cantidad de referencia.
En otra realización particular, el kit de la invención comprende, además, los elementos necesarios para comparar la cantidad de autoanticuerpos frente a una proteína mencionada en la Tabla 3 con una cantidad de referencia.
En otra realización particular, el kit de la invención comprende los elementos necesarios para detectar la cantidad del producto de la expresión de, al menos, uno de los genes seleccionados de la lista que comprende Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B en una muestra biológica aislada de un sujeto. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit de la invención comprende, además, los elementos necesarios para comparar la cantidad detectada del producto de la expresión de los genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 o ACVR2B con una cantidad de referencia. El kit de la invención puede contener, además, todos aquellos reactivos necesarios para detectar la cantidad de autoanticuerpos frente a las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, o frente a las proteínas mencionadas en las Tablas 2 ó 3, o del producto de la expresión de los genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 o ACVR2B, por medio de cualquiera de los métodos descritos anteriormente en este documento como, por ejemplo, pero sin limitarse, a
a) las proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, y/o las proteínas mencionadas en la Tabla 2, las proteínas mencionadas en la Tabla 3, sus variantes o fragmentos funcionalmente equivalentes;
b) los anticuerpos capaces de reconocer específicamente a las proteínas mencionadas en el apartado a);
c) cebadores;
d) polímeras as;
e) sondas; o
f) controles positivos y/o negativos.
El kit de la invención puede, además, incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado, el kit de la invención puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo del kit de la invención para: detectar un autoanticuerpo frente a una proteína seleccionada del grupo formado por las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B; o para
- detectar un autoanticuerpo frente a una proteína mencionada en la Tabla 2; o para
detectar un autoanticuerpo frente a una pro teína mencionada en la Tabla 3; o para
obtener datos; o para
- diagnosticar si un sujeto sufre cáncer colorrectal (CCR); o para evaluar el pronóstico o seguimiento de la evolución de un paciente que sufre CCR; o para
diagnosticar metástasis en pulmón en un paciente que sufre CCR; o para diagnosticar metástasis en hígado en un paciente que sufre CCR.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
EJEMPLO 1
Identificación de autoanticuerpos específicos de cáncer colorrectal (CCR)
Doce sueros de pacientes con CCR en estadios avanzados y que desarrollaron diferentes tipos de metástasis hacia hígado (7 pacientes), hígado y pulmón (4 pacientes) e hígado y huesos (1 paciente) y 8 sueros de individuos sanos [es decir, de individuos sin CCR] (sueros control) fueron testados usando microarrays de proteínas de alta densidad con el fin de identificar autoanticuerpos específicos de CCR y sus antígenos reactivos respectivos (Tabla 4). Los sueros control fueron seleccionados para tener exactamente la misma proporción de mujeres y hombres y la misma edad media de los pacientes con CCR (64,5 años). Los controles sanos y los pacientes con CCR mostraron un patrón de inmunoreactividad diferente.
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Después de cuantifícar la intensidad de los diferentes puntos (proteínas) con el programa GenePix, los datos se normalizaron usando el método de los cuantiles y se procesaron utilizando el ProtoArray Prospector Analyser. Los arrays usados como control mostraron un excelente comportamiento, con un bajo nivel de ruido de fondo y reactividad específica.
Con el fin de estudiar la capacidad de la firma de autoanticuerpos para discriminar entre los diferentes tipos de metástasis se realizó un clúster no supervisado con los datos procesados utilizando el programa MeV (Dana-Farber Cáncer Institute, Boston, MA, USA). Las muestras mestastáticas se separaron en dos ramificaciones principales que correspondían a los pacientes con metástasis hacia hígado e hígado y pulmón y únicamente dos muestras no se clasificaron correctamente. Por otra parte, el análisis supervisado con los datos procesados de los pacientes con CCR mostró que los dos tipos de pacientes se podían separar satisfactoriamente. Así, una muestra de AATs con una prevalencia superior al 60% se asoció a los pacientes de CCR con metástasis hacia pulmón (15 proteínas) (Tabla 5) o bien con metástasis hacia hígado (22 proteínas) (Tabla 6).
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EJEMPLO 2
Caracterización de los AATs más prevalentes en cáncer colorrectal
Las proteínas que mostraron capacidad discriminatoria entre pacientes normales y tumorales aparecen en la Tabla 7. El análisis se realizó utilizando el programa ProtoArray Prospector Analyser clasificando los datos en función del valor p calculado para cada proteína y la prevalencia de los autoanticuerpos en ambos grupos. El valor p se fijó para que fuera 0,04 como máximo y la prevalencia mayor de un 50% en la población de pacientes con CCR. En total, 432 proteínas mostraron inmunoreactividad a los autoanticuerpos presentes en el suero. Entre ellas, 43 proteínas poseían un valor p significativo menor de 0,04. En cuanto a su clasificación, 25 de ellas presentaban una mayor prevalencia en el suero de pacientes con CCR y 18 una prevalencia menor en pacientes con CCR respecto a individuos control. Seis proteínas -MAPKAPK3, Piml , SRC, STK4, FGFR4 y ACVR2B- se seleccionaron según los datos de intensidad de señal de los microarrays.
Dichas proteínas estaban entre las más prevalentes en el suero de pacientes con CCR según el análisis usando el Prospector Analyser y mostraban una prevalencia en CCR entre el 50-70% y menor de un 20% de prevalencia en los sujetos control. Aunque había variaciones significativas en cuanto a la respuesta individual, MAPKAPK3, Piml , SRC, STK4 y FGFR4 fueron reconocidas significativamente por pacientes con CCR. Por otro lado, ACVR2B mostró un reconocimiento diferente dado que lo reconocían principalmente los sujetos control.
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EJEMPLO 3
Análisis de la expresión diferencial de las proteínas seleccionadas AATs en líneas celulares y tejido tumoral de CCR
Un reconocimiento más elevado por los autoanticuerpos presentes en el suero de pacientes con CCR indicaría una sobreexpresión de aquellas proteínas en tejido tumoral de CCR, mientras que un reconocimiento más débil en el suero de pacientes con CCR que en los individuos (sujetos) normales indicaría una disminución de la expresión u otra modificación de dichas proteínas en el tumor. Con esta hipótesis de partida, 3 autoantígenos: Piml, MAPKAPK3 y ACVR2B se seleccionaron para la validación inicial. En primer lugar, los niveles de expresión de las proteínas en extractos pareados normal/tumoral de tejido del mismo paciente con CCR se analizaron mediante inmunodetección en membrana (Figura IA). Piml y MAPKAPK3 mostraron una mayor expresión en tejido tumoral, siendo su expresión más abundante en etapas avanzadas de la enfermedad. ACVR2B exhibía una débil expresión en tejido tumoral y, en general, más expresión en estadios tempranos de la enfermedad. Posteriormente, se analizaron los niveles de expresión de los autoantígenos en 6 líneas celulares de CCR en comparación con 5 líneas celulares usadas como referencia (Figura IB). La expresión de Piml y MAPKAPK3 se detectó en prácticamente todas las líneas celulares de CCR, excepto MAPKAPK3 en la línea celular SW480. En cuanto a ACVR2B, se observó su expresión en las líneas celulares de referencia incluyendo neutrófílos y linfocitos, pero no en las líneas celulares de cáncer de colon.
Con el fin de estudiar la correlación entre la respuesta humoral y la abundancia en tejido, se verificó la expresión diferencial de las 6 proteínas a nivel de ARN mensajero (ARNm) y a nivel proteico. Para determinar los niveles de ARNm se recurrió a la base de datos Oncomine (Rhodes et al. 2004. Neoplasia New York, N.Y. 6 (1), 1-6), una página web que incluye una base de datos con los resultados de datos de expresión génica en cáncer utilizando microarrays. Los datos para FGFR4, MAPKAPK3, SRC y STK4 en CCR se muestran en la Figura IC. Todos ellos mostraron unos niveles de expresión mayores en CCR. No se encontraron datos para Piml y ACVR2B en CCR. Para corroborar la expresión diferencial de las proteínas, se utilizó un microarray de tejidos de CCR con anticuerpos específicos de ACVR2B y Piml, que eran los únicos disponibles comercialmente para esta técnica entre las 6 proteínas estudiadas (Figura ID).
Piml mostró una expresión aumentada en las células epiteliales que rodean las criptas de tejido tumoral, siendo la tinción principalmente citoplasmática. Además, tanto los linfocitos como los macrófagos se tiñeron de una forma muy importante.
En cuanto a ACVR2B, la expresión estaba disminuida en pacientes con CCR, mientras que en tejido normal se observaba su expresión normal. En este caso, la tinción de ACVR2B se localizó principalmente en la membrana de las células epiteliales dado que actúa como receptor de membrana. En la Figura ID se puede observar el resultado del análisis inmunohistoquímico de Piml y ACVR2B en tejido de CCR y mucosa adyacente normal de 45 pacientes con CCR. Como se puede observar, el nivel de la pro teína Piml aparece aumentado en las muestras de CCR mientras que el de ACVR2B aparece disminuido.
EJEMPLO 4
Confirmación del uso de Piml. ACVR2B y MAPKAPK3 como
biomarcadores en CCR
La técnica de ELISA es ampliamente utilizada en clínica por su facilidad y sensibilidad. Con el fin de corroborar los resultados previos se decidió realizar un ensayo de
ELISA con las proteínas recombinantes Piml, MAPKAPK3 y ACVR2B expresadas en E. coli, ya que ello podría permitir discriminar fácilmente entre sueros de individuos sanos e individuos con CCR. Como controles se utilizaron CEA comercial y Anexina IV recombinante expresada en células de mamífero. CEA por ser el marcador más usado en el diagnóstico de CCR (Duffy, M. J. 2001 Clinical chemistry 47 (4), 624-630) y Anexina IV por su sobreexpresión en tejido de CCR (Alfonso et al. 2005. Proteomics 5 (10), 2602-
2611). Así, en este ensayo directo de ELISA se testaron 94 muestras de suero, 52 sueros de pacientes con CCR y 42 sueros de individuos sanos. Los resultados del ELISA fueron consistentes con los obtenidos en el array de proteínas y en la inmunodetección en membrana; los auto anticuerpos frente a Piml, MAPKAPK3 y ACVR2B permitían discriminar entre pacientes con CCR y sueros control.
Piml mostró una inmunoreactividad significativamente mayor en el suero de pacientes con CCR (media= 0,606, 95% CI= 0,505 a 0,708, p<0,008) que en sujetos control (media = 0,439, 95% CI= 0,369 a 0,510).
Para MAPKAPK3 se obtuvieron resultados similares en sueros de pacientes con
CCR (media= 0,929, 95% CI= 0,828 a 1,030, p<0,0001) y de sujetos control (media= 0,648, 95% CI= 0,574 a 0,722) (Figura 2).
En el caso de ACVR2B la inmunoreactividad fue superior en el suero de sujetos control (media= 0,863, 95% CI= 0,744 a 0,981, p<0,026) que en el suero de pacientes con CCR (media= 0,668, 95% CI= 0,549 a 0,790), lo que confirmó los resultados previos obtenidos con los protoarrays. En cuanto a la inmunoreactividad de CEA y Anexina IV, no se observaron diferencias significativas entre las muestras tumorales de pacientes con CCR (CEA: media=
0,787, 95% CI= 0,674 a 0,900, p<0,l); (Anexina IV: media= 0,421, 95% CI= 0,360 a 0,481, p<0,16) y muestras de sujetos control (CEA: media= 0,665, 95% CI= 0,588 a 0,742; Anexina IV: media= 0,366, 95% CI= 0,318 a 0,414).
Posteriormente, se investigó la capacidad de esta respuesta humoral como predictor para detectar CCR. Así, se obtuvieron las curvas ROC a partir de la respuesta de los autoanticuerpos frente a las proteínas Piml , MAPKAPK3 y ACVR2B (Figura 3A). La especificidad y sensibilidad del ensayo para Piml fue del 83,3% y 48,1% (usando un cut-off de 0,534), respectivamente, y el área bajo la curva (AUC) fue de AUC= 0,651 (95% CI= 0,546 a 0,746). En el caso de MAPKAPK3, la especificidad fue del 74% y la sensibilidad del 72,7% (con un cut-off de 0,762), siendo AUC= 0,733 (95% CI= 0,632 a 0,819). Para ACVR2B se encontró una especificidad y sensibilidad del 76,2% y 60%, respectivamente, (cut-off = 0,548) y AUC= 0,666 (95%CI = 0,562 a 0,760). Las proteínas control CEA y Anexina IV dieron menores valores de especificidad y sensibilidad; especificidad de 52,4% y sensibilidad de 67,3% para CEA con un cut-off= 0,61 y AUC= 0,61 (95% CI= 0,513 a 0,717). La Anexina IV dio un valor de AUC= 0,556 (95% CI= 0,450 a 0,658) indicando la ausencia de autoanticuerpos específicos para esta proteína (Figura 3C).
Finalmente, se decidió testar si diferentes combinaciones de estas proteínas mejorarían su capacidad diagnóstica. Los datos se ajustaron a una curva logística, se calcularon las regresiones logísticas y se obtuvieron diferentes modelos incorporando combinaciones de las proteínas (Figura 3B). El modelo inicial incluyó 4 proteínas: Piml, MAPKAPK3, ACVR2B y CEA; sin embargo, los tests del método discriminante lineal mostraron que CEA y Pim-1 no tenían relevancia en el modelo. Esto se confirmó comparando el modelo completo con las 4 proteínas (AUC=0,85) con un modelo que incluía solamente MAPKAPK3 y ACVR2B (AUC=0,86). Mientras que CEA no mejoraba el modelo, Piml incluso lo empeoraba ligeramente.
Así, se demostró que un modelo con la combinación de tan solo los autoanticuerpos frente a MAPKAPK3 y ACVR2B era un predictor relevante de CCR con una especificidad y sensibilidad del 73,9% y 83,3%, respectivamente, y un área bajo la curva AUC= 0,86 (Figura 3B). Adicionalmente, como se puede observar en la Figura 5C, no existe una correlación entre la señal de MAPKAPK3 y ACVR2B. Asimismo, en las Figura 5A y 5B se observa que cuanto más alta sea la señal para ACVR2B mayor es la posibilidad de pertenecer al grupo normal; la situación contraria se observa para MAPKAPK3.
La Figura 6 muestra un análisis basado en ELISA de muestras de suero usando un
ELISA con STK4 y FGFR4 como AATs.
En la Figura 7C se observa cómo la combinación de la medida de los autoanticuerpos frente a MAPKAPK3, ACVR2B, Piml y FGFR4 resulta en una combinación predictiva óptima. Asimismo, en el caso de estadios tempranos de CCR, la combinación de MAPKAPK3, ACVR2B, Piml y FGFR4 también resulta en una especificidad y sensibilidad óptimas.
En la Figura 8 se observa cómo la combinación de CEA con una combinación óptima de autoanticuerpos (autoanticuerpos frente a las proteínas MAPKAPK3, ACVR2B, Piml y FGFR4) no mejora la capacidad de predicción para el diagnóstico de CCR, lo que indica que la combinación de los marcadores de la invención es más adecuada para el diagnóstico de CCR en estadios tempranos que CEA sólo.
Los autoanticuerpos frente a las proteínas MAPKAPK3, ACVR2B, Piml y FGFR4 dan como resultado una mejor diagnosis de CCR en estadios tempranos (Figura 9). Como se observa en los resultados de la Figura 10, la presencia de autoanticuerpos en suero de pacientes con CCR frente a algunos de los biomarcadores seleccionados en la presente invención (MAPKAPK3, Piml , SRC, FGFR4 y STK4) fue constante durante todos los estadios mientras que la concentración de CEA fue mayor en estadios tardíos de CCR. Por tanto, el uso de los autoanticuerpos frente a los biomarcadores arriba citados (MAPKAPK3, Piml, SRC, FGFR4 y STK4) permite un mejor diagnóstico de CCR no solo en estadios tardíos sino también en estadios CCR tempranos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Información clínica y obtención de los sueros (Ejemplos 1, 2 y 4)
Los sueros de 12 pacientes con CCR se recogieron al realizarse su diagnóstico (Hospital Universitario de Salamanca). Estas muestras se seleccionaron por tener los pacientes CCR en estadios avanzados, además de desarrollar metástasis hacia hígado (7 pacientes), hígado y pulmón (4 pacientes) o bien, hígado y huesos (1 paciente). La edad media de estos pacientes fue de 64,5 años (entre 41 y 84 años). Ocho sueros control se obtuvieron de donantes sanos y fueron seleccionados para tener exactamente la misma media de edad de la población de pacientes con CCR y la misma proporción de hombres y mujeres. Los datos clínicos de los pacientes se muestran en la Tabla 4. Para la validación de los resultados mediante ELISA se utilizó un set independiente de 52 sueros de pacientes con CCR y 42 sueros normales.
Todos los sueros fueron procesados utilizando el mismo protocolo. Las muestras de sangre se dejaron a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir la formación del coágulo y, tras su centrifugación a 3.00Og durante 10 minutos a 4°C, los sueros fueron congelados y almacenados a -80 0C hasta su uso.
Arrays de proteínas (Ejemplos 1 y 2)
20 sueros (12 de pacientes con CCR y 8 de individuos sanos) (Tabla 4) se incubaron con el ProtoArray™ Human Protein Microarrays v.4.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Este microarray contiene 8.000 proteínas humanas fusionadas a GST (glutatión-S-transferasa), expresadas en células de insecto Spodoptera frugiperda Sf9 e impresas por duplicado. Brevemente, los arrays se equilibraron a 40C durante 15 minutos y se bloquearon con el tampón de bloqueo (1% de seroalbúmina bovina (BSA) en tampón salino fosfato (PBS) - polisorbato 20 (Tween® 20) 0,1%) durante 1 hora a 40C con agitación suave. Un total de 150 μL de suero diluido 1 :50 en tampón de bloqueo se aplicaron sobre la superficie del array. El array se selló con un CoverGlass (Corning) y se incubó durante 90 minutos a 40C. Los arrays se lavaron con tampón de incubación (1% de BSA en PBS con ditiotreitol (DTT) 0,5 mM, 5% de glicerol y 0,05% de Tritón X-100) y los autoanticuerpos del suero unidos a las proteínas del array se detectaron utilizando un anticuerpo secundario anti-IgG humana (H+L) marcado con Alexa Fluor 647 (Invitrogen) diluido 1:2.000 en tampón de incubación a 40C durante 90 minutos. Los arrays se lavaron con PBS-T ween® 20 0,1% y se secaron por centrifugación a 1.000 rpm durante 1 minuto. Finalmente, los "slides" se escanearon en un ScanArray™ 5000 (Packard BioChip Tecnologías) usando los láseres de 635 nm y 532 nm. El software de análisis de imagen GenePix Pro 5.1 se utilizó para la cuantificación. Como controles, los Protoarrays v4.0 se incubaron con un anticuerpo anti-GST antes de incubar el array con un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con AlexaFluor 555 para testar la uniformidad y la cantidad de proteína impresa en el array. Otro array se incubó directamente con el anticuerpo secundario anti-IgG humana (H+L) marcado con Alexa Fluor 647 para determinar los niveles de ruido en el ensayo.
Anticuerpos, proteínas y líneas celulares (Ejemplos 3 y 4)
Los anticuerpos y las proteínas se obtuvieron de diferentes fuentes. CEA se obtuvo de Calbiochem y la albúmina de suero humana (HSA) se obtuvo de la compañía Sigma.
El cDNA codificante de Piml humana se introdujo en el vector pET28a, el cual permite la fusión 6xHis-Piml, y fue expresada en Escherichia coli usando la cepa BL21 (DE3). El cDNA de la ACVR2B humana se introdujo en el vector pDEST 527 que permite la fusión 6xHis-ACVR2B, usando el sistema Gateway y fue expresada en bacteria, mientras que la proteína MAPKAPK3 humana se introdujo en el vector de expresión pDEST565 que permite la fusión 6xHis- GST-MAPKAPK3 y se expresó en las mismas condiciones que ACVR2B y Piml . Las proteínas así expresadas se purificaron mediante cromatografía de afinidad usando una columna HiTrap Chelating (GE Healthcare) seguida de un paso de purificación extra mediante una columna de penetrabilidad Superdex 200 column (GE Healthcare). El cDNA codificante de la Anexina IV humana se clonó en el vector de expresión pTT3 y se expresó en las células HEK293- EBNA. La proteína recombinante se expresó tras transfectar las células con lipofectamina (Sigma) y se purificó mediante una columna de afinidad de Nichelating resin (GE Healthcare). Los anticuerpos frente a MAPKAPK3 y Piml utilizados en los ensayos de ELISA se compraron a la compañía Abnova. Los anticuerpos frente a MAPKAPK3 , Pim l y ACVR2B usados en inmunodetección en membrana y array de tejidos se compraron a la compañía Abcam. Las líneas celulares de CCR (Rko, Hct l l ó, Hct l 5 , Sw45 , Sw480, Coló 205), de adenocarcinoma pancreático BxPc3 y la línea linfoblastoide Molt4 se crecieron utilizando protocolos preestablecidos para dichas células. Los neutrófilos y linfocitos usados como controles se aislaron a partir de sangre periférica de un individuo sano. Los fibroblastos murinos embrionarios (MEF) se inmortalizaron infectando un cultivo primario con el virus Epstein-Barr y se crecieron utilizando protocolos preestablecidos para esta línea celular. ELISA (Ejemplo 4)
Se desarrolló un ensayo de ELISA con el fin de testar la habilidad de los autoantígenos purificados para discriminar CCR usando suero 30 de pacientes. Brevemente, se tapizaron 0,3 μg de las proteínas purificadas o HSA como control negativo en placas Microtiter (Maxisorp, Nunc) en PBS durante toda la noche. El día después, las placas se lavaron 3 veces con PBS y se bloquearon con 3% de leche desnatada en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras un lavado adicional, las 94 muestras de suero (dilución 1 :50 en 3% de leche desnatada en PBS) se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras lavar, se utilizó un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con peroxidasa (HRP) diluido 1 :3.000 (v:v) para la detección y 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) para el desarrollo de la señal. La reacción se detuvo con H2SO4 1 M y la absorción se midió a 450 nm. Inniunodetección en membrana (Ejemplo 3)
Los extractos proteicos de tejidos pareados de 6 pacientes con CCR (12 en total) se prepararon como se ha descrito previamente en Alfonso, P. et al. (2005) Proteomic expression analysis of colorrectal cáncer by two-dimensional differential gel electrophoresis. Proteomic 5, 2602-2611) . Brevemente, los extractos proteicos se obtuvieron tras usarlos con 0,1% de dodecilsulfato sódico (SDS), 1% de Tritón X-100, 1% de desoxicolato sódico, NaCl 150 mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM, Tris-HCl 1 O mM (pH 7,2) suplementado con inhibidores de proteasas (Roche). La concentración de proteína se determinó utilizando el kit 2-D Quant (GE Healthcare) tras clarificarlo por centrifugación a 12.00Og durante 15 minutos.
Para la inmunodetección en membrana, 50 μg de los extractos proteicos de las 6 líneas celulares de cáncer de colon, las 5 líneas celulares de referencia y los tejidos pareados se corrieron en paralelo en un gel SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond-C extra) según protocolos estándar. Después del bloqueo, las membranas se incubaron con las diluciones óptimas de anticuerpos mono o policlonales frente a los antígenos seleccionados: Piml (dilución 1 :100), MAPKAPK3 (dilución 1 : 500) y ACVR2B (dilución 1 :200). Como anticuerpos secundarios se utilizó un anti-IgG de cabra (DakoCytomation) a una dilución 1 :5,000 para ACVR2B y 1 :20,000 para Piml y MAPKAPK3 o bien un anti-IgG de pollo (Jackson ImmunoReasearch Laboratory) conjugado a HRP. La señal se detectó mediante ECL (GE Healthcare). Inmunohistoquímica (Ejemplo 3)
Los microarrays de tejido (TMA) específicos de CCR con 45 muestras tumorales diferentes se prepararon como se ha descrito previamente (Madoz-Gurpide et al. 2007. Mol CeIl Proteomics 6 (12), 2150-2164). Las secciones se cortaron a una anchura máxima de 3 μm y se secaron a 560C durante 16 h antes de desparafinar en xileno y rehidratar en agua tras pasos previos en diferentes porcentajes de etanol. La exposición y recuperación de epítopos se realizó en tampón citrato sódico 0,01 M calentado durante 2 minutos en una olla a presión. Después del paso de calentamiento, los slides se lavaron con agua durante 5 minutos y nuevamente en tampón Tris salino (TBS) a pH 7,4. Los TMAs se incubaron con un anticuerpo monoclonal frente a Piml (Abcam) y un anticuerpo policlonal frente a ACVR2B (Abcam). La unión específica se detectó mediante anti-IgG de cabra conjugado a biotina. La visualización de interacciones específicas se realizó con el sistema EnVision HRP (DakoCytomation).
Análisis estadístico (Ejemplo 1, 2 y 4)
Los "slides" se analizaron con el software del fabricante -ProtoArray Prospector
Analyser 4.0 (Invitrogen)-, que usa un test estadístico basado en el principio de la desigualdad de Chebyshev (Hudson et al. 2007. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104 (44), 17494-17499). Después de la normalización por cuantiles, el algoritmo compara la señal de cada proteína a la señal de los controles negativos en el array y asigna un valor p a CI para cada proteína. El software identifica las señales significativas (las que se identifican como positivas sobre el ruido de fondo) y calcula unos valores Z que reflejan la intensidad de la señal en comparación con todas las proteínas. Finalmente, el programa compara los 2 grupos e identifica las proteínas que tienen una señal aumentada en uno de los 2 grupos y se calcula el valor p para cada proteína según la hipótesis de que no hay un aumento de señal en un grupo comparado con el otro. Los clústeres supervisados se obtuvieron usando la distancia métrica y la correlación de Pearson para visualizar la discriminación entre los grupos utilizando el programa Multi
Experiment Viewer (MeV) (Dana-Farber Cáncer Institute, Boston, MA, USA). Para determinar si la media del grupo normal y la media del grupo tumoral eran estadísticamente diferentes se realizó un test no paramétrico de Wilcoxon con los datos obtenidos del ELISA.
Posteriormente, cada marcador se evaluó de manera individual utilizando una curva ROC calculada con el programa JMP (SAS, NC, USA). Finalmente, se hizo un análisis discriminante usando modelos lineales para determinar el efecto de la combinación de los biomarcadores (Visintin et al. 2008. Clinical Cáncer Research. 14 (4), 1065-1072).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para la detección de un autoanticuerpo frente a una proteína, que comprende:
a) poner en contacto una muestra biológica con dicha proteína o con un fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo; y b) detectar la formación de un complejo autoanticuerpo-proteína o fragmento de la misma susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo;
en donde dicha pro teína se selecciona del grupo formado por las proteínas Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4, ACVR2B y combinaciones de las mismas.
2. Método según la reivindicación 1 , que comprende detectar un autoanticuerpo seleccionado del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml , un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, y combinaciones de los mismos.
3. Un método de obtención de datos en una muestra biológica de un sujeto, que comprende detectar, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína, en donde dicho autoanticuerpo se selecciona del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml, un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, y, si se desea, determinar el nivel de dicho autoanticuerpo en dicha muestra biológica.
4. Un método para diagnosticar si un sujeto sufre cáncer colorrectal (CCR), que comprende comparar el nivel de, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína, en donde dicho autoanticuerpo se selecciona del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Pim l , un auto anticuerpo frente a la proteína SRC, un auto anticuerpo frente a la proteína MAPKAP K3, un auto anticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un auto anticuerpo frente a la proteína ACVR2B, en una muestra biológica de dicho sujeto, con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, en donde si el nivel de dicho autoanticuerpo frente a la proteína Piml , o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína SRC, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína STK4, en dicha muestra, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos auto anticuerpo s, y/o si el nivel del autoanticuerpo frente a ACVR2B en dicha muestra es menor que el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, entonces dicho sujeto es diagnosticado de CCR.
5. Un método para evaluar el pronóstico o seguimiento de la evolución de un paciente que sufre cáncer colorrectal (CCR), que comprende comparar el nivel de, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína, en donde dicho autoanticuerpo se selecciona del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml, un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, en una muestra biológica de dicho paciente que sufre CCR, con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, en donde si el nivel de dicho autoanticuerpo frente a la proteína Piml, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína SRC, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4, o de dicho autoanticuerpo frente a la proteína STK4, en dicha muestra, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos autoanticuerpos, y/o si el nivel del autoanticuerpo frente a ACVR2B en dicha muestra es menor que el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, entonces dicho paciente sufre un CCR con mal pronóstico o presenta un CCR con una evolución desfavorable.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, que comprende determinar el nivel de un autoanticuerpo trente a la proteína Piml, el nivel de un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3 o el nivel de un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, que comprende determinar el nivel de un autoanticuerpo frente a la proteína Piml, el nivel de un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3 y el nivel de un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B; o determinar el nivel de un autoanticuerpo frente a la proteína MAPKAPK3 y el nivel de un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B.
8. Método según la reivindicación 7, que comprende, además, determinar el nivel de un autoanticuerpo frente a la proteína FGFR4.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, en el que dicho CCR se encuentra en sus estadios iniciales (O, I, II).
10. Un método para diagnosticar metástasis en pulmón en un paciente que sufre cáncer colorrectal (CCR), que comprende comparar el nivel de, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína en una muestra de dicho paciente, en donde dicha proteína es una proteína seleccionada del grupo de proteínas mencionadas en la Tabla 2, con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, en donde, si el nivel de autoanticuerpo frente a dicha proteína en dicha muestra es mayor que el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, el paciente de CCR presenta metástasis en pulmón.
11. Un método para diagnosticar metástasis en hígado en un paciente que sufre cáncer colorrectal (CCR), que comprende comparar el nivel de, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína en una muestra de dicho paciente, en donde dicha proteína es una proteína seleccionada del grupo de proteínas mencionadas en la Tabla 3, con el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, en donde, si el nivel de autoanticuerpo frente a dicha proteína en dicha muestra es mayor que el nivel de referencia para dicho autoanticuerpo, el paciente de CCR presenta metástasis en hígado.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha muestra es una muestra de suero del sujeto o una muestra de suero del paciente.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el nivel de autoanticuerpos se determina mediante un inmunoensayo.
14. Método según la reivindicación 13, en el que dicho inmunoensayo comprende un microarray de proteínas o un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
15. Un método de obtención de datos en una muestra de un sujeto que comprende detectar el producto de expresión de, al menos, un gen seleccionado del grupo formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 y ACVR2B, y, si se desea, cuantificar el nivel de expresión de dicho producto de expresión de dicho gen en dicha muestra.
16. Un método para diagnosticar si un sujeto sufre cáncer colorrectal (CCR), que comprende comparar el nivel de expresión de, al menos, un producto de expresión de un gen, en donde dicho gen se selecciona del grupo formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 y ACVR2B, en una muestra de dicho sujeto, con el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen, en donde si el nivel de dicho producto de expresión del gen Piml, o de dicho producto de expresión del gen SRC, o de dicho producto de expresión del gen MAPKAPKS , o de dicho producto de expresión del gen FGFR4, o de dicho producto de expresión del gen STK4, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos productos de expresión de dichos genes y/o si el nivel del producto de expresión del gen ACVR2B es menor que el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen, dicho sujeto es diagnosticado de CCR.
17. Un método para evaluar el pronóstico o seguimiento de la evolución de un paciente que sufre cáncer colorrectal (CCR), que comprende comparar el nivel de expresión de, al menos, un producto de expresión de un gen, en donde dicho gen se selecciona del grupo formado por los genes Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B, en una muestra de dicho paciente que sufre CCR, con el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen, en donde si el nivel de dicho producto de expresión del gen Piml, o de dicho producto de expresión del gen SRC, o de dicho producto de expresión del gen MAPKAPK3, o de dicho producto de expresión del gen FGFR4, o de dicho producto de expresión del gen STK4, es mayor que el nivel de referencia correspondiente para dichos productos de expresión de dichos genes y/o si el nivel del producto de expresión del gen ACVR2B es menor que el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen, dicho paciente sufre un CCR con mal pronóstico o presenta un CCR con una evolución desfavorable.
18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, que comprende determinar el nivel de expresión de un producto de expresión del gen Piml, el nivel de expresión de un producto de expresión del gen MAPKAPK3 o el nivel de expresión de un producto de expresión del gen ACVR2B.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, que comprende determinar el nivel de expresión de un producto de expresión del gen Piml, el nivel de expresión de un producto de expresión del gen MAPKAPKS y el nivel de expresión de un producto de expresión del gen A CVR2B; o determinar el nivel de expresión de un producto de expresión del gen MAPKAPK3 y el nivel de expresión de un producto de expresión del gen ACVR2B.
20. Método según la reivindicación 19, que comprende, además, determinar el nivel de expresión de un producto de expresión del gen FGFR4.
21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en el que dicho producto de expresión del gen Piml, SRC, MAPKAPKS, FGFR4, STK4 o ACVR2B es la proteína Piml , SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 o ACVR2B, respectivamente, o un fragmento de las mismas.
22. Método según la reivindicación 21, en el que el nivel de dicha proteína se determina mediante un inmunoensayo.
23. Método según la reivindicación 22, en el que dicho inmunoensayo comprende un ensayo inmunohistoquímico.
24. Un kit que comprende :
los elementos necesarios para detectar, al menos, un autoanticuerpo seleccionado del grupo formado por un autoanticuerpo frente a la proteína Piml, un autoanticuerpo frente a la proteína SRC, un autoanticuerpo frente a la pro teína MAPKAPK3, un autoanticuerpo frente a la pro teína FGFR4, un autoanticuerpo frente a la proteína STK4, y un autoanticuerpo frente a la proteína ACVR2B, o, alternativamente
los elementos necesarios para detectar, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína seleccionada entre las proteínas mencionadas en la Tabla 2, o, alternativamente
los elementos necesarios para detectar, al menos, un autoanticuerpo frente a una proteína seleccionada entre las proteínas mencionadas en la Tabla 3, o, alternativamente
- los elementos necesarios para detectar, al menos, un producto de expresión de un gen seleccionado del grupo formado por los genes Piml, SRC,
MAPKAPK3, FGFR4, STK4 yACVR2B.
25. Uso de un kit según la reivindicación 24, para detectar un auto anticuerpo frente a una proteína seleccionada del grupo formado por las proteínas Piml, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y ACVR2B; o para
obtener datos en una muestra; o para
- diagnosticar si un sujeto sufre cáncer colorrectal (CCR); o para
evaluar el pronóstico o seguimiento de la evolución de un paciente que sufre CCR; o para
diagnosticar metástasis en pulmón en un paciente que sufre cáncer colorrectal (CCR); o para
- diagnosticar metástasis en hígado en un paciente que sufre cáncer colorrectal (CCR).
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