RU2436098C2 - Детектирование рака яичника по повышенным уровням bcl-2 в моче - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики рака яичника. Сущность способа заключается в том, что у пациента определяют содержание Bcl-2 в пробе мочи иммуноферментным методом. При выявлении уровня Bcl-2 выше 2,0 нг/мл диагностируют рак яичника у пациента. Использование способа позволяет с высокой точностью на ранних стадиях выявлять рак яичника. 14 з.п. ф-лы, 12 ил., 2 табл.

Description

ОПИСАНИЕ

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Данная заявка претендует на приоритет по Предварительной заявке США с порядковым номером 60/771677, поданной 9 февраля 2006 года, которая, тем самым, включена здесь в качестве ссылки в полном объеме, включая любые фигуры, таблицы, последовательности нуклеиновых кислот, аминокислотные последовательности и чертежи.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Маркерами рака являются вещества, которые могут быть обнаружены в организме (обычно в крови или моче) при раке. Они могут быть продуктами самих раковых клеток или организма в ответ на рак или другие состояния. По некоторым причинам, самих раковых маркеров обычно недостаточно для диагностики (или исключения) конкретного типа рака. Большинство раковых маркеров может продуцироваться нормальными клетками, также как и раковыми клетками, хотя и в меньших количествах. Иногда нераковые заболевания могут также вызывать повышенные уровни определенных раковых маркеров по сравнению с нормальными уровнями. Кроме того, не всякий субъект с раком может иметь более высокие уровни ракового маркера. По этим причинам обычно только малое количество раковых маркеров используется большинством врачей. Когда врач не учитывает уровень определенного ракового маркера, он или она обычно учитывает его вместе с результатами истории болезни пациента и физического обследования и других лабораторных тестов или тестов визуализации.

Скринингом на предмет обнаружения рака называют поиск рака у индивидуумов, которые не имеют симптомов этого заболевания, тогда как ранним детектированием является обнаружение рака на ранней стадии этого заболевания, когда оно должно иметь меньшую вероятность распространения (метастазирования) (и большую вероятность эффективного лечения). Хотя раковые маркеры первоначально исследовали и развивали для тестирования рака у людей без симптомов, было показано, что очень немногие маркеры могут быть полезны в этом случае.

Рак яичника имеет наивысшую летальность среди гинекологических раков. Отсутствие ранних симптомов и отсутствие надежного теста-скрининга для детектирования рака яичника приводят к тому, что более чем у 70% женщин заболевание было диагностировано после того, как оно распространилось за пределы яичника, так что прогноз является неблагоприятным - приблизительно 12000 смертей вследствие рака яичника ежегодно (5-летнее выживание не выше 37%). В настоящее время только физическое медицинское обследование таза, ультразвук или измерение уровней в крови СА125 являются стандартными способами, доступными для детектирования рака яичника. Однако ни один из указанных способов не обеспечивает надежного и точного способа для детектирования рака яичника. Например, хотя более 80% женщин с раком яичника будут иметь повышенные уровни в крови СА125, точность уровней в крови СА125 для детектирования заболевания на ранней стадии составляет лишь на 50%. Развитие иного и нового теста для надежного и точного детектирования всех случаев рака яичника весьма необходимо. Таким образом, требуется технология, которая преодолеет существующее отсутствие надежного, точного, безопасного и экономически выгодного теста для обнаружения рака яичника. Кроме того, необходима технология, которая точно детектирует все типы рака яичника, многие из которых в настоящее время являются недетектируемыми, а также позволяет выполнять мониторинг отягощенности заболеванием в процессе развития рака яичника.

Точный, безопасный, простой и надежный тест для диагностики рака яичника мог бы быть полезен всем женщинам, в Соединенных Штатах и во всем мире, в том числе и в слабо обеспеченных с точки зрения медицины географических зонах, и, в частности, женщинам, имеющим высокий риск развития рака яичника. При условии, что в США приблизительно у 25000 женщин диагностируется рак яичника ежегодно, биомаркер рака яичника, который детектируется как на ранних, так и на поздних стадиях заболевания, мог бы не только подтверждать диагноз рака яичника, но и потенциально детектировать тысячи прежде не диагностируемых типов рака яичника. Это особенно важно для детектирования рака яичника на ранних стадиях, когда заболевание ограничено яичником, но в настоящее время составляет менее 10% диагностируемых типов рака яичника. В данных ситуациях хирургическое иссечение больного яичника увеличивает выживание пациента более чем до 90%, и можно было бы ожидать уменьшения стоимости медицинских услуг. Возможность точного детектирования и мониторинга рака яичника у каждого пациента в процессе заболевания могло бы служить не только для начальной диагностики рака яичника, но могло бы также указывать на терапевтическую эффективность и/или рецидивирующее заболевание. Развитие коммерчески доступного, одобренного FDA теста, например, на основе ELISA, могло бы стать золотым стандартом для клинической диагностики рака яичника.

Хотя апоптоз является основным биологическим процессом нормального развития и поддержания гомеостаза тканей, он участвует также в ряде патологических состояний, включая повреждение ткани, дегенеративные заболевания, иммунологические заболевания и рак (Lowe, S.W. and Lin, A.W. Carcinogenesis, 2000, 21:485-495). Независимо от того, активируется ли она мембраносвязанными рецепторами смерти клеток (Ashkenazi, A. et al., J. Clin. Invest., 1999, 104:155-162; Walczak, H. Krammer, P.H. Exp. Cell Res, 2000, 256:58-66) или индуцированной стрессом пертурбацией митохондрий с последующим высвобождением цитохрома с (Loeffler, M. and Kroemer, G. Exp. Cell Res., 2000, 256:19-26; Wernig, F. and Xu, Q. Prog. Biophys. Mol. Biol., 2002, 78:105-137; Takano, T. et al. Antiox. Redox. Signal, 2002, 4:533-541), активация каспаз, последующих в каскаде реакций, приводит к ступенчатой клеточной деструкции посредством разрушения цитоскелета, прекращения репликации и репарации ДНК, деградации хромосомной ДНК и, наконец, дезинтеграции клетки на апоптотические тела (Nagata, S. Exp. Cell Res., 2000, 256:12-18). Ключевые регуляторы апоптоза включают в себя члены семейства белков bcl-2 (Farrow, S.N. and Brown, R. Curr. Opin. Gen. Dev., 1996, 6:45-49).

Семейство белков bcl-2 состоит как из про-, так и из анти-апоптотических членов указанного семейства белков, которые действуют на различных уровнях апоптотического каскада для регуляции апоптоза. Члены семейства bcl-2 содержат по меньшей мере один домен Bcl-2-гомологии (ВН) (Farrow, S.N. and Brown, R. Curr. Opin. Gen. Dev., 1996, 6:45-49). Хотя все члены семейства bcl-2 демонстрируют активность образования каналов в мембранах, каналы Bcl-2 (прототипического члена семейства bcl-2) являются катион-(Са⁺⁺)-селективными и, вследствие их исключительной локализации в мембранах ER (эндоплазматического ретикулума) и митохондриальных мембранах (Thomenius, M.J. and Distelhorst, C.W. J. Cell Sci., 2003, 116:4493-4499), анти-апоптотическая функция Bcl-2 по меньшей мере частично опосредуется его способностью предотвращать высвобождение кальция из ER и последующую пертурбацию митохондриальных мембран и высвобождение цитохрома с. Поскольку Bcl-2 сверхэкспрессируется во многих типах опухолей, включая рак яичника (Sharma, H. et al., Head Neck, 2004, 26:733-740; Hanaoka, T. et al. Intl. J. Clin. Oncol., 2002, 7:152-158; Trisciuoglio, D. et al. J. Cell Physiol., 2005, 205:414-421; Khalifer, I. et al. Int. J. Gynecol. Pathol., 2004, 23:162-169; O'Neill, C.J. et al. Am. J. Surg. Pathol., 2005, 29:1034-1041), он способствует устойчивости (резистентности) к химическому воздействию посредством стабилизации митохондриальной мембраны против апоптотических повреждений. В настоящее время предклинические исследования сосредоточены на развитии агентов, которые ингибируют Bcl-2, в том числе антисмысловых олигонуклеотидов, таких как G3139 (Ackermann, E.J. et al. J. Biol. Chem., 1999, 274:11245-11252), и ингибиторов с малой молекулой Bcl-2 (Lickliter, J.D. et al. Leukemia, 2003, 17:2074-2080). Хотя такие исследования нацелены на Bcl-2 для терапевтического вмешательства, количественное определение Bcl-2 в моче не сообщалось ранее в литературе.

Было бы полезным иметь доступные анализы, которые обеспечивают безопасные, специфические и экономичные способы для детектирования рака, такого как рак яичника, которые могли бы принести пользу населению во всем мире.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к скринингу на предмет определения рака. Bcl-2 является биомаркером для прогнозирования, диагностики и мониторинга рака, такого как репродуктивный рак. Например, Bcl-2 может быть использован для диагностики и мониторинга рака яичника ранней стадии и поздней стадии. Bcl-2 может быть использован в качестве биомаркера для рака перед хирургией и после рецидива. Bcl-2 и агенты, которые связывают полинуклеотиды или полипептиды Bcl-2, могут быть использованы для детектирования и мониторинга рака яичника и других репродуктивных или не-репродуктивных типов рака.

Таким образом, более конкретно, данное изобретение относится к детектированию рака посредством скрининга на повышенные уровни Bcl-2 в биологических пробах, таких как моча, кровь (например, цельная кровь, сыворотка или плазма) и асцитная жидкость. В одном варианте осуществления раком является рак яичника. В другом варианте осуществления раком является тип рака, выбранный из группы, состоящей из рака молочной железы, рака эндометрия, рака шейки матки, рака легкого, рака ободочной кишки, рака предстательной железы, меланомы, глиобластомы, саркомы, рака мочевого пузыря и рака головы и шеи. Необязательно, этот способ дополнительно предусматривает подтверждение того, что субъект страдает от детектированного рака (например, путем оценки на наличие одного или нескольких симптомов рака, детектированием дополнительных раковых маркеров, детектированием присутствия рака посредством такого способа визуализации как рентгенография, СТ (компьютерная томография), ядерная визуализация (позитронно-эмиссионная томография PET и SPECT)), ультразвук и магнитно-резонансная томография, МRI), и/или лечение указанного субъекта в отношении детектированного рака (например, посредством хирургии, химиотерапии и/или облучения).

Данное изобретение относится также к наборам для проведения способов согласно изобретению.

В другом аспекте, данное изобретение относится к устройству для быстрого детектирования Bcl-2 в биологической жидкости, такой как кровь или моча. Предпочтительно, данное устройство является устройством латерального потока. В одном варианте осуществления данное устройство содержит зону нанесения, содержащую связывающий агент, который связывается с Bcl-2 в пробе; и зону детектирования, где связанный с Bcl-2 связывающий агент удерживается для подачи сигнала, причем сигнал, подаваемый для пробы, полученной из организма субъекта, с уровнем Bcl-2, более низким, чем пороговая концентрация, отличается от сигнала, подаваемого для пробы, полученной из организма пациента, с уровнем Bcl-2, равным пороговой концентрации или большим, чем пороговая концентрация.

В другом аспекте, данное изобретение относится к простому, быстрому, надежному и экономически эффективному тесту на Bcl-2 в биологической жидкости, такой как кровь или моча, сходному с доступными в настоящее время домашними тестами на беременность, которые могли бы использоваться субъектами дома, в офисе врача или у постели пациента.

В одном варианте осуществления указанным тестом является способ измерения Bcl-2 в биологической жидкости, предусматривающий (а) получение пробы биологической жидкости, такой как кровь или моча, из организма субъекта; (b) контактирование указанной пробы со связывающим агентом, который связывается с любым Bcl-2 в пробе; (с) выделение Bcl-2-связанного связывающего агента; (d) детектирование сигнала, ассоциированного с выделенным связывающим агентом из (с); и (е) сравнение сигнала, детектируемого на стадии (d), со ссылочным сигналом, который соответствует сигналу, подаваемому пробой, полученной из организма субъекта, с уровнем Bcl-2, равным пороговой концентрации. В одном варианте осуществления биологической жидкостью является моча, и пороговая концентрация составляет от 0 нг/мл до 2,0 нг/мл. В другом варианте осуществления биологической жидкостью является моча, и пороговая концентрация равна 1,8 нг/мл.

Для оценки того, могут ли уровни в моче Bcl-2 использоваться для детектирования рака яичника, мочу брали у здоровых волонтеров в норме, у пациентов с раком яичника и измеряли на Bcl-2 при помощи ELISA. Среднее количество Bcl-2 в моче раковых пациентов было обычно по меньшей мере в 10 раз большим, чем у здоровых контролей. Кроме того, ни одна из проб мочи, взятых у 35 женщин с доброкачественным гинекологическим заболеванием (включая тератомы, кисты яичника, лейомиомы, поликистозное заболевание яичника, аденофибромы или цистаденомы), не имела уровней Bcl-2, превышающих уровни, обнаруживаемые у здоровых волонтеров в норме. Уровни в моче Bcl-2 уменьшались до 100% у пациентов с раком яичника после хирургического иссечения опухоли. Чувствительность и специфичность в отношении повышенного уровня Bcl-2 в моче, ассоциированного с раком яичника, составляла почти 100%, тогда как уровни в крови СА125 > 35 Е/мл идентифицировали только у 68% пациентов с раком яичника. Сравнение клинических параметров показало, что уровни в моче Bcl-2 хорошо коррелировали со стадией и степенью дифференцировки опухоли. Однако уровни Bcl-2 в моче не были связаны с возрастом пациента или размером опухоли. Таким образом, количественное определение Bcl-2 в моче анализами на основе ELISA обеспечивает безопасный, чувствительный, специфический и экономичный способ детектирования рака яичника для мониторинга рака яичника в ходе заболевания и для предсказания терапевтического и прогностического исхода.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 является гистограммой, изображающей уровни в моче Bcl-2. Уровни в моче Bcl-2 выше у пациентов с раком яичника в сравнении с здоровыми волонтерами в норме. Мочу брали у здоровых волонтеров в норме и у пациентов с раком яичника (включая гистологические подтипы серозные, муцинозные) и перитонеальным раком. Серозные типы рака яичника дополнительно подразделяли на стадию 1 (первые три столбца от левой стороны серозной группы), стадию 2 (следующие восемь столбцов в серозной группе (т.е. столбцы 4-11 от левой стороны серозной группы)) и стадию 3 (одиннадцать столбцов в правой части серозной группы (т.е. столбцы 12-22 слева от серозной группы). Мочу тестировали в трех повторах на Bcl-2 при помощи ELISA (наборы ELISA от Bender MedSystems, номер по каталогу BMS244/3), и результаты выражали в виде средних величин в нг/мл Bcl-2 ± S.E. (стандартная ошибка). Данные показывают постоянно повышенные уровни Bcl-2 в моче пациентов с раком. Анализ с использованием t-критерия Стьюдента выявил статистически значимое различие между образцами в норме и раковыми образцами при p < 0,00001.

Фиг.2 является гистограммой, изображающей уровни в моче Bcl-2 в норме и у раковых пациентов. Дополнительные образцы мочи брали у здоровых волонтеров в норме и у пациентов с раком яичника (включая гистологические подтипы эндометриоидный, серозный и муцинозный) и перитонеальным раком. Серозные типы рака яичника дополнительно подразделяли на стадию 1 (7 самых левых столбцов в серозной группе), стадию 2 (столбцы 8-17 из левой части в серозной группе) и стадию 3 (12 самых правых столбцов в серозной группе). Мочу тестировали в трех повторах на Bcl-2 при помощи ELISA (наборы ELISA от Bender MedSystems, номер по каталогу BMS244/3), результаты выражали в виде средних величин в нг/мл Bcl-2, и они представляют все образцы мочи пациентов в норме и предоперационных пациентов с раком, тестированных к настоящему времени. В соответствии с фиг.1, эти данные последовательно показывают повышенные уровни Bcl-2 в моче пациентов с раком. Анализ с использованием t-критерия Стьюдента выявил статистически значимое различие между образцами в норме и раковыми образцами при p < 0,00001.

Фиг.3A и 3B являются гистограммами, демонстрирующими, что Bcl-2 в моче связан со стадией и степенью дифференцировки опухоли, соответственно. Уровни Bcl-2 в моче строили в зависимости от стадии опухоли из всех доступных гистологических подтипов рака яичника (серозного, эндометриоидного, муцинозного). Стадии I, II, III и V представлены римскими цифрами с указаниями групп под ними. Фиг.3А иллюстрирует, что уровни в моче Bcl-2, хотя они все еще являются значительно более высокими, чем контроли в норме, были наиболее низкими в стадии I и II опухолей (средняя величина в нг/мл Bcl-2 = 2,2), где это заболевание локализовано в яичнике и перитонеальной полости, соответственно. Уровни в моче Bcl-2 были наивысшими среди стадий III и V (средняя величина в нг/мл Bcl-2 = 4,22), когда это заболевание распространялось в значительной степени за пределы яичника или было рецидивирующим заболеванием, соответственно.

Фиг.4A и 4B являются парой гистограмм, изображающих возможность использования Bcl-2 в моче (фиг.4А) относительно измерений уровней в плазме СА125 в детектировании рака яичника (фиг.4B). Где возможно, уровни Bcl-2 в моче, показанные ранее на фиг.1-3, сравнивали с уровнями в плазме СА125 тех же самых здоровых волонтеров в норме и раковых пациентов. Последняя группа включала в себя пациентов с муцинозным раком яичника (Muc), первичным перитонеальным раком (РР) и серозным раком яичника (Serous). Уровни CA125 определяли при помощи ELISA (наборы от Bio-Quant, San Diego, CA, номер по каталогу BQ1013T) в трех повторах. Эти данные выражены в виде средней величины в нг/мл Bcl-2 (A) и средней величины Е/мл CA125 (фиг.4B). Чувствительность и специфичность в отношении детектирования рака яичника по повышенным уровням Bcl-2 в моче составляла почти 100%. В противоположность этому, уровни в крови CA125 > 35 Е/мл, распространенного в настоящее время стандарта для детектирования рака яичника, корректно идентифицировали только у 68% пациентов с раком яичника.

Фиг.5 является гистограммой, показывающей, что Bcl-2 в моче не коррелирует с возрастом пациента. Для испытания того, коррелируют ли повышенные уровни в моче Bcl-2 у раковых пациентов с возрастом пациента, уровни Bcl-2 в моче (определенные ранее на фиг.1-3 и 4А-4В) сравнивали с возрастом пациента в годах. Хотя средний возраст здоровых волонтеров в норме в этом исследовании был несколько более низким (54,9 года), чем возраст раковых пациентов (66,2 года), не было статистически значимого различия в возрасте между указанными группами вследствие широкого диапазона в возрасте (см. вставку на фиг.5). Кроме того, средний возраст раковых пациентов согласуется с литературными и клиническими данными, свидетельствуя о том, что рак яичника обычно поражает женщин приблизительно в возрасте наступления менопаузы или после наступления менопаузы. Однако, по-видимому, не было корелляции между уровнями в моче Bcl-2 и возрастом пациента.

Фиг.6 является гистограммой, показывающей, что Bcl-2 в моче не коррелирует с размером опухоли яичника. Для испытания того, коррелируют ли повышенные уровни в моче Bcl-2 у раковых пациентов с размером опухоли, уровни Bcl-2 в моче (определяемые ранее на фиг.1-3 и 4А-4В) сравнивали с размером опухоли. Опухоли классифицировали как 1=микроскопические по размеру; 3=опухоли, меньшие чем 3 см; 6=опухоли между 3 и 6 см; 10=опухоли, бóльшие чем 6 см и до 10 см; 11=опухоли, бóльшие чем 11 см. Эти данные показывают, что, по-видимому, нет корелляции между уровнями в моче Bcl-2 и размером опухоли.

Фиг.7A и 7B являются парой гистограмм, показывающих, что Bcl-2 в моче уменьшается после операции иссечения рака яичника. Для дополнительного испытания точности Bcl-2 в моче для детектирования рака яичника уровни Bcl-2 в моче сравнивали с уровнями доступных пациентов с раком яичника непосредственно до (черные столбцы) и в пределах 2 недель после (серые столбцы) первоначальной операции иссечения опухоли (удаления всей видимой опухоли) (фиг.7А). Для этих 7 пациентов, у которых пробы мочи брали до и после начальной хирургии, уровни Bcl-2 уменьшались до 100% после хирургического удаления опухоли. Кроме того, эти данные предполагают, что опухоль является источником Bcl-2, который является повышенным в моче пациентов с раком яичника, и что уровни Bcl-2 в моче изменяются параллельно присутствию рака яичника. Кроме того, пробы мочи брали у 5 из 7 пациентов на фиг.7А при последующих визитах в клинику для наблюдения в течение 7-11 месяцев после первоначальной операции, и измеряли на Bcl-2 (синие столбцы) (фиг.7B). Уровни Bcl-2 в моче оставались низкими у 3 наблюдавшихся пациентов (№ 41, 43, 54) и повышались у 2 пациентов (№ 5, 27). Предварительный обзор диаграмм показал, что пациенты № 41, 43, 54 подвергались химиотерапии во время последующих визитов, и что их заболевание раком яичника находилось под контролем. В отличие от этого, обзор диаграмм предполагает, что пациенты № 5, 27 имели рецидивирующее заболевание (5В, 27В), и что пациент № 27b подвергался дополнительной операции иссечения опухоли. В соответствии с клинической информацией, уровни Bcl-2 в моче оставались пониженными у пациентов, подвергшихся химиотерапии, и у пациентов, которые не имели видимого или минимального остаточного заболевания (№ 41, 43, 54). Подобным образом, повышенные уровни Bcl-2 в моче коррелировали с присутствием рецидивирующего заболевания (№ 5b, 27B) и уменьшались с последующим иссечением опухоли (№ 27c).

На фиг.8A и 8B приведены результаты тестирования Bcl-2 у пациентов с доброкачественным гинекологическим заболеванием. Пробы мочи испытывали при помощи ELISA на Bcl-2 у пациентов с доброкачественным гинекологическим заболеванием. Пробы испытывали в трех повторах, и данные выражали в виде средней величины в нг/мл Bcl-2 ± S.E (фиг.8A). Пробы доброкачественного гинекологического заболевания подразделяли по типу (доброкачественная кистозная тератома, простая киста, лейомиома, поликистозный яичник, аденофиброма, муцинозная и серозная цистаденома) с пробой № 41 пациента с раком яичника (белый столбец), служащей в качестве внутреннего положительного контроля. Средние величины нг/мл Bcl-2 в моче ± S.E. среди доброкачественного заболевания показаны под их соответствующими надписями. Пробы, представленные на фиг.2 и фиг.3А, показаны повторно для демонстрации распределения экспрессии Bcl-2 для группы исследования (n=92), показанной на фиг.8B. Уровни Bcl-2 у индивидуумов с доброкачественным заболеванием, у раковых и индивидуумов в норме находились в диапазонах 0,115-1,016 нг/мл, 1,12-9,8 нг/мл и 0-1,26 нг/мл и имели средние величины 0,614 нг/мл, 3,4 нг/мл и 0,21 нг/мл, соответственно.

Фиг.9 является гистограммой, показывающей, что Bcl-2 может быть секретирован в кондиционированную среду культуры клеток. Кондиционированную среду собирали из установленных линий раковых клеток, представляющих рак яичника (OV2008, SKOV3, PA1), рак шейки матки (Hela), рак предстательной железы (LNCap, DU145, PC-3), рак головы и шеи (HN5a) и лимфому (Raji), и испытывали при помощи ELISA на присутствие Bcl-2. Данные выражали в виде средней величины из трех повторных проб. Присутствие Bcl-2 в кондиционированной среде (CM) культур клеток рака яичника, рака шейки матки и рака предстательной железы предполагает, что указанные раковые клетки продуцируют и секретируют Bcl-2.

На фиг.10 показана сверхэкспрессия Bcl-2 в некоторых раковых клетках. Лизаты клеток из установленных линий раковых клеток, представляющих рак яичника (SW626, C13), рак головы и шеи (HN5a), рак шейки матки (Hela) и рак предстательной железы (DU145), подвергали Вестерн-иммуноблоттингу на Bcl-2. Актин служил в качестве нанесенного контроля, и клетки FHIOSE118 (эпителиальные клетки поверхности яичника человека, трансфицированные большим Т-антигеном SV-40) служили в качестве нормальных, незлокачественных эпителиальных контрольных клеток поверхности яичника. После денситометрических анализов уровень Bcl-2 нормализовывали относительно актина, как показано под блотами. Нормальные клетки содержали незначительные количества Bcl-2, тогда как клетки рака яичника и рака шейки матки содержали наибольшее количество Bcl-2.

На фиг.11 показаны концентрации белка Bcl-2 после хранения. Пробы мочи здоровых индивидуумов в норме (№ 506, 508) и пациентов с раком яичника (№ 77, 97) сначала тестировали на Bcl-2 в виде части этого исследования (контроль) и после хранения в течение 4 дней при комнатной температуре (25°C), в холодильнике (4°C), в морозильнике -20^оC (-20^оC) или в морозильнике -80^оC (-80^оC). Все пробы тестировали в двух повторах на уровни Bcl-2 в моче с использованием набора для ELISA (BenderMed Systems).

На фиг.12 показаны концентрации белка Bcl-2 в кондиционированной среде (CM) линий раковых клеток после обработки лизофосфатидной кислотой (LPA), в том числе DU145, линии клеток рака предстательной железы. На фигуре показано, что обработка LPA, которая часто подается обратно в раковые клетки по способу аутокринной петли, стимулирует секрецию Bcl-2 в СМ некоторых типов раковых клеток. Поскольку линии раковых клеток секретируют Bcl-2 в их CM, как это делают линии клеток рака яичника, опухолевые копии таких клеточных линий потенциально секретируют Bcl-2 в биологические жидкости, такие как моча и/или кровь, и могут быть детектированы с использованием данного изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO:1 является ДНК Bcl-2 человека (номер доступа GenBank M14745); кодирующая область (CDS): основания 32-751.

SEQ ID NO:2 является белком Bcl-2 человека (номер доступа GenBank AAA35591).

SEQ ID NO:3 является ДНК Bcl-2 человека, вариантом альфа транскрипта (номер доступа GenBank NM_000633); CDS: основания 494-1213.

SEQ ID NO:4 является белком Bcl-2 человека, вариантом альфа транскрипта (номер доступа GenBank NP_000624).

SEQ ID NO:5 ДНК Bcl-2 человека, вариантом бета транскрипта (номер доступа GenBank NM_000657); CDS: основания 494-1111.

SEQ ID NO:6 является белком Bcl-2 человека, вариантом бета транскрипта (номер доступа GenBank NP_000648).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Bcl-2 является эффективным молекулярным маркером рака, такого как рак яичника. Раковые маркеры (также называемые опухолевыми маркерами) являются молекулами, такими как гормоны, ферменты и иммуноглобулины, обнаруживаемыми в организме, которые ассоциированы с раком, и измерение или идентификация которых полезны в диагностике или клиническом лечении пациентов. Они могут быть продуктами самих раковых клеток или продуктами, вырабатываемыми в организме в ответ на раковые или другие состояния. Большинство раковых маркеров являются белками. Некоторые раковые маркеры обнаруживаются только при единственном типе рака, тогда как другие могут быть детектированы в нескольких типах рака. Как и в случае других раковых маркеров, Bcl-2 может быть использован для различных целей, таких как скрининг здоровой популяции или популяции большого риска на наличие рака; диагностика рака или конкретного типа рака, такого как рак яичника; прогнозирование и мониторинг хода заболевания у субъекта с ремиссией или при проведении операции, облучения, химиотерапии или другой противораковой обработки.

Для оценки того, могут ли уровни Bcl-2 в моче быть использованы для детектирования рака яичника, мочу брали у здоровых волонтеров в норме (N=21) и у пациентов с раком яичника (N=34) и первичным перитонеальным раком (N=2), и в трех повторах измеряли уровень Bcl-2 с использованием коммерчески доступных наборов ELISA (BenderMedSystems, номер по каталогу BMS244/3), в соответствии с инструкциями изготовителя. Результаты выражали в виде средней величины в нг/мл Bcl-2 ± S.E. Средняя величина Bcl-2 в моче здоровых волонтеров составляла 0,204 нг/мл, тогда как эта же величина у предоперационных пациентов составляла 3,12 нг/мл, обычно по меньшей мере в 10 раз больше, чем обнаруживаемая в норме в контроле. Анализ с использованием t-критерия Стьюдента выявил статистически значимое различие между образцами в норме и раковыми образцами при p < 0,00001. Сравнение клинических параметров показало, что уровни Bcl-2 в моче коррелировали со стадией и степенью дифференцировки опухоли (фиг.3A и 3B).

Пробы плазмы некоторых из тех же самых индивидуумов, описанных выше, исследовали в трех повторах, определяя уровни СА125 при помощи коммерчески доступного ELISA (Bio-Quant, номер по каталогу BQ1013T), в соответствии с инструкциями изготовителя. Чувствительность и специфичность в отношении повышенных уровней Bcl-2 в моче, ассоциированных с детектированием рака яичника, составляла почти 100%, тогда как уровни в крови CA125 > 35 Е/мл, распространенного стандарта для детектирования рака яичника, корректно идентифицировали только у 68% пациентов с раком яичника.

Для дополнительного испытания точности в отношении уровней Bcl-2 в моче для детектирования рака яичника уровни Bcl-2 в моче сравнивали у доступных пациентов с раком яичника непосредственно до и в пределах 2 недель после начальной операции иссечения (удаления всей видимой опухоли). Для тех 7 пациентов, у которых брали пробы мочи до и после операции иссечения опухоли, уровни Bcl-2 уменьшались до 100% после хирургического удаления опухоли. Кроме того, эти данные предполагают, что указанная опухоль является источником Bcl-2, обнаруживаемого в моче пациентов с раком яичника. Кроме того, пробы мочи брали у 5 из 7 пациентов при последующих визитах в клинику для наблюдения в течение 7-11 месяцев после первоначальной операции, и измеряли уровень Bcl-2. Уровни Bcl-2 в моче оставались низкими у 3 наблюдавшихся пациентов (№ 41, 43, 54) и повышалась у 2 пациентов (№ 5, 27). Предварительный обзор диаграмм показал, что пациенты № 41, 43, 54 подвергались химиотерапии по время последующих визитов, и что их заболевание раком яичника находилось под контролем. В отличие от этого, обзор диаграмм предполагает, что пациенты № 5, 27 имели рецидивирующее заболевание (5В, 27В), и что пациент № 27b подвергался дополнительной операции иссечения опухоли. В соответствии с клинической информацией, уровни Bcl-2 в моче оставались пониженными у пациентов, подвергшихся химиотерапии, и у пациентов, которые не имели видимого или минимального остаточного заболевания (№ 41, 43, 54). Подобным образом, повышенные уровни Bcl-2 в моче коррелировали с присутствием рецидивирующего заболевания (№ 5b, 27B) и уменьшались с последующим иссечением опухоли (№ 27c).

Взятые вместе, эти данные указывают, что количественное определение Bcl-2 в моче при помощи анализов на основе ELISA обеспечивает, по-видимому, новый, безопасный, чувствительный, специфический и экономичный способ детектирования рака яичника. Кроме того, уровни Bcl-2 в моче могут быть использованы для мониторинга наличия рака яичника в ходе заболевания и помогают предсказывать терапевтический и прогностический исход.

В одном аспекте, данное изобретение включает в себя способ детектирования рака у субъекта, предусматривающий детектирование присутствия Bcl-2 в биологической пробе, полученной из организма указанного субъекта, такой как моча, кровь, перитонеальная жидкость или асцитная жидкость, причем уровень Bcl-2, более высокий, чем предварительно определенный порог, служит признаком рака у этого субъекта. Предпочтительно детектирование проводят методом количественного слот-блот-анализа (такого как коммерчески доступный анализ от BioRad).

Детектирование и/или мониторинг рака с использованием способов, устройств и наборов согласно изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, рак молочной железы (например, инфильтрирующий (инвазивный), преинвазивный, воспалительный, связанный с болезнью Педжета, метастатический или рецидивирующий); желудочно-кишечный/дигестивный рак (например, рак аппендикса, желчных протоков, ободочной кишки, пищевода, желчного пузыря, желудочный рак, кишечный рак, рак печени, поджелудочной железы, ректальный рак и рак желудка); рак мочеполовой системы/мочевых путей (например, надпочечника, мочевого пузыря, почки, полового члена, предстательной железы, яичек и мочевых путей); гинекологический рак (например, шейки матки, эндометрия, фаллопиевой трубы, яичника, матки, вагины и вульвы); рак головы и шеи (например, рак глаза, головы и шеи, челюсти, гортани, носовой полости, ротовой полости, фарингеальный рак, рак слюнных желез, синуса, горла, щитовидной железы, языка и миндалины); гематологический рак/рак крови (например, болезнь Ходжкина, лейкоз (острый лимфоцитарный лейкоз, острый гранулоцитарный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз), множественную миелому, лимфому и рак лимфатического узла); рак мышечно-скелетной ткани/мягкой ткани (например, рак кости, остеосаркому, меланому, рак кожи (базально-клеточный, плоскоклеточный), саркому (саркому Юинга, саркому Капоши)); неврологический рак (например, рак мозга (астроцитому, глиобластому, глиому), рак гипофиза, спинного мозга)); и рак дыхательных путей/рак легкого (например, рак легкого (аденокарциному, овсяно-клеточный рак, немелкоклеточный рак, мелкоклеточный рак, плоскоклеточный рак) и мезотелиому). В одном варианте осуществления указанным раком является рак яичника. В другом варианте осуществления, указанный рак является раком типа, выбранного из группы, состоящей из рака молочной железы, рака эндометрия, рака шейки матки, рака легкого, рака ободочной кишки, рака предстательной железы, меланомы, глиобластомы, саркомы, рака мочевого пузыря и рака головы и шеи.

В одном варианте осуществления способа согласно изобретению детектирование предусматривает (а) контактирование биологической пробы со связывающим агентом, который связывает белок Bcl-2 с образованием комплекса; и (b) детектирование этого комплекса; и коррелирование детектированного комплекса с количеством белка Bcl-2 в пробе, причем присутствие повышенного уровня белка Bcl-2 является показателем наличия рака. В конкретном варианте осуществления детектирование (b) дополнительно предусматривает связывание метки или включение метки на агенте или использование иммуноферментного детектирования на основе ELISA.

Необязательно, способы согласно изобретению дополнительно предусматривают детектирование биомаркера рака в той же самой биологической пробе или другой биологической пробе, полученной из организма субъекта, до, во время или после указанного детектирования Bcl-2. В одном варианте осуществления указанный биомаркер рака является биомаркером репродуктивного рака, такого как гинекологический рак. В другом варианте осуществления указанный биомаркер является СА125 или OVXI. Субъект может иметь повышенный уровень СА125 в крови в момент проведения детектирования Bcl-2 или может не иметь повышенного уровня СА125 в крови в момент проведения детектирования Bcl-2.

В некоторых вариантах осуществления субъект страдает от рака, например, рака яичника, и детектирование выполняют в нескольких временных точках с интервалами, в виде частичного мониторинга субъекта до, во время или после лечения рака.

Необязательно, способы согласно изобретению дополнительно предусматривают сравнение уровня Bcl-2 в биологической пробе с уровнем Bcl-2, присутствующим в контрольной пробе в норме, причем более высокий уровень Bcl-2 в биологической пробе в сравнении с уровнем в контрольной пробе в норме является показателем рака, например, рака яичника.

В некоторых вариантах осуществления субъект не обнаруживает симптомов рака в момент проведения детектирования Bcl-2. В других вариантах осуществления субъект обнаруживает один или несколько симптомов рака в момент проведения детектирования Bcl-2. Например, что касается гинекологического рака (например, рака яичника), один или несколько симптомов гинекологического рака включают в себя симптомы, выбранные из группы, состоящей из боли в области таза, анального вагинального кровотечения, вздутия живота или метеоризма, постоянной боли в спине, постоянного расстройства желудка, изменения работы кишечника (такого как констипация, диарея, кровь в стуле, газ, более жидкий стул, частота или позывы на мочеиспускание), боли во время полового сношения, непреднамеренной потери массы на десять или более фунтов, аномалии вульвы или вагины (например, волдырей, изменения цвета кожи или выделения), изменения в молочной железе (такие как вздутие (шишка), болезненность, выделение из соска, покраснение или опухание) и усталость.

В другом варианте осуществления данное изобретение включает в себя способ прогностического обследования субъекта, имеющего рак или подозреваемого в том, что он имеет рак, предусматривающий а) определение уровня Bcl-2 в биологической пробе, полученной из организма субъекта, такой как моча, кровь или асцитная жидкость; b) сравнение уровня, определяемого на стадии (а), с диапазоном уровней Bcl-2, характерных для биологической пробы, полученной из организма субъекта в норме, который не имеет рака; и с) определение прогноза для указанного субъекта на основе сравнения на стадии (b), причем высокий уровень Bcl-2 на стадии (а) указывает на агрессивную форму рака и, следовательно, на неблагоприятный прогноз.

Термины “детектирование” или “детектировать” включают в себя анализ или установление иным образом присутствия или отсутствия Bcl-2-мишени (кодирующей Bcl-2 последовательности нуклеиновой кислоты или продукта гена Bcl-2 (полипептида)), его субъединиц или комбинаций связанных с агентом мишеней, и т.п. или анализ, с использованием опроса, выяснения, установления или иным образом определения, на одну или несколько фактических характеристик гинекологического рака, метастазирование, стадию или подобные состояния. Указанный термин включает в себя диагностическое, прогностическое применение и применение для мониторинга Bcl-2 и других раковых маркеров. Указанный термин включает в себя методологии количественного, полуколичественного и качественного детектирования. В вариантах данного изобретения, включающих в себя детектирование белка Bcl-2 (в противоположность молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих белок Bcl-2), указанный способ детектирования является предпочтительно способом на основе ELISA. Предпочтительно, в различных вариантах осуществления данного изобретения способ детектирования обеспечивает результат (т.е. считывание или сигнал) с информацией, касающейся присутствия, отсутствия или количества Bcl-2 в пробе субъекта. Например, этот результат может быть качественным (например, «положительным» или «отрицательным») или количественным (например, концентрацией, например, в нанограммах на миллилитр).

В одном варианте осуществления данное изобретение относится к способу детектирования рака у субъекта путем количественного определения белка Bcl-2 или кодирующих его нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) в биологической пробе, такой как моча, полученной у субъекта, предусматривающему (а) контактирование (реакцию) биологической пробы с антителом, специфичным в отношении Bcl-2, которое прямо или опосредованно помечено детектируемым веществом; и (b) детектирование данного детектируемого вещества.

В одном варианте осуществления данное изобретение относится к способу диагностики и/или мониторинга рака у субъекта путем количественного определения белка Bcl-2 в биологической пробе, такой как моча или кровь, полученной у субъекта, предусматривающий (а) реакцию данной биологической пробы с антителом, специфичным в отношении Bcl-2, которое прямо или опосредованно помечено детектируемым веществом; и (b) детектирование данного детектируемого вещества.

Варианты способов согласно изобретению включают в себя (а) контактирование биологической пробы, полученной у субъекта, с антителом, специфичным в отношении Bcl-2, которое прямо или опосредованно помечено ферментом; (b) добавление субстрата для указанного фермента, причем этот субстрат выбран таким образом, что субстрат или продукт реакции фермента и субстрата образует флуоресцентные комплексы; (с) количественное определение Bcl-2 в пробе путем измерения флуоресценции флуоресцентных комплексов и (d) сравнение этих количественных уровней с количественными уровнями стандарта.

В предпочтительном варианте данного изобретения предусмотрены следующие стадии:

(a) инкубирование биологической пробы с первым антителом, специфичным в отношении Bcl-2, которое прямо или опосредованно помечено детектируемым веществом, и вторым антителом, специфичным в отношении Bcl-2, которое является иммобилизованным;

(b) отделение первого антитела от второго антитела для обеспечения фазы первого антитела и фазы второго антитела;

(c) детектирование детектируемого вещества в фазе первого или второго антитела с количественным определением посредством Bcl-2 в биологической пробе; и

(d) сравнение количественно определенного Bcl-2 со стандартом.

Стандарт, используемый в способе согласно изобретению, может соответствовать уровням Bcl-2, полученным для проб у здоровых контрольных субъектов, у субъектов с доброкачественным заболеванием (например, доброкачественным гинекологическим заболеванием), у субъектов с гинекологическим раком ранней стадии, или других проб, полученных из организма субъекта. Увеличенные уровни Bcl-2 в сравнении с данным стандартом могут быть показателем рака, например, рака яичника ранней или поздней стадии.

В изобретении рассматривается также применение описанных здесь способов, устройств и наборов вместе с одним или несколькими дополнительными маркерами («биомаркерами») рака. Таким образом, в данном изобретении рассматривается способ анализа биологической пробы на наличие Bcl-2 и анализа той же самой пробы или другой биологической пробы того же самого субъекта на другие маркеры, которые являются специфическими индикаторами рака. Указанные один или несколько дополнительных маркеров могут быть детектированы до, во время и/или после проведения детектирования Bcl-2. Примеры маркеров включают в себя CA125, LPA и OVXI. В предпочтительном варианте осуществления такими маркерами являются Bcl-2 и СА125. Описанные здесь способы, устройства и наборы могут быть модифицированы таким образом, что они включают в себя агентов для детектирования дополнительных маркеров или нуклеиновых кислот, кодирующих эти маркеры.

Маркеры рака, которые могут быть использованы согласно изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, альфа-фетопротеин (AFP), например, для рака поджелудочной железы, почки, яичника, шейки матки и яичек; канцерогенный эмбриональный антиген (CEA), например, для рака легкого, поджелудочной железы, почки, молочной железы, матки, печени, желудочного и колоректального рака; углеводный антиген 15-3 (CA15-3), например, для рака легкого, поджелудочной железы, молочной железы, яичника и печени; углеводный антиген 19-9 (CA19-9), например, для рака легкого, яичника, матки, печени, кишечного, колоректального рака и рака желчных протоков; раковый антиген 125 (CA125), например, для рака легкого, поджелудочной железы, молочной железы, яичника, шейки матки, матки, печени, кишечного и колоректального рака; свободный специфический для предстательной железы антиген и специфический для предстательной железы антиген-альфа(1) (PSA), для рака предстательной железы; свободный специфический для предстательной железы антиген (PSAF), для рака предстательной железы и колоректального рака; комплекс специфический для предстательной железы антиген альфа(1)-антихимотрипсин (PSAC), для рака предстательной железы; кислая фосфатаза предстательной железы (PAP), для рака предстательной железы; тироглобулин человека (hTG), для рака щитовидной железы или опухоли Вильмса; хорионический гонадотропин бета человека (hCGb), например, для рака легкого, поджелудочной железы, почки, яичника, матки, яичек, печени, колоректального рака, рака мочевого пузыря и рака мозга; ферритин (Ferr), например, для рака легкого, рака яичек, рака гортани, лимфомы Беркитта, нейробластомы и лейкоза; нейрон-специфическая энолаза (NSE), для рака легкого, рака щитовидной железы, опухоли Вильмса и нейробластомы; интерлейкин 2 (IL-2), для рака почки и множественной миеломы; интерлейкин 6 (IL-6), для рака почки, молочной железы, рака яичника и множественной миеломы; бета 2-микроглобулин (B2M), для рака почки, рака яичника, рака предстательной железы, лейкоза, множественной миеломы и лимфомы; и альфа 2-микроглобулин (A2M), для рака предстательной железы. Выбор биологической пробы (например, крови или мочи), в которой вышеупомянутые маркеры рака являются диагностическими и/или прогностическими, может легко выполняться специалистами в данной области.

Как указано выше, данное изобретение обеспечивает способ мониторинга, диагностики или прогноза рака, такого как рак яичника, у субъекта путем детектирования Bcl-2 в биологической пробе, полученной из организма указанного субъекта. В одном варианте осуществления в указанном способе предусмотрено контактирование указанной пробы с антителом, специфичным в отношении Bcl-2, которое прямо или опосредованно помечено детектируемым веществом, и детектирование указанного детектируемого вещества.

Способы согласно изобретению могут быть использованы для детектирования избытка или недостатка Bcl-2 относительно состояния без нарушения или для детектирования наличия модифицированного (например, меньшего, чем полноразмерный) Bcl-2, которое коррелирует с состоянием нарушения (например, рака яичника), или прогрессирования в направлении состояния нарушения. Описанные здесь способы могут быть использованы для оценки вероятности наличия злокачественных или предраковых клеток. Такие способы могут быть использованы для детектирования опухолей, количественного определения их роста и способствуют диагностике и прогнозу гинекологического рака. Указанные способы могут быть использованы для детектирования наличия раковых метастазов, а также для подтверждения отсутствия раковых клеток или удаления всей опухолевой ткани после операции, противораковой химиотерапии и/или лучевой терапии. Кроме того, они могут быть использованы для мониторинга противораковой химиотерапии и повторного возникновения опухоли.

Способы согласно изобретению применимы, в частности, в диагностике ранней стадии рака яичника (например, когда субъект является бессимптомным) и для прогноза прогрессирования и смертности при заболевании раком яичника. Как показано здесь, повышенные уровни Bcl-2, детектируемые в пробе (например, мочи, сыворотки, плазмы, цельной крови, асцитов) в сравнении со стандартом (например, уровнями для субъектов в норме или доброкачественных нарушений), являются показателями продвинутой стадии заболевания, серозного гистологического типа, субоптимального иссечения опухоли, большой остаточной опухоли и/или риска прогрессирования заболевания и летальности.

Термины “проба”, “биологическая проба” и т.п. относятся к типу материала, о котором известно, что он экспрессирует или содержит Bcl-2, или в котором подозревают экспрессию или содержание Bcl-2, такому как моча. Тест-проба может быть использована непосредственно в том виде, в котором она получена, или после предобработки для модификации характера этой пробы. Проба может быть получена из любого биологического источника, такого как ткани или экстракты, в том числе клетки (например, опухолевые клетки) и физиологические жидкости, такие, например, как цельная кровь, плазма, сыворотка, перитонеальная жидкость, асциты и т.п. Указанная проба может быть получена из организма животных, предпочтительно, млекопитающих, наиболее предпочтительно, человека. Указанная проба может быть предобработана любым способом и может быть получена в любой подходящей среде, которая отрицательно не влияет на проведение анализа. Данная проба может быть обработана перед использованием, например, получением плазмы из крови, разбавлением вязких жидкостей, применением одного или нескольких ингибиторов протеаз к таким пробам, как моча (например, 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторида, ЭДТА, лейпептина и/или пепстатина) и т.п. Обработка пробы может включать в себя фильтрацию, дистилляцию, экстракцию, концентрирование, инактивацию мешающих компонентов, добавление реагентов и т.п.

Присутствие Вcl-2 может быть детектировано в различных биологических пробах, в том числе тканях и их экстрактах. Предпочтительно, Bcl-2 детектируют в моче человека.

В вариантах данного изобретения описанный здесь способ адаптирован для диагностики и мониторинга гинекологического рака путем количественного определения Bcl-2 в биологических пробах, полученных у субъекта. Предпочтительно, количество Bcl-2, количественно определенное в пробе, полученной из организма тестируемого субъекта, сравнивают с уровнями, количественно определенными для другой пробы или более ранней пробы того же субъекта, или уровнями, определенными количественно для контрольной пробы. Уровни для контрольных проб здоровых субъектов могут быть установлены перспективными и/или ретроспективными статистическими исследованиями. Здоровые субъекты, которые не имеют клинически очевидного заболевания или отклонений от нормы, могут быть выбраны для статистических исследований. Диагностика может выполняться путем нахождения статистически различных уровней Bcl-2 в сравнении с контрольной пробой или предыдущими уровнями, количественно определяемыми для того же самого субъекта.

Термин “Bcl-2” относится к белку 2 В-клеточной лимфомы человека (также известному как белок В-клеточной CLL/лимфомы 2, интегральному наружному митохондриальному белку, который блокирует апоптотическую смерть некоторых клеток, таких как лимфоциты (Cleary M.L. et al., Cell, 1986, 47(1):19-28; Tsujimoto Y. and Croce C.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83:5214-5218, которые включены здесь в качестве ссылки в их полном объеме). Термин “Bcl-2” включает в себя последовательности нуклеиновых кислот (например, номер доступа GenBank M14745; SEQ ID NO:1), кодирующие продукт гена Bcl-2 (полипептид), а также полипептид Bcl-2 (например, номер доступа GenBank AAA35591; SEQ ID NO:2). Этот термин включает в себя все гомологи, природно встречающиеся аллельные варианты, изоформы и предшественники Bcl-2 человека с номерами доступа GenBank M14745 и AAA35591. Обычно природно встречающиеся аллельные варианты Bcl-2 человека имеют значительную гомологию последовательности (70-90%) с последовательностями с номерами доступа GenBank M14745 и AAA35591. Аллельные варианты могут содержать консервативные аминокислотные замены из последовательности Bcl-2 или будут содержать замену аминокислоты из соответствующего положения в гомологе Bcl-2. Два варианта транскрипта, альфа и бета, продуцируемые путем альтернативного сплайсинга, различаются в их С-концах. Вариант альфа (номер доступа GenBank NP_000624 (SEQ ID NO:4) и номер доступа GenBank NM_000633 (SEQ ID NO:3)) представляет собой более длинный транскрипт и кодирует более длинную изоформу (альфа), а бета является более коротким (номер доступа GenBank NM_000648 (SEQ ID NO:6); номер доступа GenBank NP_000657 (SEQ ID NO:5). Вариант бета отличается в области 3'-UTR и кодирующего района от варианта альфа, а также в области С-конца. В конкретном варианте осуществления, способы, устройства и наборы согласно изобретению являются специфичными в отношении Bcl-2 (например, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и/или 6), но не в отношении молекул нуклеиновых кислот или полипептидов, известных в данной области в качестве “Bcl-2-подобных” молекул (например, использующих связывающие агенты, специфичные в отношении (например, иммунореактивные с Bcl-2) Bcl-2, но не реактивные с Bcl-2-подобными молекулами), таких как молекулы, описанные у Ruben et al., U.S. Patent Application Publication 2002/0106731 A1, published August 8, 2002, которая включена здесь в качестве ссылки в полном виде.

Термины “субъект” и “пациент” используются взаимозаменяемо для обозначения животного, например, млекопитающего, которое может быть поражено раковым заболеванием. В некоторых случаях рака субъектом является женская особь человека или млекопитающего, не являющегося человеком. В других случаях рака субъектом является мужская особь человека или млекопитающего, не являющегося человеком.

Агентами, которые способны детектировать Bcl-2 в биологических пробах субъектов, являются агенты, которые взаимодействуют или связываются с полипептидом Bcl-2 или молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей Bcl-2. Примеры таких агентов (также называемых здесь связывающими агентами) включают в себя, но не ограничиваются ими, антитела к Bcl-2 или их фрагменты, которые связывают Bcl-2, партнеры связывания Bcl-2 и молекулы нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими полипептиды Bcl-2. Предпочтительно, связывающий агент помечен детектируемым веществом (например, детектируемой частью молекулы). Связывающий агент может сам функционировать в качестве метки.

Bcl-2-антитела

Антитела, специфичные в отношении Bcl-2, которые могут быть использованы в способах согласно изобретению, могут быть получены из научно-исследовательских или коммерческих источников. Альтернативно, выделенный нативный Bcl-2 или рекомбинантный Bcl-2 может быть использован для получения антител, моноклональных или поликлональных антител и иммунологически активных фрагментов (например, Fab- или F(ab')₂-фрагмента), тяжелой цепи антитела, легкой цепи антитела, гуманизированных антител, генетически сконструированной одноцепочечной F_v-молекулы (Ladne et al., U.S. Patent No. 4946778), или химерного антитела, например, антитела, которое имеет специфичность связывания мышиного антитела, но в котором присутствуют фрагменты антитела человека. Антитела, в том числе моноклональные и поликлональные антитела, фрагменты и химеры, могут быть получены с использованием способов, известных квалифицированным в данной области специалистам. Предпочтительно, антитела, используемые в способах согласно изобретению, являются реактивными против Bcl-2, если они связываются с K_a, большей или равной 10⁷ M. В сэндвич-иммуноанализе согласно изобретению используются мышиные поликлональные антитела и кроличьи поликлональные антитела.

Для получения моноклональных антител млекопитающего-хозяина инокулируют белком или пептидом Bcl-2 и затем повторно инокулируют. Селезенки берут у инокулированных млекопитающих спустя несколько дней после последней бустер-иммунизации. Суспензии клеток селезенок сливают с опухолевыми клетками в соответствии с общим способом, описанным Kohler and Milstein (Nature, 1975, 256:495-497). Для возможности использования, пептидный фрагмент должен содержать достаточное количество аминокислотных остатков для определения эпитопа детектируемой молекулы Bcl-2.

Если указанный фрагмент является слишком коротким, чтобы быть иммуногенным, он может быть конъюгирован с молекулой-носителем. Некоторые подходящие молекулы-носители включают в себя гемоцианин фиссуреллы (моллюска) и бычий сывороточный альбумин. Конъюгирование может проводиться способами, известными в данной области. Одним таким способом является объединение остатка цистеина указанного фрагмента с остатком цистеина молекулы-носителя. Пептидные фрагменты могут быть синтезированы способами, известными в данной области. Некоторые подходящие способы описаны Stuart и Young в "Solid Phase Peptide Synthesis," Second Edition, Pierce Chemical Company (1984).

Очистка указанных антител или фрагментов может выполняться различными способами, известными специалистам, в том числе путем осаждения сульфатом аммония или сульфатом натрия с последующим диализом против солевого раствора, методом ионообменной хроматографии, аффинной или иммуноаффинной хроматографии, а также гель-фильтрации, зонального электрофореза и т.д. (Goding in, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2d ed., pp. 104-126, Orlando, Fla., Academic Press). Предпочтительно использовать очищенные антитела или очищенные фрагменты антител, имеющие по меньшей мере часть области, связывающей Bcl-2, включающие в себя, например, фрагменты Fv, F(ab')₂, Fab (Harlow and Lane, 1988, Antibody Cold Spring Harbor), для детектирования Bcl-2 в жидкостях пациентов с гинекологическим раком или субъектов, находящихся при риске возникновения указанного типа рака, предпочтительно в моче или крови пациентов с раком яичника.

Для использования в детектировании и/или мониторинге рака, очищенные антитела могут быть ковалентно связаны, либо непосредственно, либо через линкер, с соединением, которое служит в качестве репортерной группы, для создания возможности детектирования присутствия Bcl-2. Целый ряд различных типов веществ может служить в качестве репортерной группы, в том числе, но не только, ферменты, красители, радиоактивные изотопы металлов и неметаллов, флуорогенные соединения, флуоресцентные соединения и т.д. Способы получения конъюгатов антител указанных антител (или их фрагментов) согласно изобретению, применимых для детектирования и мониторинга, описаны в Патентах США с номерами 4671958; 4741900 и 4867973.

В одном из аспектов изобретения предпочтительные связывающие эпитопы могут быть идентифицированы из известной последовательности гена Bcl-2 и его кодируемой аминокислотной последовательности и использованы для генерирования Bcl-2-антител с высокой аффинностью связывания. Кроме того, идентификация связывающих эпитопов на Bcl-2 может быть использована в проектировании и конструировании предпочтительных антител. Например, ДНК, кодирующая предпочтительный эпитоп на Bcl-2, может быть рекомбинантно экспрессирована и использована для отбора антитела, которое связывается селективно с эпитопом. Затем отобранные антитела подвергают действию пробы при условиях, достаточных для создания возможности специфического связывания этого антитела со специфическим связывающим эпитопом на Bcl-2, и затем детектируют количество образованного комплекса. Методологии специфических антител хорошо понятны и описаны в литературе. Более подробное описание их получения может быть найдено, например, в Practical Immunology, Butt, W. R., ed., Marcel Dekker, New York, 1984.

В данном изобретении рассматривается также детектирование Вcl-2-антител. Bcl-2 является специфичным в отношении гинекологического рака маркером. Таким образом, детектирование Bcl-2-антител в биологических жидкостях субъекта может дать возможность диагностировать гинекологический рак.

Анализы связывания белка

Антитела, специфически реактивные в отношении Bcl-2, или производные, такие как конъюгаты с ферментом или меченые производные, могут быть использованы для детектирования Bcl-2 в различных биологических пробах, например, они могут быть использованы в любых известных иммуноанализах, которые основаны на взаимодействии связывания между антигенной детерминантой белка и антителами. Примерами таких анализов являются радиоиммуноанализы, ферментные иммуноанализы (например, ELISA), тесты с использованием иммунофлуоресценции, иммунопреципитации, латексной агглютинации, гемагглютинации и гистохимические тесты.

Антитело, специфичное в отношении Bcl-2, метят детектируемым веществом, и его местонахождение в биологических пробах может быть определено на основе присутствия детектируемого вещества. Примеры детектируемых веществ включают в себя, но не ограничиваются ими, следующие радиоизотопы (например, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹³¹I), флуоресцентные метки (например, FITC, родамин, лантанидные люминофоры), люминесцентные метки, такие как люминол; ферментные метки (например, пероксидаза хрена, бета-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза, ацетилхолинэстераза), биотинильные группы (которые могут быть детектированы маркированным авидином, например, стрептавидином, содержащим флуоресцентный маркер или ферментную активность, которые могут быть детектированы оптическими или калориметрическими способами), предварительно определенные полипептидные эпитопы, узнаваемые вторичным репортером (например, пары последовательностей лейциновой молнии, сайты связывания для вторичных антител, домены связывания металлов, эпитопные метки). Могут быть также использованы непрямые способы, в которых первичную реакцию антиген-антитело усиливают введением второго антитела, имеющего специфичность в отношении антитела, реактивного против Bcl-2. В качестве примера, если антителом, имеющим специфичность против Bcl-2, является кроличье IgG-антитело, то вторым антителом может быть козье антитело против гамма-глобулина кролика, меченное детектируемым веществом, описанным выше.

Способы конъюгирования или мечения антител, обсуждаемые выше, могут легко выполняться специалистом в данной области. (См., например, Imman, Methods in Enzymology, Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B, Jakoby and Wichek (eds.), Academic Press, New York, p. 30, 1974; and Wilchek and Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications," Anal. Biochem. 171:1-32, 1988, в отношении способов конъюгирования или мечения антител ферментом или партнером связывания лиганда).

Для детектирования сигнала может быть использована флуорометрия с временной разрешающей способностью. Например, способ, описанный в Christopoulos T.K. and Diamandis E.P., Anal. Chem., 1992:64:342-346, может быть использован с обычным фотометром с временной разрешающей способностью.

Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления согласно изобретению, обеспечен способ, в котором Bcl-2-антитело метят ферментом, добавляют субстрат для этого фермента, причем субстрат выбирают таким образом, что субстрат или продукт реакции фермента и субстрата образует флуоресцентные комплексы с лантанидным металлом. Лантанидный металл добавляют и Bcl-2 определяют количественно в пробе измерением флуоресценции флуоресцентных комплексов. Антитела, специфичные в отношении Bcl-2, могут быть прямо или опосредованно помечены ферментом. Ферменты выбирают на основании способности субстрата фермента или продукта реакции фермента и субстрата образовывать комплекс с лантанидными металлами, такими как европий и тербий. Примеры подходящих ферментов включают в себя щелочную фосфатазу и бета-галактозидазу. Предпочтительно, ферментом является щелочная фосфатаза. Bcl-2-антитела могут быть опосредованно помечены ферментом. Например, антитела могут быть конъюгированы с одним партнером пары связывания лиганда, а этот фермент может быть связан с другим партнером пары связывания лиганда. Репрезентативные примеры включают в себя авидин-биотин и рибофлавин-рибофлавинсвязывающий белок. Предпочтительно, антитела биотинилируют, а фермент связывают со стрептавидином.

В одном варианте этого способа антитело, связанное с Bcl-2 в пробе, детектируют путем добавления субстрата для данного фермента. Субстрат выбирают таким образом, что в присутствии лантанидного металла (например, европия, тербия, самария и диспрозия, предпочтительно европия и тербия) субстрат или продукт реакции фермента и субстрата образует флуоресцентный комплекс с лантанидным металлом. Примеры ферментов и субстратов для ферментов, которые обеспечивают флуоресцентные комплексы, описаны в Патенте США № 53112922, Diamandis. В качестве примера, когда антитело прямо или опосредованно помечено щелочной фосфатазой, субстратом, используемым в данном способе, может быть 4-метилумбелиферилфосфат или 5-фторсалицилфосфат. Интенсивность флуоресценции комплексов измеряют с использованием флурометра с временной разрешающей способностью, например, CyberFluor 615 Immoanalyzer (Nordion International, Kanata Ontario).

Проба, антитело, специфичное в отношении Bcl-2, или Bcl-2 могут быть иммобилизованы на носителе. Примерами подходящих носителей являются агароза, целлюлоза, декстран, Сефадекс, Сефароза, липосомы, карбоксилметилцеллюлоза-полистирол, фильтровальная бумага, ионообменная смола, пластиковая пленка, пластиковая трубка, стеклянные гранулы, сополимер полиамина, метилвинилового эфира и малеиновой кислоты, сополимер аминокислот, сополимер этилена и малеиновой кислоты, найлон, шелк и т.д. Носитель может быть, например, в форме пробирки, тест-планшета, лунки, гранул, диска, сферы и т.д. Иммобилизованное антитело может быть получено реакцией материала с подходящим нерастворимым носителем с использованием известных химических или физических способов, например, путем связывания с цианогенбромидом.

В соответствии с одним вариантом осуществления данное изобретение обеспечивает способ определения Bcl-2 в подходящей пробе, например, в моче, измерением Bcl-2 при помощи иммуноанализа. Специалисту в данной области будет понятно, что для измерения Bcl-2 могут быть использованы различные способы иммуноанализа. Обычно, способ иммуноанализа Bcl-2 может быть конкурентным или неконкурентным. Конкурентные способы обычно используют иммобилизованное или способное иммобилизоваться антитело к Bcl-2 (анти-Bcl-2) и меченую форму Bcl-2. Bcl-2 пробы и меченый Bcl-2 конкурируют за связывание с анти-Bcl-2. После отделения меченного Bcl-2, который стал связанным с анти-Bcl-2 (связанной фракции), от меченого Bcl-2, который остался не связанным (не связанной фракции), количество метки либо связанной, либо не связанной фракции измеряют, и это количество может быть коррелировано с количеством Bcl-2 в биологической пробе любым подходящим способом, например, сравнением с калибровочной кривой.

Предпочтительно, для определения Bcl-2 используют неконкурентный способ, причем наиболее обычным способом является «сэндвич»-способ. В этом анализе, используют два анти-Bcl-2-антитела. Одно из анти-Bcl-2-антител является прямо или опосредованно меченым (также называемое «детектирующим антителом», а другое иммобилизовано (также называемое «захватывающим антителом»). Захватывающее антитело и детектирующее антитело контактируют одновременно или последовательно с биологической пробой. Последовательные способы могут выполняться инкубированием захватывающего антитела с пробой и добавлением детектирующего антитела при заданном времени после этого (иногда данный способ называют «прямым» способом); или детектирующее антитело может инкубироваться сначала с последующим добавлением захватывающего антитела (иногда данный способ называют «обратным» способом). После выполнения необходимого инкубирования (инкубирований) до завершения этого анализа захватывающее антитело выделяют из жидкой тест-смеси, и метку измеряют по меньшей мере в части отделенной фазы захватывающего антитела или в остатке жидкой тест-смеси. Обычно, метку измеряют в фазе захватывающего антитела, так как она содержит Bcl-2, связанный захватывающим антителом и детектирующим антителом (в виде «сэндвича» между ними).

В типичном иммунометрическом анализе с двумя сайтами на Bcl-2 одно или оба антитела (захватывающее антитело и детектирующее антитело) являются поликлональными антителами. Метка, используемая в детектирующем антителе, может быть выбрана из любых меток, обычно известных в данной области. Как и в других вариантах анализа детектирования белка, метка может быть ферментом или хемилюминесцентной частью молекулы, например, радиоактивным изотопом, флуорофором, детектируемым лигандом (например, детектируемым вторичным связыванием меченым партнером связывания для этого лиганда) и т.п. Предпочтительно, антитело метят ферментом, который детектируют добавлением субстрата, который выбран таким образом, что продукт реакции фермента и субстрата образует флуоресцентные комплексы. Захватывающее антитело выбирают таким образом, что оно обеспечивает способы отделения от остальной части тест-смеси. Таким образом, захватывающее антитело может вводиться в этот анализ в уже иммобилизованной или нерастворимой форме или может находиться в способной к иммобилизации форме, т.е. в форме, которая делает возможным выполнение иммобилизации после введения захватывающего антитела в этот анализ. Иммобилизованное захватывающее антитело может содержать антитело, ковалентно или нековалентно присоединенное к твердой фазе, такой как магнитная частица, латексная частица, многолуночный микротитрационный планшет, гранула, кювета или другой реакционный сосуд. Примером способного к иммобилизации захватывающего антитела является антитело, которое было химически модифицировано лигандной частью, например, гаптеном, биотином или т.п., и которое может быть затем иммобилизовано контактированием с иммобилизованной формой партнера связывания для этого лиганда, например, антитела, авидина или т.п. В одном варианте осуществления захватывающее антитело может быть иммобилизовано с использованием видоспецифического антитела против захватывающего антитела, которое связано с твердой фазой.

В конкретном способе сэндвич-иммуноанализа согласно изобретению используется два антитела, реактивных в отношении Bcl-2, причем второе антитело обладает специфичностью в отношении антитела, реактивного в отношении Bcl-2, меченного ферментной меткой, и флуорогенный субстрат для фермента. В одном варианте осуществления ферментом является щелочная фосфатаза (ALP), а субстратом является 5-фторсалицилфосфат. ALP отщепляет фосфат из флуорогенного субстрата, 5-фторсалицилфосфата, с образованием 5-фторсалициловой кислоты (FSA). Затем 5-фторсалициловая кислота может образовывать высоко флуоресцентный трехкомпонентный комплекс формы FSA-Tb(3+)-ЭДТА, который может быть количественно определен путем измерения флуоресценции Tb³⁺ в режиме флуорометрии с временной разрешающей способностью. Интенсивность флуоресценции обычно измеряют с использованием флуорометрии с временной разрешающей способностью, как описано здесь.

Вышеописанные способы и форматы иммуноанализа являются примерными и не являются ограничивающими, так как обычно будет понятно, что в данном изобретении может быть использован любой способ или формат иммуноанализа.

Способы, устройства и наборы для детектирования белка согласно изобретению могут использовать технологию нанопроволочного сенсора (Zhen et al., Nature Biotechnology, 2005, 23(10):1294-1301; Lieber et al., Anal. Chem., 2006, 78(13):4260-4269, которые включены здесь в качестве ссылки) или технологию микроконсоля (Lee et al., Biosens. Bioelectron, 2005, 20(10):2157-2162; Wee et al., Biosens. Bioelectron., 2005, 20(10):1932-1938; Campbell and Mutharasan, Biosens. Bioelectron., 2005, 21(3):462-473; Campbell and Mutharasan, Biosens. Bioelectron., 2005, 21(4):597-607; Hwang et al., Lab Chip, 2004, 4(6):547-552; Mukhopadhyay et al., Nano. Lett, 2005, 5(12):2835-2388, которые включены здесь в качестве ссылки) для детектирования Bcl-2 в пробах. Кроме того, Huang et al. описывают иммуноанализ специфического антигена предстательной железы на коммерчески доступном биосенсоре резонанса поверхностных плазмонов (Biosens. Bioelectron., 2005, 21(3):483-490, которая включена здесь в качестве ссылки), который может быть адаптирован для детектирования Bcl-2. Высокочувствительные миниатюрные иммуноанализы могут быть также использованы для детектирования Bcl-2 (Cesaro-Tadic et al., Lab Chip, 2004, 4(6):563-569; Zimmerman et al., Biomed. Microdevices, 2005, 7(2): 99-110, которые включены здесь в качестве ссылки).

Нуклеиновые кислоты

Нуклеиновые кислоты, включающие в себя природно встречающиеся нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, антисмысловые олигонуклеотиды и синтетические олигонуклеотиды, которые гибридизуются с нуклеиновой кислотой, кодирующей Bcl-2, применимы в качестве агентов для детектирования наличия Bcl-2 в биологических пробах пациентов с гинекологическим раком или пациентов, у которых есть риск возникновения гинекологического рака, предпочтительно в моче пациентов с раком яичника или пациентов, у которых есть риск возникновения рака яичника. Данное изобретение рассматривает применение последовательностей нуклеиновых кислот, соответствующих кодирующей последовательности Bcl-2 и комплементарной ей последовательности, а также последовательностей, комплементарных последовательностям транскриптов Bcl-2, встречающимся дополнительно выше или ниже по ходу транскрипции от этой кодирующей последовательности (например, последовательностей, содержащихся в 5'- и 3'-нетранслируемых областях или простирающихся в 5'- и 3'-нетранслируемые области), для применения в качестве агентов для детектирования экспрессии Bcl-2 в биологических пробах пациентов с гинекологическим раком или пациентов, у которых есть риск возникновения гинекологического рака, предпочтительно в моче пациентов с раком яичника или пациентов, у которых есть риск возникновения рака яичника.

Предпочтительными олигонуклеотидами для детектирования присутствия Bcl-2 в биологических пробах являются олигонуклеотиды, которые комплементарны по меньшей мере части последовательности кДНК, кодирующей Bcl-2. Эти комплементарные последовательности известны также в данной области как «антисмысловые» последовательности. Олигонуклеотиды могут быть олигорибонуклеотидами или олигодезоксирибонуклеотидами. Кроме того, олигонуклеотиды могут быть природными олигомерами, состоящими из биологически значимых нуклеотидов, т.е. А (аденина), dA (дезоксиаденина), G (гуанина), dG (дезоксигуанина), С (цитозина), dC (дезоксицитозина), T (тимина) и U (урацила), или модифицированных разновидностей олигонуклеотидов с заменой, например, кислорода фосфата метильной группой или атомом серы в межнуклеотидной фосфодиэфирной связи. Кроме того, нуклеотиды, как таковые, и/или рибозные части молекул могут быть модифицированы.

Олигонуклеотиды могут быть синтезированы химически с использованием любого из известных химических способов синтеза олигонуклеотидов, хорошо описанных в данной области. Например, олигонуклеотиды могут быть получены с использованием любого из коммерчески доступных, автоматизированных синтезаторов нуклеиновых кислот. Альтернативно, олигонуклеотиды могут быть созданы стандартными способами рекомбинантных ДНК, например, индукцией транскрипции некодирующей цепи. Последовательность ДНК, кодирующая Bcl-2, может быть инвертирована в системе рекомбинантой ДНК, например, встроена в обращенной ориентации ниже по ходу транскрипции справа, от подходящего промотора, так что теперь транскрибируется некодирующая цепь.

Хотя для гибридизации с нуклеиновой кислотой, кодирующей Bcl-2, может быть использован олигонуклеотид любой длины, предпочтительными являются олигонуклеотиды, обычно находящиеся в пределах диапазона 8-100 нуклеотидов. Наиболее предпочтительными олигонуклеотидами для применения в детектировании Bcl-2 в пробах мочи являются олигонуклеотиды в пределах диапазона 15-50 нуклеотидов.

Затем олигонуклеотид, выбранный для гибридизации, независимо от того, синтезирован ли он химически или с использованием технологии рекомбинантных ДНК, выделяют и очищают с использованием стандартных способов и затем предпочтительно метят (например, ³⁵S или ³²P) с использованием стандартных протоколов мечения.

В данном изобретении рассматривается также применение пар олигонуклеотидов в полимеразной цепной реакции (ПЦР) для детектирования экспрессии Bcl-2 в биологических пробах. Эти пары олигонуклеотидов включают в себя прямой праймер Bcl-2 и обратный праймер Bcl-2.

Наличие Bcl-2 в пробе, полученной из организма пациента, может быть определено гибридизацией нуклеиновых кислот, например, но не только, Нозерн-блот-анализом, дот-блоттингом, блот-анализом по Саузерну, гибридизацией с флуоресценцией in situ (FISH) и ПЦР. Хроматография, предпочтительно ВЭЖХ, и другие известные анализы могут быть также использованы для определения уровней мессенджер-РНК Bcl-2 в пробе.

Кодирующие Bcl-2 молекулы нуклеиновых кислот предположительно могут быть обнаружены в биологических жидкостях в Bcl-2-положительной раковой клетке, которая сбрасывается или высвобождается в исследуемой жидкости.

В одном из аспектов данного изобретения рассматривается применение нуклеиновых кислот в качестве агентов для детектирования Bcl-2 в биологических пробах пациентов, где нуклеиновые кислоты являются мечеными. Нуклеиновые агенты могут быть меченными радиоактивной меткой, флуоресцентной меткой, ферментом, хемилюминесцентным маркером, колориметрическим маркером или другими метками или маркерами, которые обсуждались выше или которые известны в данной области.

В другом аспекте данного изобретения рассматривается применение Нозерн-блот-анализа для детектирования присутствия мРНК Bcl-2 в пробе биологической жидкости. Первая стадия этого анализа включает в себя разделение пробы, содержащей нуклеиновую кислоту Bcl-2, гель-электрофорезом. Затем диспергированные нуклеиновые кислоты переносят на нитроцеллюлозный фильтр или другой фильтр. Затем, меченый олигонуклеотид подвергают гибридизации на фильтре в подходящих условиях, например, 50% формамида, 5 × SSРЕ, 2 × раствор Денхардта, 0,1% ДСН при 42^оС, как описано в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis et al. (1982, CSH Laboratory). Другие используемые процедуры, известные в данной области, включают в себя гибридизацию в растворе, дот- и слот-гибридизацию РНК и микромассивы на основе зондов. Измерение радиоактивности гибридизованных фрагментов с использованием стандартных процедур, известных в данной области, позволяет количественно определять количество нуклеиновой кислоты Bcl-2, присутствующей в биологической жидкости пациента.

Дот-блоттинг включает в себя нанесение проб, содержащих представляющую интерес нуклеиновую кислоту, на мембрану. Нуклеиновая кислота может быть денатурирована до или после нанесения на мембрану. Процедуры дот-блоттинга хорошо известны специалисту в данной области и описаны более полно в Патентах США с номерами 4582789 и 4617261, описания которых включены здесь в качестве ссылки.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является способом амплификации одной или нескольких специфических последовательностей нуклеиновых кислот с использованием праймеров и агентов для полимеризации и затем детектирования амплифицированной последовательности. Продукт удлинения одного праймера при гибридизации с другим становится матрицей для получения желаемой специфической последовательности нуклеиновой кислоты, и наоборот, и способ повторяют так часто, как это необходимо для получения желаемого количества этой последовательности. Специалист в данной области рутинным образом использует полимеразную цепную реакцию для детектирования присутствия желаемой последовательности (Патент США № 4683195).

Конкретным примером ПЦР, которую рутинным образом выполняет специалист для детектирования желаемых последовательностей, является ПЦР с использованием обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР; Saiki et al., Science, 1985, 230:1350; Scharf et al., Science, 1986, 233:1076). ОТ-ПЦР включает в себя выделение тотальной РНК из биологической жидкости, денатурацию указанной РНК в присутствии праймеров, которые узнают желаемую последовательность нуклеиновой кислоты, использование праймеров для генерирования кДНК-копии РНК обратной транскрипцией, амплификацию кДНК при помощи ПЦР с использованием специфических праймеров и детектирование амплифицированной кДНК электрофорезом или другими способами, известными специалисту в данной области.

В предпочтительном варианте осуществления способы детектирования нуклеиновой кислоты Bcl-2 в биологических жидкостях пациентов с гинекологическим раком или пациентов, у которых есть риск возникновения гинекологического рака, включают в себя Нозерн-блот-анализ, дот-блоттинг, блот-анализ по Саузерну, FISH и ПЦР

Устройства

Способ согласно изобретению может быть реализован на твердом носителе. Используемыми твердыми носителями могут быть твердые носители, которые являются общепринятыми для целей анализа аналита в биологической пробе, и обычно конструируются из таких материалов, как целлюлоза, полисахарид, такой как Сефадекс, и т.п., и могут быть частично окружены корпусом для защиты и/или манипулирования с твердым носителем. Твердый носитель может быть жестким, полужестким, гибким, эластичным (имеющим способность к восстановлению формы («память формы») и т.д., в зависимости от желаемого применения. Bcl-2 может быть детектирован в пробе in vivo или in vitro (ex vivo). Когда, в соответствии с одним вариантом осуществления, количество Bcl-2 в пробе должно быть определено без взятия пробы из организма (т.е. in vivo), этот носитель должен безопасным для субъекта и может быть в любой форме, удобной для введения субъекту. Например, носитель может быть зондом, изготовленным из политетрафторэтилена, полистирола или другого жесткого невредного пластикового материала и имеющим размер и форму, которые подходят для введения субъекту. Выбор подходящего инертного носителя находится в пределах компетенции специалистов в данной области, также как и его размеры для предполагаемой цели.

Стадия контактирования в анализе (способе) согласно изобретению может включать в себя контактирование, объединение или смешивание биологической пробы и твердого носителя, такого как реакционный сосуд, микрососуд, пробирка, микропробирка, лунка, многолуночный планшет или другой твердый носитель. В одном варианте осуществления согласно изобретению, твердый носитель, который контактирует с биологической пробой (например, мочой), имеет подушку абсорбента или мембрану для латерального потока жидкой среды, подлежащей анализу, такие как мембраны, доступные от Millipore Corp. (Bedford, MA), в том числе, но не только, мембраны Hi-Flow Plus™ и мембранные карты и материалы подушек SureWick™ pad.

Диагностическое устройство, применимое в проведении способов согласно изобретению, может быть сконструировано в любой форме, адаптированной для предполагаемого применения. Так, в одном варианте осуществления, устройство согласно изобретению может быть сконструировано в виде одноразовой или повторяемо используемой тест-полоски или щупа для контактирования с биологической пробой, такой как моча или кровь, для которой должен быть определен уровень Bcl-2. В другом варианте осуществления, устройство может быть сконструировано с использованием известных в данной области микромасштабных способов изготовления для получения подобных игле вариантов, пригодных для имплантации или инъекции в анатомический участок, такой как брюшная полость, для постоянного нахождения при диагностических применениях. В других вариантах, устройства, предназначенные для повторного лабораторного применения, могут быть сконструированы в форме удлиненного зонда.

В других вариантах осуществления устройства согласно изобретению содержат твердый носитель (такой как полоска или щуп) с поверхностью, которая функционирует в виде матрикса латерального потока, определяющего путь потока для биологической пробы, такой как моча, цельная кровь, сыворотка, плазма, перитонеальная жидкость или асциты.

Иммунохроматографические анализы, также известные как тест-полоски латерального потока или просто стрип-тесты, для детектирования различных представляющих интерес аналитов, были известны ранее и могут быть использованы для детектирования Bcl-2. Преимущества тестов латерального потока включают в себя благоприятный для пользователя формат, быстрые результаты, долгосрочную стабильность на протяжении широкого диапазона климатических условий и относительно низкую стоимость изготовления. Эти признаки делают тесты латерального потока идеальными для применений, включающих в себя в том числе тестирование в домашних условиях, быстрое диагностическое тестирование и тестирование в этой области на различные аналиты. Лежащий в основе этого теста принцип является простым. По существу любой лиганд, который может быть связан с визуально детектируемым твердым носителем, таким как окрашенные микросферы, может быть количественно тестирован и во многих случаях даже полуколичественно. Например, иммунополоска одностадийного латерального потока для детектирования свободного и тотального специфического антигена предстательной железы в сыворотке описана в Fernandez-Sanchez et al. (J. Immuno. Methods, 2005, 307(1-2):1-12, которая включена здесь в качестве ссылки) и может быть адаптирована для детектирования Bcl-2 в биологической пробе, такой как кровь или моча.

Некоторые из более общих иммунохроматографических анализов, имеющихся в настоящее время на рынке, являются тестами на беременность (такие как, продаваемый без рецепта (OTC) тест-набор), Strep-горло и Chlamydia. Многие новые тесты на хорошо известные антигены были разработаны недавно с использованием способа иммунохроматографического анализа. Например, антиген для наиболее распространенного возбудителя внебольничной пневмонии был известен с 1917 года, но простой анализ был разработан лишь недавно с использованием способа с тест-полоской (Murdoch, D.R. et al. J Clin Microbiol, 2001, 39:3495-3498). Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) детектировался быстро в смешанной крови с использованием сходного анализа (Soroka, S.D. et al. J Clin Virol, 2003, 27:90-96). Нитроцеллюлозную мембранную карту также использовали для диагностики шистосомоза детектированием перемещения и связывания наночастиц угля (van Dam, G.J. et al. J Clin Microbiol, 2004, 42:5458-5461).

Двумя обычными подходами к иммунохроматографическому анализу являются неконкурентная (или прямая) и конкурентная (или конкурентное ингибирование) схемы реакции (TechNote #303, Rev. #001, 1999, Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN). Прямой формат (сэндвич с двумя антителами) обычно используют при тестировании на более крупные аналиты со множественными антигенными сайтами, такие как лютеинизирующий гормон (LH), хорионический гонадотропин человека (hCG) и ВИЧ. В этом случае, желательным является меньшее, чем избыток, количество аналита в пробе, так что некоторые из микросфер не будут захватываться на линии захвата и будут продолжать перемещение в потоке в направлении второй линии иммобилизованных антител, контрольной зоны. Указанная контрольная линия использует видоспецифические анти-иммуноглобулин-антитела, специфические в отношении конъюгатов антител на этих микросферах. Свободный антиген, если он присутствует, вводят на устройство добавлением пробы (мочи, сыворотки и т.д.) на подушку для добавления пробы. Затем свободный антиген связывается с комплексами антитело-микросфера. Антитело 1, специфичное в отношении эпитопа 1 антигена пробы, связывается с окрашенными микросферами и сушится на данном устройстве. При добавлении пробы комплекс микросфера-антитело повторно гидратируется и переносится в зону захвата и контрольных линий жидкостью. Антитело 2, специфичное в отношении второго антигенного сайта (эпитопа 2) антигена пробы, сушится помещением на эту мембрану вблизи линии захвата. Антитело 3, видоспецифическое, анти-иммуноглобулин-антитело, которое будет реагировать с антителом 1, сушится помещением на мембрану вблизи контрольной линии. Если антиген присутствует в пробе (т.е. тест положительный), он будет связываться своими двумя антигенными сайтами как с антителом 1 (конъюгированным с микросферами), так и с антителом 2 (высушенным на мембране вблизи линии захвата). Покрытые антигеном 1 микросферы связываются антителом 3 вблизи контрольной линии независимо от того, присутствует ли антиген или не присутствует. Если антиген не присутствует в этой пробе (тест отрицательный), микросферы проходят линию захвата без улавливания, но захватываются контрольной линией.

Схему конкурентной реакции обычно используют при тестировании на малые молекулы с единственной антигенной детерминантой, которая не может связываться с двумя антителами одновременно. Как и в сэндвич-анализе с двумя антителами, свободный антиген, если он присутствует, вводят на подушку для пробы. Свободный антиген, присутствующий в пробе, связывается с комплексом антитело-микросфера. Антитело 1 является специфичным в отношении антигена пробы и связывается с окрашенными микросферами. Конъюгат антиген-молекула носителя (обычно БСА) сушат на мембране вблизи линии захвата. Антитело 2 (Ab2) сушат на мембране вблизи контрольной линии, и оно является видоспецифическим анти-иммуноглобулин-антителом, которое будет захватывать частицы реагента и подтверждать, что тест завершен. Если антиген присутствует в пробе (тест положительный), антитело на микросферах (Ab1) является уже насыщенным антигеном из пробы, и, следовательно, конъюгат антигена, связанный с линией захвата, не будет связываться с ней. Любые микросферы, не уловленные молекулой носителя антигена, могут быть уловлены Ab2 на контрольной линии. Если антиген не присутствует в пробе (тест отрицательный), окрашенным микросферам, покрытым антителом, дают захватываться конъюгатом антитела, связанным вблизи линии захвата.

Обычно мембраны, используемые для удерживания антител на устройстве, изготавливают из первичных гидрофобных материалов, таких как нитроцеллюлоза. Как микросферы, используемые в качестве твердофазных носителей, так и конъюгатные антитела являются гидрофобными, и их взаимодействие с мембранами позволяет им быть эффективно высушенными на мембране.

Пробы и/или Bcl-2-специфические связывающие агенты могут быть выстроены упорядоченным образом на твердом носителе, или могут быть использованы множественные носители для мультиплексного детектирования или анализа. “Упорядоченное выстраивание” относится к действию организации или размещения членов библиотек (например, упорядоченного ряда различных проб или упорядоченного ряда устройств, которые нацелены на одни и те же молекулы-мишени или на различные молекулы-мишени) или другой коллекции, в логический или физический упорядоченный ряд. Таким образом, «упорядоченный ряд» относится к физическому или логическому размещению, например, биологических проб. Физическим упорядоченным рядом может быть любой «пространственный формат» или «физически выстроенный в виде решетки формат», в котором физические проявления соответствующих членов библиотек размещены упорядоченным образом, что делает возможным комбинаторный скрининг. Например, пробы, соответствующие индивидуальным или объединенным членам библиотеки проб, могут быть размещены в серии пронумерованных рядов и столбцов, например, на многолуночном планшете. Подобным образом, связывающие агенты могут быть высеяны или помещены иным образом в микротитрационные, например, 96-луночные, 384-луночные или 1536-луночные планшеты (или лотки). Необязательно, Bcl-2-специфические связывающие агенты могут быть иммобилизованы на твердом носителе.

Детектирование Bcl-2 и раковых биомаркеров и другие анализы проб могут проводиться одновременно или последовательно с детектированием других молекул-мишеней и могут проводиться автоматизированным образом, в высокопроизводительном формате.

Bcl-2-специфические связывающие агенты могут быть нанесенными, но «свободными» (неиммобилизованными) в зоне конъюгата и могут быть иммобилизованы в зоне захвата твердого носителя. Bcl-2-специфические связывающие агенты могут быть иммобилизованы, например, неспецифической адсорбцией на носителе или ковалентным связыванием с носителем. Способы иммобилизации связывающих агентов на носителях известны в данной области и описаны, например, в Патентах США с номерами 4399217, 4381291, 4357311, 4343312 и 4260678, которые включены здесь в качестве ссылки. Такие способы могут быть использованы для иммобилизации связывающих агентов в данном изобретении. Когда твердым носителем является политетрафторэтилен, можно связывать антитела гормонов на носителе активацией носителя при помощи натрия и аммиака для его аминирования и ковалентным связыванием антитела с активированным носителем посредством карбодиимидной реакции (yon Klitzing, Schultek, Strasburger, Fricke and Wood in "Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine 1982", International Atomic Energy Agency, Vienna (1982), pages 57-62).

В диагностическом устройстве согласно изобретению может быть использована технология полоски латерального потока (LFS), которая может быть применена для ряда других быстрых систем анализа с использованием тест-полоски, таких как продаваемые без рецепта тест-полоски для раннего определения беременности, на основе антител к хорионическому гонадотропину человека (hCG). Как и в случае многих других диагностических устройств, в этом устройстве используется связывающий агент для связывания молекулы-мишени (Bcl-2). Это устройство имеет зону нанесения для приема биологической пробы, такой как кровь или моча, зону мечения, содержащую метку, которая связывается с Bcl-2 в пробе, и зону детектирования, где удерживается метка Bcl-2.

Связывающий агент, удерживаемый в зоне детектирования, дает сигнал, и сигнал различается, в зависимости от того, являются ли уровни Bcl-2 в биологической пробе более низкими, чем конкретная пороговая концентрация, равными пороговой концентрации или большими, чем пороговая концентрация. Например, в случае Bcl-2 в моче для детектирования рака яичника, пороговая концентрация может составлять от 0 нг/мл до 2,0 нг/мл. В другом варианте осуществления, в случае Bcl-2 в моче для детектирования рака яичника, пороговая концентрация составляет 1,8 нг/мл. Проба, полученная из организма субъекта, имеющая уровень Bcl-2, равный указанной ссылочной концентрации Bcl-2 или больший, чем указанная ссылочная концентрация Bcl-2, может называться «пороговым уровнем», «пороговым количеством» или «пороговой пробой». Зона нанесения в указанном устройстве является подходящей для получения биологической пробы, подлежащей анализу. Она обычно образована из абсорбирующего материала, такого как промокательная бумага. Зона мечения содержит связывающий агент, который связывается с любым Bcl-2 в пробе. В одном варианте осуществления связывающим агентом является антитело (например, моноклональное антитело, поликлональное антитело, фрагмент антитела). Для легкости детектирования, связывающий агент PPS ассоциирован с меткой, которая обеспечивает сигнал, который является видимым невооруженным глазом, например, он помечен флуоресцентной меткой или окрашенной меткой, такой как коллоидное золото, которое дает видимую розовую окраску.

Зона детектирования удерживает Bcl-2, с которым связан связывающий агент. Это обычно достигается с использованием иммобилизованного связывающего агента, такого как иммобилизованное антитело. Когда оба - и связывающий агент в зоне мечения, и связывающий агент в зоне детектирования - являются антителами, они обычно узнают различные эпитопы на молекуле-мишени (белке Bcl-2). Это способствует образованию «сэндвича», содержащего антитело-Bcl-2-антитело.

Зона детектирования находится ниже зоны нанесения, причем зона мечения обычно расположена между этими двумя зонами. Таким образом, проба будет мигрировать из зоны нанесения в зону мечения, где любой Bcl-2 в этой пробе связывается с меткой. Комплексы Bcl-2-связывающий агент продолжают мигрировать в зону детектирования вместе с избыточным связывающим агентом. Когда комплекс Bcl-2-связывающий агент встречается с захватывающим реагентом, этот комплекс удерживается, тогда как проба и избыточный связывающий агент продолжают мигрировать. По мере увеличения уровней Bcl-2 в пробе, количество связывающего агента (в форме комплекса Bcl-2-связывающий агент), удерживаемое в зоне детектирования, увеличивается пропорционально.

В предпочтительном варианте осуществления устройство согласно изобретению способно к различению между пробами в соответствии с пороговой концентрацией. Это может достигаться различными путями.

Один тип устройства включает в себя ссылочную зону, которая включает в себя сигнал фиксированной интенсивности, с которым можно сравнивать количество связывающего агента, удержанного в зоне детектирования: когда сигнал в зоне детектирования равен сигналу в ссылочной зоне, указанная проба является пороговой пробой; когда сигнал в зоне детектирования является менее интенсивным, чем в ссылочной зоне, указанная проба содержит меньше Bcl-2, чем пороговая проба; когда сигнал в зоне детектирования является более интенсивным, чем в ссылочной зоне, указанная проба содержит больше Bcl-2, чем пороговая проба.

Подходящая ссылочная зона может быть без труда приготовлена и откалибрована. Для этого типа устройства, связывающий агент будет обычно присутствовать в избытке относительно Bcl-2 в пробе, и ссылочная зона может находиться выше или, предпочтительно, ниже зоны детектирования. Сигнал в ссылочной зоне будет того же самого типа, что и сигнал в зоне детектирования, т.е. обычно оба сигнала будут видимыми невооруженным глазом, например, они будут использовать одну и ту же метку. Предпочтительная ссылочная зона в устройстве этого типа содержит иммобилизованный белок (например, бычий сывороточный альбумин), который помечен коллоидным золотом.

В другом устройстве согласно изобретению ссылочная зона находится ниже зоны детектирования и включает в себя реагент, который захватывает связывающий агент (например, иммобилизованное анти-связывающий агент-антитело). Связывающий агент, который протекает через это устройство, не присутствует в избытке, а находится в такой концентрации, что 50% его связывается с пробой, имеющей Bcl-2 в пороговой концентрации. Таким образом, в пороговой пробе 50% связывающего агента будут удерживаться в зоне детектирования и 50% в ссылочной зоне. Если уровень Bcl-2 в пробе выше уровня Bcl-2 в пороговой пробе, менее чем 50% связывающего агента будут достигать ссылочной зоны, и зона детектирования будет давать более интенсивный сигнал, чем ссылочная зона; напротив, если уровень Bcl-2 в пробе меньше уровня в пороговой пробе, менее чем 50% связывающего агента будут удерживаться в зоне детектирования, и ссылочная зона будет давать более интенсивный сигнал, чем зона детектирования.

В другом устройстве согласно изобретению, которое действует в соответствии со сходными принципами, ссылочная зона находится ниже зоны детектирования и включает в себя ограниченное количество реагента, который захватывает связывающий агент (например, иммобилизованного анти-связывающий агент-антитела). Этот реагент присутствует при таком уровне, что он удерживает то же самое количество метки, которое будет связываться в зоне детектирования для пороговой пробы, причем избыточная метка продолжает мигрировать за пределы ссылочной зоны.

Таким образом, в указанных трех типах устройства используют сравнение между зоной детектирования и ссылочной зоной для сравнения пробы с пороговой концентрацией. Отношение связывания в зоне детектирования : ссылочной зоне предпочтительно может быть определено невооруженным глазом. Тесное соседство зоны детектирования и ссылочной зоны является предпочтительным для облегчения визуального сравнения интенсивностей сигнала в этих двух зонах.

В четвертом типе устройства не требуется ссылочная зона, а зона детектирования сконструирована таким образом, что она дает по существу реакцию по принципу «включено-выключено», например, сигнал не образуется ниже пороговой концентрации, но сигнал образуется при пороговой концентрации или при концентрации выше пороговой концентрации.

В пятом типе устройства не требуется ссылочная зона, но используется наружный стандарт, который соответствует пороговой концентрации. Этот тип может принимать различные формы, например, форму напечатанной карты, с которой может сравниваться сигнал в зоне детектирования, или в форме считывающего прибора (ридера), который сравнивает абсолютную величину, измеренную в зоне детектирования (например, колориметрический сигнал), со ссылочной величиной, хранящейся в памяти этого прибора.

В некоторых вариантах осуществления согласно изобретению устройство включает в себя зону контроля ниже зоны детектирования. Она может обычно использоваться для захвата избыточного связывающего агента, который проходит через зону детектирования и/или ссылочную зону (например, с использованием иммобилизованного анти-связывающий агент-антитела). Когда связывающий агент удерживается в указанной зоне контроля, это подтверждает, что происходила мобилизация связывающего агента, а также миграция через устройство. Будет понятно, что эта функция может достигаться ссылочной зоной.

В предпочтительном варианте осуществления зона детектирования, ссылочная зона и зона контроля предпочтительно образованы на нитроцеллюлозном носителе.

Миграция из зоны нанесения в зону детектирования будет обычно облегчаться тампоном ниже зоны детектирования для создания капиллярного перемещения. Этот тампон обычно образован из абсорбирующего материала, такого как промокательная или хроматографическая бумага.

Устройство согласно изобретению может быть получено простым и дешевым способом, предпочтительно в форме щупа. Кроме того, оно может быть очень легко использовано пользователем, например, в домашних условиях. Таким образом, это изобретение обеспечивает устройство, которое может быть использовано дома для скрининга на предмет обнаружения рака, например, рака яичника.

Наборы для диагностики или мониторинга гинекологического рака

В одном из аспектов данное изобретение включает в себя наборы, содержащие требуемые элементы для диагностики или мониторинга рака. Предпочтительно, данные наборы содержат контейнер для сбора биологической жидкости пациента и агент для детектирования наличия Bcl-2 или кодирующей его нуклеиновой кислоты в этой жидкости. Компоненты указанных наборов могут быть представлены либо в водной среде, либо в лиофилизированной форме.

Способы согласно изобретению могут проводиться с использованием диагностического набора для качественного или количественного детектирования Bcl-2 в пробе, такой как кровь или моча. В качестве примера, набор может содержать связывающие агенты (например, антитела), специфичные в отношении Bcl-2, антитела против этих антител, меченные ферментом; и субстрат для этого фермента. Набор может также содержать твердый носитель, такой как микротитрационные многолуночные планшеты, стандарты, разбавитель для анализа, промывочный буфер, адгезивные крышки для планшетов и/или инструкции для проведения способа согласно изобретению с использованием указанного набора. В одном варианте осуществления набор включает в себя один или несколько ингибиторов протеаз (например, коктейль (смесь) ингибиторов протеаз)) для применения к биологической пробе, подлежащей анализу (такой как кровь или моча).

Могут быть приготовлены наборы для диагностики или мониторинга гинекологического рака, содержащие один или несколько агентов, которые детектируют белок Bcl-2, таких как, но не только, Bcl-2-антитела, их фрагменты или партнеры связывания Bcl-2. Агент (агенты) могут быть упакованы с контейнером для сбора биологической жидкости из организма пациента. При использовании антител или партнера связывания в наборах в форме конъюгатов, к которым присоединена метка, такая как ион радиоактивного металла или часть молекулы, компоненты таких конъюгатов могут доставляться либо в полностью конъюгированной форме, в форме промежуточных продуктов, либо в виде отдельных частей молекул, которые должны быть конъюгированы пользователем этого набора.

Могут быть также приготовлены наборы, содержащие один или несколько агентов, которые детектируют нуклеиновую кислоту, таких как, но не только, полноразмерная нуклеиновая кислота Bcl-2, олигонуклеотиды Bcl-2 и пары праймеров Bcl-2. Агент (агенты) могут быть упакованы с контейнером для сбора биологических проб из организма пациента. Нуклеиновая кислота может находиться в меченой форме или быть способной к превращению в меченую форму.

Другие компоненты набора могут включать в себя, но не ограничиваются ими, средства для сбора биологических проб, средства для мечения детектирующего агента (связывающего агента), мембраны для иммобилизации белка Bcl-2 или нуклеиновой кислоты Bcl-2 в биологической пробе, средства для нанесения биологической пробы на мембрану, средства для связывания агента с Bcl-2 в биологической пробе субъекта, второе антитело, средство для выделения тотальной РНК из биологической жидкости субъекта, средства для выполнения гель-электрофореза, средства для генерирования кДНК из выделенной тотальной РНК, средства для выполнения анализов гибридизации и средства для выполнения ПЦР и т.д.

В данном контексте термин «ELISA» включает в себя твердофазный иммуноферментный анализ, который использует антитело или антиген, связанные с твердой фазой, и конъюгат фермент-антиген или фермент-антитело для детектирования и определения количества антигена (например, Bcl-2) или антитела, присутствующего в пробе. Описание способа ELISA можно найти в части 22 4-го издания Basic and Clinical Immunology by D.P. Sites et al., 1982, published by Lange Medical Publications of Los Altos, Calif, и в Патентах США с номерами 3654090; 3850752 и 4016043, описания которых включены здесь в качестве ссылки. ELISA является анализом, который может быть использован для определения количества антигена, белков или других представляющих интерес молекул в пробе. В частности, ELISA может проводиться прикреплением на твердом носителе (например, поливинилхлориде) антитела, специфичного в отношении представляющего интерес антигена или белка. Может быть добавлен клеточный экстракт или другая представляющая интерес проба, например, моча, для образования комплекса антитело-антиген, и лишняя, не связанная проба вымывается. Добавляют связанное с ферментом антитело, специфичное в отношении отличающегося сайта на этом антигене. Носитель промывают для удаления не связанного второго антитела, связанного с ферментом. Связанное с ферментом антитело может включать в себя, но не ограничивается ею, щелочную фосфатазу. Фермент на втором антителе может превращать добавленный бесцветный субстрат в окрашенный продукт или может превращать нефлуоресцентный субстрат во флуоресцентный продукт. Обеспеченный здесь способ анализа на основе ELISA может проводиться в единственной камере или на серии камер и может быть адаптирован для автоматизированных процессов.

В примерных вариантах осуществления антитела могут быть помечены парой красителей (FRET), белком переноса энергии резонанса биолюминесценции (BRET), комбинациями флуоресцентный краситель-гасящий краситель, белковыми фрагментами для анализов β-gal-комплементации. Антитела могут участвовать во FRET, BRET, гашении флуоресценции или β-gal-комплементации для генерирования, например, флуоресценции, колориметрических сигналов или сигналов усиленной хемилюминесценции (ECL).

Данные способы используются рутинным образом в детектировании антигенспецифических реакций антител и хорошо описаны в общих справочниках по иммунологии, таких как Immunology by Ivan Roitt, Jonathan Brostoff and David Male (London: Mosby, cl998. 5th ed. и Immunobiology: Immune System in Health and Disease/Charles A. Janeway and Paul Travers. Oxford: Blackwell Sci. Pub., 1994), содержания которых включены здесь в качестве ссылки.

Определения

В данном контексте термины «рак» и «раковый» относятся к описанию физиологического состояния млекопитающих, которое обычно характеризуется неконтролируемым ростом клеток, т.е. пролиферативными нарушениями. Примеры таких пролиферативных нарушений включают в себя такие типы рака, как карцинома, лимфома, бластома, саркома и лейкоз, а также другие типы рака, описанные здесь. Более конкретные примеры таких типов рака включают в себя рак молочной железы, рак предстательной железы, рак ободочной кишки, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, желудочно-кишечный рак, рак поджелудочной железы, рак шейки матки, рак яичника, перитонеальный рак, рак печени, например, карцинома печени, рак мочевого пузыря, колоректальный рак, эндометриальная карцинома, рак почки и рак щитовидной железы.

Другими неограничивающими примерами рака являются базально-клеточный рак, рак желчных путей; рак костей; рак головного мозга и ЦНС; хориокарцинома; рак соединительной ткани; эзофагеальный рак; рак глаза; рак головы и шеи; эпителиальная неоплазма; рак гортани; лимфома, в том числе лимфома Ходжкина и не-Ходжкинская лимфома; меланома; миелома; нейробластома; рак ротовой полости (например, губы, языка, рта и глотки); рак поджелудочной железы; ретинобластома; рабдомиосаркома; ректальный рак; рак респираторной системы; саркома; рак кожи; рак желудка; тестикулярный рак; рак матки; рак мочевыводящей системы, а также другие карциномы и саркомы. Примеры типов рака перечислены в таблице 1.

Таблица 1 Примеры типов рака
*	Острый лимфобластный лейкоз взрослых	*	Лейкемический ретикулез
	Острый лимфобластный лейкоз детей		Рак головы и шеи
	Острый миелоидный лейкоз взрослых		Печеночно-клеточный рак (рак печени) взрослых (первичный)
	Острый миелоидный лейкоз детей		Печеночно-клеточный рак (рак печени) детей (первичный)
	Адренокортикальная карцинома		Лимфома Ходжкина взрослых
	Адренокортикальная карцинома детей		Лимфома Ходжкина детей
	Ассоциированные со СПИДом типы рака		Лимфома Ходжкина во время беременности
	Ассоциированная со СПИДом лимфома		Гипофарингеальный рак
	Анальный рак		Глиома гипоталамуса и зрительного пути детей
	Астроцитома детская мозжечковая	*	Внутриглазная меланома
	Астроцитома детская церебральная		Карцинома островковых клеток (эндокринной поджелудочной железы)
*	Базально-клеточная карцинома	*	Саркома Капоши
	Рак желчных протоков, внепеченочный		Рак почки (ренальный рак)
	Рак мочевого пузыря		Рак почки детей
	Рак мочевого пузыря детей	*	Ларингеальный рак
	Рак кости		Ларингеальный рак детей
	Остеосаркома/злокачественная фиброзная гистиоцитома		Лейкоз, острый лимфобластный, взрослых
	Глиома ствола головного мозга детей		Лейкоз, острый лимфобластный, детей
	Опухоль головного мозга взрослых		Лейкоз, острый миелоидный, взрослых
	Опухоль головного мозга, глиома ствола головного мозга детей		Лейкоз, острый миелоидный, детей
	Опухоль головного мозга, мозжечковая		Лейкоз, хронический лимфоцитарный
	Астроцитома детей		Лейкоз, хронический миелогенный
	Опухоль головного мозга, церебральная астроцитома/злокачественная глиома детей		Лейкемический ретикулез
	Опухоль головного мозга, эпендимома детей		Рак губы и ротовой полости
	Опухоль головного мозга, медуллобластома детей		Рак печени взрослых (первичный)
	Опухоль головного мозга, супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли детей		Рак печени детей (первичный)
	Опухоль головного мозга, зрительного пути и гипоталамическая глиома детей		Рак легкого, немелкоклеточный
	Опухоль головного мозга детей		Рак легкого, мелкоклеточный
	Рак молочной железы		Лимфома, ассоциированная со СПИДом
	Рак молочной железы детей		Лимфома Беркитта
	Рак молочной железы мужчин		Лимфома, кожная Т-клеточная, см. грибовидный микоз и синдром Сезари
	Бронхиальные аденомы/карциноиды детей		Лимфома Ходжкина взрослых
	Лимфома Беркитта		Лимфома Ходжкина детей
*	Карциноидная опухоль детей		Лимфома Ходжкина во время беременности
	Карциноидная опухоль, желудочно-кишечная карцинома неизвестная первичная		Лимфома не-Ходжкина взрослых

	Лимфома центральной нервной системы, первичная		Лимфома не-Ходжкина детей
	Мозжечковая астроцитома детей		Лимфома не-Ходжкина во время беременности
	Церебральная астроцитома/злокачественная глиома детей		Лимфома первичная центральной нервной системы
	Рак шейки матки	*	Макроглобулинемия Вальденштрема
	Типы рака детей		Злокачественная фиброзная гистиоцитома кости/остеосаркома
	Хронический лимфоцитарный лейкоз		Медуллобластома детей
	Хронический миелогенный лейкоз		Меланома
	Хронические миелопролиферативные нарушения		Меланома внутриглазная (глаза)
	Рак ободочной кишки		Карцинома клеток Меркеля
	Колоректальный рак детей		Мезотелиома взрослых, злокачественная
	Кожная Т-клеточная лимфома, см. грибовидный микоз и синдром Сезари		Мезотелиома детей
*	Эндометриальный рак		Метастатический плоскоклеточный рак шеи с неизвестным первичным происхождением
	Эпендимома детей		Синдром множественной эндокринной неоплазии детей
	Эзофагеальный рак		Множественная миелома/неоплазма плазматических клеток
	Эзофагеальный рак детей		Грибовидный микоз
	Опухоли семейства Юинга		Миелодиспластические синдромы
	Опухоль экстракраниальных зародышевых клеток детей		Миелодиспластические/миелопролиферативные заболевания
	Опухоль экстрагонадных зародышевых клеток		Миелогенный лейкоз, хронический
	Рак внепеченочного желчного протока		Миелоидный лейкоз взрослых, острый
	Рак глаза, внутриглазная меланома		Миелоидный лейкоз детей, острый
	Рак глаза, ретинобластома		Миелома, множественная
	Рак желчного пузыря		Миелопролиферативные нарушения, хронические
	Желудочный рак (рак желудка)	*	Рак носовой полости и параназальных синусов
*	Желудочный рак (рак желудка) детей		Назофарингеальный рак
	Желудочно-кишечная карциноидная опухоль		Назофарингеальный рак детей
	Опухоль экстракраниальных зародышевых клеток детей		Нейробластома
	Опухоль зародышевых клеток, опухоль экстрагонадных зародышевых клеток, яичника		Лимфома не-Ходжкина взрослых
	Опухоль гестационных трофобластных клеток		Лимфома не-Ходжкина детей
	Глиома взрослых		Лимфома не-Ходжкина во время беременности
	Глиома глиома стволовых клеток детей, церебральная		Немелкоклеточный рак легкого
	Глиома, церебральная астроцитома детей	*	Рак ротовой полости детей
	Глиома детей, зрительного пути и гипоталамуса		Рак ротовой полости, губы и ротоглоточный рак
*	Рак кожи (меланома)		Остеосаркома/злокачественная фиброзная гистиоцитома кости
	Рак кожи, клеток Меркеля		Рак яичника детей
	Мелкоклеточный рак легкого		Эпителиальный рак яичника
	Рак тонкой кишки		Опухоль зародышевых клеток яичника
	Саркома мягких тканей взрослых		Потенциальная опухоль яичника с низкой злокачественностью
	Саркома мягких тканей детей	*	Рак поджелудочной железы
	Плоскоклеточная карцинома, см. Рак кожи (не-меланома)		Рак поджелудочной железы детей
	Плоскоклеточный рак шеи неизвестного первичного происхождения, метастатический		Рак поджелудочной железы, островковых клеток

	Рак желудка (желудочный рак)		Рак носовой полости и параназальных синусов
	Рак желудка (желудочный рак) детей		Рак околощитовидной железы
	Супратенториальные недифференцированные нейроэктодермальные опухоли детей		Рак полового члена
*	Т-клеточная лимфома, кожная, см. грибовидный микоз и синдром Сезари		Феохромоцитома
	Тестикулярный рак		Пинеобластома и супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли детей
	Тимома детей		Опухоль гипофиза
	Тимома и тимусная карцинома		Неоплазма плазматических клеток/множественная миелома
	Рак щитовидной железы		Плевролегочная бластома
	Рак щитовидной железы детей		Рак молочной железы при беременности
	Рак переходных клеток почечных лоханок и мочеточника		Лимфома Ходжкина при беременности
	Трофобластная опухоль, гестационная		не-Ходжкинская лимфома при беременности
*	Карцинома взрослых неизвестного первичного сайта		Первичная лимфома центральной нервной системы
	Рак детей неизвестного первичного сайта		Рак предстательной железы
	Необычные типы рака детей	*	Ректальный рак
	Рак переходных клеток мочеточника и почечных лоханок		Почечно-клеточный рак (рак почки)
	Рак матки		Почечно-клеточный рак (рак почки) детей
	Рак матки, эндометриальный		Рак переходных клеток почечной лоханки и мочеточника
	Саркома матки		Ретинобластома
*	Рак вагины		Рабдомиосаркома детей
	Глиома зрительного пути и гипоталамуса детей		Рак слюнных желез
	Рак вульвы		Рак слюнных желез детей
*	Макроглобулинемия Вальденштрема		Саркома, семейства опухолей Юинга
	Опухоль Вильмса		Саркома Капоши
			Саркома мягкой ткани взрослых
			Саркома мягкой ткани детей
			Саркома матки
			Синдром Сезари
			Рак кожи (не-меланома)
			Рак кожи детей

В данном контексте, термин «опухоль» относится ко всему неопластическому росту и неопластической пролиферации клеток, независимо от того, являются ли они злокачественными или доброкачественными, и ко всем предраковым и раковым клеткам и тканям. Например, конкретный рак может характеризоваться опухолью с плотной массой (солидной опухолью). Масса солидной опухоли, если она присутствует, может быть массой первичной опухоли. Массой первичной опухоли называют рост раковых клеток в ткани, происходящий из перерождения нормальной клетки в ткани. В большинстве случаев, массу первичной опухоли идентифицируют по присутствию кисты, которая может быть обнаружена визуально или способами пальпации или по отклонению от нормы формы, текстуры или массы ткани. Однако некоторые первичные опухоли не являются доступными пальпации и могут быть детектированы только с использованием способов медицинской визуализации, таких как рентгеновское излучение (например, маммаграфия), ультразвук, СТ (компьютерная томография) и MRI (ЯМР-томография), или пункционных биопсий. Применение указанных последних способов является более частым в раннем детектировании. Молекулярный и фенотипический анализ раковых клеток в ткани будет обычно подтверждать, является ли рак эндогенным в отношении данной ткани, или это повреждение обусловлено метастазированием из другого места.

«Проба» (биологическая проба) может быть любой представляющей интерес композицией, полученной из организма человека или субъекта, не являющегося человеком, в любом физическом состоянии (например, твердом, жидком, полутвердом в виде паров) и любой комплексности. Проба может быть любой композицией, в которой резонно предполагать содержание Bcl-2, который может анализироваться способами, устройствами и наборами согласно изобретению. Предпочтительно, проба является жидкостью (биологической жидкостью). Пробы могут содержаться в тест-пробирке, культуральном сосуде, многолуночном планшете или любом другом контейнере или поддерживающем субстрате. Проба может быть, например, культурой клеток, тканью человека или животного. Жидкие гомогенаты клеточных тканей являются биологическими жидкостями, которые могут содержать Bcl-2 для детектирования с использованием согласно изобретению.

«Комплексностью пробы» называют относительное количество различных разновидностей молекул, которые присутствуют в пробе.

Термины «жидкость организма» или «биологическая жидкость» относятся в данном контексте к композиции, полученной из организма человека или животного. Биологические жидкости включают в себя, но не ограничиваются ими, мочу, цельную кровь, плазму крови, сыворотку, слезы, сперму, слюну, мокроту, выдыхаемый воздух, секреции из носа, фарингеальные экссудаты, бронхоальвеолярный лаваж, трахеальные аспирации, интерстициальную жидкость, лимфатическую жидкость, амниотическую жидкость, гландулярную жидкость, фекалии, пот, слизистую, вагинальную или уретральную секрецию, цереброспинальную жидкость и трансдермальный экссудат. Биологическая жидкость включает в себя экспериментально разделенные фракции всех из предыдущих растворов или смеси, содержащие гомогенизированный твердый материал, такой как фекалии, ткани пробы биопсии.

Термин «ex vivo» относится в данном контексте к среде вне организма субъекта. Таким образом, проба биологической жидкости, взятая у субъекта, является, согласно изобретению, пробой ex vivo биологической жидкости. В некоторых вариантах способа согласно изобретению с помощью постоянно встроенных устройств получают пробы in vivo.

В данном контексте термин «конъюгат» относится к соединению, содержащему две или более молекулы, связанные вместе, необязательно через связывающую (линкерную) группу, с образованием единой структуры. Связывание может быть прямым присоединением (например, с образованием химической связи) молекул или посредством связывающей группы.

В данном контексте термины твердые «носитель», «субстрат» и «поверхность» относятся к твердой фазе, которая является пористым или непористым водонерастворимым материалом, который может быть представлен в любой форме, такой как полоска, палочка, частица, гранулы или многолуночный планшет. В некоторых вариантах осуществления носитель имеет организующий поддерживающий матрикс, который предпочтительно функционирует в качестве организационного матрикса, такой как микротитрационный планшет. Твердые поддерживающие материалы включают в себя, но не ограничиваются ими, целлюлозу, полисахарид, такой как Сефадекс, стекло, полиакрилоилморфолид, диоксид кремния, стекло с контролируемыми порами (CPG), полистирол, полистирол/латекс, полиэтилен, например, полиэтилен с ультравысокой молекулярной массой (UPE), полиамид, поливинилфторид (PVDF), политетрафторэтилен (PTFE; TEFLON), модифицированный карбоксилом тефлон, найлон, нитроцеллюлозу и металлы и сплавы, такие как золото, платина и палладий. Твердый носитель может быть биологическим, небиологическим, органическим, неорганическим или комбинацией любого из них, существующим в виде частиц, тяжей, осадков, гелей, пластин, подушек, карт, полосок, щупов, тест-полосок, трубок, сфер, контейнеров, капилляров, подушек, ломтиков, пленок, предметных стекол и т.д., в зависимости от конкретного применения. Предпочтительно, твердый носитель является плоским по форме для облегчения контакта с биологической пробой, такой как моча, цельная кровь, плазма, сыворотка, перитонеальная жидкость или асцитная жидкость. Другие подходящие поддерживающие материалы будут очевидны специалистам в данной области. Твердый носитель может быть мембраной, с подкладкой или без подкладки (например, подкладкой карты из полистирола или полиэфира), такой как доступные от Millipore Corp. (Bedford, MA), например, мембранные карты Hi-Flow™ Plus. Поверхность твердого носителя может содержать реакционно-способные группы, такие как карбоксил, амино, гидроксил, тиол или т.п. для присоединения нуклеиновых кислот, белков и т.д. Поверхности на твердом носителе будут иногда, хотя и не всегда, изготовлены из того же материала, что и носитель. Таким образом, поверхность может быть образована из любых из большого разнообразия материалов, таких как полимеры, пластики, смолы, полисахариды, диоксид кремния или материалы на основе диоксида кремния, уголь, металлы, неорганические стекла, мембраны или любые вышеупомянутые материалы-носители (например, в виде слоя или покрытия).

В данном контексте термины «метка» и «тэг» относятся к веществам, которые могут сообщать детектируемый сигнал, и включают в себя, но не ограничиваются ими, ферменты, такие как щелочная фосфатаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и пероксидаза хрена, рибозим, субстрат для репликазы, такой как QB-репликаза, промоторы, красители, флуоресцирующие агенты, такие как флуоресцеин, изотиоцианат, соединения родамина, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фталевый альдегид и флуорескамин, хемилюминесцирующие агенты, такие как изолюминол, сенсибилизаторы, коферменты, субстраты ферментов, радиометки, частицы, такие как латексные или угольные частицы, липосомы, клетки и т.д., которые могут быть дополнительно помечены красителем, катализатором или другой детектируемой группой.

В данном контексте термины «рецептор» и «рецепторный белок» означают биологически активную белковую молекулу, которая специфически связывается с другими молекулами, такими как Bcl-2.

В данном контексте термин «лиганд» относится к молекуле, которая содержит структурную часть, которая связана посредством специфического взаимодействия с конкретным рецепторным белком.

В данном контексте термин «антитело» относится к молекулам иммуноглобулина или иммунологически активным частям (фрагментам) молекул иммуноглобулина, т.е. молекулам, которые содержат антигенсвязывающий сайт или паратоп. Указанный термин включает в себя моноклональные антитела и поликлональные антитела.

В данном контексте термины «моноклональное антитело» или «композиция моноклональных антител» относится к молекуле антитела, которая содержит только одну разновидность антигенсвязывающего сайта, способную иммунореагировать с конкретным антигеном. Таким образом, композиция моноклональных антител обычно проявляет аффинность связывания в отношении единственного эпитопа любого антигена, с которым она реагирует. Композиция моноклональных антител обычно состоит из антител, продуцируемых клонами единственной клетки, называемой гибридомой, которая секретирует (продуцирует) только один тип молекулы антитела. Гибридомная клетка образуется слиянием антителопродуцирующей клетки и линии миеломных клеток или других самосохраняющих линий. Такие антитела были впервые описаны в статье Kohler and Milstein, Nature, 1975, 256:495-497, описание которой включено здесь в качестве ссылки. Примерная гибридомная технология описана Niman et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A., 1983, 80:4949-4953. Другие способы получения моноклональных антител, гибридомной клетки или культуры гибридомных клеток также хорошо известны. См., например, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; или способ выделения моноклональных антител из иммунологического репертуара, описанный Sasatry, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1989, 86:5728-5732; и Huse et al., Science, 1981, 246:1275-1281. Данный цитируемый ссылочный материал включен в настоящее описание в качестве ссылки.

В данном контексте полупроницаемой мембраной называют биосовместимый материал, который является непроницаемым для жидкостей и позволяет перенос газов через нее. Такие газы включают в себя, но не ограничиваются ими, кислород, пары воды и диоксид углерода. Полупроницаемые мембраны являются примером материала, который может быть использован для образования по меньшей мере части ограждения, определяющего полость проточной камеры. Данная полупроницаемая мембрана может исключать микробное загрязнение (например, размер пор является характерно достаточно малым для исключения прохождения микробов, которые могут загрязнять аналит, например, клетки). В конкретном аспекте, полупроницаемая мембрана может иметь оптическую прозрачность и чистоту, достаточные для возможности наблюдения аналита, такого как клетки, в отношении окраски, роста, размера, морфологии, визуализации и других целей, хорошо известных в данной области.

В данном контексте термин «связывать» относится к любому физическому присоединению или тесной ассоциации, которые могут быть постоянными или временными. Связывание может происходить, например, в результате образования водородных связей, гидрофобных сил, ван-дер-ваальсовых сил, ковалентного или ионного связывания.

В данном контексте термин «частица» включает в себя нерастворимые материалы любой конфигурации, в том числе, но не только, сферической, нитеподобной, кистеподобной формы и неправильных форм. Частицы могут быть магнитными. Примеры частиц включают в себя, но не ограничиваются ими, гранулы из диоксида кремния, целлюлозы, гранулы Сефарозы, полистироловые гранулы (твердые, пористые, дериватизованные), стекло с контролируемыми порами, гелевые гранулы, магнитные гранулы, золи, биологические клетки, субклеточные частицы, микроорганизмы (простейшие, бактерии, дрожжи, вирусы) и другие инфекционные агенты, мицеллы, липосомы и другие нерастворимые материалы.

«Кодирующая последовательность» или «кодирующая область» является полинуклеотидной последовательностью, которая транскрибируется в мРНК и/или транслируется в полипептид. Например, кодирующая последовательность может кодировать представляющий интерес полипептид. Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном трансляции на 5'-конце и стоп-кодоном трансляции на 3'-конце. Кодирующая последовательность может включать в себя, но не ограничивается ими, последовательности мРНК, кДНК и рекомбинантные полинуклеотидные последовательности.

В данном контексте термин «полипептид» относится к любому полимеру, содержащему любое количество двух или более аминокислот, и используется здесь взаимозаменяемо с терминами «белок», «генный продукт» и «пептид».

В данном контексте термин «нуклеозид» относится к молекуле, имеющей пуриновое или пиримидиновое основание, ковалентно связанное с сахаром рибозой или дезоксирибозой. Примерные нуклеозиды включают в себя аденозин, гуанозин, цитидин, уридин и тимидин.

Термин «нуклеотид» относится к нуклеозиду, имеющему одну или несколько фосфатных групп, соединенных сложноэфирными связями с фрагментом сахара молекулы. Примерные нуклеотиды включают в себя нуклеозидмонофосфаты, дифосфаты и трифосфаты.

Термины «полинуклеотид», «молекула нуклеиновой кислоты» и «нуклеотидная молекула» используются здесь взаимозаменяемо и относятся к полимеру нуклеотидов, соединенных вместе фосфодиэфирной связью между 5'- и 3'-атомами углерода. Полинуклеотиды могут кодировать полипептид, например, полипептид Bcl-2 (экспрессируемый или не экспрессируемый) или могут быть, например, короткой интерферирующей РНК (siRNA), антисмысловыми нуклеиновыми кислотами (антисмысловыми олигонуклеотидами), аптамерами, рибозимами (каталитическими РНК) или образующими триплекс олигонуклеотидами (т.е. антигеном).

В данном контексте термин «РНК» или «молекула РНК» или «молекула рибонуклеиновой кислоты» относится обычно к полимеру рибонуклеотидов. Термин «ДНК» или «молекула ДНК», или «молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты» относится обычно к полимеру дезоксирибонуклеотидов. Молекулы ДНК и РНК могут быть синтезированы природно (например, путем репликации ДНК или транскрипции ДНК, соответственно). Молекулы РНК могут быть посттранскрипционно модифицированы. Молекулы ДНК и РНК могут быть синтезированы химически. Молекулы ДНК и РНК могут быть одноцепочечными (т.е. одноцепочечными РНК (ssRNA) и одноцепочечными ДНК (ssDNA), соответственно) или мультицепочечными (например, двухцепочечными, т.е. dsRNA и dsDNA, соответственно). Однако, на основе характера согласно изобретению, термины «РНК» или «молекула РНК» или «молекула рибонуклеиновой кислоты» могут также относиться к полимеру, содержащему прежде всего (т.е. более чем 80% или предпочтительно более чем 90%) рибонуклеотиды, но необязательно включающему в себя по меньшей мере одну не-рибонуклеотидную молекулу, например, по меньшей мере один дезоксирибонуклеотид и/или по меньшей мере один аналог нуклеотида.

В данном контексте термин «аналог нуклеотида» или «аналог нуклеиновой кислоты», также называемые здесь измененными нуклеотидом/нуклеиновой кислотой или модифицированными нуклеотидом/нуклеиновой кислотой, относится к нестандартному нуклеотиду, в том числе не встречающимся в природе рибонуклеотидам или дезоксирибонуклеотидам. Предпочтительные аналоги нуклеотидов модифицированы в любом положении таким образом, что изменяются определенные химические свойства нуклеотида, но сохраняется способность аналога нуклеотида выполнять его предполагаемую функцию. Например, замкнутые нуклеиновые кислоты (LNA) являются классом аналогов нуклеотидов, обладающих очень высокой аффинностью и превосходной специфичностью в отношении комплементарных ДНК и РНК. LNA-олигонуклеотиды использовались в качестве антисмысловых молекул как in vitro, так и in vivo (Jepsen J.S. et al., Oligonucleotides, 2004, 14(2):130-146).

В данном контексте, термин «аналог РНК» относится к полинуклеотиду (например, химически синтезированному полинуклеотиду), имеющему по меньшей мере один измененный или модифицированный нуклеотид в сравнении с соответствующей неизмененной или немодифицированной РНК, но сохраняющему ту же самую или сходную природу или функцию, что и соответствующая неизмененная или немодифицированная РНК. Как обсуждалось выше, олигонуклеотиды могут быть связаны связями, которые приводят к более низкой скорости гидролиза аналога РНК в сравнении с молекулой РНК с фосфодиэфирными связями. Примерные аналоги РНК включают в себя рибонуклеотиды и/или дезоксирибонуклеотиды с модифицированным сахаром или скелетом. Такие изменения или модификации могут дополнительно включать в себя добавление не-нуклеотидного материала, например, к концу (концам) РНК или внутри нее (в одном или нескольких нуклеотидах РНК).

Термины «содержащий», «состоящий из» и «состоящий по существу» определяются в соответствии с их обычным значением. Указанные термины могут заменять друг друга на протяжении данной заявки для введения специфического значения, связанного с каждым термином.

Термины «выделенный» или «биологически чистый» относятся к материалу, который является в основном или по существу свободным от компонентов, которые обычно сопутствуют материалу, когда он находится в своем нативном состоянии.

В контексте данного описания формы единственного числа «а», «an» и «the» включают в себя ссылку на множественное число, если контекст не диктует ясно обратное. Так, например, ссылка на «антитело» включает в себя более чем одно такое антитело. Ссылка на «молекулу» включает в себя более чем одну такую молекулу, и т.д.

Практика согласно изобретению может использовать, если нет других указаний, общепринятые способы молекулярной биологии, микробиологии, технологии рекомбинантных ДНК, электрофизиологии и фармакологии, которые находятся в рамках квалификации данной области. Такие способы полностью объясняются в литературе (см., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover Ed. 1985); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan Eds., Academic Press, Inc.); Transcription and Translation (Hames et al. Eds. 1984); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller et al. Eds. (1987) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (2nd ed., Springer-Verlag); и PCR: A Practical Approach (McPherson et al. Eds. (1991) IRL Press)), каждая из которых включена здесь в качестве ссылки в полном объеме.

Далее приведены примеры, которые иллюстрируют материалы, способы и процедуры для применения на практике согласно изобретению. Данные примеры являются иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Когорта пациентов. С институционального санкционирования, полученного ранее, брали пробы мочи и крови у здоровых волонтеров в норме (N=21), женщин с доброкачественными гинекологическими нарушениями (N=35) и пациентов с раком яичника (N=34) в Раковом Центре H. Lee Moffitt Cancer Center. Все, за исключением 8 проб, брали перед начальным хирургическим иссечением, тогда как последние 8 проб брали у пациентов с рецидивирующим заболеванием в момент зачисления в данное исследование. Парафиновые блоки идентифицировали, когда было возможно, и предметные стекла обследовали для подтверждения гистологической диагностики в соответствии с баллами FIGO (Международной федерации гинекологов и акушеров). Рассматривали также медицинские карты этих женщин и извлекали информацию, касающуюся возраста пациента, типа, стадии, степени дифференцировки, размера и хирургического лечения опухоли в случае доступности.

Приготовление проб. С информированного согласия пациентов, пробы мочи и плазмы брали у пациентов, делали их анонимными и кодировали для защиты идентичности пациента и выписывали из Ракового центра H. Lee Moffitt Cancer Center для данного протокола исследования. Все пробы хранили на льду. Пробы мочи обрабатывали стандартным коктейлем ингибиторов протеаз (80 мкг/мл 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторида, 200 мкг/мл ЭДТА, 0,2 мкг/мл лейпептина, 0,22 мкг/мл пепстатина, Sigma Scientific, St. Louis, MI) и центрифугировали при 3000 × g. Затем готовили аликвоты супернатантов и проб плазмы и хранили их при -20^оC.

Твердофазный иммуноферментный анализ. Для измерения уровней Bcl-2 в моче пациентов, пробы анализировали с использованием количественного сэндвич-иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для измерения уровней CA125 в плазме субъектов пробы анализировали при помощи ELISA (Bio-Quant, San Diego, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Ферментативные реакции детектировали при 450 нм с использованием планшет-ридера Dynex MRX (Dynex Technologies, Chantilly, VA) и результаты Bcl-2 выражали в виде средней оптической плотности трех повторов проб ± S.E, в то время как результаты СА125 выражали в виде среднего двух повторов проб.

Статистический анализ. Пробы для ELISA Bcl-2 испытывали в трех повторах, и данные подвергали критерию Крускела-Уоллиса для нормального распределения. Затем данные анализировали с использованием U-критерия Манна-Уитни для определения статистической значимости между пробами контролей в норме, пациентов с доброкачественным заболеванием и пациентов с раком яичника. Подобным образом, дискриминантные анализы с использованием системы SAS использовали для определения подходящего членства в каждой группе (нормальные vs. доброкачественные vs. раковые).

Пример 1 - Уровни Bcl-2 в моче повышены у пациентов с раком яичника

Мочу и кровь брали у 90 индивидуумов, причем пробы брали у контролей в норме (N=21), у женщин с доброкачественным заболеванием (N=35) и у женщин с раком яичника (N=34). Последняя категория состояла из женщин, диагностированных с эндометриоидным (N=I), муцинозным (N-7), а также серозным раком яичника (N=24) и первичным перитонеальным раком, который часто связан с раком яичника, (N=2). Пробы брали у женщин с доброкачественным гинекологическим заболеванием, состоящих из женщин с доброкачественными кистозными тератомами (N=2), простыми кистами (N=10), лейомиомами (N=8), поликистозным раком яичника (N=1), аденофибромами яичника (N=4), муцинозными цистаденомами (N=2) и серозными цистаденомами (N=S). Хотя эта когорта является небольшим поисковым исследованием, она является репрезентативным исследованием типичной клинической практики в отношении распределения гистологии, степени и стадии.

Для определения потенциальной пригодности уровней Bcl-2 в моче в качестве нового молекулярного маркера для рака яичника, пробы мочи у контролей в норме, женщин с доброкачественным гинекологическим заболеванием и пациентов с образцами рака яичника подвергали анализам ELISA (фиг.1). Количество Bcl-2 в моче было обычно незначительным (среднее 0,21 нг/мл) в контрольных пробах в норме. В противоположность этому, Bcl-2 в моче, ассоциированной с раком яичника и первичным перитонеальным раком, был обычно в 10 раз (3,4 нг/мл) более высоким, чем Bcl-2, обнаруживаемый в контрольных пробах в норме (фиг.1A). Ни одна из проб мочи в норме не содержала Bcl-2 в количестве >1,8 нг/мл, в то время как только 2 из раковых проб обнаруживали Bcl-2 в меньшем, чем 1,8 нг/мл, количестве (1,12 нг/мл и 1,78 нг/мл). Поскольку серозная карцинома представляет большинство эпителиальных типов рака яичника, уровни Bcl-2 у пациентов с серозной аденокарциномой испытывали по степени (фиг. 1А) и стадии (фиг.1В) заболевания. Хотя имелась тенденция в отношении повышенных уровней Bcl-2 с увеличением степени и стадии опухоли, различие в уровнях Bcl-2 между степенью и стадией не было статистически значимым. Подобным образом, креатинин сыворотки измеряли в момент сбора мочи, и было показано, что уровни Bcl-2 в моче не были связаны с ренальной дисфункцией (данные не показаны). Примечательно, что единственный пациент (№ 77) продемонстрировал чрезвычайно повышенные уровни Bcl-2 (>9 нг/мл) в отсутствие заметных клинических симптомов.

Таблица 2 суммирует результаты, представленные на фиг.1 и 2 для средних уровней Bcl-2 в образцах мочи. Количества в скобках указывают число проб в каждой соответствующей группе. Кроме того, данные сгруппированы таким образом, чтобы показать средние уровни Bcl-2 (нг/мл) между индивидуумами в норме и гистологическими подтипами рака яичника, степени опухоли и стадии опухоли. Эти данные показывают, что, в то время как средний уровень Bcl-2 в моче здоровых волонтеров равен 0,204 нг/мл, средний уровень Bcl-2 в моче всех раковых пациентов является в 10 раз более высоким (3,12 нг/мл). Кроме того, уровни Bcl-2 в моче, по-видимому, в сильной степени связаны со стадией опухоли и умеренным образом связаны со степенью опухоли среди серозных раков яичника (наиболее часто встречающегося типа рака яичника).

Таблица 2 Уровни Bcl-2 у пациентов в норме и у пациентов с раком яичника
Проба		Bcl-2 (нг/мл)
Нормальная группа (21)		0,204
Эндометриодный подтип (1)		3,168
Муцинозный подтип (4)		2,35
Перитонеальный рак (2)		1,78
Серозный подтип (29)	Степень 1 (7)	2,76
	Степень 2 (10)	3,98
	Степень 3 (12)	3,94
	Стадия 1 (3)	1,92
	Стадия 2 (4)	3,23
	Стадия 3 (14)	4,07
	Стадия 5 (8)	4,04

Пример 2 - Bcl-2 в моче у пациентов с доброкачественным гинекологическим заболеванием не является повышенным

Измерение методом ELISA Bcl-2 в моче 35 женщин с доброкачественным гинекологическим заболеванием (мочи, собранной непосредственно перед лечением пациентов) показало средние уровни Bcl-2 в моче 0,02 нг/мл и отсутствие проб >1,8 нг/мл Bcl-2, как показано на фиг.8А. Доброкачественные заболевания включали в себя доброкачественные тератомы, простые кисты, лейомиомы, поликистозный яичник, фибромы и аденомы. Эти величины были сходны с контролями в норме, но значимо меньшими, чем в пробах рака яичника, что предполагает, что повышенные уровни Bcl-2 в моче, более высокие, чем 1,8 нг/мл, ассоциированы с раком яичника.

Критерий Крускела-Уоллиса использовали для испытания нормального распределения указанных данных. Поскольку «нормальная» группа не удовлетворяла нормальному распределению, вероятно, вследствие малого числа проб, различия между группами анализировали с использованием U-критерия Манна-Уитни. Результаты не показали значимого различия между контролями в норме и доброкачественным заболеванием (p<0,5), но показали p<0,001 между нормальной группой и группой с доброкачественным заболеванием и группой с раком. Суммирование уровня Bcl-2 в моче для этой группы исследований представлено на фиг.8В. Подобным образом, дискриминантные анализы с использованием системы SAS выявили, что вероятность подходящего членства в нормальной/доброкачественной или раковой группе была >90%.

Пример 3 - Bcl-2 в моче не коррелирует с возрастом пациента или размером опухоли

Сравнение клинических параметров предполагало, что уровни Bcl-2 в моче не были связаны с возрастом пациентов (см. фиг.5). Хотя диапазон возрастов и средний возраст контролей в норме (29-81 лет, среднее 48,5 ± S.D. 12,7 лет) и женщин с доброкачественным гинекологическим заболеванием (28-84 лет, среднее 55,9 ± S.D. 13,9 лет) был несколько более низким, чем диапазон и средний возраст женщин с раком яичника (26-92 года, среднее 62,2 ± S.D. 13,8 лет), различия не были статистически значимыми в этом исследовании. Подобным образом, уровни Bcl-2 в моче не коррелировали с размером опухоли при операции иссечения опухоли (фиг.6), находясь в диапазоне от микроскопических до >10 см, и могут отражать биологическую вариацию между индивидуумами или вариацию состава опухоли.

Пример 4 - Bcl-2 в моче позволяет детектировать рак яичника более точно, чем СА125 в крови

Для испытания, является ли повышенный уровень Bcl-2 в моче лучшим диагностическим индикатором для рака яичника, чем раковый антиген 125 (CA125), Bcl-2 в моче сравнивали с уровнями СА125 в 12 контролях в норме и 23 пациентах с раком яичника (фиг.4А и 4В). У тестируемых пациентов повышенный уровень Bcl-2 в моче, ассоциированный с детектированием рака яичника, составлял почти 100%. Повышенный уровень Bcl-2 в моче (>1,8 нг/мл) идентифицировал 17/17 пациентов с серозной аденокарциномой, 4/4 пациентов с муцинозным раком яичника и 1/2 пациентов с первичным перитонеальным раком в качестве положительного на рак яичника рака (фиг.4A). Ни один из контролей в норме не имел уровней Bcl-2 >1,8 нг/мл, и они были затем корректно классифицированы как рак-отрицательные. В противоположность этому, уровни СА125 крови >35 Е/мл, современного стандарта для детектирования рака яичника, идентифицировали 13/17 или 76% пациентов с серозной аденокарциномой (фиг.4В). Подобным образом, анализы СА125 идентифицировали 3/4 или 75% пациентов с муцинозным раком яичника, хотя уровни CA125 данных пациентов находились в диапазоне 41-43 Е/мл, и 1/2 или 50% пациентов с первичным перитонеальным раком были рак-положительными. Повышенные уровни СА125 также некорректно идентифицировали 2/12 или 16% здоровых индивидуумов как рак-положительные, что позволяет предположить, что повышенный уровень Bcl-2 в моче, по-видимому, детектирует рак яичника более точно, чем СА125.

Пример 5 - Bcl-2 в моче уменьшается после операции иссечения опухоли

Для дополнительного испытания точности в отношении высоких уровней Bcl-2 в моче в детектировании рака яичника, уровни Bcl-2 сравнивали у 7 пациентов с раком яичника непосредственно до (фиг.7А и 7В, черные столбцы) и в пределах 2 недель после начальной операции иссечения для удаления всей видимой опухоли (белые столбцы). Для пациентов, у которых пробы мочи брали до и после начальной операции, уровни Bcl-2 уменьшались до 100% после хирургического удаления опухоли, что предполагает, что присутствие опухоли коррелирует хорошо с повышенным уровнем Bcl-2 в моче у пациентов с раком яичника.

В настоящее время, предклинические исследования сосредоточены на развитии агентов, которые ингибируют Bcl-2, в том числе антисмысловых олигонуклеотидов и ингибиторов Bcl-2 с малой молекулой. Хотя такие исследования нацелены на Bcl-2 для терапевтического вмешательства, представленные данные показывают, что количественное определение Bcl-2 в моче анализами на основе ELISA может обеспечить новый, безопасный, чувствительный, специфический и экономичный способ детектирования рака яичника, который будет полезным для всех женщин не только в Соединенных Штатах, но и во всем мире, в том числе в слабо обеспеченных с точки зрения медицины географических зонах, и, в частности, женщин, имеющих высокий риск развития рака яичника. Кроме того, при условии, что приблизительно 25000 женщин диагностируются как имеющие рак яичника ежегодно в США, детектирование рака яичника при помощи Bcl-2 в моче как на ранних, так и на поздних стадиях заболевания, могло бы не только подтверждать диагноз рака яичника, но и могло бы потенциально детектировать тысячи ранее не диагностируемых типов рака яичника. Это особенно важно для детектирования рака яичника на ранних стадиях, которые ответственны за менее чем 10% диагностируемых типов рака яичника, но в этих случаях хирургическое иссечение больного яичника увеличивает выживание пациента до более чем 90%, и можно ожидать уменьшения стоимости медицинских услуг. Наконец, наряду с выполнением новой диагностической функции, уровни Bcl-2 в моче могут быть использованы для мониторинга наличия рака яичника в ходе заболевания, который может влиять на терапевтический и прогностический результат. Ясно, что исследования большей популяции гарантируются для подтверждения потенциала для уровней Bcl-2 в моче, чтобы служить в качестве биомаркера для рака яичника, а также исследования молекулярного механизма (молекулярных механизмов), ответственных за повышенный уровень Bcl-2 в случае рака яичника. Однако, поскольку нет сообщений, которые используют либо детектирование в моче, либо применение Bcl-2 в качестве биомаркера для рака яичника, это поисковое исследование предполагает, что измерение Bcl-2 в моче при помощи ELISA может обеспечить инновационный, простой способ детектирования всех типов рака яичника и, возможно, уменьшения летальности этого коварного заболевания, которое убивает тысячи женщин ежегодно.

Пример 6 - Условия хранения мочи для тестирования Bcl-2

Исследования, испытывающие стабильность при хранении Bcl-2 в моче, показывают, что при приготовлении проб с добавлением коктейля ингибиторов протеаз пробы мочи могут храниться в течение более 1 года при -20^оC без потери функционирования в детектировании Bcl-2 (см. «Контроль» и «-20^оС» на фиг.11). Это было бы благоприятным для индивидуумов, когда желательно повторение прежних проб с последующими пробами. Альтернативно, пробы могут также храниться при 4^оC в течение до 4 дней без отрицательного влияния на детектирование Bcl-2 в моче. Данные результаты являются важными, так как они показывают, что время, возможно, требующееся для транспортировки проб мочи пациентов (из потенциально отдаленных географических зон) в лабораторию для тестирования Bcl-2, не будет отрицательно влиять на результат детектирования Bcl-2 в моче, если к пробам мочи добавляют ингибиторы протеаз, и пробы мочи хранят на холоду. Однако пониженный уровень Bcl-2 измеряли в пробах, хранящихся при комнатной температуре в течение 4 дней, и Bcl-2 не мог быть детектирован в пробах мочи, хранящихся при -80^оC; таким образом, по-видимому, хранение проб мочи для детектирования Bcl-2 при комнатной температуре или при -80^оC должно быть запрещено.

Все патенты, заявки на патенты, предварительные заявки и публикации, на которые даются ссылки или которые цитируются здесь, supra или infra, включены здесь в полном объеме, включающем в себя все фигуры и таблицы, в той степени, в которой они не являются несовместимыми с формулировками согласно изобретению.

Должно быть понятно, что описанные здесь примеры и варианты приведены только для иллюстративных целей, и что различные модификации или изменения могут быть предложены квалифицированными в данной области лицами в свете указанных примеров и вариантов, и они должны находиться в пределах идеи и содержания настоящей заявки.

Claims (15)

1. Способ точного детектирования рака яичника у пациента, включающий детектирование присутствия Bcl-2 в биологической пробе мочи, полученной от указанного пациента, с использованием иммуноферментной детекции на основе ELISA, где уровень Bcl-2 выше порога от 0 до 2,0 нг/мл служит признаком наличия рака яичника у пациента.

2. Способ по п.1, в котором указанное детектирование включает
(a) приведение биологической пробы в контакт со связывающим агентом, который связывается с белком Bcl-2 с образованием комплекса;
(b) детектирование указанного комплекса; и установление корреляции детектируемого комплекса с количеством белка Bcl-2 в пробе, причем наличие уровня белка Bcl-2 выше предопределенного порога служит признаком наличия рака яичника.

3. Способ по п.2, в котором связывающий агент иммобилизован на носителе.

4. Способ по п.2, в котором связывающий агент представляет собой моноклональное или поликлональное антитело.

5. Способ по п.2, в котором указанное детектирование в (b) дополнительно включает связывание или встраивание в связывающие агент метки.

6. Способ по п.1, дополнительно включающий детектирование биомаркера рака в одной и той же биологической пробе или в другой биологической пробе, полученной от указанного пациента, до, в процессе или после указанного детектирования Вс1-2.

7. Способ по п.6, в котором биомаркером рака является биомаркер гинекологического рака.

8. Способ по п.6, в котором биомаркером рака является СА125, LPA или OVXI.

9. Способ по п.1, в котором пациент страдает раком яичника и в котором указанное детектирование осуществляют в несколько моментов времени через интервалы как часть мониторинга пациента до, во время или после лечения рака яичника.

10. Способ по п.1, в котором пациент не проявляет симптомов рака яичника в момент проведения указанного детектирования.

11. Способ по п.1, в котором пациент проявляет один или более симптомов рака яичника в момент проведения указанного детектирования.

12. Способ по п.1, в котором пациент проявляет один или более симптомов, выбранных из группы, состоящей из боли в области таза, аномального вагинального кровотечения, вздутия живота или метеоризма, постоянной боли в спине, постоянного расстройства желудка, изменения работы кишечника или мочевого пузыря, боли во время полового сношения, непреднамеренной потери массы на десять или более фунтов, аномалии вульвы или вагины, изменений в молочной железе и усталости.

13. Способ по п.8, в котором указанный пациент имеет повышенный уровень СА125 в крови в момент проведения указанного детектирования.

14. Способ по п.8, в котором указанный пациент не имеет повышенного уровня СА125 в крови в момент проведения указанного детектирования.

15. Способ по п.1, в котором указанная предопределенная пороговая концентрация составляет 1,8 нг/мл.

Images