WO2020229717A1 - Método para predecir la respuesta terapéutica a fármacos inhibidores de la serina-treonina kinasa braf - Google Patents

Método para predecir la respuesta terapéutica a fármacos inhibidores de la serina-treonina kinasa braf Download PDF

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Pedro CRESPO BARAJA
Berta CASAR MARTÍNEZ
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Definitions

  • the present invention is framed within! field of oncology, specifically within the methods for predicting the response to serinethreonine kinase BRAF inhibitor drugs in cancer patients with oncogenic mutations in BRAF (BRAF positive). These methods make it possible to identify early which patients will benefit from said treatment prior to its administration.
  • the invention provides a biomarker, as well as a specific antibody against it, useful for predicting which patients will show sensitivity and, therefore, an adequate clinical response, to subsequent treatment with BRAF inhibitors.
  • Cytoplasmic ERK1 / 2 correlate with a good prognosis in invasive breast tumors and in small cell lung tumors (Blackhall FH. Et al, 2007, Clin Cáncer f ⁇ es, 9: 2241-2247; Nakopoulou L. et al ⁇ , 2007, APMIS , 113: 693-701). Unfortunately, to date this concept has not been able to be brought into practice, as there is no easy way to discriminate between cytoplasmic ERK1 / 2 and nuclear ERK1 / 2, except for cumbersome microscopic techniques (Bollag G et al., 2010, Nature, 467: 596-599), impractical for routine diagnosis.
  • the present invention solves the problem raised above by means of a method that makes it possible to discriminate cytoplasmic ERK1 / 2 from nuclear ERK1 / 2.
  • This method uses, in particular, the detection and quantification, in isolated samples of BRAF positive cancer patients, ERK1 / 2 phosphorylated in serine 301/284 respectively, which have been shown in the present invention to be present only in the cytopiasmatic fraction of ERK.
  • the quantification of the levels of ERK1 / 2 phosphorylated in serine 301/284 thus makes it possible to predict the clinical response to subsequent treatment with BRAF inhibitors.
  • the inventors of the present invention have identified a new phosphorylation site in ERK2, specifically in serine 284 (serine 301 in ERK1) and, after generating an antibody that specifically recognizes ERK1 and ERK2 phosphorylated in serine 301/284 respectively, they have verified that said phosphorylation occurs, solely and exclusively, in the cytopiasmatic fraction of ERK1 / 2.
  • the levels of ERK1 / 2 phosphorylated in serine 301/284 are much higher in melanoma cell lines that respond adequately to treatment with the BRAF inhibitor drug vemurafenib, in comparison with the levels found in lines resistant to said drug. Therefore, the quantification of the levels of ERK1 / 2 phosphorylated in serine 301/284 in biological samples isolated from cancer patients carrying oncogenic mutations in BRAF (BRAF positive) allows to predict the therapeutic response to the administration of BRAF inhibitors.
  • the serine phosphorylated anti-ERK1 / 2 antibody 301/284 generated in the present invention can be used in the method of predicting the therapeutic response to BRAF inhibitors proposed here for the easy and rapid stratification of cases of cancer, preferably melanoma, BRAF positive based on its response potential to BRAF inhibitor therapy.
  • one aspect of the invention refers to the use of levels of phosphorylated ERK1 in serine 301 and levels of phosphorylated ERK2 in serine 284 as a biomarker to predict in vitro the therapeutic response to treatment with an inhibitor drug of serine-threonine kinase BRAF in a patient.
  • Predicting therapeutic response refers to determining, prior to administering treatment, whether the BRAF inhibitor drug will induce a favorable, positive, or adequate response in the subject or patient once treated with it, that is, after administer the drug.
  • a "positive or adequate response" to a BRAF inhibitor drug occurs when an improvement or reduction in symptoms of the tumor, preferably cancer, more preferably melanoma, is observed in the patient.
  • Said positive or adequate response to treatment with a BRAF inhibitor occurs, in particular, when the levels of total ERK1 / 2 activity, evaluated by means of the phosphorylation levels of its TEY phosphorylation motif, are decreased in an isolated biological sample. of the patient after drug administration compared to said activity levels measured in a biological sample isolated from the same patient prior to drug administration.
  • Said positive or adequate response to treatment with a BRAF inhibitor also occurs, preferably, when there is disappearance, or decrease, of the macroscopic metastatic lesions.
  • in vitro means that the methods and uses described in the invention are performed entirely outside the human or animal body.
  • subject preferably refers to a human or non-human mammal, such as primates, equines, rodents, ruminants, cats or dogs.
  • patient to whom the invention relates is a human being.
  • ERK1 / 2 preferably refers to human ERK1 (MAPK1) and ERK2 (MAPK3) (MAPK1 (UniprotKB: P28482) and MAPK3 (Unipro ⁇ KB: P27361) according to the HUGO nomenclature).
  • MAPK1 Human ERK1
  • ERK3 MAPK3
  • MAR kinases involved in various cellular functions, such as regulation of meiosis, mitosis, and postmitosis in differentiated cells.
  • a variety of stimuli including growth factors, cytokines, viral infection, carcinogenic agents, etc., activate the RAS-ERK signaling pathway.
  • ERK1 / 2 are rapidly phosphorylated upon activation of cell surface receptor tyrosine kinases, such as the epidermal growth factor receptor. This phosphorylation leads to the activation of its kinase activity.
  • the "ERK1 / 2 phosphorylated at serine 301 or at serine 284, respectively” are the ERK1 and ERK2 enzymes that have incorporated a phosphate group at said specific positions in their amino acid sequence.
  • the enzyme "serine-threonine kinase BRAF” is the enzyme, preferably human, (UniprotKB: P15056), more preferably encoded by the 7q34 gene.
  • the term "BRAF positive” refers, in the present invention, to the presence of a substitution (oncogenic) mutation at residue V600 of the BRAF amino acid sequence, preferably to the presence of the V600E substitution.
  • the serine threonine kinase inhibitor BRAF is vemurafenib and / or dabrafenib, more preferably vemurafenib.
  • the drug “vemurafenib” (PLX4032 or RG7204) is a low molecular weight chemical compound that is administered orally, inhibitor of the activity of the enzyme serine-threonine kinase BRAF.
  • the therapeutic indication of this BRAF inhibitor is in unresectable melanoma or metastatic with a positive BRAF V600 mutation. It is marketed under the name Zeiboraf®.
  • the drug “dabrafenib” is also a BRAF inhibitor and its therapeutic indication is in unresectable or metastatic melanoma with a positive BRAF V600 mutation, as treatment alone or in combination with trametinib, and in advanced non-small cell lung cancer with mutation of BRAF V600 positive, in combination with trametinib. It is marketed under the name of Tafinlar®
  • Oncogenic mutations in the gene encoding the BRAF enzyme which lead to the substitution of the amino acid Valine (V) at position 600, preferably by the aspartic amino acid (E), lead to the constitutive activation of this protein, which promotes cell proliferation in the absence of the growth factors that are normally required for such proliferation.
  • Oncogenic mutations in BRAF have been very frequently identified in specific cancers, being present, for example, in 60% of melanomas. The most frequently observed oncogenic mutation in BRAF is V6QQE, which represents approximately 90% of the mutations in BRAF observed in melanoma.
  • the patient referred to in the present invention suffers from cancer, in particular BRAF positive cancer, that is to say, is a cancer patient presenting an oncogenic mutation in BRAF where said mutation is preferably in V60Q, more preferably the mutation is V60GE.
  • the cancer is melanoma, even more preferably BRAF V600 mutation positive unresectable or metastatic melanoma, or non-small cell lung cancer, even more preferably BRAF V800 mutation positive advanced non-small cell lung cancer.
  • the cancer is melanoma.
  • the BRAF inhibitor is vemurafenib and the patient is suffering from melanoma.
  • cytoplasmic ERK1 / 2 are correlated, not only with the therapeutic response to treatment with a BRAF inhibitor drug, but also with a good prognosis in breast tumors, preferably invasive, and in lung tumors, preferably small cells (Blackhali FH. E ⁇ ai, 2007, Clin Cancer Res, 9: 2241-2247; Nakopoulou L.
  • another aspect of the invention refers to the use of the levels of phosphorylated ERK1 in serine 301 and levels of ERK2 phosphorylated in serine 284 as a biomarker for the in vitro prognosis of breast tumors, preferably invasive, and / or lung, preferably small cell, in a patient.
  • prognosis refers to the method by which a prediction is established of the events that will occur in the development or course of a disease, preferably cancer, including relapse or metastatic dissemination capacity.
  • method of the invention for predicting the therapeutic response to treatment with a serine-threonine kinase inhibitor drug BRAF in a patient, wherein said method comprises the following stages:
  • step (a) Quantify the levels of serine 301 phosphorylated ERK1 and serine 284 phosphorylated ERK2 in a biological sample isolated from the patient (collected prior to administering treatment with the BRAF inhibitor), b. Compare the levels quantified in step (a) with a reference value, where said reference value comes from the quantification of levels of phosphorylated ERK1 in serine 301 and of ERK2 phosphorylated in serine 234 in a biological sample isolated from a unresponsive patient to treatment with a serine-threonine kinase inhibitor BRAF, and c. Assign the patient of stage (a) to the group of individuals who will respond adequately to the treatment when the quantification value obtained in stage (a) is significantly higher than the reference value.
  • Quantify refers to the measurement of the amount or concentration of ERK1 phosphorylated at serine 301 and ERK2 phosphorylated at serine 284 in the sample.
  • amount refers to, but is not limited to, the absolute or relative amount of serine 301 phosphorylated EKK1 and 284 serine phosphorylated ERK2 in the sample, as well as any other value or parameter related to it or that can be derived from it.
  • values or parameters comprise, for example, intensity values of a signal obtained from any physical or chemical property of ERK1 phosphorylated at serine 301 and ERK2 phosphorylated at serine 284 obtained by indirect or direct measurements, for example, by mass spectroscopy or by nuclear magnetic resonance.
  • the quantification of the levels of phosphorylated ERK1 in serine 301 and of ERK2 phosphorylated in serine 284, as described in the present invention, can be carried out as a direct or indirect measurement.
  • Direct measurement refers to the measurement of the intensity of a signal directly obtained from the presence of ERK1 phosphorylated in serine 301 and ERK2 phosphorylated in serine 284. This signal is directly correlated with the number of product molecules present in the sample. This signal, also called “intensity signal”, can be obtained, for example, by measuring an intensity value derived from a physical or chemical property of the product.
  • Indirect measurement refers to the measurement obtained from a secondary component (i.e., a component that is different from ERK1 phosphorylated at serine 301 and ERK2 phosphorylated at serine 284) or a measurement derived from, for example, responses cells, ligands, substrates, tags or enzymatic reaction products associated with phosphorylated ERK1 at serine 301 and phosphorylated ERK2 in serine 284 or its activities.
  • a secondary component i.e., a component that is different from ERK1 phosphorylated at serine 301 and ERK2 phosphorylated at serine 284
  • This quantification of the levels of phosphorylated ERK1 in serine 301 and the levels of phosphorylated ERK2 in serine 284 can be performed, but not limited to, by incubation or in situ hybridization with specific antibodies against (that recognize) ERK1 phosphorylated in serine 301 and / or ERK2 phosphorylated at serine 234, or an immunologically active fragment thereof, in assays such as Western blot, electrophoresis geies, membrane blotting and hybridization with specific probes, immunoprecipitation assays, protein arrays, preferably microarrays based on antibodies, flow cytometry, immunofluorescence, immunobistochemistry, chemiluminescence, immunoassays such as ELISA, radioimmunoassay (RIA), or any other enzymatic method, by incubation with a specific ligand or substrate, lateral flow devices or Luminex®, NMR or any other technique diagnostic imaging using paramagnetic nanoparticles or another type
  • Measurement of the levels of phosphorylated ERK1 in serine 301 and of phosphorylated ERK2 in serine 284 can be carried out by the specific recognition of any fragment of the enzymes thus phosphorylated by means of probes and / or antibodies.
  • the quantification of the levels of ERK1 phosphorylated in serine 301 and of ERK2 phosphorylated in serine 284 is carried out in the present invention by immunoassay based on specific antibodies against said forms of ERK, more preferably by Western blot.
  • the antibodies employed may be labeled or unlabeled, for example, they may be labeled with a secondary antibody, an enzyme, an enzyme substrate, radioisotopes, magnetic labels, fluorescence, or the like, and / or they may be immobilized on a support such as a microtitration plate or bio-chip.
  • an “immunoassay” or “immunohistochemical assay” is a biochemical assay that detects and / or quantifies the amount or concentration of one or more peptides of interest (in the context of the present invention, ERK1 phosphorylated on serine 301 and ERK2 phosphorylated on serine 284), in a sample. To do this, the reaction uses one or more antibodies specific to the antigens to be detected. The quantification of the protein can be carried out by any method known in the art, for which the antigen and / or the antibody will preferably be labeled.
  • the immunoassay to which the present invention relates can be competitive or non-competitive.
  • the detected signal will be inversely proportional to the concentration of antigen in the sample.
  • the detected signal is directly proportional to the concentration of antigen in the sample.
  • Examples of useful immunoassays to be applied in the method of the present invention are, but are not limited to, immunobloting (Western biot), immunoprecipitation, ELISA, multiplex assay, dipstick assay, on-line immunoassay (LIA), radioimmunoassay (RIA), immunoradiometric assay.
  • IRMA immunofluorescence
  • immunohistochemistry immunohistochemistry
  • chemoinvestment passive hemagiutination
  • immunostaining with gold particles transmission electron microscopy
  • lipopolysaccharide LPS
  • iqPCR immunoquantitative real-time PCR
  • electrochemoiniscent labels Label-free immunoassays (e.g., surface plasmon resonance), photoacoustic immunoassay, cloned donor enzyme immunoassay (CEDIA), lateral flow immunochromatographic assays, magnetic immunoassay (MIA), envelope-based fiber optic immunoassay (SOFIA), immunoassay based on CD / DVD or agglutination-PCR (A DAR).
  • MIA magnetic immunoassay
  • SOFIA envelope-based fiber optic immunoassay
  • a DAR agglutination-PCR
  • the ELISA assay is based on the immobilization of an antigen or antibody on a solid support, so that this system is subsequently put in contact with a fluid phase that contains the complementary reagent, which can be linked to a label or marker compound.
  • the ELISA technique referred to in the present invention can be direct, indirect or sandwich.
  • the antibody used in the methods described herein is preferably conjugated to a detection system or is linked to a secondary antibody which is coupled to a detection system.
  • the signal produced as a consequence of the labeling reaction can be measured, for example, but not limited to, by spectrophotometry, chemiluminescence, spectrophotometry, bioluminescence, deferential calorimetry, analytical ultracentrifugation, interferometry, etc.
  • the technique employed in the present invention is chemiluminescence.
  • collected prior to administering the BRAF inhibitor treatment refers to a biological sample from the patient when the patient has not yet received prior treatment with BRAF inhibitors, preferably vemurafenib.
  • isolated biological sample refers to, but is not limited to, any biological tissue and / or fluid obtained or extracted from a subject or patient that comprises tumor cells, that is, cells derived from a tumor.
  • the biological sample can be, for example, a tissue from a tumor biopsy or a sample from a fine needle aspirate, or it can be a biological fluid, for example, blood, plasma, serum, lymph, ascites fluid, urine, saliva or glandular exudate.
  • the biological sample can be fresh, frozen, fixed or fixed and embedded in paraffin.
  • reference value is any value or range of values derived from the quantification of the levels of phosphorylated EKK1 in serine 301 and of ERK2 phosphorylated in serine 284 in an isolated biological sample from a patient known not to respond adequately to treatment with a BRAF inhibitor, preferably vemurafenib, or in a mixture of isolated biological samples from such patients.
  • step (b) of the method of the invention can be carried out manually or in an automated manner.
  • An amount "significantly greater” than a reference value can be determined using various statistical tools, such as, for example, but not limited to, determination of confidence intervals, determination of the p-value, the S ⁇ dent's T test, Fisher's discriminant functions, Kruskal-Wallis, ANOVA, Bonferroni, Mann-Whitney, etc.
  • Steps (a) and (b) of the method of the invention can be totally or partially computerized. Furthermore, the method of the invention may comprise other additional, optional steps, for example related to the pre-treatment of biological samples before their analysis.
  • the serine-threonine kinase inhibitor BRAF is vemurafenib and / or dabrafenib, more preferably vemurafenib
  • the patient to which the method of the invention is to be applied suffers from cancer, in particular BRAF positive cancer, that is, it is a cancer patient that has an oncogenic mutation in BRAF where said mutation is preferably in the V600, most preferably the mutation is V600E.
  • cancer in particular BRAF positive cancer
  • said mutation is preferably in the V600, most preferably the mutation is V600E.
  • the cancer is melanoma, even more preferably unresectable or metastatic melanoma with positive BRAF V600 mutation, or non-small cell lung cancer, even more preferably BRAF V600 mutation positive advanced non-small cell lung cancer.
  • the cancer is melanoma.
  • the serine threonine kinase inhibitor BRAF is vemurafenib and the patient suffers from melanoma.
  • the patient to whom the method of the invention is to be applied is human.
  • the quantification of the levels of phosphorylated ERK1 in serine 301 and of ERK2 phosphorylated in serine 284 is carried out, in the methods described herein, by using an antibody that recognizes ERK1 phosphorylated in serine 301 and ERK2 phosphorylated on serine 284 specific for the peptide consisting of SEQ ID NO: 1 (NRLFPNADSKALDLLDKML), that is, by means of the antibody of the invention described below.
  • Another aspect of the invention relates to an in vitro method for the prognosis of tumors breast, preferably invasive, and / or lung, preferably microcytic, in a patient, where said method comprises the following steps:
  • stage (a) Assign the patient from stage (a) to the group of individuals who will present a good prognosis when the quantification value obtained in stage (a) is significantly higher than the reference value from stage (b). "Relapse, metastasis and / or absence of improvement in tumor symptoms, preferably cancer.
  • the antibody described in the present invention which recognizes ERK1 phosphorylated at serine 301 and ERK2 phosphorylated at serine 284 and which is specific against the peptide of SEQ ID NO: 1, has been designed by the inventors of the present invention to develop the methods described here. Therefore, another aspect of the invention refers to an antibody, which recognizes ERK1 phosphorylated in serine 301 and ERK2 phosphorylated in serine 284, specific against the peptide consisting of SEQ ID NO: 1 (NRLFPNADSKALDLLDKML).
  • this antibody will be referred to as "antibody of the invention”.
  • This antibody of the invention is poiiclonai, that is, it has been generated by immunizing an animal, preferably a non-human mammal, more preferably a rabbit, with the peptide (antigen) designed by the inventors consisting of SEQ ID NQ: 1.
  • Methods for the production and purification of polyclonal antibodies by immunizing an animal with the corresponding antigen are widely known to those skilled in the art, and any of them could be used to obtain the antibody of the invention.
  • the serine at position 9 is phosphorylated, preferably said serine has been chemically phosphorylated.
  • Said peptide is 100% homologous or identical between the paralogs ERK1 and ERK2, therefore the antibody of the invention generated against it recognizes (binds, hybridizes with) both serine phosphorylated proteins 301 and 284 respectively.
  • Another aspect of the invention refers to a peptide consisting of SEQ ID NO: 1 (NRLFPNADSKALDLLDKML), where the serine at position 9 is phosphorylated.
  • Another aspect of the invention refers to the use of said peptide for the generation of the antibody of the invention.
  • the antibody of the invention is labeled.
  • labeled refers to the antibody being conjugated to a tag or detection system.
  • a large number of labels that can be conjugated to an antibody are known in the state of the art. Examples of such labels are, but are not limited to, radioisotopes [eg 32P, 35S, or 3H], fluorescent or luminescent markers [eg, Fluorescein (FITC), Rhodamine, Texas Red, GFP, Phycoerythrin (PE), Aiophycocyanin, 6 - carboxyf! uorescein (6-FAM), 2 ', 7'-dimethoxy-4', 5'-dic!
  • the advantage of labeling antibodies is that they can be detected and their signal quantified.
  • the antibody of the invention is immobilized on a support.
  • immobilized refers to the fact that the antibody is bound to a support without losing its immunoreaction activity with its antigen (peptide of SEQ ID NO: 1).
  • the support is the surface of a matrix (for example, a nyion or latex matrix), a membrane, a plate of microtitration (for example, 96-well) or support made of plastic, silicone, glass or similar, or beads (for example spheres, preferably agarose spheres or small superparamagnetic microspheres composed of biodegradable matrices), gel, cellulosic support, adsorption resin or similar.
  • a matrix for example, a nyion or latex matrix
  • a membrane for example, a plate of microtitration (for example, 96-well) or support made of plastic, silicone, glass or similar, or beads (for example spheres, preferably agarose spheres or small superparamagnetic microspheres composed of biodegradable matrices), gel, cellulosic support, adsorption resin or similar.
  • beads for example spheres, preferably agarose spheres or small superparamagnetic microspheres composed of bio
  • the antibody described in the present invention can be human, humanized, recombinant, monoclonal, chimeric, conjugated, etc.
  • Immunoiogically active fragments of the antibody of the invention are also included within the scope of the present invention. Examples of such fragments are, but are not limited to, a Fab, F (ab ') 2, Fab', F se or Fv fragment.
  • kit of the invention which comprises the antibody of the invention, where said antibody may or may not be labeled and / or immobilized as described above.
  • kits preferably comprises all those elements necessary to predict the therapeutic response to treatment with a BRAF inhibitor drug in a patient or to predict (the evolution of) breast tumors, preferably invasive, and / or lung, preferably small cells. in a patient, according to the methods described above.
  • the kit of the invention can comprise elements such as, for example but not limited to, preservation solutions, buffers, diluents, filters, vehicles, enzymes, such as polymerases, cofactors necessary to obtain an optimal activity of said enzymes, etc.
  • the kit can comprise all those supports and containers necessary for the implementation of the methods described herein.
  • the kit can also comprise other molecules, genes, proteins or probes, suitable as positive or negative controls.
  • the kit of the invention further comprises instructions on how to carry out the methods described herein, labels to identify the different elements included in the kit and their application and / or lists of the components included in the kit.
  • the kit of the invention can comprise, in different combinations, primers or oligonucleotides and control probes, secondary antibodies that serve for the marking through their conjugation with a detection system and / or control antibodies that serve for the normalization of the levels of expression, reagents, detection signals, instruments necessary for processing and commissioning of arrays, fluorochromes, labeling probes, substrates necessary for the activation or initiation of the labeling reaction by the selected conjugation system, blocking solutions, de stop and / or wash, or the like.
  • control probes, primers and / or antibodies can be specific for genes, proteins or peptides constitutively expressed by the cells in the biological sample analyzed, so that their application makes it possible to ensure that the values of the expression levels of ERK1 phosphorylated in serine 301 and ERK2 phosphorylated at serine 284 measured in the sample are reliable and correct.
  • the kit may also comprise suitable means to house and preserve the biological sample to be analyzed in the methods described herein.
  • suitable means may be, for example, a container suitable for containing a sample from a tumor biopsy or aspirate.
  • said kit may comprise a container such as bottles, vials, syringes or test tubes.
  • Said container can be made of, for example, but not limited to, glass or plastic or any other suitable material for the preservation of the biological sample under optimal conditions.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the antibody of the invention or the kit of the invention to predict in vitro the therapeutic response to treatment with a serine-threonine kinase inhibitor drug BRAF in a patient, or to predict in vitro (the evolution of) breast tumors, preferably invasive, and / or lung, preferably small cell, in a patient, more preferably by the methods described above.
  • the serine-threonine kinase inhibitor BRAF it is vemurafenib and / or dabrafenib, preferably vemurafenib.
  • the patient suffers from cancer, in particular BRAF positive cancer, that is, it is a cancer patient presenting an oncogenic mutation in BRAF, where said mutation is preferably V600, more preferably the mutation is V600E.
  • the cancer is melanoma, even more preferably BRAF V600 mutation positive unresectable or metastatic melanoma, or non-small cell lung cancer, even more preferably BRAF V600 mutation positive advanced non-small cell lung cancer.
  • the cancer is melanoma.
  • the serine-threonine kinase inhibitor BRAF is vemurafenib and the patient has melanoma
  • the patient is human.
  • Another aspect of the invention relates to an in vitro method for obtaining information or data useful for predicting the therapeutic response to treatment with a serine-threonine kinase inhibitor drug BRAF in a patient, where said method comprises the following steps:
  • Another aspect of the present invention relates to a method of treating a patient suffering from BRAF positive cancer, preferably BRAF positive melanoma, comprising: (a) identifying the patient as a responder or non-responder to treatment with BRAF inhibitors, preferably to treatment with vemurafenib, according to the method of the invention; and (b) administering said treatment to the patient when in step (a) it has been determined that he is a self-responding patient
  • HEK294 cells were transfected with human ERK2 (Hs) or zebrafish (Dr), where the homologous residue of serine 284 is a proline, therefore, not phosphorylatable. It is observed that the antibody only recognizes human ERK2, in cells under stimulation, in this case with EGF. An anti-FLAG antibody was used as a control.
  • ERK1 / 2 phosphorylated in ser 301/284 are located exclusively in the cytoplasm. HeLa cells were stimulated with EGF for 5 min, and the subcellular localization of phosphorylated endogenous ERK1 / 2 in the aforementioned residues was analyzed by immunofluorescence and confocal microscopy. It is observed that ERK1 / 2 phosphorylated in these positions are completely excluded from the nucleus, marked with DAR!
  • Fig. 3 Correlation between levels of ERK1 / 2 phosphorylated in ser 301/284 and sensitivity to vemurafenib. From the BRAF positive melanoma cell line M249, a subline resistant to vemurafenib (vemR) was obtained and the levels of phospho-ser 284/301 were analyzed in this subline in comparison with the parental line. It is observed that these levels are much higher in the parental line, sensitive to vemurafenib. Fig, 4. Correlation between levels of ERK1 / 2 phosphonates in ser 301/284 and sensitivity to vemurafenib.
  • vemR subline resistant to vemurafenib
  • vemurafenib The sensitivity to vemurafenib was evaluated in different melanoma lines, analyzing the reduction in the total activity of ERK1 / 2, measured by the decrease in the levels of canonical phosphorylation (p-ERK). It is observed that the most sensitive lines are 8505C and A375P. Phospho-ser 284/301 levels were also analyzed in these lines. It is observed that these levels, before treatment with vemurafenib, are much higher than those observed in the resistant lines MELJUSO and SKMEL2. Fig, 5. Vemurafenib sensitivity of melanoma lines used in Fig. 4, evaluated by the concentration necessary to stop proliferation (GI50). It is observed that the most sensitive lines are 8505C and A375P, which show the highest levels of phospho-ser 284/301 in FIG. Four.
  • Example 1 Material and methods.
  • the cell lines used in the tests were:
  • HEK293T Human kidney embryonic cells, T antigen positive.
  • HeLa epithelial cells of cervical cancer.
  • A375p melanoma epithelial cells, show a BRAF mutation.
  • SKMEL2 melanoma epithelial cells, show BRAF mutation.
  • Parental M249 and Vemurafenib-resistant M249 melanoma epithelial cells, mutation in BRAF.
  • the cell lines were grown in DMEM culture medium supplemented with 10% Fetal Bovine Serum and antibiotics (Penicillin and Streptomycin).
  • the cells were used with the appropriate volume of lysis buffer (20 mM HEPES pH 7.5, 10 Mm EGTA, 40 mM b-glycerophosphate, 1% non-ionic detergent NP40, 2.5 mM MgCb , 1 mM orthovanadate, 1 mM DTT and extemporaneously 10mg / ml aprotinin and 10mg / ml leupeptin).
  • the cells were harvested and centrifuged at 12,000 rpm, for 10 minutes and at 4 ° C.
  • the protein extracts were separated from the rest of the components of the cells and the protein concentration of each cell was quantified. For the determination of the amount of protein, the Bradford method was used.
  • the filters were incubated with the phospho-specific primary antibody of the invention (0.2-0.4 mg / ml diluted in 4% BSA in TBS-T) for one hour at room temperature or overnight at 4 ° C under stirring. Two washes with TBS-T were performed for a total of fifteen minutes, after which the filters were incubated with the corresponding secondary antibody conjugated to peroxidase, diluted 1: 5,000 or 1: 10,000 in 0.4% BSA in TBS-T for one hour at room temperature. Two TBS-T washes were carried out again and the protein was detected by chemiluminescence using the ECL kit. An autoradiography of the filters with Kónica films was carried out, which allowed to detect a band where the primary antibody had specifically recognized the phosphorylated prophein of interest. As internal loading control, a specific antibody was used that recognizes the total protein of interest.
  • the cells were grown in DMEM 10% Fetal Bovine Serum until subconfluence on sterile 10 mm diameter glass coverslips. At the time of immunofluorescence, cells were washed with 1X PBS and fixed with a 4% solution of paraformaldehyde in 1X PBS, for 10 minutes at room temperature. Cells were permeabilized by incubating for 5 minutes with a 0.5% dilution of Triton X-100 in PBS, followed by three 1X PBS washes of five minutes each. The cells were then incubated with the phosphospecific primary antibody of the invention at a concentration 1/100 for one hour in a humid chamber.
  • Tissue samples or cell pellets were fixed with 4% parafolmaldehyde and embedded in paraffin.
  • the sections were mounted on positively charged slides (Genex-brand®), recommended for immunohistochemistry. Dewaxing was achieved by passing the sections through xylene (10 min), and decreasing graduations of ethyl alcohol (100 ° 10 min, 98 ° 5 min, and 70 ° 5 min). A blocking of the endogenous peroxidase activity was carried out by incubating the sections in 3% hydrogen peroxide solution in methanol for 15 min, and incubation in distilled water for 10 min.
  • the sections were incubated with a 1% BSA bovine serum albumin solution in TBST buffer for 30 min with the intention of blocking non-specific binding sites. Subsequently, the sections were incubated with the phosphospecific antibody of the invention at a 1: 100 dilution in PBS, overnight at 4 ° C, in a humid chamber.
  • the development of the reaction was carried out by the DAKO chromogen DAB technique. Contrast staining was performed by immersing the sections in Mayer's hematoxylin for 1 min; they were then placed under a stream of running water for development. Mounting was done with aqueous mounting medium (VectaMount AQ, Vector Lab ind). Observation of the preparations was made on a Nikon microscope. The photographs were taken with an Olympus C4QG0 digital camera.
  • ERK1 / 2 phosphorylated in ser 301/284 was analyzed. For this, immunofluorescence was performed in HeLa cells, fasting (starved) or stimulated with EGF for 5 min (Fig. 2). It was observed, by confocal microscopy, that endogenous ERK1 / 2 phosphorylated in being 301/284 are located exclusively in the cytoplasm, being completely excluded from the cell nucleus, stained by DAPI.
  • the correlation of the levels of ERK1 / 2 phosphorylated to be 301/284 with the sensitivity towards BRAF inhibitors in melanoma cells carrying BRAF mutations was analyzed.
  • the M249 cell line was used, from which a subline resistant to vemurafenib (vemR) was obtained.
  • the levels of endogenous ERK1 / 2 phosphorylated in ser 301/284 were analyzed by western blot (FIG. 3) comparing the resistant subline with the parental line, sensitive to vemurafenib. It was observed that the levels of phospho-ser 301/284 are much higher in the parental line, sensitive to vemurafenib, demonstrating a positive correlation between the levels of phospho-ser 301/284 and the response to the antitumor compound.

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Abstract

La presente invención se refiere a un método in vitro que permite predecir la respuesta terapéutica al tratamiento con fármacos inhibidores de BRAF, tales como vemurafenib, en pacientes de cáncer asociado a mutaciones oncogénicas en dicha kinasa, tal como meianoma BRAF positivo. Dicho método se basa en ¡a medición de los niveles de ERK1/2 citoplasmática, a través de la detección y cuantifi catión de ERK1/2 fosforiladas en serina 301/284 respectivamente, en una muestra biológica aislada del paciente. La invención también proporciona un anticuerpo específico frente a ERK1/2 fosforiladas en serina 301/284 y un kit que lo comprende, ios cuales son de utilidad en el método descrito.

Description

DESCRIPCIÓN
MÉTODO PARA PREDECIR LA RESPUESTA TERAPÉUTICA A FÁRMACOS INHIBIDORES DE LA SERINA-TREONINA KINASA BRAF La presente invención se encuadra dentro de! campo de la oncología, específicamente dentro de los métodos de predicción de la respuesta a fármacos inhibidores de ia serina- treonina kinasa BRAF en pacientes de cáncer portadores de mutaciones oncogénicas en BRAF (BRAF positivos). Dichos métodos permiten identificar tempranamente qué pacientes se beneficiarán de dicho tratamiento previamente a su administración. En particular, la invención proporciona un biomarcador, así como un anticuerpo específico frente al mismo, útil para predecir qué pacientes mostrarán sensibilidad y, por tanto, una respuesta clínica adecuada, a un posterior tratamiento con inhibidores de BRAF.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El 60% de los melanomas portan mutaciones oncogénicas en la serina / treonina kinasa BRAF. Actualmente, el único tratamiento eficaz para estos casos es mediante la administración de inhibidores específicos de dicha kinasa (por ejemplo, vemurafenib y dabrafenib). Aunque la mayoría de los casos responden al tratamiento, por razones todavía desconocidas aproximadamente un 30% de ios pacientes son refractarios a dicha terapia, por lo que dichos pacientes se ven sometidos a un tratamiento inútil, no exento de efectos secundarios adversos. Además, considerando que dicho tratamiento cuesta alrededor de 30.000€ por paciente, estos casos suponen para los sistemas de salud un dispendio de recursos económicos innecesario y completamente estéril. La existencia de pacientes refractarios al tratamiento con fármacos inhibidores de BRAF hace necesario desarrollar métodos de predicción que puedan aplicarse en ia práctica clínica para identificar estos pacientes en una etapa temprana. Este enfoque ayudaría a diseñar estrategias de tratamiento eficaces adaptadas a cada paciente. La caracterización de marcadores moleculares que permitan discriminar ios casos que son susceptibles de responder ai tratamiento con inhibidores de BRAF y ios que no, entre todos los pacientes de melanoma BRAF positivo, es de crucial importancia. Ser capaces de determinar tempranamente si el paciente presentará una respuesta favorable al tratamiento antes de administrar el mismo sería muy útil en la práctica clínica para poder seleccionar el tratamiento apropiado para cada caso individual. Esto permitiría a su vez mejorar el pronóstico del sujeto.
Sin embargo, actualmente no hay disponible ningún biomarcador ni ninguna metodología que permita predecir, de manera fiable y simple, la respuesta clínica ai tratamiento con fármacos inhibidores de BRAF en estos pacientes antes de proceder a su administración. Es decir, no se dispone de métodos susceptibles de ser aplicados en la práctica clínica que permitan la identificación de los pacientes no respondedores, lo que impide predecir la eficacia de la terapia.
Hace unos años se describió que la respuesta a vemurafenib se correlaciona positivamente con los niveles citopiasmáticos de la MAR kinasa ERK1/2 (Bollag G etal., 2010, Nature, 467: 596-599). A este respecto, cabe destacar también que ios niveles de
ERK1/2 citoplasmático se correlacionan con un buen pronóstico en tumores de mama invasivos y en tumores microcíticos de pulmón (Blackhall FH. et al, 2007, Clin Cáncer fíes, 9: 2241-2247; Nakopoulou L. et al·, 2007, APMIS, 113: 693-701). Desafortunadamente, hasta la fecha dicho concepto no se ha podido llevar a la clínica, ya que no hay una manera fácil de discriminar entre ERK1/2 citoplasmática y ERK1/2 nuclear, a no ser por engorrosas técnicas microscópicas (Bollag G et al., 2010, Nature, 467: 596-599), poco prácticas para el diagnóstico rutinario.
Por lo tanto, es necesario disponer de herramientas adecuadas susceptibles de ser empleadas en la práctica clínica que posibiliten identificar de manera selectiva ERK1/2 citoplasmática versus ERK1/2 nuclear, ya que dichas herramientas permitirían predecir la respuesta de ios pacientes de cáncer, preferiblemente melanoma, BRAF positivo a la administración terapéutica de fármacos inhibidores de BRAF, tales como vemurafenib. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención soluciona el problema anteriormente planteado mediante un método que permite discriminar ERK1/2 citoplasmática de ERK1/2 nuclear. Dicho método utiliza, en particular, la detección y cuantificación, en muestras aisladas de pacientes de cáncer BRAF positivo, de ERK1/2 fosforiiadas en la serina 301/284 respectivamente, las cuales se ha demostrado en la presente invención que están presentes únicamente en la fracción citopiasmática de ERK. La cuantificación de los niveles de ERK1/2 fosforiiadas en la serina 301/284 permite, así, predecir la respuesta clínica a un posterior tratamiento con inhibidores de BRAF
Los inventores de la presente invención han identificado un nuevo sitio de fosforilación en ERK2, concretamente en la serina 284 (serina 301 en ERK1) y, tras generar un anticuerpo que reconoce específicamente a ERK1 y ERK2 fosforiiadas en serina 301/284 respectivamente, han comprobado que dicha fosforilación se da, única y exclusivamente, en la fracción citopiasmática de ERK1/2. Así, utilizando técnicas de electroforesis de proteínas, se demuestra en la presente invención que los niveles de ERK1/2 fosforiiadas en serina 301/284 son muy superiores en líneas celulares de melanoma que responden adecuadamente ai tratamiento con el fármaco inhibidor de BRAF vemurafenib, en comparación con ios niveles encontrados en líneas resistentes a dicho fármaco. Por tanto, la cuantificación de los niveles de ERK1/2 fosforiiadas en serina 301/284 en muestras biológicas aisladas de pacientes de cáncer portadores de mutaciones oncogénicas en BRAF (BRAF positivo) permite predecir la respuesta terapéutica a la administración de inhibidores de BRAF.
Asimismo, el anticuerpo antí-ERK1/2 fosforiiadas en serina 301/284 generado en la presente invención puede ser utilizado en el método de predicción de la respuesta terapéutica a inhibidores de BRAF aquí propuesto para la estratificación, fácil y rápida, de los casos de cáncer, preferiblemente melanoma, BRAF positivo en función de su potencial de respuesta a la terapia con inhibidores de BRAF.
Por todo ello, un aspecto de la invención se refiere al uso de los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de los niveles de ERK2 fosforilada en la serina 284 como biomarcador para predecir in vitro la respuesta terapéutica al tratamiento con un fármaco inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF en un paciente.
“Predecir la respuesta terapéutica” se refiere a determinar, antes de administrar el tratamiento, si el fármaco inhibidor de BRAF inducirá una respuesta favorable, positiva o adecuada en el sujeto o paciente una vez tratado con el mismo, es decir, después de administrar el fármaco. Una“respuesta positiva o adecuada” a un fármaco inhibidor de BRAF se produce cuando se observa una mejora o una reducción en ios síntomas del tumor, preferibiemente cáncer, más preferiblemente melanoma, en el paciente. Dicha respuesta positiva o adecuada ai tratamiento con un inhibidor de BRAF se da, en particular, cuando los niveles de actividad total de ERK1/2, evaluados mediante los niveles de fosforilación de su motivo de fosforilación TEY, se ven disminuidos en una muestra biológica aislada del paciente tras la administración del fármaco en comparación con dichos niveles de actividad medidos en una muestra biológica aislada del mismo paciente previamente a la administración del fármaco. Dicha respuesta positiva o adecuada al tratamiento con un inhibidor de BRAF se da, también, preferibiemente, cuando hay desaparición, o disminución, de las lesiones metastáticas macroscópicas.
El término“ín vitro” significa que los métodos y usos descritos en la invención se realizan enteramente fuera del cuerpo humano o animal.
El término“sujeto”,“individuo” o“paciente”, como se usa en la presente invención, se refiere preferiblemente a un humano o mamífero no humano, tai como primates, equinos, roedores, rumiantes, gatos o perros. Preferiblemente, el paciente al que se refiere la invención es un ser humano.
“ERK1/2” se refiere, preferiblemente, a ERK1 (MAPK1) y ERK2 (MAPK3) humanas (MAPK1 (UniprotKB: P28482) y MAPK3 (UniproíKB: P27361) según la nomenclatura HUGO). Son MAR kinasas implicadas en diversas funciones celulares, tales como regulación de la meiosis, mitosis y postmitosis en células diferenciadas. Una variedad de estímulos, incluyendo factores de crecimiento, citoquinas, infección viral, agentes carcinogénicos, etc., activan la vía de señalización RAS-ERK. ERK1/2 son rápidamente fosforiladas tras la activación de ios receptores tirosina kinasas de la superficie celular, tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico. Esta fosforilación conduce a la activación de su actividad kinasa.
Las“ERK1/2 fosforiladas en la serina 301 o en la serina 284, respectivamente” son las enzimas ERK1 y ERK2 que han incorporado un grupo fosfato en dichas posiciones concretas de su secuencia aminoacídica. La enzima “serina-treonina kinasa BRAF” es ia enzima, preferiblemente humana, (UniprotKB: P15056), más preferiblemente codificada por el gen 7q34. La expresión “BRAF positivo” se refiere, en la presente invención, a la presencia de una mutación (oncogénica) de sustitución en el residuo V600 de la secuencia aminoacídica de BRAF, preferiblemente a la presencia de la sustitución V600E.
En otra realización preferida, ei inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF es vemurafenib y/o dabrafenib, más preferiblemente vemurafenib.
El fármaco“vemurafenib” (PLX4032 o RG7204) es un compuesto químico de bajo peso molecular que se administra por vía oral, inhibidor de la actividad de la enzima serina- treonina quinasa BRAF La indicación terapéutica de este inhibidor de BRAF es en melanoma no resecable o metastásico con mutación de BRAF V600 positiva. Se comercializa bajo ei nombre de Zeiboraf®.
El fármaco“dabrafenib” es también un inhibidor de BRAF y su indicación terapéutica es en melanoma no resecable o metastásico con mutación de BRAF V600 positiva, como tratamiento en monoterapia o en combinación con trametinib, y en cáncer de pulmón no microcítico avanzado con mutación de BRAF V600 positiva, en combinación con trametinib. Se comercializa bajo ei nombre de Tafinlar®
Las mutaciones oncogénicas en ei gen codificante para la enzima BRAF, las cuales conducen a la sustitución del aminoácido Valina (V) en la posición 600, preferiblemente por el aminoácido aspártico (E), conducen a ia activación constitutiva de esta proteína, lo que promueve la proliferación celular en ausencia de ios factores de crecimiento que normalmente son requeridos para dicha proliferación. Las mutaciones oncogénicas en BRAF se han identificado de manera muy frecuente en tipos de cáncer específicos, estando presentes, por ejemplo, en el 60% de los melanomas. La mutación oncogénica en BRAF observada con mayor frecuencia es V6QQE, la cual representa aproximadamente ei 90% de las mutaciones en BRAF observadas en casos de melanoma.
Por ello, en otra realización preferida, ei paciente ai que se refiere ia presente invención padece cáncer, en particular cáncer BRAF positivo, es decir, es un paciente de cáncer que presenta una mutación oncogénica en BRAF donde dicha mutación es preferiblemente en la V60Q, más preferiblemente la mutación es V60GE. Más preferiblemente, el cáncer es melanoma, aún más preferiblemente melanoma no resecable o metastásico con mutación de BRAF V600 positiva, o cáncer de pulmón no microcítico, aún más preferiblemente cáncer de pulmón no microcítico avanzado con mutación de BRAF V800 positiva. En una realización particular, el cáncer es melanoma. En la realización más preferida de la presente invención, el inhibidor de BRAF es vemurafenib y el paciente padece melanoma.
Como ios niveles de ERK1/2 citoplasmático se correlacionan, no solo con la respuesta terapéutica al tratamiento con un fármaco inhibidor de BRAF, sino también con un buen pronóstico en tumores de mama, preferiblemente invasivos, y en tumores de pulmón, preferiblemente microcíticos (Blackhali FH. eí ai, 2007, Clin Cáncer Res, 9: 2241-2247; Nakopoulou L. el al., 2007, APMiS, 113: 893-701), otro aspecto de la invención se refiere al uso de los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de los niveles de ERK2 fosforilada en la serina 284 como biomarcador para el pronóstico in vitro de tumores de mama, preferiblemente invasivos, y/o de pulmón, preferiblemente microcíticos, en un paciente.
El término“pronóstico” se refiere al procedimiento mediante el cual se establece una predicción de ios sucesos que ocurrirán en el desarrollo o curso de una enfermedad, preferiblemente, cáncer, incluyendo recaída o capacidad de diseminación metastásica.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro, de ahora en adelante “método de la invención”, para predecir la respuesta terapéutica ai tratamiento con un fármaco inhibidor de la serina-treonína kinasa BRAF en un paciente, donde dicho método comprende las siguientes etapas:
a. Cuantificar ios niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284 en una muestra biológica aislada del paciente (recolectada antes de administrar el tratamiento con el inhibidor de BRAF), b. Comparar los niveles cuantificados en la etapa (a) con un valor de referencia, donde dicho valor de referencia procede de la cuantificación de los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 234 en una muestra biológica aislada de un paciente que no responde al tratamiento con un inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF, y c. Asignar al paciente de la etapa (a) al grupo de individuos que responderán adecuadamente ai tratamiento cuando el valor de cuantificación obtenido en la etapa (a) es significativamente mayor que el valor de referencia. La expresión“cuantificar” se refiere a la medida de la cantidad o concentración de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284 en la muestra.
El término“cantidad” se refiere, pero sin limitación, a la cantidad absoluta o relativa de EKK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284 en la muestra, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con ella o que se pueda derivar de ella. Estos otros valores o parámetros comprenden, por ejemplo, valores de intensidad de una señal obtenida a partir de cualquier propiedad física o química de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284 obtenidos por medidas indirectas o directas, por ejemplo, por espectroscopia de masas o por resonancia magnética nuclear.
Así, la cuantificación de ios niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284, tai y como se describe en la presente invención, puede realizarse como una medición directa o indirecta. La medición directa se refiere a la medición de la Intensidad de una señal directamente obtenida de la presencia de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284. Esta señal se correlaciona directamente con el número de moléculas de producto presentes en la muestra. Esta señal, también denominada“señal de intensidad”, puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad derivado de una propiedad física o química del producto. La medición indirecta se refiere a la medición obtenida a partir de un componente secundario (es decir, un componente que es diferente de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284) o una medición derivada de, por ejemplo, respuestas celulares, ligandos, sustratos, etiquetas o productos de reacción enzimática asociados a ERK1 fosforilada en la serina 301 y ERK2 fosforilada en ia serina 284 o a sus actividades.
Métodos para detectar y cuantificar los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y los niveles de ERK2 fosforilada en la serina 284 son conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante estudios masivos de fosfoproteómica empleando la técnica de espectrometría de masas.
Esta cuantificación de los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y ios niveles de ERK2 fosforilada en la serina 284 puede realizarse, pero sin limitación, por incubación o hibridación in situ con anticuerpos específicos contra (que reconocen) ERK1 fosforilada en la serina 301 y/o ERK2 fosforilada en la serina 234, o un fragmento inmunológicamente activo de ios mismos, en ensayos tales como Western blot, geies de electroforesis, transferencia a membrana e hibridación con sondas específicas, ensayos de inmunoprecipitación, arrays de proteína, preferentemente microarrays basados en anticuerpos, citometría de flujo, inmunofluorescencia, inmunobistoquímica, quimioluminiscencia, inmunoensayos tales como ELISA, radioinmunoensayo (RIA), o cualquier otro método enzimático, por incubación con un ligando o sustrato específico, dispositivos de flujo lateral o Luminex®, RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas u otro tipo de nanopartículas funcionalizadas, por técnicas cromatográficas preferentemente combinadas con espectrometría de masas, colorimetría o isoeiectroenfoque. La medición de los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284 puede realizarse por el reconocimiento específico de cualquier fragmento de las enzimas así fosforiladas por medio de sondas y/o anticuerpos.
Preferiblemente, la cuantificación de los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284 se lleva a cabo en la presente invención mediante inmunoensayo basado en anticuerpos específicos frente a dichas formas de ERK, más preferiblemente mediante Western blot. Para el inmunoensayo, los anticuerpos empleados pueden estar marcados o no marcados, por ejemplo, pueden marcarse con un anticuerpo secundario, una enzima, un sustrato de una enzima, radioisótopos, etiquetas magnéticas, fluorescencia o similares, y/o pueden estar inmovilizados en un soporte tal como una placa de microtituiación o bio-chip. Un “inmunoensayo” o “ensayo inmunohistoquímico” es un ensayo bioquímico que detecta y/o cuantifica ia cantidad o concentración de uno o más pépíidos de interés (en el contexto de la presente invención ERK1 fosforilada en la serina 301 y ERK2 fosforilada en la serina 284), en una muestra. Para ello, la reacción emplea uno o más anticuerpos específicos de los antígenos que van a ser detectados. La cuantificación de ia proteína puede llevarse a cabo por cualquier método conocido en ia técnica, para lo cual el antígeno y/o el anticuerpo estarán preferiblemente marcados. El inmunoensayo al que se refiere la presente invención puede ser competitivo o no competitivo. En un inmunoensayo competitivo la señal detectada será inversamente proporcional a la concentración de antígeno en ia muestra. En un inmunoensayo no competitivo (tal como un ELISA en sándwich) la señal detectada es directamente proporcional a la concentración de antígeno en la muestra.
Ejemplos de inmunoensayos útiles para ser aplicados en el método de la presente invención son, pero sin limitarnos, inmunobloting (Western biot), inmunoprecipitación, ELISA, ensayo multiplex, ensayo dipstick, inmunoensayo en línea (LIA), radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoradiométrico (IRMA), inmunofiuorescencia, inmunohistoquímica, quimioiuminiscencia, hemagiutinación pasiva, inmunomarcaje con partículas de oro (microscopía electrónica de transmisión), chips de lipopolisacárido (LPS) o proteína o mapa-x, PCR inmunocuantitativa en tiempo real (iqPCR), etiquetas electroquimioiuminiscentes, inmunoensayos libres de etiquetas (por ejemplo, resonancia de plasmones superficiales), inmunoensayo fotoacústico, inmunoensayo con enzimas clonadas de donador (CEDIA), ensayos inmunocromatográficos de flujo lateral, inmunoensayo magnético (MIA), inmunoensayo de fibra óptica envolvente (SOFIA), inmunoensayo basado en CD/DVD o aglutinación- PCR (A DAR).
El ensayo ELISA está basado en la inmovilización de un antígeno o anticuerpo en un soporte sólido, de manera que este sistema es posteriormente puesto en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario, el cual puede estar unido a una etiqueta o compuesto marcador. La técnica ELISA referida en la presente invención puede ser directa, indirecta o en sándwich.
El anticuerpo empleado en los métodos aquí descritos se encuentra preferiblemente conjugado con un sistema de detección o se encuentra unido a un anticuerpo secundario el cual está acoplado a un sistema de detección. La señal producida como consecuencia de la reacción de mareaje se puede medir, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante espectrofotometría, quimioluminiscencia, espectrofiuorometría, bioluminiscencia, calorimetría deferencial, ultracentrifugación analítica, interferometría, etc. Preferiblemente, la técnica empleada en la presente invención es quimioluminiscencia.
La expresión“recolectada antes de administrar el tratamiento con el inhibidor de BRAF” se refiere a una muestra biológica procedente del paciente cuando éste aún no ha recibido tratamiento previo con inhibidores de BRAF, preferiblemente con vemurafenib.
El término“muestra biológica aislada” se refiere, pero sin limitaciones, a cualquier tejido y/o fluido biológico obtenido u extraído de un sujeto o paciente que comprende células tumorales, es decir, células procedentes de un tumor. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, un tejido procedente de una biopsia tumoral o una muestra procedente de un aspirado por aguja fina, o puede ser un fluido biológico, por ejemplo, sangre, plasma, suero, linfa, fluido ascítico, orina, saliva o exudado glandular. La muestra biológica puede ser fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina. El término“valor de referencia”, tal y como se emplea en el método de la invención anteriormente descrito, es cualquier valor o rango de valores derivado de la cuantificación de ios niveles de EKK1 fosforiiada en la serina 301 y de ERK2 fosforiiada en la serina 284 en una muestra biológica aislada de un paciente que se sabe que no responde adecuadamente al tratamiento con un inhibidor de BRAF, preferiblemente vemurafenib, o en una mezcla de muestras biológicas aisladas de pacientes de este tipo.
La“comparación” a la que se refiere a la etapa (b) del método de la invención puede llevarse a cabo de manera manual o automatizada.
Una cantidad“significativamente mayor” que un valor de referencia puede determinarse mediante varias herramientas estadísticas, tales como, por ejemplo, pero sin limitarnos, determinación de intervalos de confianza, determinación del p-valor, test T de Síudent, funciones discriminantes de Fisher, Kruskal-Wallis, ANOVA, Bonferroni, Mann-Whitney, etc.
Las etapas (a) y (b) del método de la invención pueden ser total o parcialmente computerizadas. Además, el método de la invención puede comprender otras etapas adicionales, opcionales, por ejemplo, relacionadas con el pre-tratamiento de las muestras biológicas antes de su análisis.
En otra realización preferida del método de la invención, el inhibidor de la serína-treonina kinasa BRAF es vemurafenib y/o dabrafenib, más preferiblemente vemurafenib
En otra realización preferida, el paciente ai que le va a ser aplicado el método de la invención padece cáncer, en particular cáncer BRAF positivo, es decir, es un paciente de cáncer que presenta una mutación oncogénica en BRAF donde dicha mutación es preferiblemente en la V600, más preferiblemente la mutación es V600E.
Más preferiblemente, el cáncer es melanoma, aún más preferiblemente melanoma no resecable o metastásico con mutación de BRAF V600 positiva, o cáncer de pulmón no microdtico, aún más preferiblemente cáncer de pulmón no microcítico avanzado con mutación de BRAF V600 positiva. En una realización particular, el cáncer es melanoma.
En una realización particular del método de la invención, el inhibidor de la serina- treonina kinasa BRAF es vemurafenib y el paciente padece melanoma.
En otra realización preferida, el paciente ai que le va a ser aplicado el método de la invención es humano.
En otra realización preferida, la cuantificación de los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284 se lleva a cabo, en los métodos aquí descritos, mediante el uso de un anticuerpo que reconoce a ERK1 fosforilada en la serina 301 y a ERK2 fosforilada en la serina 284 específico frente ai péptido que consiste en la SEQ ID NO: 1 (NRLFPNADSKALDLLDKML), es decir, mediante el anticuerpo de la invención descrito más abajo.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para el pronóstico de tumores de mama, preferiblemente invasivos, y/o de pulmón, preferiblemente microcíticos, en un paciente, donde dicho método comprende las siguientes etapas:
a. Cuantificar los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284 en una muestra biológica aislada del paciente, b. Comparar los niveles cuantificados en la etapa (a) con un valor de referencia, donde dicho valor de referencia procede de la cuantificación de los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284 en una muestra biológica aislada de un paciente diagnosticado con el mismo tipo de cáncer que el paciente del paso (a) y que presenta un mal pronóstico, y
c. Asignar al paciente de la etapa (a) al grupo de individuos que presentarán un buen pronóstico cuando el valor de cuantificación obtenido en la etapa (a) es significativamente mayor que el valor de referencia de la etapa (b) Se entiende por“mal pronóstico” la recaída, metástasis y/o ausencia de mejora en los síntomas del tumor, preferiblemente cáncer.
El anticuerpo descrito en la presente invención, el cual reconoce a ERK1 fosforilada en la serina 301 y a ERK2 fosforilada en la serina 284 y que es específico frente al péptido de SEQ ID NO: 1 , ha sido diseñado por los inventores de la presente invención para desarrollar los métodos aquí descritos. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo, que reconoce a ERK1 fosforilada en la serina 301 y a ERK2 fosforilada en la serina 284, especifico frente al péptido que consiste en la SEQ ID NO: 1 (NRLFPNADSKALDLLDKML). De ahora en adelante se hará referencia a este anticuerpo como“anticuerpo de la invención”.
Este anticuerpo de la invención es poiiclonai, es decir, ha sido generado mediante la inmunización de un animal, preferiblemente mamífero no humano, más preferiblemente conejo, con el péptido (antígeno) diseñado por ios inventores que consiste en la SEQ ID NQ: 1. Métodos de producción y purificación de anticuerpos policlonales mediante inmunización de un animal con el antígeno correspondiente son ampliamente conocidos por los expertos en la materia, y cualquiera de ellos podría emplearse para la obtención del anticuerpo de la invención. En el péptido que consiste en la SEQ ID NO: 1 , la serina de la posición 9 se encuentra fosforilada, preferiblemente dicha serina ha sido fosforilada químicamente. Dicho péptido es 100% homólogo o idéntico entre los parálogos ERK1 y ERK2, por lo que el anticuerpo de la invención generado frente al mismo reconoce (se une, híbrida con) ambas proteínas fosforiíadas en ia serina 301 y 284 respectivamente.
Otro aspecto de la invención, se refiere a un péptido que consiste en la SEQ ID NO: 1 (NRLFPNADSKALDLLDKML), donde la serina de la posición 9 está fosforilada. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de dicho péptido para la generación del anticuerpo de la invención.
Preferiblemente, el anticuerpo de la invención se encuentra marcado. El término “marcado”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a que el anticuerpo está conjugado con una etiqueta o sistema de detección. Son conocidos en el estado de la técnica un elevado número de etiquetas que pueden ser conjugadas a un anticuerpo. Ejemplos de dichas etiquetas son, pero sin limitarnos, radioisótopos [por ejemplo, 32P, 35S o 3H], marcadores fluorescentes o luminiscentes [por ejemplo, fiuoresceína (FITC), rodamina, rojo texas, GFP, ficoeritrina (PE), aioficocianina, 6- carboxif!uoresceina (6-FAM), 2',7'-dimetoxi-4',5'-dic!oro-6-carboxifluoresceina (JOE), 6- carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2',4',7',4,7-bexacíorofíuoresceina (HEX), 5- carboxifiuoresceina (5-FAM) o N,N,N',N'-tetrameti!-6-carboxírodamina (TAMRA)]; anticuerpos secundarios o fragmentos de anticuerpos [por ejemplo, fragmentos F(ab)2)], etiquetas de afinidad [por ejemplo, biotina, avidina, agarosa, proteína morfogenética del hueso (BMP), haptenos], enzimas o substratos de enzimas [por ejemplo, fosfatasa alcalina (AP) y peroxidasa de rábano picante (HRP)].
La ventaja de marcar los anticuerpos es que éstos pueden ser detectados y su señal cuantificada. Preferiblemente, el anticuerpo de ia invención se encuentra inmovilizado en un soporte. El término“inmovilizado”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a que el anticuerpo está unido a un soporte sin perder su actividad de inmunoreacción con su antígeno (péptido de SEQ ID NO: 1). Preferiblemente, el soporte es ia superficie de una matriz (por ejemplo, una matriz de nyion o látex), una membrana, una placa de microtituiación (por ejemplo, de 96 pocilios) o soporte de plástico, silicona, vidrio o similar, o bien cuentas (por ejemplo esferas, preferiblemente esferas de agarosa o microesferas pequeñas superparamagnéticas compuestas de matrices biodegradables), gel, soporte celulósico, resina de adsorción o similares. En general, cualquier superficie sólida que permita la unión, directa o indirecta, mediante enlace covaiente o no covalente, del anticuerpo de la Invención puede ser empleado. Además, el soporte puede estar en forma de varilla, tira reactiva, papel, cuenta de látex, microesfera, array, placa muitipocilio o similar. Más preferiblemente, el anticuerpo de la invención se encuentra marcado e inmovilizado. Aun más preferiblemente, dicho mareaje se da a través de un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano.
El anticuerpo descrito en la presente invención puede ser humano, humanizado, recombinante, monoclonal, quimérico, conjugado, etc. Dentro del alcance de la presente invención también se incluyen fragmentos inmunoiógicamente activos del anticuerpo de la invención. Ejemplos de dichos fragmentos son, pero sin limitarnos, un fragmento Fab, F(ab')2, Fab', F se o Fv. Otro aspecto de la invención se refiere a un kit, útil para ser empleado en los métodos aquí descritos, de ahora en adelante“kit de la invención”, que comprende el anticuerpo de la invención, donde dicho anticuerpo puede o no estar marcado y/o inmovilizado como se ha descrito anteriormente. Este kit comprende, preferiblemente, todos aquellos elementos necesarios para predecir ia respuesta terapéutica al tratamiento con un fármaco inhibidor de BRAF en un paciente o para pronosticar (ia evolución de) tumores de mama, preferiblemente invasivos, y/o de pulmón, preferiblemente microcíticos, en un paciente, según los métodos descritos anteriormente. Así, el kit de la invención puede comprender elementos tales como, por ejemplo pero sin limitarnos, soluciones de conservación, tampones, diluyentes, filtros, vehículos, enzimas, tales como polimerasas, cofactores necesarios para obtener una actividad óptima de dichas enzimas, etc. El kit puede comprender todos aquellos soportes y recipientes necesarios para la implementación de los métodos aquí descritos. El kit puede comprender además otras moléculas, genes, proteínas o sondas, adecuados como controles positivos o negativos. Preferiblemente, el kit de la invención comprende además instrucciones sobre cómo llevar a cabo ios métodos aquí descritos, etiquetas para identificar los diferentes elementos comprendidos en el kit y su aplicación y/o listados de los componentes comprendidos en el kit.
El kit de la invención puede comprender, en diferentes combinaciones, cebadores u oligonucleótidos y sondas control, anticuerpos secundarios que sirvan para el mareaje a través de su conjugación con un sistema de detección y/o anticuerpos control que sirvan para la normalización de ios niveles de expresión, reactivos, señales de detección, instrumentos necesarios para el procesamiento y puesta en marcha de arrays, fluorocromos, sondas de mareaje, sustratos necesarios para la activación o iniciación de la reacción de mareaje por el sistema de conjugación seleccionado, soluciones de bloqueo, de parada y/o de lavado, o similares. Las sondas, cebadores y/o anticuerpos control pueden ser específicos de genes, proteínas o péptidos expresados constitutivamente por las células en la muestra biológica analizada, de manera que su aplicación permita asegurar que los valores de los niveles de expresión de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284 medidos en la muestra son fiables y correctos.
El kit puede también comprender medios adecuados para albergar y conservar la muestra biológica que va a ser analizada en los métodos aquí descritos. Dichos medios pueden ser, por ejemplo, un contenedor adecuado para contener una muestra de una biopsia o aspirado tumoral. Asi, dicho kit puede comprender un contenedor tal como botellas, viales, jeringas o tubos de ensayo. Dicho contendor puede estar hecho de, por ejemplo, pero sin limitarnos, vidrio o plástico o cualquier otro material adecuado para la conservación de la muestra biológica en condiciones óptimas.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del anticuerpo de la invención o del kit de la invención para predecir in vitro la respuesta terapéutica al tratamiento con un fármaco inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF en un paciente, o para pronosticar in vitro (la evolución de) tumores de mama, preferiblemente invasivos, y/o de pulmón, preferiblemente microcíticos, en un paciente, más preferiblemente mediante ios métodos anteriormente descritos.
En una realización preferida de dicho uso, el inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF es vemurafenib y/o dabrafenib, preferiblemente vemurafenib.
En otra realización preferida, ei paciente padece cáncer, en particular cáncer BRAF positivo, es decir, es un paciente de cáncer que presenta una mutación oncogénica en BRAF, donde dicha mutación es preferiblemente en la V600, más preferiblemente la mutación es V600E.
Más preferiblemente, el cáncer es melanoma, aún más preferiblemente melanoma no resecable o metastásico con mutación de BRAF V600 positiva, o cáncer de pulmón no microcítico, aún más preferiblemente cáncer de pulmón no microcítico avanzado con mutación de BRAF V600 positiva. En una realización particular, el cáncer es melanoma.
En la realización más preferida, el inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF es vemurafenib y el paciente padece melanoma
En otra realización preferida, ei paciente es humano.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro de obtención de información o datos útiles para predecir la respuesta terapéutica al tratamiento con un fármaco inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF en un paciente, donde dicho método comprende las siguientes etapas:
a. Cuantificar los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284 en una muestra biológica aislada del paciente (recolectada antes de administrar ei tratamiento con el inhibidor de BRAF), y b. Comparar los niveles cuantificados en ia etapa (a) con un valor de referencia, donde dicho valor de referencia procede de la cuantificación de ios niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en ia serina 284 en una muestra biológica aislada de un paciente que no responde al tratamiento con un inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF
Estas etapas (a) y (b) se pueden llevar a cabo como se ha explicado anteriormente para el método de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para tratar a un paciente que padece cáncer BRAF positivo, preferiblemente melanoma BRAF positivo, que comprende: (a) identificar al paciente como respondedor o no respondedor al tratamiento con inhibidores de BRAF, preferiblemente al tratamiento con vemurafenib, según el método de la invención; y (b) administrar dicho tratamiento al paciente cuando en la etapa (a) se ba determinado que es un paciente respondedor ai mismo
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para ios expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos del ámbito de protección de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig, 1. Especificidad del anticuerpo de la invención (anticuerpo anti-fosfo ser284/301). Células HEK294 fueron transfectadas con ERK2 humana (Hs) o de pez zebra (Dr), donde el residuo homólogo de la serlna 284 es una prollna, por tanto, no fosforilable. Se observa que el anticuerpo sólo reconoce ERK2 humana, en células bajo estimulación, en este caso con EGF. Un anticuerpo anti-FLAG fue utilizado como control.
Fig, 2. ERK1/2 fosforiladas en ser 301/284 se localizan exclusivamente en el citoplasma. Células HeLa fueron estimuladas con EGF por 5 min, y la localización subcelular de ERK1/2 endógenas fosforiladas en los antedichos residuos se analizó mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal. Se observa que ERK1/2 fosforiladas en dichas posiciones están completamente excluidas del núcleo, marcado con DAR!
Fig. 3. Correlación entre ios niveles de ERK1/2 fosforiladas en ser 301/284 y la sensibilidad a vemurafenib. De la línea celular de melanoma BRAF positivo M249, se obtuvo una sublínea resistente a vemurafenib (vemR) y los niveles de fosfo-ser 284/301 se analizaron en dicha sublínea en comparación con la linea parental. Se observa, que dichos niveles son muy superiores en la línea parental, sensible a vemurafenib. Fig, 4. Correlación entre los niveles de ERK1/2 fosfonladas en ser 301/284 y la sensibilidad a vemurafenib. Se evaluó la sensibilidad ai vemurafenib en distintas líneas de melanoma, analizando la reducción en la actividad total de ERK1/2, medida por la bajada en los niveles de fosforilación canónica (p-ERK). Se observa que las líneas más sensibles son 8505C y A375P. Los niveles de fosfo-ser 284/301 también se analizaron en dichas líneas. Se observa que dichos niveles, antes del tratamiento con vemurafenib, son muy superiores a los observados en las líneas resistentes MELJUSO y SKMEL2. Fig, 5. Sensibilidad a vemurafenib de las líneas de melanoma utilizadas en la Fíg. 4, evaluada por la concentración necesaria para parar la proliferación (GI50). Se observa que las líneas más sensibles son 8505C y A375P, las cuales muestran ios niveles más altos de fosfo-ser 284/301 en la FIG. 4.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del método de la invención y del anticuerpo generado para ser empleado en dicho método. Ejemplo 1 , Material v métodos.
Las líneas celulares empleadas en los ensayos fueron:
HEK293T: Células embrionarias de riñón humano, antigeno T positivas.
HeLa: células epiteliales de cáncer de cuello uterino.
A375p: células epiteliales de melanoma, presentan mutación en BRAF.
SKMEL2: células epiteliales de melanoma, presentan mutación en BRAF.
M249 parental y M249 resistente a Vemurafenib: células epiteliales de melanoma, presentan mutación en BRAF.
Mel JUSO: células epiteliales de melanoma.
Las líneas celulares se crecieron en medio de cultivo DMEM suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino y antibióticos (Penicilina y Estreptomicina). Western folot:
Para la obtención de los extractos totales de proteína las células se Usaron con el volumen adecuado de tampón de lisis (20 mM HEPES pH 7.5, 10 Mm EGTA, 40 mM b- glicerofosfato, 1 % detergente no iónico NP40, 2,5 mM MgCb, 1 mM ortovanadato, 1 mM DTT y extemporáneamente 10mg/ml aprotinina y 10mg/ml leupeptina). Las células se recogieron y se centrifugaron a 12.000 rpm, durante 10 minutos y a 4°C. Se separaron ios extractos de proteínas del resto de componentes de las células y se procedió a la cuantificación de la concentración proteica de cada iisado. Para la determinación de la cantidad de proteína se usó el método de Bradford. Se tomaron aproximadamente 50 pg de proteína, a los que se añadió tampón Laemlí 5X (100 mM Tris pH 6.8, 4% SDS, 20% glicerol, 20 mM DTT y 0,005% azul de bromofenoi). Tras hervir las muestras durante cinco minutos, se sometieron a electroforesis en un ge! vertical de poliacriiamida -SDS (dodecil sulfato sódico)- PAGE de un porcentaje del 12% de acriíamida. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa fijando el amperaje en 400 mA durante 1 hora. Finalizada la transferencia, las membranas se incubaron durante una hora, a temperatura ambiente y con agitación, en una solución de TBS-T con un 4% de BSA, para bloquear los sitios inespecíficos. Tras ello, los filtros fueron incubados con el anticuerpo primario fosfoespecífico de la invención (0,2-0, 4 mg/ml diluido en BSA al 4% en TBS-T) durante una hora a temperatura ambiente o toda la noche a 4°C en agitación. Se realizaron dos lavados con TBS-T durante un total de quince minutos, tras ios cuales se incubaron los filtros con el correspondiente anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa, diluido 1 :5.000 o 1 :10.000 en BSA ai 0,4% en TBS-T durante una hora a temperatura ambiente. Se realizaron de nuevo dos lavados con TBS-T y se procedió a la detección de la proteína por quimioluminiscencia utilizando el kit ECL. Se realizó una autorradiografía de los filtros con películas Kónica que permitió detectar una banda allí donde el anticuerpo primario había reconocido de forma específica la profeína fosforilada de interés. Como control de carga interno se utilizó un anticuerpo específico que reconoce la proteína total de interés.
Inmunofluorescencia
Las células se crecieron en DMEM 10% Suero fetal Bovino hasta subconfluencia sobre cubreobjetos de vidrio de 10 mm de diámetro estériles. En el momento de hacer la inmunofluorescencia, las células se lavaron con PBS 1X y se fijaron con una solución al 4% de paraformaldehído en PBS 1X, durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se permeabilizaron incubando durante 5 minutos con una dilución 0,5% de Tritón X-100 en PBS, seguido de tres lavados de PBS 1X de cinco minutos cada uno. A continuación, las células se incubaron con el anticuerpo primario fosfoespecífico de la invención a una concentración 1/100 durante una hora en una cámara húmeda. Tras tres lavados con PBS, de cinco minutos cada uno, se añadió el anticuerpo secundario conjugado con el fiuoróforo FITC y se incubó durante 45-50 minutos en una cámara húmeda y en oscuridad. Transcurrido ese tiempo, se realizaron dos nuevos lavados, de cinco minutos cada uno, con PBS 1X. Por último, se añadió sobre un portaobjetos una gota de medio de montaje Prolong con DAPI y posteriormente se colocó encima el cubre con las células hacia abajo. Las células se examinaron mediante microscopía confocal (Leica TCS SP8). Las imágenes se digitalizaron y procesaron utilizando el programa Fiji Image J.
Inmunohistoquímica
Las muestras de tejido o ios peílets celulares fueron fijadas con parafolmaldehido al 4% e incluidas en parafina. Los cortes fueron montados en portaobjetos con carga positiva (Genex-brand®), recomendados para inmunohistoquímica. El desparafinado se logró mediante el pase de ios cortes por xileno (10 min), y graduaciones decrecientes de alcohol etílico (100° 10 min, 98° 5 min, y 70° 5 min). Se llevó a cabo un bloqueo de la actividad endógena peroxidasa mediante incubación de ios cortes en solución de peróxido de hidrógeno 3% en metanol por 15 min, e incubación en agua destilada por 10 min. Posteriormente, los cortes se incubaron con una solución de albúmina bovina sérica BSA 1 % en buffer TBST por 30 min con la intención de bloquear sitios de unión inespecíficos. Posteriormente, los cortes se incubaron con el anticuerpo fosfoespecífico de la invención a una dilución 1 :100 en PBS, durante toda la noche a 4 °C, en cámara húmeda. El revelado de la reacción se llevó a cabo mediante la técnica de DAB cromogen de DAKO. La coloración de contraste se realizó sumergiendo ios cortes en hematoxilina de Mayer durante 1 min; luego se colocaron bajo un flujo de agua corriente para el revelado. El montaje se realizó con medio de montaje acuoso (VectaMount AQ, Vector Lab ind). La observación de las preparaciones se hizo en un microscopio Nikon. Las fotografías fueron tomadas con una cámara digital Olympus C4QG0.
Ejemplo 2 Resultados
Para obtener un anticuerpo que reconociese específicamente la ser 301/284 fosforiiada de ERK1/2, respectivamente, se inmunizaron conejos con el péptido consistente en la SEQ ID NO: 1 anteriormente mencionado, siguiendo los protocolos al uso rutinariamente utilizados para este fin. La inmunoreactividad del suero resultante fue analizada mediante western blot (Fig. 1) en células HEK293 transfectadas con plásmidos que codifican EKK2 humana (Hs) o de pez cebra (Dr) En esta última el residuo correspondiente a la serina 284 es una prolina {prolina 293), por lo que no es fosforilable, y sirve de control negativo. Se observó que tras la estimulación con EGF durante 5 min, que induce la fosforilación de ios residuos canónicos TEY tanto en ERK2 humanas como de pez cebra, la fosforilación de ser 284 se detecta únicamente en ERK2 humana.
Una vez demostrada la especificidad del anticuerpo, se procedió a analizar la sublocalízación céluiar de ERK1/2 fosforiiada en ser 301/284. Para ello, se realizaron inmunofluorescencias en células HeLa, en ayuno (starved) o estimuladas con EGF durante 5 min (Fig. 2). Se observó, mediante microscopía confocal, que ERK1/2 endógenas fosforiiadas en ser 301/284 se localizan exclusivamente en el citoplasma, estando completamente excluidas del núcleo celular, teñido mediante DAPI.
Posteriormente, se analizó la correlación de los niveles de ERK1/2 fosforiiada en ser 301/284 con la sensibilidad hacia los inhibidores de BRAF en células de melanoma portadoras de mutaciones en BRAF. Para este menester se utilizó la línea celular M249, de la cual se obtuvo una sublínea resistente a vemurafenib (vemR). Los niveles de ERK1/2 endógenas fosforiiadas en ser 301/284 se analizaron mediante western blot (FIG. 3) comparando la subiínea resistente con la línea parental, sensible ai vemurafenib. Se observó que los niveles de fosfo-ser 301/284 son muy superiores en la línea parental, sensible a vemurafenib, demostrando una correlación positiva entre los niveles de fosfo-ser 301/284 y la respuesta ai compuesto antitumorai.
Para verificar el anterior punto se evaluó la correlación entre ios niveles de fosforilación de ser 284/301 en ERK1/2 y la sensibilidad al vemurafenib en distintas líneas de melanoma Se observó que la reducción en la actividad total de ERK1/2, medida por la bajada en los niveles de fosforilación canónica (p-ERK) mediante western blot, tras el tratamiento de las distintas lineas celulares con vemurafenib, se correlacionaba con ios mayores niveles de fosfo~ser 284/301. Se observa que dichos niveles antes del tratamiento con vemurafenib son muy superiores en las líneas más sensibles, 8505C y A375P, a los observados en las líneas más resistentes, MELJUSO y SKMEL2 (FIG. 4). Esta correlación también se observa cuando se evalúa la concentración de vemurafenib necesaria para parar la proliferación (GI50) de las distintas líneas celulares de melanoma (FIG. 5). Se observa que las líneas más sensibles al tratamiento con vemurafenib son 8505C y A375P, las cuales muestran los niveles más altos de fosfo- ser 284/301 en la FIG 4.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de los niveles de ERK2 fosforiiada en la serina 284 como biomarcador para predecir in vitro la respuesta ai tratamiento con un inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF en un paciente
2. Uso según la reivindicación 1 , donde el inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF es vemurafenib y/o dabrafenib.
3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde el paciente padece cáncer
4 Uso según la reivindicación 3, donde el cáncer es melanoma o cáncer de pulmón no microcítico.
5 Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el inhibidor de la serina- treonina kinasa BRAF es vemurafenib y el paciente padece melanoma.
6 Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el paciente es humano
7 Método in vitro para predecir la respuesta al tratamiento con un inhibidor de la serina- treonina kinasa BRAF en un paciente, donde dicho método comprende las siguientes etapas:
a. Cuantificar los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284 en una muestra biológica aislada del paciente, b. Comparar los niveles cuantificados en la etapa (a) con un valor de referencia, donde dicho valor de referencia procede de la cuantificación de los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforiiada en la serina 284 en una muestra biológica aislada de un paciente que no responde ai tratamiento con un inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF, y c. Asignar al paciente de la etapa (a) al grupo de individuos que responderán adecuadamente ai tratamiento cuando el valor de cuantificación obtenido en la etapa (a) es significativamente mayor que el valor de referencia.
8. Método según la reivindicación 7, donde el inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF es vemurafenib y/o dabrafenib.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, donde el paciente padece cáncer.
10. Método según la reivindicación 9, donde el cáncer es melanoma o cáncer de pulmón no microcítico.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, donde el inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF es vemurafenib y el paciente padece melanoma.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 , donde el paciente es humano.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, donde la cuantificación de los niveles de ERK1 fosforilada en la serina 301 y de ERK2 fosforilada en la serina 284 se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo específico frente al péptido que consiste en la SEQ ID NO: 1.
14. Un anticuerpo específico frente al péptido que consiste en la SEQ ID NQ: 1.
15. Kit que comprende el anticuerpo según la reivindicación 14.
16. Uso del anticuerpo según la reivindicación 14 o del kit según la reivindicación 15 para predecir in vitro la respuesta al tratamiento con un inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF en un paciente.
17. Uso según la reivindicación 16, donde el inhibidor de la serina-treonina kinasa BRAF es vemurafenib y/o dabrafenib.
18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, donde el paciente padece cáncer.
19. Uso según la reivindicación 18, donde e! cáncer es melanoma o cáncer de pulmón no microcítico.
20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde el inhibidor de la serina- treonina kinasa BRAF es vemurafenib y el paciente padece melanoma.
21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, donde el paciente es humano.
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