KR20080114689A - 증가된 ｂｃｌ-2에 의한 암의 발견 - Google Patents

증가된 ｂｃｌ-2에 의한 암의 발견 Download PDF

Info

Publication number
KR20080114689A
KR20080114689A KR1020087019574A KR20087019574A KR20080114689A KR 20080114689 A KR20080114689 A KR 20080114689A KR 1020087019574 A KR1020087019574 A KR 1020087019574A KR 20087019574 A KR20087019574 A KR 20087019574A KR 20080114689 A KR20080114689 A KR 20080114689A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bcl
cancer
sample
host
urine
Prior art date
Application number
KR1020087019574A
Other languages
English (en)
Inventor
패트리샤 에이 크룩
Original Assignee
유니버시티 오브 사우스 플로리다
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 사우스 플로리다 filed Critical 유니버시티 오브 사우스 플로리다
Publication of KR20080114689A publication Critical patent/KR20080114689A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Abstract

본 발명은 숙주로부터의 생물학적 샘플 내, 바람직하게 뇨 또는 혈액 샘플 내 Bcl-2를 검출하는 것에 의해, 숙주 내 초기 또는 말기 난소암 등의 암의 진단, 예후, 모니터하기 위한 방법에 관한 것이다. Bcl-2는 Bcl-2 단백질에 결합하거나 검출하는 제제 또는 Bcl-2 단백질 또는 일부분과 특이적으로 반응하는 항체 등의 암호화 핵산에 결합하거나 검출하는 제제를 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법들을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신체 분비액 내 Bcl-2의 신속한 검출을 위한 장치 및 신체 분비액 내 Bcl-2를 신속하게 측정하기 위한 방법들에 관한 것이다.
Bcl-2, 난소암, 진단, 예후, Bcl-2 단백질, 핵산

Description

증가된 ＢＣＬ-2에 의한 암의 발견{DETECTION OF CANCER BY ELEVATED LEVELS OF BCL-2}
본 출원은 그림, 표, 핵산 서열, 아미노산 서열 및 도면 일체를 포함하여 본 출원의 참조문헌으로 병합되어 있는, 2006년 2월 9일자로 출원된 미국 가특허 출원 제 60/771,677호에 대한 우선권의 이익을 주장한다.
암 표지(마커, marker)들은 암이 존재할 때 체내(보통 혈액 또는 요(Urine) 내)에서 발견될 수 있는 물질들이다. 그것들은 암 세포 자체의 산물일 수도 있고, 암이나 기타 환경에 대응하여 신체에서 생산한 물질일 수도 있다. 여러가지 이유 때문에 암 마커들이 특정 유형의 암을 진단(또는 판정)하기에 충분하지 않은 것이 일반적이다. 대부분의 암 마커들은 암 세포뿐만 아니라, 비록 더 적은 양이더라도 정상 세포에 의해서도 생산 가능하다. 간혹 암성이 아닌 질병(non-cancerous disease)들 또한 특정 암 마커들의 수치를 정상보다 높게 만드는 원인이 될 수 있다. 더욱이, 암을 가진 모든 사람이 높은 수준의 암 마커를 갖는 것도 아니다. 이런 이유들 때문에, 소량의 암 마커들만 의사들에 의해 이용되고 있는 실정이다. 의사가 특정 암 마커의 수치를 볼 때에는, 환자의 병력과 신체검사, 및 기타 랩 테스트나 영상 테스트들의 결과와 함께 고려하는 것이 일반적이다.
선별검사란 질병의 증상을 가지지 않은 개인들에게서 암을 찾는 것을 의미하는 한편, 조기발견은 아직 덜 확산되었다고 보일 경우(그리고 더 효과적으로 치료될 것으로 보일 경우)에 질병 초기단계에서 암을 발견하는 것을 의미한다. 비록 처음에는 암 마커들이 증상이 없는 사람들에게서 암을 시험하기 위해 검사 및 개발되었다 하더라도, 이런 경우에 거의 도움이 되는 마커들이 없다는 것이 알려졌다.
난소암은 부인암들 중에서 가장 사망율이 높은 것으로 나타났다. 난소암을 발견하기 위한 조기 증후가 드물고, 신뢰할 만한 선별검사가 없는 탓에, 70%가 넘는 여성들이 질병이 난소 위로 퍼진 다음에 진단을 받게 되며, 그 결과 난소암으로 매년 12,000명의 사망자를 낳을 만큼 예후가 좋지 않다 (5년 생존율이 37%에 못 미침). 현재로서는 신체 골반검진, 초음파, 또는 혈액 CA-125 수준 측정이 난소암 발견을 위한 유일한 표준법들이다. 하지만, 이들 중 어떤 것도 난소암 발견을 위해 신뢰할 만하거나 정확한 방법을 제공하지는 못하고 있다. 예를 들어, 난소암 보유 여성들 중 80% 이상이 증가된 혈액 CA125 수준을 가질 것인 반면, 혈액 CA125 수준은 약 50%만이 초기단계 질병 발견 목적으로서 정확하다. 모든 난소암을 신뢰할 수 있고 정확하게 발견해내기 위한 대체 및 신규 검사 개발이 시급하다. 따라서, 신뢰성 있고, 정확하고, 안전하고, 비용면에서 효율적인 난소암 검사가 부족한 현실을 극복할 기술이 요구된다. 아울러 난소암 진행단계 중에 질병부담을 모니터하는 기술뿐만 아니라, 현재 대다수가 발견되지 않은 채 진행되고 있는 모든 난소암들을 정확하게 발견해내는 기술이 요구된다.
정확하고, 안전하고, 단순하고, 신뢰성 있는 난소암 진단검사는 의료 혜택을 받지 못하는 지역과 특히 난소암 발병 고위험군에 속하는 여성들을 포함하여, 미국 및 전세계의 모든 여성들에게 이로울 것이다. 매년 미국 내 약 25,000명의 여성들이 난소암 진단을 받는다고 볼 때, 질병 초기와 후기 단계에서 발견 가능한 난소암에 대한 하나의 생물 마커가 난소암을 확진할 뿐만 아니라 이전에 난소암 진단을 받지 못한 수천명을 잠재적으로 발견해낼 수도 있을 것이다. 이는 특히나 질병이 난소에 국한되어 있는 초기 단계에 있는 난소암 발견에 있어서 중요하지만, 겨우 10% 미만이 난소암 진단을 받는 실정이다. 이러한 상황에서, 질환을 가진 난소에 대한 절제술(surgical debulking)이 실시된다면 환자의 생존율을 90%로 증대시킬 수 있을 것이고, 의료비용을 줄일 수 있을 것으로 예상된다. 질병의 진행 중에 각각의 환자에게서 난소암을 정확하게 발견하고 모니터하는 기능은 초기 난소암 진단뿐만 아니라 치료 효율 및/또는 질병 재발을 감지하는 데에도 역할을 하게 될 것이다. 상업적으로 입수가능한, 그 예로써 FDA-승인 ELISA-기반 검사의 개발이 난소암 임상진단에 대한 기준(gold standard)이 될 것이다.
세포사멸(apoptosis)은 조직 항상성의 정상적인 진행과 유지를 위해 필수적인 생물학적 과정이기도 하지만, 조직손상, 퇴행성 질환, 면역 질환, 암을 포함한 수많은 병리학적 환경에 관여하기도 한다 (Lowe, S.W. 및 Lin, A.W. Carcinogenesis, 2000, 21:485-497). 막결합 세포사멸 수용체(membrane bound death receptor)들(Ashkenazi, A. 외 J. Clin . Invest ., 1999,104:155-162; Walzak, H. Krammer, P.H. Exp . Cell Res, 2000,256:58-66)에 의해서든, 또는 사이토크롬 c 방출로 이어지는 스트레스 유발 미토콘드리아 이상(stress-induced mitochodrial perturbation)(Loeffler, M. 와 Kroemer, G. Exp . Cell Res ., 2000,256:19-26; Wernig, F. 와 Xu, Q. Prog . Biophys . Mol . Biol ., 2002,78:105-137; Takano, T. 외 Antiox . Redox . Signal , 2002,4:533-541)에 의해서 활성화되든, 하류 카스파아제(caspase)가 활성화되면 세포골격을 손상시키고, DNA 복제 및 복구를 방해하고, 염색체 DNA를 분해하고, 마지막으로 세포를 세포자멸체(apoptotic body) 내에서 붕괴시키는 것(Nagata, S. Exp . Cell Res ., 2000,256:12-18)에 의한, 단계적 세포 파괴 결과를 가져온다. 세포사멸에 대한 주요 조절자들에는 bcl-2 단백질군의 멤버들이 포함된다(Farrow, S.N. 와 Brown, R. Curr. Opin . Gen . Dev ., 1996,6:45-49).
상기 bcl-2 단백질군은 세포사멸을 조절하기 위해 다양한 수준의 세포사멸 과정에서 작용하는 프로(pro)- 및 안티(anti)- 세포사멸 단백질군 멤버들로 이루어진다. 상기 bcl-2 군 멤버들은 하나 이상의 Bcl-2 상동성(BH) 자리를 포함한다(Farrow, S.N. 와 Brown, R. Curr . Opin . Gen . Dev ., 1996,6:45-49). 비록 모든 bcl-2 군 멤버들이 세포막 채널 형성작용에 관여하지만, Bcl-2 (원형(archetypal) bcl-2 군 멤버) 채널은 양이온 (Ca++) 선택성이며, 그것의 외성 소포체(ER) 및 미토콘드리아 편재(Thomenius, M.J. 와 Distelhorst, C.W. J. Cell Sci ., 2003,116:4493-4499) 탓에, Bcl-2의 안티-세포사멸 기능은 적어도 부분적으로는 상기 소포체로부터 칼슘 방출, 이어지는 미토콘드리아막 이상 및 사이토크롬 c 방출을 억제하는 능력에 의해 매개된다. Bcl-2는 난소암을 포함한 많은 종양 유형에서 과발현(Sharma, H. 외 Head Neck, 2004,26:733-740; Hanaoka, T. 외 Intl . J. Clin. Oncol ., 2002,7:152-158; Trisciuoglio, D. 외 J. Cell Physiol ., 2005,205:414-421; Khalifeh, I. 외 Intl . J. Gynecol . Pathol ., 2004,23:162-169; O'Neill, C.J. 외 Am . J. Surg . Pathol ., 2005,29:1034-1041)되기 때문에, 세포사멸 억제에 대항하여 미토콘드리아막을 안정화시킴으로써 화학저항성에 기여한다. 현재, 전임상 연구들은 G3, 139와 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드(Ackermann, E.J. 외 J. Biol . Chem ., 1999,274:11245-11252)와 Bcl-2의 저분자 억제자(Lickliter, J.D. 외 Leukemia, 2003,17:2074-2080)를 포함하여, Bcl-2를 억제하는 제제의 개발에 집중되어 있다. 상기 연구들이 치료 개입용 Bcl-2를 목표로 하고 있기는 하지만, 뇨의 Bcl-2의 정량화가 이전에 문헌에 개시된 적은 없었다.
난소암과 같은 암을 발견하기 위하여, 안전하고, 민감하고, 특별하고, 경제적이면서, 전세계 사회에 이익이 되는 방법들을 제공하는 검사들을 입수가능하도록 가지는 것이 도움이 될 것이다.
본 발명은 암 선별검사에 관한 것이다. Bcl-2는 재발성 암과 같은 암의 예후, 진단, 모니터링 목적 생물 마커를 구성한다. 예를 들어 Bcl-2는 초기 및 말기 난소암을 진단하고 모니터하는 데에 이용될 수 있다. Bcl-2는 수술 전 및 재발 후 암에 대한 생물 마커로 이용될 수도 있다. Bcl-2, 및 Bcl-2 폴리뉴클레오티드나 폴리펩티드들을 결합하는 제제들은 난소암, 및 기타 재발성 또는 비재발성 암을 발견하고 모니터하는 데에 이용될 수 있다.
따라서, 더욱 상세하게는, 본 발명은 뇨, 혈액 (예, 전혈, 혈청, 혈장), 및 복수(ascites fluid) 등의 생물학적 샘플 내에서 증가된 Bcl-2에 대한 선별검사에 의해 암을 발견하는 것에 관한 것이다. 일실시예에서는, 상기 암이 난소암이다. 다른 실시예에서는, 상기 암이 유방, 자궁내막, 자궁경부, 폐, 결장, 전립선, 흑색종, 신경교아세포(glioblastoma), 육종(sarcoma), 방광, 두경부(head and neck)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종류이다. 선택적으로, 본 발명의 방법은 숙주가 발견된 암으로 고통받는지를 입증하는 것(예, 하나 이상의 암 증후를 수집하거나, 부수적인 암 마커들을 발견하거나, X-선, CT, 핵 영상(PET 및 SPECT), 초음파, MRI 등 영상기법을 통해 암 존재를 발견하거나, 발견된 암에 대해 숙주를 치료(예, 수술, 화학치료법, 및/또는 조사(radiation))하는 것에 의함)을 포함한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 방법들을 실현하기 위한 키트에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 혈액이나 뇨 등의 체액 내에서 Bcl-2를 신속하게 발견하기 위한 장치에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 장치는 측방유동장치(lateral flow device)이다. 일실시예에서는, 상기 장치가 혈액이나 뇨 등의 체액의 샘플을 받는 어플리케이션 존(application zone); 샘플 내에서 Bcl-2에 결합하는 결합제를 포함하는 라벨링 존(labeling zone); 및 신호를 보내기 위해 Bcl-2-결합 결합제가 보유되는 디텍션 존(detection zone)을 포함하는데, 상기 디텍션 존에서는 자극역치 농도보다 낮은 수준의 Bcl-2를 가진 숙주로부터 샘플에 대해 주어진 신호가, 자극역치 농도와 동일하거나 높은 수준의 Bcl-2를 가진 환자로부터 샘플에 대해 주어진 신호와 상이하다.
다른 측면에서, 본 발명은 간단하고, 신속하고, 신뢰성 있고, 정확하고, 비용면에서 효율적으로 혈액이나 뇨와 같은 체액 내에서 Bcl-2에 대한 검사에 관한 것이다. 이 검사는 숙주에 의해 가정이나, 의사 사무실 또는 환자의 침상에서 사용 가능한 현재의 가정용 임신 테스트와 유사한 것이다.
일실시예에서는, 상기 검사가 체액 내에서 Bcl-2를 측정하는 방법으로서, (a) 혈액이나 뇨 등의 체액 샘플을 숙주에게서 습득하는 단계; (b) 상기 샘플을 샘플 내 Bcl-2에 결합하는 결합제와 접촉시키는 단계; (c) Bcl-2-결합 결합제를 분리하는 단계; (d) (c) 단계에서 분리된 상기 결합제와 연관된 신호를 감지하는 단계; 및 (e) (d)단계에서 감지된 신호를, 자극역치 농도와 동일 수준의 Bcl-2를 지닌 숙주로부터의 샘플에서 주어진 신호에 해당하는 참조 신호와 비교하는 단계를 포함한다. 일실시예에서는, 상기 체액이 뇨이고, 상기 자극역치 농도가 0 ng/ml과 2.0 ng/ml 사이이다. 다른 실시예에서는, 상기 체액이 뇨이고, 상기 자극역치 농도가 1.8 ng/ml이다.
뇨 속의 Bcl-2가 난소암 발견에 사용될 수 있는지를 검증하기 위해서, 정상인 건강한 자원자들, 난소암 환자들에게서 뇨를 채취하여, ELISA로 Bcl-2를 측정하였다. 암 환자들의 뇨 속의 평균 Bcl-2 양은 건강한 대조군들보다 적어도 10배 이상 많았다. 추가적으로, 양성 부인과 질환 (기형종, 난소낭, 평활근종, 다낭성 난소질환, 선섬유종, 낭생종 포함)을 가진 35명의 여성에게서 채취한 뇨 샘플 중 어느 것도 정상인 건강한 자원자들에게서 발견된 이상의 Bcl-2를 갖지 않았다. 절제술을 한 난소암 환자들에게서는 뇨 속의 Bcl-2 양이 100%까지 감소하였다. 난소암과 관련한 뇨 속의 증가된 Bcl-2에 대한 민감성과 특이성은 거의 100%인 한편, 35U/ml가 넘는 혈중 CA125 수치는 난소암 환자들 중 68%만을 판정했다. 임상 계수의 비교에 의하면 뇨 속의 Bcl-2 수치가 종양 단계와 등급과 상호관련성이 있음을 나타냈다. 하지만, 뇨 속의 Bcl-2 수치가 환자의 연령이나 종양 크기와는 무관했다. 따라서, ELISA 기반 검사에 의한 뇨 속의 Bcl-2 정량화가 안전하고, 민감하고, 특이적이면서, 경제적으로, 난소암을 발견하고, 질환의 과정을 통해 난소암을 모니터하고, 치료 및 예후 결과를 예견하기 위한 방법을 제공한다.
Bcl-2은 난소암 같은 암에 대해 효과적인 분자 표지자이다. 암 마커(종양 마커라고도 부름)들은 암과 관련하여 체내에서 발견된 호르몬, 효소, 및 면역글로불린 등의 분자로서, 그 측정 또는 동정이 환자 진단이나 임상 관리에서 유용하다. 그것들은 암세포 자체의 산물일 수도 있고, 또는 암이나 기타 환경에 반응한 신체의 산물일 수도 있다. 대부분의 암 마커들은 단백질이다. 몇몇 암 마커들이 단일 유형의 암에서만 발견되는 반면에, 다른 마커들은 다양한 유형의 암에서 발견 가능하다. 다른 암 마커들의 경우처럼, Bcl-2는 건강한 인구나 고위험 인구에 대한 선별; 암 또는 특정 유형 암 진단; 및 숙주 내 완화 또는 수술, 방사선, 화학요법, 또는 기타 암 치료를 받는 중의 과정 모니터 등 다양한 목적으로 사용 가능하다.
뇨 속의 Bcl-2 수치가 난소암 발견을 위해 사용될 수 있는지를 밝혀내기 위하여, 뇨가 정상인 건강한 자원자들(N=21), 난소암(N=34) 및 일차 복막암(N=2) 보유 환자들에게서 채취되었으며, 상업적으로 구득가능한 ELISA 키트(BenderMedSystems, catalog #BMS244/3)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 3회 반복하여 Bcl-2를 측정하였다. 그 결과가 평균 ng/ml Bcl-2 ± S.E으로 표현되었다. 건강한 자원자들의 뇨 속의 Bcl-2 양의 평균은 0.204 ng/ml이었는데, 수술전 암 환자들에게서는 3.12 ng/ml가 평균이었는데, 정상 대조군에서 발견되는 것보다는 적어도 10배 이상이었다. 학생 t-검증 분석결과는 0.00001 미만 p값에서 정상 및 암 표본들 간에 통계적 차이를 밝혀냈다. 임상 계수들을 비교한 결과 뇨 속의 Bcl-2 수치가 종양 단계 및 등급과 상호연관되어 있음을 나타냈다 (도 3A 및 3B).
이들 동일한 상기 개체들 중 일부에서의 혈장 샘플들이 CA125 수치에 대해, 제조자의 사용설명에 따라 상업적으로 구득가능한 ELISA(Bio-Quant, catalog #BQ1013T)로 3회 반복 시험되었다. 난소암 발견과 연관되는 뇨 속의 증가된 Bcl-2에 대한 민감도와 특이성이 거의 100%인 한편, 혈청 CA125 수치는 난소암 발견을 위한 현 기준치로서 단지 68%의 난소암 환자만을 식별해내는 35 U/ml를 초과하였다.
난소암 발견을 위해 뇨 속의 Bcl-2 수치에 대한 정확도를 보다 심도있게 검증하기 위해서, 뇨 속의 Bcl-2 수치를 초기 절제술(가시적인 종양 전부를 제거하는 것) 직전 및 수술후 2주 이내인 난소암 환자들로부터 비교하였다. 초기 수술 전과 후에 뇨 샘플을 채취한 7명의 환자들에서, Bcl-2 수치가 수술에 의한 종양 제거 후에 100%까지 감소하였다. 상기 데이터가 암시하는 것은, 종양이 난소암 환자들의 뇨에서 증가된 것으로 발견된 Bcl-2의 출처에 해당한다는 것이다. 추가로, 초기 수술 후 7 내지 11개월 동안의 수술후 임상 방문시에, 상기 7명 중 5명으로부터 뇨 샘플을 채취하고, Bcl-2을 측정하였다. 3명의 수술후 환자들 (#41, 43, 54)들에서는 뇨 속의 Bcl-2 수치가 낮게 유지되었고, 2명의 환자들(#5, 27)에서는 증가하였다. 예비 챠트 검토에 의하면 #41, 43, 54 환자들은 수술후 방문시에 화학요법을 진행하고 있었고, 그들의 난소암 질환이 관리중이었음을 알 수 있었다. 반면, 챠트 검토에서 #5, 27 환자들은 재발성 질환을 가졌고, #27 환자는 추가 종양 절제술을 받았음을 암시한다. 상기 임상 정보에 부합하여, 화학요법을 진행중이며 명백하거나 최소한의 질환이 존재하지 않는 환자들(#41, 43, 54)에게서는 뇨 속의 Bcl-2 수치가 낮게 유지되었다. 또한, 뇨 속의 증가된 Bcl-2 수치는 재발성 질환(#5, 27)의 존재와 관련이 있었으며, 이어진 질환 절제술(#27c)로 감소하였다.
정리하면, 상기 데이터들이 나타내는 것은 ELISA 기반 시험에 의한 뇨 속의 Bcl-2 정량화가 신규하고, 안전하고, 민감하고, 특이적이면서 경제적인 난소암 발견 방법을 제공하는 것으로 보인다는 사실이다. 또한, 뇨 속의 Bcl-2 수치가 질환 진행과정을 통해서 난소암 존재여부를 모니터하는 데에 사용될 수 있고, 치료와 예후 결과를 예측할 수도 있다.
일 측면에 있어서, 본 발명은 숙주로부터의 생물학적 샘플, 예를 들어 뇨, 혈액, 복막액, 또는 복수 내에서 Bcl-2의 존재여부를 발견하는 단계를 포함하는, 숙주 내에서 암을 발견하기 위한 방법을 포함하고 있다. 이때, Bcl-2 수치가 소정의 자극역치를 초과하면 숙주 내에서 암을 표지한다. 바람직하게는, 상기 발견하는 단계가 정성적 슬롯-블롯(slot-blot) 분석(BioRad사로부터 상업적으로 입수가능한 것 등)에 의해 수행되지 않는다.
본 발명에 의한 방법, 장치, 키트를 이용하여 발견하고 또는 모니터하는 암에는 유방암 (예, 침윤성(침투성), 침투전, 염증성, 파제트병(Paget's Disease), 전이성, 또는 재발성); 위장/소화 암 (예, 충수, 담관, 결장, 식도, 담낭, 위액, 창자, 간, 췌장, 직장, 및 위장); 비뇨생식/뇨 암 (예, 부신, 방광, 신장, 음경, 전립선, 고환, 및 뇨); 부인암 (예, 자궁경부, 자궁내막, 자궁관, 난소, 자궁, 질, 및 외음부); 두경부 암 (예, 눈, 두경부, 턱, 후두, 비강, 구강암, 인두, 침샘, 굴(sinus), 인후, 갑상선, 혀, 및 편도); 혈액암 (예, 호지킨병(Hodgkin's disease), 백혈병 (급성 림프구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병), 다발골수종, 림프종, 및 림프절); 근골격/연 조직 암 (예, 골, 골육종, 흑색종, 피부(기저세포, 편평세포), 육종(유윙육종(Ewing's sarcoma), 카포시육종(Kaposis sarcoma)); 신경암 (예, 뇌(별아교세포종, 아교모세포종, 신경아교종), 뇌하수체샘, 척수); 및 호흡기/폐 암 (예, 폐(샘암종, 귀리세포, 비-소세포, 소세포, 편평세포) 및 중피종)이 포함된다. 일실시예에서는, 상기 암이 난소암이다. 다른 실시예에서는, 상기 암이 유방암, 자궁내막암, 자궁경부암, 폐암, 결장암, 전립선암, 흑색종, 아교모세포종, 육종, 방광암, 및 두경부암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종류이다.
본 발명의 방법의 일실시예에서는, 상기 발견하기 위한 방법은: (a) 복합체를 형성하기 위하여 생물학적 샘플을 Bcl-2 단백질에 결합하는 결합제와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 복합체를 발견하는 단계; 및 상기 발견된 복합체를 상기 샘플 내 Bcl-2 단백질에 연관시키는 단계를 포함하며, 이때 증가된 Bcl-2 단백질의 존재가 암에 대한 표지자이다. 특정 실시예에서는, (b) 단계가 상기 결합제 상에 표지(label)를 연결하거나 부착하는 것, 또는 ELISA-기반 면역효소 감지를 이용하는 것을 더 포함한다.
선택적으로, 본 발명에 의한 방법들은, 상기 Bcl-2 발견 단계 이전, 도중, 또는 이후에, 숙주에서 획득한 동일하거나 상이한 생물학적 샘플 내에서 암에 대한 생물 마커를 발견하는 단계를 더 포함한다. 일실시예에서는, 상기 암에 대한 생물 마커가 부인암 등의 재발성 암에 대한 생물 마커이다. 다른 실시예에서는 상기 생물 마커가 CA125 또는 OVXI이다. Bcl-2 발견이 진행되는 시점에 상기 숙주가 혈액 내에서 증가된 CA125 수치를 가질 수도 있고, 또는 Bcl-2 발견이 진행되는 시점에 상기 숙주가 혈액 내에서 증가된 CA125 수치를 갖지 않을 수도 있다.
몇몇 실시예에서는, 상기 숙주가 난소암 등의 암으로 고통받고 있으며, 상기 암 치료 이전, 도중, 또는 이후에 상기 숙주에 대한 모니터링의 일환으로서 상기 발견하는 일이 간격을 두고 수차례 실시된다.
선택적으로, 본 발명의 방법들은 생물학적 샘플 내 Bcl-2 수치를 정상 대조구 샘플 내의 Bcl-2 수치와 비교하는 단계를 더 포함하는데, 여기서 상기 정상 대조구 샘플 내의 수치에 비해서 더 높은 Bcl-2 수치가 난소암 등의 암에 대한 표지가 된다.
몇몇 실시예에서는, Bcl-2 발견이 진행되는 시점에 상기 숙주가 아무런 암의 증후를 나타내지 않는다. 다른 실시예에서는, Bcl-2 발견이 진행되는 시점에 상기 숙주가 하나 이상의 암의 증후를 나타낸다. 예를 들어, 부인암 (예, 난소암)의 경우, 하나 이상의 부인암 증후에는 골반통, 이상 질출혈, 복부 종창 또는 팽만, 지속성 등통, 지속성 위경련, 배변 또는 배뇨 변화 (변비, 설사, 혈변, 가스, 얇은 대변, 배뇨 횟수 또는 긴급성, 변비 등), 성교통, 10파운드 이상의 비자발적 체중감소, 외음부 또는 질 이상 (수포, 피부색 변화, 또는 분비물 등), 유방 변화 (덩어리, 동통, 유두 분비물, 오목형성(dimpling), 발적(redness), 또는 종창(swelling) 등), 및 피로로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것들이 포함된다.
다른 실시예에서는, 본 발명이 암을 보유하고 있거나, 보유하는 것으로 의심되는 숙주의 예후 평가를 위한 방법을 포함하는데, 이 방법은 a) 상기 숙주에게서 획득한 뇨, 혈액, 또는 복수 등의 생물학적 샘플 내에서 Bcl-2 수치를 결정하는 단계; b) (a) 단계에서 결정된 수치를 암을 보유하지 않은 정상 숙주에게서 획득한 생물학적 샘플 내 존재하는 것으로 알려진 Bcl-2의 범위와 비교하는 단계; 및 c) (b) 단계 비교에 기초하여 상기 숙주의 예후를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 (a) 단계에서 높은 수치의 Bcl-2가 매우 적극적인 형태로 암을 표지하고, 따라서 빈약한 예후를 표지한다.
본 발명에서 사용된 "발견하는 단계" 또는 "발견"의 표현은 표적 Bcl-2 (Bcl-2 암호화 핵산 서열 또는 Bcl-2 유전자 산물(폴리펩티드)), 그 소단위들, 또는 보조제 결합 표적들의 조합형태 등의 존재 여부를 검사하거나 확립하는 것, 또는 부인암의 하나 이상의 실제 특성들, 전이, 병기, 또는 유사한 조건들을 검사, 심문, 확인, 확립, 또는 결정하는 것이 해당된다. 상기 표현은 Bcl-2와 기타 암 생물 마커들에 대한 진단, 예후, 및 모니터링 적용예들을 포괄하는 개념이다. 상기 표현은 정량적, 반-정량적, 및 정성적 발견 방법론을 포괄하는 개념이다. Bcl-2 단백질 (Bcl-2 단백질을 암호화하는 핵산 분자와는 반대됨) 발견에 관여하는 본 발명의 실시예들에서는, 상기 발견 방법이 ELISA 기반 기술인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 다양한 실시예들에서 상기 발견 방법은 숙주 샘플 내에서 Bcl-2의 존재, 부존재, 또는 양에 관한 정보로 된 결과 (즉, 판독 또는 신호)를 제공한다. 예를 들어, 상기 결과는 정성적 (예, "양성" 또는 "음성"), 또는 정량적 (예, ng/ml 등의 농도)일 수 있다.
일실시예에서, 본 발명은 숙주의 뇨라든지 생물학적 샘플 내 Bcl-2 단백질을 정량하거나 핵산 (DNA 또는 RNA)을 암호화함으로써 숙주 내에서 암을 발견하기 위한 방법에 관한 것으로, (a) 상기 생물학적 샘플을 감지가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지되어 있는 Bcl-2에 특이적인 항체와 접촉 (반응)시키는 단계; 및 (b) 상기 감지가능한 물질을 발견하는 단계를 포함한다.
일실시예에서, 본 발명은 숙주의 뇨 또는 혈액 등의 생물학적 샘플 내 Bcl-2를 정량함으로써 숙주 내에서 암 진단 및/또는 모니터하기 위한 방법에 관한 것으로, (a) 상기 생물학적 샘플을 감지가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지되어 있는 Bcl-2에 특이적인 항체와 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 감지가능한 물질을 발견하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법들에 관한 실시예들은 (a) 생물학적 샘플을 효소로 직접 또는 간접적으로 표지되어 있는 Bcl-2에 특이성을 지닌 항체와 접촉시키는 단계; (b) 상기 효소에 대해 선택된 것으로서, 기질 또는 효소-기질의 반응 산물이 형광 복합체를 형성하게 되어 있는 기질을 첨가하는 단계; (c) 상기 형광 복합체의 형광도를 측정하여 상기 샘플 내 Bcl-2를 정량하는 단계; 및 (d) 상기 정량된 수치를 표준치와 비교하는 단계에 관여한다.
본 발명의 바람직한 일실시예는 다음 단계들을 포함한다:
(a) 생물학적 샘플을 감지가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지되어 있는 Bcl-2에 특이성을 지닌 제1 항체, 및 고정되어 있는 Bcl-2에 대해 특이성을 지닌 제2 항체와 배양시키는 단계;
(b) 상기 제1 항체를 상기 제2 항체와 분리시켜 제1 항체상과 제2 항체상을 형성하는 단계;
(c) 상기 제1 또는 제2 항체상에서 상기 감지가능한 물질을 발견하여 상기 생물학적 샘플 내 Bcl-2를 정량하는 단계; 및
(d) 상기 정량된 Bcl-2를 표준치와 비교하는 단계.
본 발명에 따른 방법에 사용된 표준치는 건강한 대조구 숙주들, 양성 질환(예, 양성 부인과 질환) 숙주들, 초기 부인암 숙주들, 또는 기타 숙주의 샘플들에 대해 얻어진 Bcl-2 수치에 해당할 수 있다. 상기 표준치와 비교할 때 증가된 Bcl-2 수치가 초기 또는 말기 난소암 등과 같이 암을 표지한다.
또한 본 발명은 상기 방법을 이용하는 장치들, 및 하나 이상의 추가적 암 마커들("생물 마커")과 연결되어 있는 키트들에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 Bcl-2의 존재 확인을 위해 생물학적 샘플을 분석하기 위한 방법 및 암에 대한 특이적 마커들인 타 마커들에 대해서 동일한 숙주로부터의 동일한 샘플 또는 다른 생물학적 샘플을 분석하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 하나 이상의 추가적 암 마커들은 Bcl-2의 발견이 진행되기 이전, 도중, 및/또는 이후에 발견될 수 있다. 마커들의 예에는 CA125, LPA, 및 OVXI가 포함된다. 하나의 바람직한 실시예에서는, 상기 마커들이 Bcl-2와 CA125이다. 여기에 언급된 상기 방법들, 장치들, 및 키트들은 상기 추가적 암 마커들을 발견하기 위한 제제들, 또는 상기 마커들을 암호화하는 핵산들을 포함하여 변형될 수도 있다.
본 발명에 연결되어 사용 가능한 암 마커들에는: 예를 들어 췌장, 신장, 난소, 자궁경부, 및 정소 암 용도의 알파태아단백(alpha fetoprotein, AFP); 예를 들어 폐, 췌장, 신장, 유방, 자궁, 간, 위액, 및 직장결장 암 용도의 암종배아항원(carcinogenic embryonic antigen, CEA); 예를 들어 폐, 췌장, 유방, 난소, 및 간 암 용도의 CA15-3; 예를 들어 폐, 난소, 자궁, 간, 위, 직장결장, 및 담관 암 용도의 CA19-9; 예를 들어 폐, 췌장, 유방, 난소, 자궁경부, 자궁, 간, 위, 및 직장결장 암 용도의 CA125; 전립선암 용도의 자유 전립선특이 항원 및 전립선특이 항원-알파(1)(free prostate specific antigen 및 prostate specific antigen-alpha(1))(PSA); 전립선 및 직장결장 암 용도의 자유 전립선특이 항원(PSAF); 전립선암 용도의 전립선특이 항원-알파(1)항키모트립신 복합체 (free prostate specific antigen-alpha(1)antichymotrypsin complex, PSAC); 전립선암 용도의 전립선산성 인산분해효소(prostatic acid phosphatase, PAP); 갑상선암 또는 윌름즈 종양(Wilm's tumor) 용도의 사람 티로글로불린(human thyroglobulin, hTG); 예를 들어 폐, 췌장, 신장, 난소, 자궁, 정소, 간, 직장결장, 방광, 및 뇌 암 용도의 사람융모성 성선자극호르몬 베타(human chorionic gonadotropin beta, hCGb); 폐, 정소, 후두 암, 버킷림프종(Burkitt's lymphoma), 신경모세포종, 및 백혈병 용도의 뉴론특이 에놀라제(neuron specific enolase, NSE); 신장암 및 다발골수종 용도의 인터루킨 2(interleukin 2, IL-2); 신장암, 유방암, 난소암 및 다발골수종 용도의 인터루킨 6(interleukin 6, IL-6); 신장암, 난소암, 전립선암, 백혈병, 다발골수종, 및 림프종 용도의 베타 2 마이크로글로불린(beta 2 microglobulin, B2M); 및 전립선암 용도의 알파 2 마이크로글로불린(alpha 2 microglobulin, A2M)이 포함되나, 이들에만 한정되는 것은 아니다. 상기 암 마커들이 진단 및/또는 예후 특성을 보이는 생물학적 샘플 (혈액 또는 뇨 등)의 선택은 당업계 기술자들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명은 숙주로부터의 생물학적 샘플 내의 Bcl-2를 발견하는 것에 의해, 숙주 내에서 난소암 등의 암을 모니터, 진단하기 위한 방법, 또는 예후하기 위한 방법을 제공한다. 일실시예에서는 상기 방법이 상기 샘플을 감지가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지되어 있는 Bcl-2에 특이성을 지닌 항체와 접촉시키는 단계, 및 상기 감지가능한 물질을 발견하는 단계를 포함한다.
본 발명에 의한 방법들은 무질환 상태와 연관된 초과량 아니면 미달량의 Bcl-2, 또는 질환 상태(예, 난소암)와 상호연관된 변형 Bcl-2(예, 전체길이(full length) 미만)의 존재여부를 발견하기 위해서, 또는 질환 상태로의 진행경과를 발견하기 위해서 이용될 수도 있다. 여기서 언급된 방법들은 암 또는 전암(pre-malignant) 세포들의 존재 가능성을 평가하기 위해 이용될 수도 있다. 이러한 방법들은 종양 발견, 종양 성장 평가, 부인암 진단 및 예후 보조를 위해 이용될 수 있다. 상기 방법들은 수술, 암 화학요법, 및/또는 방사요법에 따른 모든 종양 조직의 부재 또는 제거 여부 확인뿐만 아니라, 암 전이의 존재 발견을 위해 사용될 수 있다. 아울러 이들은 암 화학요법 및 종양 재발 여부를 모니터하기 위해 사용될 수도 있다.
본 발명의 방법들은 초기 난소암(예, 숙주가 무증상인 경우) 진단과, 난소암 진행경과 및 치사가능성 예후에 있어서 특히 유용하다. 여기서 설명한 바와 같이, 표준치(예, 정상 또는 양성 질환 경우의 수치)와 비교한, 샘플 내에서 발견한 Bcl-2의 증가한 수치는 진행된 병기, 장액 조직 타입(serous histological type), 준최적 절제, 대량 잔여 종양(large residual tumor), 및/또는 질병 경과와 치사가능성의 증가된 위험에 대한 표지자에 해당한다.
"샘플", "생물학적 샘플" 등은 Bcl-2를 발현하거나 포함하는 것으로 알려지거나 의심되는 일종의 물질, 예를 들면 뇨를 의미한다. 테스트 샘플은 그 원료(source)에서 채취된 그대로 직접 사용되거나, 샘플의 특성 변형을 위해 전처리한 다음에 사용될 수도 있다. 상기 샘플은 조직, 추출물, 세포(예, 종양 세포) 및 생리액, 예를 들면 전혈, 혈장, 혈청, 복막액, 복수 등을 포함하여 어떠한 생물학적 원료로부터도 도입할 수 있다. 상기 샘플은 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 사람으로부터 얻어질 수 있다. 상기 샘플은 어떠한 방법으로도 전처리될 수 있고, 및/또는 실험을 방해하지 않는 편리 배지(convenient medium)에도 준비될 수 있다. 상기 샘플은 사용에 앞서 처리될 수 있는데, 예를 들면 혈액으로부터 혈장을 마련한다든지, 점액을 희석시킨다든지, 하나 이상의 프로테아제 억제자((protease inhibitor)들을 뇨 (예, 4-(2 아미노에틸)-벤젠 설포닐 플루오라이드, EDTA5 리우펩틴(leupeptin), 및/또는 펩스타틴(pepstatin)) 같은 샘플에 적용한다든지 하는 등이다. 샘플 처리과정은 여과, 증류(distillation), 추출, 농축, 방해 요소들의 불활성화, 시약 첨가, 등이 관계된다. Bcl-2의 존재는 다양한 생물학적 샘플에서 발견될 수 있는데, 조직(tissue)이나 그 추출물들이 해당된다. 바람직하게는 Bcl-2는 사람의 뇨에서 발견된다.
본 발명 실시예들에서는, 상술한 방법이 숙주의 생물학적 샘플 내의 Bcl-2를 정량함으로써 부인암 진단과 모니터하는 데에 적용되어진다. 바람직하게는 실험 중인 숙주의 생물학적 샘플 내에서 정량된 Bcl-2의 양이 상기 숙주의 다른 샘플이나 보다 이전 샘플에서 정량된 양, 또는 대조구 샘플에서 정량된 양과 비교된다. 건강한 숙주들로부터의 대조구 샘플들에서의 양은 예상(prospective) 및/또는 회고(retrospective) 통계연구에 의해 설정될 수 있다. 임상적 증상이 있는 질환이나 비정상 증상을 갖지 않는 건강한 숙주들이 통계 연구를 위해 선별될 수 있다. 통계학적으로 대조구 샘플이나 동일 숙주에 대해 이전에 정량된 수치와 비교하여 상이한 수치의 Bcl-2를 발견하는 것에 의해 진단이 내려질 수 있다.
"Bcl-2"는 사람 B-세포 림프종 단백질 2 (human B-cell lymphoma protein 2)(B-세포 CLL/림프종 2로도 알려짐), 즉 림프구와 같은 일부 세포들의 세포사멸을 막는 통합 미토콘드리아 외막 단백질을 의미한다(Cleary M.L.외, Cell, 1986, 47(1):19-28; Tsujimoto Y. 및 Croce C.M., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 1986, 83:5214-5218, 전문에 대하여 참고문헌으로 통합인용됨). "Bcl-2"에는 Bcl-2 폴리펩티드(예, 유전자은행 등록번호 AAA35591; 서열목록번호 2)뿐만 아니라 Bcl-2 유전자 산물(폴리펩티드)을 암호화하는 핵산 서열 (예, 유전자은행 등록번호 M14745; 서열목록번호 1)이 포함된다. Bcl-2에는 유전자은행 등록번호 M14745과 AAA35591인 사람 Bcl-2의 모든 상동체, 자연발생 대립 변이체(allelic variant), 아이소형(isoform) 및 전구체들이 포함된다. 일반적으로, 사람 Bcl-2의 자연발생 대립 변이체들은 상기 유전자은행 등록번호 M14745과 AAA35591에서 나타난 서열과 중요한 서열 상동성 (70-90%)을 공유하게 된다. 대립 변이체들은 상기 Bcl-2 서열로부터 보존적아미노산치환(conservative amino acid substitution)을 함유할 수도 있고, 또는 Bcl-2 상동체 내의 해당 위치에서 하나의 아미노산 치환을 함유할 수도 있다. 교대 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 만들어진 두 개의 전사 변이체(transcript variant), 즉 알파와 베타는 각각의 C-말단에서 차이가 있다. 상기 알파 변이체 (유전자은행 등록번호 NP_000624 (서열목록번호 4); 및 유전자은행 등록번호 NM_000633 (서열목록번호 3))는 더 긴 전사체를 나타내며, 더 긴 아이소형 (알파)를 암호화하고, 베타는 더 짧다(유전자은행 등록번호 NP_000648 (서열목록번호 6); 및 유전자은행 등록번호 NP_000657 (서열목록번호 5)). 상기 베타 변이체는 상기 C-말단부와 함께 3' UTR 및 암호화 부위에 있어서 상기 알파 변이체와 상이하다. 특정 일실시예에서는, 본 발명의 방법들, 장치들, 및 키트들이 Bcl-2에는 특이적인 반면 (예, 서열목록번호 1, 2, 3, 4, 5, 및/또는 6), Ruben 외, 미국특허출원공개 제2002/0106731호 A1(2002.08.08 공개, 그 전문이 참고문헌으로 통합 참조됨)에 설명된 바와 같이 당해 분야에서 "Bcl-2 유사" 분자들로 알려져 있는 핵산 분자들이나 폴리펩티드들에는 특이적이지 않다(예, Bcl-2에 특이적인 결합제를 채택(예, 면역반응하는 것)하고 있지만, Bcl-2 유사 분자들과는 반응하지 않음).
"숙주" 및 "환자"는 상호 혼용가능한데, 포유동물 같은 항온동물로서, 암으로 고통받을 수 있는 동물을 의미한다. 일부 암에서는, 상기 숙주가 사람이나 사람 이외의 암컷 포유동물이다. 다른 암에서는, 상기 숙주가 사람이나 사람 이외의 수컷 포유동물이다.
숙주의 생물학적 샘플 내 Bcl-2 감지 능력을 가진 제제들은 상기 Bcl-2 폴리펩티드 또는 Bcl-2 암호화 핵산 분자와 상호작용하거나 결합하는 물질이다. 상기 제제들 (본문에서 결합제를 의미하기도 함)의 예로는 Bcl-2를 결합하는 Bcl-2 항체들 또는 그 조각들, Bcl-2 결합 파트너들, 및 Bcl-2 폴리펩티드들을 암호화하는 핵산 분자들에 혼성화하는 핵산 분자들이 해당되지만, 이들에만 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 결합제가 감지가능한 물질 (예, 감지가능한 성분물질)로 표지된다. 상기 결합제는 자체적으로 표지 기능을 할 수도 있다.
Bcl -2 항체
본 발명에 따른 방법에서 이용되는 Bcl-2에 특이적인 항체들은 연구목적이나 상업목적 원료로부터 수득 가능하다. 그 외에, 분리된 천연 Bcl-2 또는 재조합 Bcl-2가 항체, 단일클론 또는 다클론 항체, 및 면역활성 조각 (예, Fab 또는 (Fab)2 조각), 항체 중쇄, 항체 경쇄, 인간화 항체, 유전공학에 의한 단일 사슬 Fv 분자 (Ladne 외, 미국특허번호 제4,946,778호), 또는 키메릭 항체, 예를 들면 마우스 항체의 결합 특이성을 보유하지만, 나머지 부분들이 사람으로부터 기원한 것인 항체를 포함하고 있다. 단일클론 및 다클론 항체들, 조각들 및 키메라들을 포함한 항체들은 당해 기술분야에서 공지된 방법들을 이용하여 준비할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법들에서 사용된 항체들은 107M 이상 또는 동일한 값의 Ka로 결합하는 경우에 Bcl-2에 대하여 반응성을 갖는다. 본 발명의 샌드위치 면역분석법에서는, 마우스 다클론 항체들과 토끼 다클론 항체들이 사용되었다.
단일클론 항체들을 생산하기 위해서, 숙주 포유동물이 Bcl-2 단백질 또는 펩티드로 접종되고 나서 추가 접종된다. 최종 접종일로부터 며칠 뒤에 접종 동물들에게서 비장(spleen)을 수거한다. 상기 비장으로부터의 세포 현탁물을 콜러와 밀스타인(Kohler and Milstein)에 개시된 통상의 기법(Nature, 1975, 256:495-497)에 따라 종양 세포와 융합시킨다. 이용가치가 있으려면, 발견되는 Bcl-2 분자의 항원결정인자(epitope)를 한정하기 위해서 펩티드 조각이 충분한 아미노산 잔기를 함유하고 있어야 한다.
면역원성이 되기에는 상기 조각이 너무 짧다면, 캐리어 분자에 접합될 수도 있다. 적합한 일부 캐리어 분자들로는 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)과 소혈청 알부민(bovine serum albumin)이 있다. 접합은 당업계 공지기술에 의해 실시될 수 있다. 그러한 기술의 하나로는, 상기 조각의 시스테인 잔기과 상기 캐리어 분자 상에 있는 시스테인 잔기를 결합시키는 것이다. 상기 펩티드 조각들은 당업계 공지기술에 의해 합성될 수 있다. 적합한 일부 기술들이 스튜어트와 영(Stuart and Young)에 의해 "솔리드상 펩티드 합성(Solid Phase Peptide Synthesis)", 제2판, 피어스 화학회사(Pierce Chemical Company)(1984)에 개시되어 있다.
상기 항체 또는 조각의 정제는 암모늄 설페이트 또는 나트륨 설페이트에 의한 침전에 이어지는, 겔 여과, 구역 전기영동 등과 함께 염 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 또는 면역친화도 크로마토그래피를 포함한, 공지된 다양한 정제 기술들에 의해 실시될 수 있다 (Goding in, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2d ed., pp. 104-126, Orlando, Fla., Academic Press). 부인암 환자나 그 위험 수준에 있는 이들의 유체, 바람직하게는 난소암 환자들의 뇨 또는 혈액 내에서 Bcl-2를 발견하기 위해서는 Fv, F(ab')2, Fab 조각 등(Harlow and Lane, 1988, Antibody Cold Spring Harbor)과 같이, Bcl-2 결합 영역을 적어도 한 군데 이상 갖는, 정제된 항체나 정제된 항체 조각들을 사용하는 것이 바람직하다.
암의 발견 및/또는 모니터링에 사용하기 위해서, 상기 정제된 항체들은 직접적으로든 링커에 의해서든 Bcl-2 존재의 발견을 허용하는 지시기(reporter group)로 작용하는 화합물에 공유결합될 수 있다. 다양한 종류의 물질들이 상기 지시기로서 작용할 수 있는데, 효소에만 한정하지 않고, 염료, 방사성 금속 및 비금속 동위원소, 형광유도성 화합물(fluorogenic compound), 형광 화합물(fluorescent compound) 등이 포함된다. 발견과 모니터링에 유용한 본 발명의 항체(또는 그 조각)들의 항체 접합체들을 제조하기 위한 방법들이 미국특허 제4,671,958; 4,741,900 및 4,867,973에 개시되어 있다.
본 발명에 의한 일실시예에서는, 바람직한 결합 항원결정인자들이 공지의 Bcl-2 유전자 서열 및 그 암호화된 아미노산 서열로부터 식별될 수 있으며, 높은 결합 친화도로 Bcl-2 항체들을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 또한, Bcl-2 상에서의 결합 항원결정인자들의 식별은 바람직한 항체들의 설계과 구조에 이용될 수 있다. 예를 들면, Bcl-2에서 바람직한 항원결정인자를 암호화하는 DNA가 재조합적으로 발현될 수 있고, 그 항원결정인자에 선택적으로 결합하는 항체를 선별하기 위해 이용될 수 있다. 선별된 항체들은 이후 상기 항체가 Bcl-2 상의 특이적인 결합 항원결정인자에 특이적으로 결합하기에 충분한 조건 하에서 샘플에 노출되고 나서, 형성된 복합체가 감지된다. 특이적인 항체 방법론들이 주지 이해되고 문헌에 개시되어 있다. 항기 방법에 대한 보다 상세한 설명은 예를 들면, Practical Immunology, Butt, W.R., ed.,Marcel Dekker, New York, 1984에 개시되어 있다.
본 발명은 또한 Bcl-2 항체들의 발견에 대한 것이다. Bcl-2는 부인암-특이적 마커이다. 따라서, Bcl-2 항체를 숙주의 생물학적 유체에서 발견하는 것은 부인암의 진단을 가능하게 할 수 있다.
단백질 결합 검정( Protein Binding Assays )
Bcl-2와 특이적으로 반응하는 항체들, 또는 그 유도체들, 예를 들면 효소 접합체들 또는 표지된 유도체들이 다양한 생물학적 샘플 내에서 Bcl-2를 발견하기 위해 사용될 수 있는데, 예를 들어 단백질의 항원결정기와 항체들 간의 결합 작용에 의존하는 공지된 모든 면역측정법에서도 사용될 수도 있다. 상기 측정법들의 예에는 방사면역측정법(radioimmunoassay), 효소 면역측정법(ELISA), 면역형광법(immunofluorescence), 면역침전법(immunoprecipitation), 라텍스 응집반응법(latex agglutination), 혈구응집반응법(hemagglutination), 및 조직화학 시험(histochemical test)이 있다.
Bcl-2에 특이적인 항체가 감지가능한 물질로 표지되고, 상기 감지가능한 물질의 존재에 기초하여 생물학적 샘플 내에 국소적으로 존재할 수 있다. 감지가능한 물질의 예에는, 방사성동위원소들 (예, 3H, 14C, 35S, 125I, 131I), 형광 표지물질 (예, FITC, 로다민(rhodamine), 란탄계 인(lanthanide phosphors)), 루미놀(luminol) 등의 발광표지물질; 효소계 표지물질 (예, 허스래디시페록시다아제(horseradish peroxidase, HRP), 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 루시페라아제, 알칼라인 포스파타아제(alkallind phosphase), 아세틸콜린에스테아제(acetylcholinestease), 비오티닐기(표지된 아비딘(avidin)(예, 광 또는 비색(colorimetric) 측정법으로 감지가능한 형광 마커 또는 효소활성을 갖는 스트렙트아비딘)에 의해 감지가능함), 이차 지시기에 의해 인식된 소정의 폴리펩티드 항원결정인자 (예, 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체에 대한 결합자리, 금속 결합도메인, 항원결정인자 태그)가 있다. Bcl-2에 대해 반응하는 항체에 특이성을 지닌, 이차 항체의 도입으로 일차 항원-항체 반응이 증폭되는 간접 방법도 이용될 수 있다. 일례에 따르면, Bcl-2에 대해 특이성을 가진 항체가 토끼 IgG 항체라면, 상기 이차 항체는 상기 언급한 감지가능 물질로 표지된 염소 항-토끼 감마-글로불린일 수 있다.
상기 설명한 항체들을 컨쥬게이션하거나 라벨링하기 위한 방법들은 업계 통상의 기술 중 하나로 수행될 수 있다. (예를 들면, Imman, Methods In Enzymology, Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B, Jakoby and Wichek (eds.), Academic Press, New York, p. 30, 1974; and Wilchek and Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications," Anal. Biochem. 171:1-32, 1988, 효소 또는 리간드 결합 파트너로 항체들을 컨쥬게이션시키거나 라벨링하기 위한 방법 관련하여 참조).
신호를 감지하기 위해 시분할 형광 분석기법(time-resolved fluorometry)이 사용될 수도 있다. 예를 들면, Christopoulos T.K. and Diamandis E.P., Anal. Chem., 1992:64:342-346에 기재된 방법이 기존의 시분할 형광 분석기법으로 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일실시예에 따르면, Bcl-2 항체가 효소로 표지되고, 상기 효소에 대한 기질이 첨가되는 방법이 제공되는데, 상기 기질은 기질, 또는 상기 효소와 기질의 반응 산물이 란탄족 금속과 형광 복합체를 형성하게 되는 것으로 선택되어진다. 란탄족 금속이 첨가되고, 상기 형광 복합체의 형광도를 측정하여 Bcl-2를 샘플 내에서 정량한다. Bcl-2에 특이적인 항체들은 효소로 직접 또는 간접적으로 표지된다. 효소들은 그 효소에 대한 기질, 또는 효소와 기질의 반응산물이 유로피움(europium) 및 터비움(terbium) 등의 란탄족 금속들과 혼합하는 능력에 따라 선택된다. 적절한 효소의 예로는 알칼라인 포스파타아제와 베타-갈락토시다아제가 있다. 바람직하게는, 상기 효소는 알칼라인 포스파타아제이다. 상기 Bcl-2 항체들은 또한 간접적으로 효소로 표시될 수도 있다. 예를 들면, 상기 항체들이 리간드 결합쌍의 하나의 파트너에 컨쥬게이션될 수도 있고, 상기 효소가 상기 리간드 결합쌍의 다른 파트너에 결합될 수도 있다. 대표적인 예에는 아비딘-비오틴, 및 리보플라빈-리보플라빈 결합 단백질이 있다. 바람직하게는, 상기 항체들이 비오틸화되고, 상기 효소가 스트렙타비딘에 결합되는 것이다.
상기 방법 중 일실시예에서는, 샘플 내에서 Bcl-2에 결합된 항체가 효소에 대한 기질을 첨가함으로써 검출된다. 상기 기질은 란탄족 금속 (예, 유로피움, 터비움, 사마리움, 디스프로슘, 바람직하게는 유로피움, 터비움)의 존재 하에, 상기 기질, 또는 효소와 기질의 반응 산물이 란탄족 금속과 형광 복합체를 형성하게 되는 것으로 선택된다. 효소들 및 형광 복합체를 형성하는, 효소들에 대한 기질들의 예가 Diamandis에 의한 미국특허번호 제5,3112,922에 나타나 있다. 예에 의해, 상기 항체가 직간접적으로 알칼라인 포스파타아제로 표지될 때에는, 그 방법에서 채택된 기질은 4-메틸움벨리페릴 포스페이트(4-methylumbeliferyl phosphate)이거나, 5-플루오르프살리실 포스페이트(5-fluorpsalicyl phosphate)이 가능하다. 상기 복합체들의 형광 강도는 일반적으로 시분할 형광 분석기, 예, CyberFluor 615 Immoanalyzer (Nordion International, Kanada Ontario)를 사용하여 측정 가능하다.
상기 샘플, Bcl-2 특이성 항체, 또는 Bcl-2는 캐리어 상에 고정될 수도 있다. 적절한 캐리어의 예로는 아가로오스, 셀룰로오스, 덱스트란, 세파덱스, 세파로오스, 리포좀, 카르복시메틸 셀룰로오스 폴리스티렌, 여과지, 이온교환 수지, 가소성 필름, 가소성 튜브, 유리 비드, 폴리아민-메틸 비닐 에테르-말레이산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레이산 공중합체, 나일론, 실크 등이 있다. 상기 캐리어는 예를 들면, 튜브, 테스트판, 웰, 비드, 디스크, 구 등의 형태일 수 있다. 상기 고정된 항체는 공지된 화학적 또는 물리적 방법들, 예를 들어 시아노겐 브롬 커플링을 이용하여 적절한 불용성 캐리어와 상기 원료를 반응시키는 것에 의해 준비될 수 있다.
일실시예에 따르면, 본 발명은 면역검정법에 의해 Bcl-2를 측정하는 것에 의해 뇨와 같은 어떠한 샘플 내에서 Bcl-2를 확인하기 위한 모드를 제공한다. 다양한 면역검정법이 Bcl-2를 측정하는 데에 이용될 수 있다는 사실이 업계 기술자들에게 명백하다. 일반적으로, Bcl-2 면역검정법은 경쟁적일 수도 있고, 비경쟁적일 수도 있다. 경쟁적인 방식들은 Bcl-2에 대해 고정되었거나 고정이 가능한 항체(항-Bcl-2) 및 표지된 Bcl-2 형태를 이용한다. 샘플 Bcl-2와 표지된 Bcl-2가 항-Bcl-2에 결합하기 위해 경쟁한다. 그 결과 항-Bcl-2에 결합하게 된 표지된 Bcl-2(결합 조각)을 남아 있는 비결합 (비결합 조각)부로부터 분리한 후에, 결합 조각에서든지 비결합 조각에서든지 상기 표지의 양이 측정되고, 기존의 방식, 예를 들면 표준곡선과 비교하는 것에 의해서,생물학적 샘플 내의 Bcl-2의 양과 상호연관될 수 있다.
바람직하게는, Bcl-2의 확인을 위해서는 "샌드위치" 방식이라는 가장 일반적인 방식과 함께 비경쟁 방식이 이용된다. 이러한 검정법에 있어서는, 두 개의 항-Bcl-2 항체들이 채용된다. 상기 항-Bcl-2 항체들 중 하나가 직간접적으로 표지되고 ("검출 항체"라고도 부름), 다른 것은 고정되거나 고정될 수 있게 된다("포획 항체"라고도 부름). 상기 포획 및 검출 항체들은 동시에 또는 시계열적으로 상기 생물학적 샘플과 접촉될 수 있다. 시계열적 방법들은 상기 포획 항체를 상기 샘플과 인큐베이트시키고, 상기 검출 항체를 소정 시간 후에 첨가하는 것에 의해 실시될 수 있다(간혹 "순방향" 방식이라고도 부름); 또는 상기 검출 항체가 상기 샘플과 먼저 인큐베이트될 수 있고, 그런 다음에 상기 포획 항체가 첨가되는 것에 의해 실시될 수도 있다(간혹 "역방향" 방식이라고도 부름). 필요한 인큐베이트가 일어난 후에, 검정을 완료하기 위해서는, 상기 포획 항체가 테스트 혼합액에서 분리되고, 상기 표지가 상기 분리된 포획 항체 상 또는 잔류 테스트 혼합액 중 적어도 한 부분에서 측정된다. 일반적으로 상기 포획 항체 상에서 측정되는데, 그것이 상기 포획 및 검출 항체들에 의해 결합된 ("샌드위치된") Bcl-2를 포함하기 때문이다.
Bcl-2에 대한 전형적인 두 자리 면역계측 검사에서는, 상기 포획 항체와 검출 항체 중 어느 하나 또는 모두가 다클론 항체이다. 상기 검출 항체에서 사용된 표지는 업계에서 통상적으로 알려진 것들로부터 선택 가능하다. 단백질 검출 방법에 대한 다른 실시예들에서처럼, 상기 표지는 효소 또는 화학발광 물질, 예를 들면, 또는 방사활성 동위원소, 형광체, 감지가능한 리간드 (예, 상기 리간드에 대한 표지된 결합 파트너에 의한 이차 결합에 의해 감지가능함) 등이 될 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 효소와 기질의 반응 산물이 형광 복합체를 형성하게 되도록 선택되는 기질을 첨가함으로써 감지되는 효소로 표지된다. 상기 포획 항체는 상기 잔류 테스트 혼합액으로부터 분리되기 위한 모드를 제공하게 되도록 선택된다. 따라서, 상기 포획 항체는 미리 고정되었거나 불용성인 상태로 검정에 도입될 수 있고, 또는 고정이 가능한 상태, 즉 상기 포획 항체가 상기 검정에 주입된 데 이어서 고정이 실시될 수 있는 상태로 도입될 수 있다. 고정된 포획 항체는 자분(magnetic particle), 라텍스 분말, 미세역가 멀티웰 평판(microtiter multi-well plate), 비드, 큐벳, 또는 기타 반응용기와 같은 고체상에 공유 또는 비공유 결합되어 있는 항체를 포함할 수 있다. 고정이 가능한 포획 항체의 예는 리간드 물질, 예를 들어 불완전항원(hapten), 비오틴 등으로 화학 변형되고, 이어서 상기 리간드에 대한 고정된 형태의 결합 파트너, 예를 들어 항체, 아비딘 등과의 접촉에 의해 고정될 수 있는 항체이다. 일실시예에서 상기 포획 항체는 상기 고체상에 결합되어 있는 상기 포획 항체에 종 특이적인 항체를 사용하여 고정될 수 있다.
본 발명의 특정 샌드위치 면역검정법은 Bcl-2에 대해 반응하는 두 개의 항체, 효소 표지로 표지된 Bcl-2에 대해 반응하는 항체에 대해 특이성을 갖는 이차 항체, 상기 표소에 대한 형광 기질을 사용한다. 일실시예에서 상기 효소는 알칼라인 포르파타아제(ALP)이고, 상기 기질은 5-플루오로살리실 포스페이트이다. ALP는 상기 형광 기질, 5-플루오로살리실 포스페이트로부터 포스페이트를 끊고, 5-플루오로살리실산(FSA)를 만들어낸다. 이후, 5-플루오로살리실산은 FSA-Tb(3+)-EDTA 형태의 고 형광성 삼성분 복합체(ternary complex)를 형성하게 되는데, 시분할 모드에서 Tb3+ 형광도를 측정함으로써 정량이 가능하다. 형광 강도는 일반적으로 상기의 시분할 형광분석법을 이용하여 측정된다.
상기의 면역검정법들과 포맷들은 예시를 위한 것이며, 제한하기 위한 것이 아니다. 일반적으로 어떠한 면역검정법이나 포맷도 본 발명에서 이용될 수 있는 것으로 이해를 요한다.
본 발명에 의한 단백질 검출 방법들, 장치들, 및 키트들은 샘플 내의 Bcl-2 검출을 위한 나노와이어 센서기술(Zhen 외, Nature Biotechnology, 2005, 23(10):1294-1301; Lieber 외, Anal . Chem., 2006, 78(13):4260-4269, 여기에 병합참조됨) 또는 마이크로캔틸레버 기술(microcantilever technology)(Lee 외, Biosens . Bioelectron, 2005, 20(10):2157-2162; Wee 외, Biosens . Bioelectron ., 2005, 21(3):462-473; Campbell and Mutharasan, Biosens . Bioelectron ., 2005, 21(4):597-607; Hwang 외, Lab Chip, 2004, 4(6):547-552; Mukhopadhyay 외, Nano . Lett ., 2005, 5(12):2385-2388, 여기에 병합참조됨)을 활용할 수 있다. 부가적으로, Huang 외.는 상업적으로 구득 가능하고 Bcl-2 검출을 위해 채택 가능한 표면 플라즈몬 공명 바이오센서(Biosens . Bioelectron ., 2005, 21(3):483-490, 여기에 병합참조됨)에서 전립선 특이성 항원 면역검정에 대해 설명하고 있다. 고-민감도의 소형화 면역검정들 또한 Bcl-2 검출을 위해 활용 가능하다(Cesaro-Tadic 외, Lab Chip, 2004, 4(6):563-569; Zimmerman 외, Biomed. Microdevices, 2005, 7(2):99-110, 여기에 병합참조됨).
핵산
천연 핵산, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, Bcl-2를 암호화하는 핵산에 혼성화하는 합성 올리고뉴클레오티드를 포함한 핵산들이, 부인암 환자들이나 그럴 염려가 있는 환자들의 생물학적 샘플, 바람직하게는 부인암 환자들이나 그럴 염려가 있는 환자들의 뇨 속의 Bcl-2 존재여부를 검출하기 위한 보조제로서 유용하다. 부인암 환자들이나 그럴 염려가 있는 환자들의 생물학적 샘플, 바람직하게는 부인암 환자들이나 그럴 염려가 있는 환자들의 뇨 속에서 Bcl-2의 발현을 감지하기 위한 보조제로 이용하기 위해, 본 발명은 암호화 서열로부터 상방 또는 하방에 더 생기는 Bcl-2 전사체 서열(예, 5'와 3' 비번역부에 포함된 서열 또는 거기서 연장된 서열)에 상보적인 서열뿐만 아니라, Bcl-2 암호화 서열 및 그 상보적인 서열에 대응하는 핵산 서열을 이용하고자 한다.
생물학적 샘플 내의 Bcl-2의 존재여부를 검출하기 위해 바람직한 올리고뉴클레오티드들은 Bcl-2를 암호화하는 cDNA 서열의 적어도 한 부분에 상보적인 것들이다. 이들 올리고뉴클레오티드들은 올리고리보뉴클레오티드들이거나 올리고디옥시리보뉴클레오티드들일 수 있다. 추가로, 올리고뉴클레오티드들은 생물학적으로 중요한 뉴클레오티드들, 즉 A (아데닌), dA(디옥시아데닌), G(구아닌), dG(디옥시구아닌), C(시토신), dC(디옥시시토신), T(티민) 및 U(우라실)의 천연 올리고머들, 또는 예를 들어 뉴클레오티드 내부 포스포디에스테르 결합 내의 인산 산소를 메틸기나 황 원소로 치환한 올리고뉴클레오티드 변성 종들일 수 있다. 또한, 이들 뉴클레오티드들 자체, 및/또는 리보오스 단위들이 변형될 수도 있다.
상기 올리고뉴클레오티드들은 업계에 주지된 화학적 올리고뉴클레오티드 합성법을 이용하여 화학 합성될 수 있다. 예를 들면, 상기 올리고뉴클레오티드들은 상업적으로 구득 가능한 자동화된 핵산 합성기 중 어떠한 것을 사용하여 제조될 수 있다. 이 밖에, 상기 올리고뉴클레오티드들은 표준 재조합 DNA 기술, 예를 들면 비암호화 가닥의 전사를 유도하는 것에 의해 만들어질 수도 있다. Bcl-2를 암호화하는 상기 DNA 서열이 재조합 DNA 시스템에 도입, 예를 들면 적절한 프로모터의 역 방향 다운스트림(reverse orientation downstream)에 삽입되고, 비암호화 가닥이 전사된다.
비록 Bcl-2 암호화 핵산에 혼성화하기 위해서 어떤 길이를 가진 올리고뉴클레오티드든지 사용될 수 있다 하더라도, 일반적으로 올리고뉴클레오티드들은 8-100 뉴클레오티드 범위 이내인 것이 바람직하다. 뇨 샘플 내 Bcl-2 검출용으로 더욱 바람직한 올리고뉴클레오티드들은 15-50 뉴클레오티드 범위 이내인 것들이다.
Bcl-2 핵산 분자에 혼성화하기 위해서 선별된 올리고뉴클레오티드는 화학적 또는 재조합 DNA 기술로 합성된 것인데, 이후 표준 기술을 이용하여 분리되고 정제된 다음, 표준 표지 프로토콜을 사용해서 (예, 35S, 32P) 표지되는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플 내의 Bcl-2의 발현을 감지하기 위한 중합연쇄반응(PCR)에 올리고뉴클레오티드 쌍들을 이용하기 위한 것이다. 상기 올리고뉴클레오티드 쌍들에는 순방향 Bcl-2 프라이머와 역방향 Bcl-2 프라이머가 포함된다.
환자로부터의 샘플 내에서 Bcl-2의 존재여부는 핵산 혼성화에 의해 결정될 수 있는데, 예를 들면, 노던 블랏 분석(Northern blot analysis), 도트 블랏팅(dot blotting), 서던 블랏 분석(Southern blot analysis), 형광동소교잡법(fluorescence in situ hybridization, FISH), 및 PCR이 있지만, 이들에만 한정되는 것은 아니다. 크로마토그래피, 바람직하게는 HPLC, 및 기타 공지된 분석법들 또한 샘플 내 Blc-2의 전령 RNA 수치를 판독하는 데에 이용 가능하다.
검사시에 유체 속으로 흘러나오거나 방출되게 되는 Bcl-2-양성 암 세포 내에 있는 생물학적 유체 내에서 Bcl-2 암호화하는 핵산 분자들이 발견될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 환자들의 생물학적 샘플 내의 Bcl-2를 검출하기 위한 보조제로서 핵산을 이용하기 위한 것으로, 여기서 상기 핵산은 표지되어 있다. 상기 핵산 보조제들은 상술하였거나 업계에 공지되어 있는 방사능 라벨, 형광 라벨, 효소, 화학발광 태그, 비색 태그(colorimetric tag) 또는 기타 라벨이나 태그로 표지될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 체액 샘플 내에서 Bcl-2 mRNA의 존재여부를 검출하기 위한 노던 블랏 분석법을 이용하기 위한 것이다. 상기 분석법의 첫번째 단계는 Bcl-2 핵산을 함유하는 샘플을 겔 전기영동으로 분리하는 것이다. 이후 분산된 핵산이 니트로셀룰로오스 필터나 다른 필터로 옮겨진다. 이어서, 적당한 혼성화 조건, 예를 들면 42℃, 50% 포름아미드, 5 x SSPE, 2 x 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 0.1% SDS 하에서, 상기 표지된 올리고뉴클레오티드가 상기 필터에 노출되는데, 분자 클로닝(Molecular Cloning): A Laboratory Manual, Maniatis 외 (1982, CSH Laboritory)에 개시되어 있는 바와 같다. 업계에 알려진 기타 유용한 공정들에는 용액 혼성화, 도트 및 슬롯 RNA 혼성화, 및 탐침(probe) 기반 마이크로어레이들이 있다. 업계에 알려진 표준 공법을 이용하여 혼성화된 조각들의 방사능을 측정함으로써 환자의 생물학적 유체 내에 존재하는 Bcl-2 핵산의 양을 결정하게 된다.
도트 블랏팅(점보합)은 원하는 핵산을 함유하는 샘플들을 막에 붙이는 것이다. 상기 핵산은 상기 막에 붙이기 전 또는 후에 변성될 수 있다. 상기 막은 표지된 탐침으로 인큐베이트된다. 도트 블랏팅 공정들은 당업계 기술자들에게 주지되어 있고, 미국특허번호 제4,582,789호와 제4,617,261호에 더욱 상세하게 기술되어 있는데, 이들은 여기서 병합참조되어 있다.
중합연쇄반응(PCR)은 핵산 샘플 내에 존재하는 하나 이상의 특정 핵산 서열을 중합화를 위해 프라이머와 보조제를 이용하여 증폭시킨 후, 증폭된 서열을 검출하기 위한 공정이다. 하나의 프라이머가 다른 것에 혼성화될 때의 신장(extension) 산물이, 원하는 특정 핵산 서열의 생산을 위한 템플릿이 되며, 그 반대도 가능하고, 이러한 과정이 원하는 양의 서열을 생산하기 위해 필요한 만큼 반복된다. 원하는 서열의 존재를 검출하기 위해서 당업계 기술자라면(미국특허번호 제4,683,195호) 관례적으로 중합연쇄반응을 이용한다.
원하는 서열을 검출하기 위해 당업계 기술자에 의해 관례적으로 수행되는 PCR의 특정 예는 역전사 PCR (RT-PCR; Saiki 외, Science , 1985, 230:1350; Scharf 외, Science, 1986, 233:1076)이다. RT-PCR는 전체 RNA를 생물학적 유체로부터 분리하고, 상기 RNA를 원하는 핵산 서열을 인식하는 프라이머 존재 하에서 변성시키고, 상기 프라이머를 이용하여 역전사에 의해 상기 RNA의 cDNA 복사본을 형성하고, 특정 프라이머들을 이용하여 PCR에 의해 상기 cDNA를 증폭시키고, 증폭된 cDNA를 전기영동이나 당업계 기술자들에게 알려진 기타 기술로 검출하는 것이다.
바람직한 실시예에서, 부인암 환자들이나 그럴 위험에 있는 이들의 생물학적 유체 내, 바람직하게는 난소암 환자들이나 그럴 위험에 있는 이들의 뇨 속에서 Bcl-2 핵산을 검출하는 방법들에는 노던 블랏 분석법, 도트 블랏팅, 서던 블랏 분석법, FISH, PCR이 있다.
장치
본 발명의 방법들은 고체 지지체 위에서 수행될 수 있다. 상기 고체 지지체로 사용되는 것은 기존에 생물학적 샘플 내 분석물의 분석용으로 사용되던 것일 수 있으며, 일반적으로 셀룰로오스, 세파덱스(Sephadex) 등의 폴리사카라이드 등으로 이루어지며, 상기 고체 지지체의 보호 및/또는 제어를 위해 부분적으로 하우징으로 둘러싸인 구조일 수 있다. 적용대상에 따라 상기 고체 지지체는 경질, 반경질, 연질, 탄성질 (형상 기억 보유) 등일 수 있다. Bcl-2는 체내 또는 시험관내(즉, 체외)에서 샘플 속에서 검출될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 샘플 내 Bcl-2의 양이 신체(즉, 체내)로부터 샘플을 제거하는 일 없이 결정되어야 할 때, 상기 지지체는 숙주에 무해하고 신체의 적절한 부위로 삽입하기에 간편한 형태이어야 한다. 예를 들어, 상기 지지체는 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리스티렌 또는 기타 경질 무독성 플라스틱 물질로 되고, 숙주 속으로 도입될 수 있을 만큼의 크기와 모양을 가진 프로브일 수 있다. 적절한 삽입 지지체의 선별은 업계 기술자들의 능력 범위 내에 있으며, 본 발명의 목적을 위한 범주 내에 있다.
본 발명의 검정 (방법)에서 접촉 단계는 상기 생물학적 샘플과 상기 고체 지지체, 예를 들면 반응용기, 마이크로용기, 튜브, 마이크로튜브, 멀티웰 플레이트, 기타 고체 지지체를 접촉, 결합, 또는 혼합하는 것과 연관된다. 본 발명의 일실시예에서 상기 생물학적 샘플 (예, 뇨)과 접촉될 고체 지지체는 분석 대상 유체 매질의 측방 유동을 위해 흡수 패드 또는 막, 예를 들어 밀리포어사(Millipore Corp. (Bedford, MA))로부터 입수 가능한 것, 이들에만 한정되는 것은 아니지만 하이-플로우 플러스TM 막(Hi-Flow PlusTM)들 및 막 카드들, 및 슈어윅TM (SureWickTM)패드 물질들을 갖는다.
본 발명의 방법들을 수행하는 데 유용한 진단 장치는 목적하는 용도로 채낵된 어떠한 형태로든 구성될 수 있다. 따라서, 일실시예에서, 본 발명의 장치는 Bcl-2 수치가 결정되어야 할 뇨 또는 혈액과 같은 생물학적 샘플과 접촉될 수 있도록 취급가능하거나 재활용가능한 테스트 스트립이나 막대기 형태로 구성될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 장치는 내재진단 목적(indwelling diagnostic applications)으로 해부 부위, 예를 들어 복막강으로 이식되거나 삽입될 수 있는 침 유사 예들을 생성하는 것으로 알려진 마이크로 규모의 제조기술을 이용하여 구성될 수 있다. 또 다른 실시예들에서, 반복된 실험을 하기 위해 장치들은 신장된 프로브 형태로 구성될 수 있다.
바람직한 실시예들에서, 본 발명의 장치들은 뇨, 전혈, 혈청, 혈장, 복막액, 또는 복수와 같은 생물학적 샘플에 대한 유체 경로를 한정하는 측방유동 매트릭스로 작용하는 표면을 가진, 고체 지지체(스트립 또는 딥스틱)을 포함한다.
측방유동 테스트 스트립 또는 단순히 스트립 테스트로도 알려진, 다양한 분석대상물 검출용 면역크로마토그래피 검정법들이 공지되어 왔는데, Bcl-2 검출용으로 이용 가능하다. 측방유동 시험들의 이점에는 사용자 친화형 포맷, 신속한 결과, 광범위한 기후 조건에 걸쳐 장기간 안정성, 상대적으로 저렴한 제조비용이 있다. 이들 특징들은 측방유동 시험들이 가정용 테스트, 신속한 현장진단검사(point of care testing), 및 다양한 분석물들에 대한 현장 테스트와 관련된 용도들에서 이상적인 것으로 판단되도록 한다. 상기 테스트를 뒷받침하는 원칙은 간단하다. 특히, 육안으로 감지가능한 고체 지지체, 예를들어 염색된 미소구체에 결합될 수 있다면 어떠한 리간드라도 반-정량적 경우까지도 포함한 많은 경우에 정성적으로 시험될 수 있다. 예를 들면, 혈청 내 유리 및 전체 전립선 특이 항원(free and total prostate specific antigen) 검출용 1단계 측방유동 면역스트립이 페르난데즈-산체즈 외(J. Immuno. Methods, 2005, 307(1-2):1-12, 여기에 병합참조되어 있음)에 기술되어 있으며, 혈액이나 뇨 등의 생물학적 샘플 내에서 Bcl-2를 검출하기 위해서 채용될 수도 있다.
현재 시판중인 보다 상용화된 면역크로마토그래피 검정법들 중 일부가 임신 (처방전 없이 살 수 있는 테스트 키트(over-the-counter(OTC) test kit), 인후염, 클라미디아(Chlamydia) 테스트용이다. 주지의 항원들에 대한 많은 새로운 실험이 최근에 면역크로마토그래피 검정방법을 이용하여 개발되었다. 예를 들면, 원외폐렴(community acquired pneumonia)의 가장 일반적인 원인에 대한 항원이 1917년 이후 알려져 왔으나, 간단한 실험은 최근에서야 개발되었으며, 이 간단한 실험 스트립 기술을 이용하여 수행되었다. (Murdoch, D.R. 외, J Clin Microbiol, 2001, 39:3495-3498). 인간 면역결핍 바이러스(HIV)가 혼주 혈(pooled blood)에서 유사한 방법을 사용하여 신속하게 검출되었다(Soroka, S.D. 외, J Clin Virol , 2003, 27:90-96). 니트로셀룰로오스 막 카드 또한 탄소 나노입자들의 이동 및 결합을 감지하는 것에 의한 주혈흡충증(schistosomiasis) 진단에 사용되었다(van Dam, G.J.외, J Clin Mirobiol , 2004, 42:5458-5461).
상기 면역크로마토그래피 검정에 대한 두 가지 일반적인 접근법은 비경쟁적 (또는 직접적) 및 경쟁적 (또는 경쟁적 억제) 반응 기작 (TechNote #303, Rev. #001, 1999, Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN)이다. 직접적 (더블 항체 샌드위치) 포맷은 황체 호르몬(LH), 인간 성선자극호르몬(hCG), HIV와 같은 복합 항원 부위를 지닌 큰 분석물들을 실험할 때 이용되는 것이 일반적이다. 이러한 예시에서는, 잉여 샘플 분석물보다 작아서, 일부 미소 구체들이 포획 라인에서 포획되지 않고, 고정 항체들의 이차 라인인, 컨트롤 존으로 계속 유동하는 것이 바람직하다. 상기 컨트롤 라인은 미소 구체들 상에서 컨쥬게이트 항체들에 특이적인, 종 특이성 항-면역글로불린 항체들을 이용한다. 만약 존재한다면, 유리 항원이 샘플 추가 패드 상으로의 샘플(뇨, 혈청 등) 첨가에 의해 장치에 도입된다. 이후 유리 항원은 항체-미소구체 복합체에 결합한다. 샘플 항원의 에피토프 1에 특이적인 항체 1이 염색 미소구체들에 결합되고 상기 장치 위에서 건조된다. 샘플이 첨가되면, 미소구체-항체 복합체는 재 수화되고, 유체에 의해 포획 존과 컨트롤 라인으로 옮겨진다. 샘플 항원의 이차 항원 부위 (에프토프 2)에 특이적인 항체 2가 상기 포획 라인 막에서 건조된다. 종 특이적인 항체 3, 즉 항체 1과 반응할 항-면역글로불린 항체가 상기 포획 라인 막에서 건조된다. 만약 항원이 상기 샘플 내에 존재한다면 (즉, 양성 테스트), 두 개의 항원 부위에 의해 항체 1 (미소구체에 접합되어 있음)과 항체 2 (포획 라인 막에서 건조됨) 모두에 결합할 것이다. 항원 존재여부와 관계없이, 항체 1-코팅 미소구체들이 항체 3에 의해 상기 포획 라인에서 결합된다. 항원이 상기 샘플 내에 존재하지 않는다면 (즉, 음성 테스트), 미소구체들은 포획되지 않은 채로 상기 포획 라인을 통과하고, 상기 컨트롤 라인에 잡히게 된다.
경쟁적 반응 기작은, 두 개의 항체에 동시에 결합할 수 없는 단일 항원 결정기들을 지닌 소형 분자들을 테스트할 때 통상적으로 이용된다. 더블 항체 샌드위치 분석에서와 같이, 유리 항원이 존재한다면 그것은 샘플 패드로의 샘플 첨가에 의해 장치에 도입된다. 상기 샘플에 존재하는 유리 항원은 항체-미소구체 복합체에 결합하게 된다. 항체 1은 샘플 항원에 특이적이고 염색된 미소구체들에 결합된다. 항원-캐리어 분자 (BSA) 접합체가 포획 라인 막 위에서 건조된다. 항체 2 (Ab2)은 상기 포획 라인 막 위에서 건조되고, 시약 입자들을 포획하고 테스트가 완료되었음을 확인하는 종 특이적 항-면역글로불린이다. 만약 항원이 샘플 내에 존재한다면 (양성 테스트), 미소구체들 상의 항체(Ab1)은 이미 샘플로부터의 항원으로 포화되고, 따라서 상기 포획 라인에 결합된 항원 접합체는 그것에 결합하지 않게 된다. 항원 캐리어 분자에 의해 포획되지 않은 어떠한 미소구체들도 Ab2에 의해 컨트롤 라인에서 포획될 수 있다. 만약 샘플 내에 항원이 존재하지 않는다면 (음성 테스트), 항체-코팅 염색된 미소구체들은 상기 포획 라인에 결합된 항원 접합체에 의해 포획될 수가 있게 된다.
보통, 이들 장치 상에 자리잡고 있는 항체들을 보유하는 데에 사용되는 막들은 일차 소수성 재료로 만들어지는데, 니트로셀룰로오스 등이 있다. 상기 고체 지지체로 사용되는 미소구체들 및 컨쥬게이트 항체들은 모두 소수성이며, 상기 막과의 상호작용은 상기 막 위에서 효율적으로 건조되도록 하여 준다.
샘플 및/또는 Bcl-2-특이성 결합제들이 상기 고체 지지체 상에 배열되거나, 다중 검출이나 분석 목적으로는 복합 지지체들이 사용될 수 있다. "배열하는 것"은 라이브러리(예, 상이한 샘플들의 배열 또는 동일하거나 상이한 표적 분자들을 표적하는 장치들의 배열), 또는 기타 집합체들의 구성요소들을 논리적 또는 물리적 배열로 조직화하거나 배치하는 행위를 의미한다. 따라서, "배열"은 생물학적 샘플 등의 물리적 또는 논리적 배치를 의미한다. 물리적 배열은 관련 요소들의 물리적 발현형태들이 정렬된 방식으로 배열되어 복합 스크리닝될 수 있는 어떠한 "공간상의 포맷" 또는 물리적 격자 포맷"도 가능하다. 예를 들면, 샘플 라이브러리의 개별 또는 혼주 요소들에 대응하는 샘플들이 일련의 숫자화된 열과 행, 예를 들면 멀티-웰 플레이트로 배열될 수 있다. 유사하게, 결합제들이 미량역가판, 예를 들어 96-웰, 384-웰, 1536-웰 판(또는 트레이)에 플레이트되거나 보유될 수 있다. 선택적으로, Bcl-2-특이성 결합제들은 상기 고체 지지체 상에 고정될 수도 있다.
Bcl-2와 암 생물표지자들의 검출, 및 샘플에 수행되어야 할 기타 검정들이 다른 표적 분자들의 검출과 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있으며, 자동화된 방식으로 높은 작업처리량 포맷으로 수행될 수도 있다.
상기 Bcl-2-특이성 결합제들은 보유되지만 상기 접합체(컨쥬게이트) 존에 "유리"(비고정 상태)될 수도 있고, 고체 지지체의 포획 존에서 고정될 수 있다. 상기 Bcl-2-특이성 결합제들은 상기 지지체 상에서 비 특이적 흡수에 의해 고정될 수도 있고, 또는 예를 들어 공유결합에 의해 상기 지지체에 고정될 수도 있다. 지지체 상에 결합제들을 고정하는 기술들은 업계에 알려져 있으며, 미국특허 제4,399,217, 4,381,291, 4,357,311, 4,343,312, 및 4,260,678호에 예시적으로 기재되어 있으며, 이들은 여기에 병합참조되어 있다. 이들 기술들은 본 발명에서 상기 결합제들을 고정화하는 데에 이용될 수 있다. 상기 고체 지지체가 폴리테트라플루오로에틸렌이면, 이를 아민화하기 위해 나트륨과 암모니아를 사용해서 상기 지지체를 활성화시키고, 카르보디이미드 반응을 이용해서 항체를 활성화된 지지체에 공유결합시킴으로써 호르몬 항체들을 상기 지지체 상에 결합시키는 것이 가능하다 (yon Klitzing, Schultek, Strasburger, Fricke and Wood in "Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine 1982", International Atomic Energy Agency, Vienna (1982), 57-62면).
본 발명에 따른 진단 장치는 측방유동스트립(LFS, lateral flow strip) 기술을 활용할 수 있는데, 이는 사람융모성 성선자극호르몬(hCG)에 대한 항체를 기반으로 한 비-처방전 조기 임신 테스트 스트립과 같은 수많은 신속한 스트립 분석 시스템에 적용되어 왔다. 많은 기타 진단 장치들에서와 같이, 상기 장치는 표적 분자(Bcl-2)를 결합하기 위한 결합제를 이용한다. 상기 장치는 혈액 또는 뇨와 같은 생물학적 샘플을 주입받기 위한 어플리케이션 존, 샘플 내의 Bcl-2에 결합하는 라벨을 포함하는 라벨링 존, 및 Bcl-2 라벨을 보유하는 디텍션 존을 가진다.
상기 디텍션 존에 보유된 결합제는 신호를 보내고, 상기 신호는 생물학적 샘플 내의 Bcl-2 수치가 주어진 역치 농도보다 낮은지, 동일한지, 높은지에 따라 상이하다. 예를 들어, 난소암 발견을 위한 뇨 Bcl-2의 경우에, 상기 역치 농도는 0 ng/ml과 2.0 ng/ml 사이일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 난소암 발견을 위한 뇨 Bcl-2의 경우에, 상기 역치 농도는 1.8 ng/ml이다. 주어진 표준 Bcl-2 농도와 동일하거나 높은 Bcl-2 수치를 갖는 숙주로부터의 샘플은 "역치값", "역치량", 또는 "역치 샘플"로 표현될 수 있다. 상기 장치 내 어플리케이션 존은 분석대상 생물학적 샘플을 주입받기에 적합하다. 그것은 통상적으로 압지(blotting paper) 같은 흡착 물질로 형성된다. 상기 라벨링 존은 샘플 내 어떠한 Bcl-2에도 결합하는 결합제를 포함한다. 일실시예에서, 상기 결합제는 항체 (예, 단일클론 항체, 다클론 항체, 항체 조각)이다. 검출의 편의를 위해, 상기 결합제는 바람직하게 육안으로 식별가능한 신호를 제공하는 라벨과 연결되어 있다, 예를 들면 형광 태그나, 핑크색으로 식별가능한 접합 콜로이드 금과 같은 유색 태크로 태그되어 있다.
상기 디텍션 존은 상기 결합제가 결합되어 있는 Bcl-2를 보유한다. 이것은 통상적으로 고정된 항체 같은 고정된 결합제를 사용하여 수행된다. 상기 라벨링 존과 디텍션 존 내부 결합제가 모두 항체인 경우에는, 일반적으로 상기 표적 분자 (Bcl-2 단백질)에 대한 상이한 에피토프들을 인식하게 될 것이다. 이는 항체-Bcl-2-항체를 포함하는 "샌드위치" 형태를 형성하게 될 것이다.
상기 디텍션 존은 상기 어플리케이션 존의 하방에 있으며, 상기 라벨링 존은 일반적으로 그 둘 사이에 위치한다. 샘플은 따라서 상기 어플리케이션 존으로부터 상기 라벨링 존으로 유입되고, 거기서 샘플 내 어떤 것이든지 상기 라벨에 결합하게 된다. Bcl-2-결합제 복합체는 계속해서 잉여 결합제와 함께 상기 디텍션 존으로 유입된다. 상기 Bcl-2-결합제 복합체가 포획제를 만나게 되면, 상기 복합체가 상기 샘플 내에 보유되고, 잉여 결합제는 계속해서 내보내진다. 상기 샘플 내 Bcl-2 수치가 증가함에 따라, 상기 디텍션 존에 보유된 결합제 양 (Bcl-2-결합제 복합체 형태)이 비례해서 증가한다.
바람직한 실시예들에서, 본 발명의 장치는 상기 역치 농도에 따른 샘플들 간을 구분하는 능력을 갖는다. 이는 다양한 방식으로 이루어질 수 있다.
하나의 유형의 장치에는 상기 디텍션 존에 보유된 결합제 양이 비교될 수 있는, 고정된 강도의 신호를 포함하는 표준 존(reference zone)이 포함되는바, 상기 디텍션 존 내부 신호가 상기 표준 존 내부 신호와 동일할 때, 상기 샘플이 역치 샘플이 되고; 상기 디텍션 존 내부 신호가 상기 표준 존 내부 신호보다 작을 때에는, 상기 샘플이 역치 샘플보다 적은 Bcl-2를 포함하게 되고; 상기 디텍션 존 내부 신호가 상기 표준 존 내부 신호보다 클 때에는, 상기 샘플이 역치 샘플보다 많은 Bcl-2를 포함하게 된다.
적절한 표준 존이 준비되고, 어려움없이 조정될 수 있다. 이러한 유형의 장치에 있어서는, 상기 결합제가 샘플 내 Bcl-2에 초과 존재하게 되는 것이 일반적일 것이며, 상기 표준 존은 상기 디텍션 존의 상방 또는 바람직하게는 하방에 위치할 수 있다. 상기 표준 존 내부 신호는 상기 디텍션 존 내부 신호와 동일한 종류일 것이다, 즉 육안으로 식별가능한 것으로, 예를 들면 동일한 태크를 사용할 것이다. 바람직한 종류의 장치 내 표준 존은 콜로이드 금으로 태그되어 있는 고정된 단백질 (예, 소 혈청 알부민)을 포함한다.
본 발명의 또 다른 장치에서, 상기 표준 존은 상기 디텍션 존의 하방에 있고, 결합제를 포획하는 시약(예, 고정된 안티-결합제 항체)을 포함한다. 상기 장치를 통해 유동하는 결합제는 초과 존재하지 않으나, 일정 농도로 존재하여 그 중 50%가 역치 농도에서 Bcl-2를 갖는 샘플에 의해 결합된다. 따라서 역치 샘플에서는, 상기 결합제의 50%가 상기 디텍션 존 내에 보유되고, 50%가 상기 표준 존 내에 보유될 것이다. 만약 상기 샘플 내 Bcl-2 수치가 역치 샘플보다 많으면, 상기 결합제의 50% 미만이 상기 표준 존에 도달하고 상기 디텍션 존이 상기 표준 존보다 큰 강도의 신호를 내보낼 것이다; 역으로, 만약 상기 샘플 내 Bcl-2 수치가 역치 샘플보다 적으면, 상기 결합제의 50% 미만이 상기 디텍션 존에 보유되고, 상기 표준 존이 상기 디텍션 존보다 큰 강도의 신호를 내보낼 것이다.
유사한 원리에 따라 작동하는 본 발명의 또 다른 장치에서, 상기 표준 존은 상기 디텍션 존의 하방에 존재하고, 결합제를 포획하는 제한된 양의 시약(예, 고정된 안티-결합제 항체)을 포함한다. 상기 시약은 일정 수준으로 존재하여, 그것이 역치 샘플에 대해 상기 디텍션 존에 결합하게 되는 동일한 양의 라벨을 보유하면서, 초과 라벨은 계속해서 상기 표준 존을 넘어서 방출된다.
이들 세 가지 유형의 장치에 있어서, 따라서 상기 디텍션 존과 상기 표준 존 사이를 비교하는 것이 상기 역치 농도와 상기 샘플을 비교하는 데에 사용된다. 상기 디텍션:표준 결합비는 바람직하게 육안으로 결정될 수 있다. 상기 두 존에서의 신호 강도를 육안 대조하기 위해서는 상기 디텍션 및 표준 존의 근접 병치가 바람직하다.
네번째 유형의 장치에서는 아무런 표준 존이 필요하지 않으나, 상기 디텍션 존이 필수적으로 온/오프 반응, 예를 들어 역치 농도 미만에서는 신호가 주어지지 않지만, 역치 또는 그 이상에서는 신호가 주어지는 반응을 제공하는 구조이다.
다섯번째 유형의 장치에서는, 아무런 표준 존이 필요하지 않으나, 상기 역치 농도에 상응하는 외부 표준이 사용된다. 이는 다양한 형태, 예를 들면 상기 디텍션 존 내부 신호가 비교될 수 있도록 인쇄된 카드, 또는 기계에 저장된 표준값에 대하여 상기 디텍션 존에서 측정된 전체 값을 비교하는 기계 리더 (예, 칼로리미터 신호)를 가질 수 있다.
본 발명의 일부 실시예들에서, 상기 장치는 상기 디텍션 존의 하방으로 컨트롤 존을 포함한다. 이는 일반적으로 상기 디텍션 및/또는 표준 존들을 통과하는 잉여 결합제를 포획하는 데에 사용된다(예, 고정된 안티-결합제 항체를 사용). 결합제가 상기 컨트롤 존에 보유될 때, 상기 결합제의 이동성과 상기 장치를 통한 방출이 일어나게 됨을 확인한다. 이러한 작용은 상기 표준 존에 의해 수행될 수도 있다고 이해해야 할 것이다.
바람직한 실시예에서, 상기 디텍션, 표준, 컨트롤 존은 바람직하게 니트로셀룰로오스 지지체 상에 형성된다.
상기 어플리케이션 존으로부터 상기 디텍션 존으로의 이동은 상기 디텍션 존의 하방에 있으면서 모세관 이동을 보조하는 윅(wick)에 의해 보조되는 것이 일반적이다. 상기 윅은 일반적으로 흡묵지 또는 크로마토그래피 용지와 같은 흡착성 물질로 형성된다.
본 발명의 장치는 간단하고 저렴하고, 딥스틱 형태로 간현하게 생산 가능하다. 아울러 사용방법 또한 매우 간편한데, 예를 들어 가정 사용자에 의해 간편하게 사용될 수 있다. 본 발명은 따라서 가정에서 난소암 등의 암을 스크린하기 위해 사용될 수 있는 장치를 제공한다.
부인암을 진단하거나 모니터하기 위한 키트
한 측면에서, 본 발명은 암을 진단하거나 모니터하기 위해 필요한 요소들을 포함하는 키트들을 포함한다. 바람직하게, 상기 키트들은 환자로부터 생물학적 유체를 수집하기 위한 용기 및 상기 유체 내 Bcl-2 또는 그것의 암호화 핵산의 존재를 검출하기 위한 시약을 포함한다. 상기 키트들의 부품들은 수용성 매체 또는 동결건조 형태로 포장될 수 있다.
본 발명의 방법들은 정성적 또는 정량적으로 혈액 또는 뇨 등의 샘플 내 Bcl-2를 검출하기 위한 진단 키트를 사용하여 수행될 수 있다. 예시에 의하면, 상기 키트는 Bcl-2에 특이적인 결합제들(예, 항체들), 효소로 표지된 항체들에 대항한 항체들; 상기 효소에 대한 기질을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 미량역가 멀티-웰 판 등의 고체 지지체, 표준체, 실험 희석제, 세정 완충액, 부착판 커버, 및/또는 키트를 사용하여 본 발명 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 키트는 분석대상 생물학적 샘플(혈액 또는 뇨 등)에 적용가능한 하나 또는 프로테아제 억제자들 (예, 프로테아제 억제자 칵테일)을 포함한다.
상기 Bcl-2 단백질, 예를 들면 이들에만 제한되는 것은 아니지만 Bcl-2 항체들, 그 조각들, 또는 Bcl-2 결합 파트너들을 검출하는 하나 이상의 제제들을 포함하는 부인암 진단 또는 모니터용 키트들이 제조될 수 있다. 상기 제제(들)는 환자로부터 생물학적 유체를 수집하기 위한 용기로 포장될 수 있다. 상기 항체들 또는 결합 파트너가 상기 키트 내에서 방사성 금속 이온 또는 물질 등의 라벨이 부착되는 컨쥬게이트(접합체) 형태로 사용될 때, 상기 컨쥬게이트들의 요소들은 키트 사용자에 의해서 완전히 접합된 형태로 공급될 수도 있고, 중간 접합 또는 접합될 개별 물질 형태로 공급될 수도 있다.
이들에만 제한되는 것은 아니지만 전체 길이 Bcl-2 핵산, Bcl-2 올리고뉴클레오티드, 및 Bcl-2 프라이머들 쌍과 단은 Bcl-2 핵산을 검출하는 하나 이상의 제제를 포함하는 키트들이 또한 제조될 수 있다. 상기 제제(들)는 환자로부터 생물학적 샘플들을 수집하기 위한 용기로 포장될 수 있다. 상기 핵산은 표지된 형태 또는 표지될 형태로 공급될 수 있다.
키트의 다른 부품들에는 이들에만 제한되는 아니지만 생물학적 샘플을 수집하기 위한 수단, 검출 제제(결합제)를 표지하기 위한 수단, 상기 샘플 내 Bcl-2 단백질 또는 Bcl-2 핵산을 고정화하기 위한 막, 상기 생물학적 샘플을 막에 적용하기 위한 수단, 상기 제제를 숙주의 생물학적 샘플 내 Bcl-2에 결합하기 위한 수단, 이차 항체, 전체 RNA를 숙주의 생물학적 유체에서 분리하기 위한 수단, 겔 전기영동을 수행하기 위한 수단, cDNA를 분리된 전체 RNA로부터 생성하기 위한 수단, 혼성화법을 수행하기 위한 수단, 및 PCR을 수행하기 위한 수단 등을 포함한다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "ELISA"는 샘플 내에 존재하는 항원 (예, Bcl-2) 또는 항체의 양을 검출하고 정량하기 위해 고체상에 결합된 항체나 항원 및 효소-항원 또는 효소-항체 접합체를 이용하는 효소-결합 면역흡착법을 포함한다. 상기 ELISA 기술에 대한 설명은 기초 및 임상 면역학(Basic and Clinical Immunology by D.P. Sites 외, 1982, Lange Medical Publications of Los Altos, Calif. 출간) 제4판 제22장 및 미국특허 3,654,090; 3,850,752; 및 4,016,043에 기재되어 있으며, 이들은 여기에 병합참조되어 있다. ELISA는 샘플 내 항원, 단백질, 또는 관심있는 기타 분자들을 정량하는 데에 사용될 수 있는 분석법이다. 특히, ELISA는 고체 지지체(예, 폴리비닐클로라이드) 상에 관심 항원이나 단백질에 특이적인 항체를 부착시킴으로써 수행될 수 있다. 세포 추출물 또는 뇨 등의 관심대상 기타 샘플이 항체-항원 복합체를 형성하기 위해 첨가될 수 있고, 초과, 결합되지 않은 샘플은 세척되어 버려진다. 항원 상의 상이한 부위에 특이적인 효소-결합 항체가 첨가된다. 상기 지지체는 결합되지 않은 효소-결합 이차 항체를 제거하기 위해 세척된다. 상기 효소-결합 항체는 이에만 한정적이지는 않지만 알칼라인 포스파타아제를 포함할 수 있다. 상기 이차 항체 상의 효소는 첨가된 무색 기질을 유색 산물로 전환시킬 수 있거나 비-형광 기질을 형광 산물로 전환시킬 수 있다. 여기서 제공된 ELISA-기반 분석법은 단일 챔버 내에서 수행될 수 있거나 챔버들의 배열 형태에서 수행될 수도 있고, 자동화 공정에 채택될 수도 있다.
이들 실시예들에서, 상기 항체들은 FRET 다이(dye) 쌍, 생체발광 공명에너지전달(BRET, bioluminiscence resonance energy transfer) 단백질, 형광 다이-형광약화 다이 조립체, 베타 갈 상호작용 검출 단백질 조각들로 라벨될 수 있다. 상기 항체들이 예를 들면 형광, 비색 또는 강화된 화학발광(ECL) 신호를 생성하기 위해 FRET, BRET, 형광 약화 또는 베타-갈 상호작용에 참여할 수도 있다.
이들 방법들은 규칙적으로 항원-특이성 항체 반응의 검출에 이용되고, Ivan Roitt, Jonathan Brostoff, David Male에 의한 '면역학'(London: Mosby, c1998. 5th ed. and Immunobiology: Immune System in Health and Disease/Charles A. Janeway and Paul Travers. Oxford: Blackwell Sci. Pub., 1994) 등의 일반 면역학 교재에서 잘 설명되어 있으며, 그 내용들은 여기에 병합참조된다.
정의
여기서 사용되는 바와 같이, 용어 "암" 및 "암성의"는 비정상적 세포 성장, 즉 증식성 질환으로 특징되는 포유류의 생리학적 상태를 의미한다. 그러한 증식성 질환들의 예에는 여기에 열거된 다른 암들을 포함하여 상피세포암, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 같은 암들이 해당된다. 그러한 암들의 보다 상세한 예에는 유방암, 전립선암, 결장암, 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위장암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 복막암, 간암 (예, 간암(hepatic cancer), 방광암, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 및 갑상선 암이 포함된다.
암의 기타 비제한적 예에는 기저세포암종, 담도암; 골 암; 뇌 및 CNA 암; 융모막암종; 결합조직 암; 식도암; 안암; 두경부암; 위암(gastric cancer); 상피내암; 후두암; 호드킨 및 비-호드킨 림프종을 포함한 림프종; 흑색종; 골수종; 신경모세포종; 구강암 (예, 입술, 혀, 구강, 및 인두); 십이지장암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡기 암; 피부암; 위암(stomach cancer); 고환암; 자궁암; 비뇨기 암; 및 기타 암종 및 육종을 포함한다. 암 종류들의 예가 표 1에 나열되어 있다.
암 종류의 예
급성 림프모구성 백혈병,성인 부비동 및 비강암
급성 림프모구성 백혈병,아동 부갑상샘암
급성 골수성 백혈병,성인 음경암
급성 골수성 백혈병,아동 크롬친화세포종
부신겉질암종 솔방울샘모세포종과 천막위출혈
부신겉질암종, 아동 원시신경외배엽종양, 아동
에이즈 관련 암 뇌하수체암
에이즈 관련 림프종 형질세포신생물/ 다발골수종
항문암 흉막폐 모세포종
별아교세포종, 아동 소뇌 임신 및 유방암
별아교세포종, 아동 대뇌 임신 및 호지킨 림프종
바닥세포암종, 기저세포암종 임신 및 비호지킨 림프종
간외 쓸개관암, 간외담관암 원발 중추신경계 림프종
방광암 전립샘암
방광암, 아동 직장암
골암, 뼈육종/악성 섬유 콩팥세포(신장) 암
조직구종 콩팥세포(신장) 암, 아동
뇌줄기신경아교종, 아동 신우와 요관, 이행세포암
뇌종양, 성인 망막모세포종
뇌종양, 뇌줄기신경아교종, 아동 횡문근육종, 아동
뇌종양, 아동 소뇌 침샘암
별아교세포종, 아동 침샘암, 아동
뇌종양. 아동 대뇌 육종, 어윙 종양 군
별아교세포종/악성 신경아교종, 아동 카포시육종
뇌종양, 상의세포종. 뇌실막세포종, 아동 육종, 연조직, 성인
뇌종양, 속질모세포종, 아동 육종, 연조직, 아동
천막상의 뇌종양 육종, 자궁
원시신경외배엽종양, 아동 세자리 증후군
뇌종양, 시각경로와 시상하부 신경아교종, 아동 피부암 (비흑색종)
뇌종양, 아동 피부암, 아동
유방암 폐암, 소세포
우방암, 아동 림프종, 에이즈관련
유방암, 남성 림프종, 버키트
기관지 / , 아동 피부 T 세포림프종,
버키트 림프종 균상식육종 및 세자리증후군
카르시노이드종양, 아동 림프종, 호지킨, 성인
카르시노이드종양, 위장의 림프종, 호지킨, 아동
불명 원발성의 카르노시노이드 종양 림프종, 호키진, 임신중
중추신경계 털세포백혈병
림프종, 원발성 두경부 암
소뇌별아교세포종, 아동 간세포성 (간)암, 성인 (원발성)
대뇌별아교세포종/악성 간세포성 (간)암, 아동 (원발성)
신경아교종, 아동 호지킨림프종, 성인
자궁경부암 호지킨림프종, 아동
소아암 임신 중 호지킨림프종
만성 림프종 백혈병 시상하부와 시각경로 신경아교종, 아동
만성 골수성 백혈병 안내 흑색종, 멜라닌종
만성 골수증식 섬세포암종 (내분비 췌장)
장애 카포시육종
결장암 신장 (콩팥 세포) 암
결장직장암, 아동 신장암, 아동
피부 T 세포림프종, see 후두암
균상식육종 및 세자리 증후군 후두암, 아동
자궁내막암 백혈병, 급성 림프성, 성인
뇌실막세포종, 아동 백혈병, 급성 림프성, 아동
식도암 밸혈병, 급성 골수성, 성인
식도암, 아동 백혈병, 급성 골수성, 아동
어윙 종양 군 백혈병, 만성 림프성
두개외 생식세포종, 아동 백혈병, 만성 골수성
두개외 생식세포종 백혈병, 털세포
간외 쓸개관암 구순 및 구강암
안구암, 눈속 멜라닌종 간암, 성인 (원발성)
안구암, 망막모세포종 간암, 아동 (원발성)
쓸개암 폐암, 대세포
위(위)암 대세포폐암
위(위)암, 아동 구강암, 아동
위장의 카르시노이드종양 구강암, 입술 및 구인두암
배세포종양, 두개외, 아동 뼈육종, 악성섬유
배세포종양, 두개외 뼈 조직구종
배세포종양, 난소 난소암, 아동
임신성 융모성 종양 난소상피암
신경아교종, 성인 난소 생식세포종
신경아교종, 아동뇌줄기 저악성 가능성 난소종양
신경아교종, 아동대뇌 췌장암
별아교세포종 발덴스트롬 마크로글로불린혈증
신경아교종, 아동 시각경로 및 시상하부 뼈/뼈육종의 악성섬유조직구종
피부암 (흑색종) 속질모세포종, 아동
피부암종, 메르켈세포 멜라닌종
소세포폐암 멜라닌종, 안내(눈)
소장암 메르켈세포 암(종)
연조직육종, 성인 중피종, 성인 악성
연조직육종, 아동 중피종, 아동
편평세포암종, see 피부 잠재 원발성 전이 편평 경부암
암(비흑색종) 복합내분비샘신생물 증후군, 아동
잠재 원발성 전이 편평경부암 다발골수종 및 형실세포종양
위(위)암 균상식육종
위(위)암, 아동 골수형성이상증후군
천막상의 원시 신경외배엽종양, 아동 골수형성이상/ 골수증식성 질환
T세포림프종, 피부의 see 골수백혈병, 만성의
균상식육종 및 세자리 증후군 골수성 백혈병, 성인 급성
고환암 골수성 백펼병, 아동 급성
가슴샘종암, 아동 다발골수종
가슴생종 및 흉선암종 골수증식질환, 만성
갑상샘암 비강 및 부비동암
갑상샘암, 아동 코인두암
신우 및 요관의 이행세포암 코인두암, 아동
영양막종양, 임신 신경모세포종
불명 원발부위, 암종, 성인 비호지킨림프종, 성인
불명 원발부위, 암종, 아동 비호지킨림프종, 아동
소아비정상암 비호지킨림프종, 임신중의
요관 및 신우, 이행세포암 림프종, 원발성 중추신경계
요도암
자궁내막암
자궁육종
질암
시각경로와 시상하부 신경아교종, 아동
외음부암
췌장암, 아동
췌장암, 섬세포
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "종양"은 악성 또는 양성, 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직들을 포함하여 모든 종양 세포 성장 및 증식을 의미한다. 예를 들면, 특정한 하나의 암은 고형 종양(solid mass tumor)으로 특징지어질 수 있다. 상기 고형 종양은 존재시 일차 종양이 될 수 있다. 일차 종양은 조직 내 일반 세포의 변형의 결과물인 조직 내 암 세포들의 성장을 의미한다. 다수의 경우에, 상기 일차 종양은 낭종의 존재에 의해 인식되며, 그것은 육안 또는 촉진 기법들을 통해 발견 가능하거나, 상기 조직의 형태, 재질 또는 중량에 있어서의 불규칙성에 의해 발견 가능하다. 하지만, 일부 일차 종양들은 촉진이 불가능하고, 단지 X-레이 (예, 유방조영술), 초음파, CT, MRI 등의 의료 영상기술, 또는 침습으로만 감지될 수 있다. 상기 후자 기술들의 사용이 초기 발견에서 더욱 일반적이다. 조직 내 암 세포들의 분자 및 염색체 분석은 보통 암이 상기 조직 내재성인지 또는 병변이 다른 부위로부터의 전이 때문인지 확인하게 될 것이다.
"샘플" (생물학적 샘플)은 사람 또는 사람이 아닌 숙주로부터의 관심있는 물질의 어떠한 물리적 상태 (예, 고체, 액체, 반-고체, 기체) 및 그 조합형태의 조성물일 수 있다. 상기 샘플은 본 발명의 방법들, 장치들, 및 키트들에 의해 분석 가능한 Bcl-2를 포함하는 것으로 논리적으로 의심되는 조성물일 수 있다. 바람직하게, 상기 샘플은 유체 (생물학적 유체)일 수 있다. 샘플들은 사람이나 동물 샘플이 포함된다. 상기 샘플은 테스트 튜브, 배양용기, 멀티-웰 플레이트, 또는 기타 용기 또는 지지용 기질 안에 저장될 수도 있다. 상기 샘플은 예를 들면 세포 배양, 사람이나 동물 조직일 수 있다. 세포 조직들의 유체 균질물들은 본 발명에 의한 검출 목적 Bcl-2를 함유할 수 있는 생물학적 유체들이다.
샘플의 "복합성"은 상기 샘플 내에 존재하는 상이한 분자 물질들의 상대적 숫자를 의미한다.
용어 "체액" 및 "신체 분비액"는 여기서 사용된 바와 같이, 사람이나 동물 숙주로부터 습득된 조성물을 의미한다. 신체 분비액에는 이들에만 제한되는 것은 아니지만, 뇨, 전혈, 혈장, 혈청, 눈물, 정액, 타액, 가래, 배출된 호흡, 콧물, 인두삼출물(pharyngeal exudates), 기관지액(bronchoalveolar lavage), 기관흡인물(tracheal aspiration), 간질액, 림프액, 수막액, 양수, 샘액(glandular fluid), 분변, 땀, 점액, 질 또는 자궁 분비물, 경피액, 및 뇌척수액이 포함된다. 신체 분비액은 또한 전술한 액체들 전부 또는 분변, 조직, 생검 샘플 등과 같은 균질화된 고형물을 포함하는 혼합체들의 실험적으로 분리된 부분들을 포함한다.
용어 "체외"는 여기서 사용된 바와 같이, 숙주의 외부 환경을 의미한다. 따라서, 숙주에게서 수집한 신체 분비액의 샘플은 본 발명에서 의도되는 바와 같이 신체 분비액의 체외 샘플이 된다. 본 발명의 방법 및 장치 중 내재 실시예들은 체내에서 샘플을 습득한다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "컨쥬게이트(접합체)"는 서로 결합되었거나 선택적으로 결합기를 통해 결합되어 단일 구조를 형성하는 둘 이상의 분자를 포함하는 물질을 의미한다. 결합은 분자들 간의 직접 연결 (예, 화학결합) 또는 연결기 사용에 의해 형성될 수 있다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 고체 "지지체", "기질", 및 "표면"은 다공질 또는 비-다공질의, 스트립, 막대(rod), 입자, 비드, 또는 다중-웰 플레이트 등 많은 형상을 지닌 불수용성 물질인 고체 상을 의미한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 지지체는 바람직하게는 미량역가 트레이 등 유기 매트릭스로 작용하는 고정된 유기 지지 매트릭스를 갖는다. 고체 지지체 재료에는 이들에만 한정되는 것은 아니지만, 셀룰로오스, 세파덱스 등의 폴리사카라이드, 유리, 폴리아크릴로일모르포라이드, 실리카, 다공성 유리구슬(CPG), 폴리스티렌, 폴리스티렌/라텍스, 초고분자량 폴리에틸렌(UPE) 등의 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리비닐리딘 플루오라이드(PVDF), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE; TEFLON), 카르복실 변형 테프론, 나일론, 니트로셀룰로오스, 및 금, 플래티넘, 팔라듐 등의 금속 및 합금이 포함된다. 상기 고체 지지체는 생물학적, 비-생물학적, 유기, 무기, 또는 이들의 조합체일 수 있으며, 구체적인 용도에 따라 입자, 가닥, 침전물, 겔, 시트, 패드, 카드, 스트립, 딥스틱, 테스트 스트립, 튜브 구체, 용기, 모세관, 패드, 슬라이스, 필름, 플레이트, 슬라이드 등의 형태로 존재한다. 바람직하게는, 뇨, 전혈, 혈장, 혈청, 복막액, 복수 등의 생물학적 샘플과의 접촉을 향상하기 위해서 상기 고체 지지체는 평면 형태이다. 기타 적합한 고체 지지체 재료는 업계 기술자들에게는 명백할 것이다. 상기 고체 지지체는 필리포어 사(Millipore Corp. Bedford, MA)로부터 구득이 가능한 것들, 예를 들어 Hi-FlowTM 플러스 멤브레인 카드와 같은 지지조각(backing)(예, 폴리스티렌 또는 폴리에스테르 카드 지지조각)이 있거나 없는 막일 수도 있다. 상기 고체 지지체의 표면은 핵산, 단백질 등의 부착을 위해서 카르복실, 아미노, 히드록실, 티올 등의 반응기를 포함할 수도 있다. 상기 고체 지지체 상의 표면들은 때때로, 항상 그런 것은 아니지만, 상기 지지체와 같은 물질로 이루어질 수도 있다. 따라서, 상기 표면은 상당히 다양한 물질, 예를 들면 폴리머, 레진, 폴리사카라이드, 실리카 또는 실리카 계열 물질, 카본, 금속, 무기 유리, 막, 또는 상기 지지체 재료 중 어느 하나로 이루어질 수 있다 (예, 층 또는 코팅 형태).
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "라벨" 및 "태그"는 감지가능한 신호를 보낼 수 있는 물질을 의미하며, 이들에만 한정되는 것은 아니지만, 알칼라인 포스파타아제, 글루코오스-6-포스페이트 탈수소화효소, 및 당근과산화효소(HRP) 등의 효소, 리보자임, QB 복제효소와 같은 복제효소에 대한 기질, 프로모터, 다이(dye), 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민 화합물, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 및 플루오레스카민 등의 형광체, 이소루미놀 등의 화학발광체, 민감제, 코엔자임, 효소기질, 방사성 라벨, 라텍스 또는 탄소 입자 등의 입자, 리포좀, 세포 등이 포함되며, 이들은 다이, 촉매 또는 기타 감지가능 작용기로 더 표지화될 수도 있다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "수용체" 및 "수용체 단백질"은 Bcl-2 등의 다른 분자에 (또는 함께) 특이적으로 결합하는 생물학적으로 활성을 지닌 단백질성 분자를 인지하기 위해 여기에서 사용된다.
여기서 사용된 바와 같이, 용여 "리간드"는 특정 수용체 단백질과의 특이적 상호작용에 의해 결합되는 구조부를 포함하는 분자를 의미한다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자들과, 면역글로불린 분자들, 즉 항체 결합 부위 또는 파라토프를 함유하는 분자들의 면역학적으로 활성을 띤 부위 (조각)들을 의미한다. 상기 용어는 단일클론 항체와 다클론 항체를 포함한다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 물질"은 특정 항원과 면역반응을 할 수 있는 오직 한 종의 항체 결합부위를 포함하는 항체 분자를 의미한다. 단일클론 항체 물질은 따라서 일반적으로 면역반응하게 되는 어떠한 항원에 대해 단일한 결합 친화도를 나타낸다. 단일클론 항체 물질은 일반적으로 오직 한 종의 항체 분자를 배출(생산)하는 하이브리도마로 불리는 단일 세포의 클론들에 의해 생산된 항체들로 구성된다. 상기 하이브리도마 세포는 항체 생산 세포와 골수종이나 기타 자가-영구 세포주를 융합하는 것에 형성된다. 그런 항체들은 콜러와 밀스타인에 의해 Nature, 1975, 256:495-497에 처음 개시되었으며, 그 개시는 여기서 병합참조된다. 하나의 하이브리도마 기술 예가 니만 외에 의해, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 1983, 80:4949-4953에 개시되어 있다. 기타 단일클론 항체, 하이브리도마 세포, 또는 하이브리도마 세포배양을 생산하는 방법들이 또한 주지되어 있다. 예를 들면, Antibodies: A Laboratory Manual, 할로우 외, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; 또는 사사트리 외에 의해 Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 1989, 86:5728-5732; 휴즈 외, Science , 1981, 246:1275-1281에 개시된, 면역학적 레퍼토리로부터 단일클론 항체들을 분리하는 방법들을 참조한다. 상기 인용된 참조문헌들은 여기에 병합참조된다.
여기서 사용된 바와 같이, 반투과성 막은 액체에는 불투과성이고 기체들의 전달을 가능하게 할 수 있는 생적합성 물질을 의미한다. 상기 기체들에는, 이들에만 한정되는 것은 아니지만, 산소, 수증기, 및 이산화탄소가 포함된다. 반투과성 막은 유동 챔버강을 한정하는 막음재 중 최소한 일부분을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 상기 반투과성 막은 미생물 오염을 제거할 수 있도 있다 (예, 공(pore) 크기가 세포 등의 분석물을 오염시킬 수 있는 미생물의 경로를 없앨 수 있을 만큼 충분히 작다). 구체적 예에서, 반투과성 막은 세포 등의 분석물의 색, 성장, 크기, 형태, 영상 및 업계 주지의 기타 목적용의 관찰을 가능하게 하기 위해 충분한 최적의 투명도와 깨끗함을 가진다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "결합"은 영구적이거나 일시적일 수 있는 어떠한 물리적 부착이나 근접 연결을 의미한다. 상기 결합은 예를 들어 수소결합, 소수성 힘, 반데르발스 힘, 공유 또는 이온 결합의 결과이다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "입자"는 이에만 한정되는 것은 아니지만, 구형, 실 모양, 브러쉬 모양, 및 불규칙 형태를 포함한, 어떤 형태로든 불용성 물질을 포함한다. 입자들은 규칙적이거나 불규칙적 내부 채널을 가진 다공질일 수 있다. 입자들은 자성일 수 있다. 입자들의 예에는, 이들에만 한정되는 것은 아니지만, 실리카, 셀룰로오스, 세파로스 비드, 폴리스티렌 (고체, 다공질, 유동체형) 비드, 다공성 유리(CPG), 겔 비드, 자성 비드, 졸, 생물학적 세포, 하위세포성 입자, 미생물 (프로토조아, 박테리아, 효모, 바이러스, 및 기타 감염성 제제), 마이셀, 리포좀, 시클로덱스트린, 및 기타 불용성 물질들이 포함된다.
"암호화 서열" 또는 "암호화 부위"는 mRNA로 전사되고 또는 폴리펩티드로 번역되는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 예를 들면, 암호화 서열은 관심 있는 폴리펩티드를 암호화할 수도 있다. 상기 암호화 서열의 경계들은 5'-말단부에서 번역 개시코돈 및 3'-말단부에서 번역 종결코돈에 의해 결정된다. 암호화 서열에는 이들에만 한정되는 것은 아니지만, mRNA, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드 서열이 포함된다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 둘 이상의 아미노산의 수를 포함하는 폴리머를 의미하며, 여기에서는 용어 "단백질", "유전 산물", 및 "펩티드" 교차 사용된다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오시드"는 리보오스 또는 데옥시리보오스 당에 공유결합된 퓨린 또는 피리미딘 염기를 갖는 분자를 의미한다. 뉴클레오시드의 예에는 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 티미딘이 포함된다.
용어 "뉴클레오티드"는 상기 당에 에스테르 결합으로 연결된 하나 이상의 인산기를 갖는 뉴클레오시드를 의미한다. 뉴클레오티드의 예에는 뉴클레오시드 1인산, 2인산, 3인산이 포함된다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산 분자", 및 "뉴클레오티드 분자"는 여기서 교차 사용되며, 5'와 3' 탄소 원자 간에 인산디에스테르 결합에 의해 함께 연결된 뉴클레오티드 폴리머를 의미한다. 폴리뉴클레오티드들은 Bcl-2 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드를 암호화할 수 있으며 (발현되든 발현되지 않든), 또는 예를 들면 siRNA, 안티센스 핵산 (안티센스 올리고뉴클레오티드), 아프타머(aptamer), 리보자임 (촉매 RNA), 또는 삼중-형성 올리고뉴클레오티드 (즉, 항원)일 수도 있다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "RNA" 또는 "RNA 분자" 또는 "리보핵산 분자"는 일반적으로 리보뉴클레오티드 폴리머를 의미한다. 용어 "DNA", 또는 "DNA 분자", 또는 "데옥시리보핵산 분자"는 일반적으로 데옥시리보뉴클레오티드 폴리머를 의미한다. DNA와 RNA 분자들은 천연 합성될 수 있다 (예, DNA 복제 또는 DNA 전사에 의함). RNA 분자들은 후-전사적으로 변형될 수 있다. DNA와 RNA 분자들은 또한 화학 합성도 가능하다. DNA와 RNA 분자들은 단일 가닥 (즉, 각각 ssRNA, ssDNA) 또는 다중 가닥 (예, 이중 가닥, 즉, dsRNA, dsDNA)일 수 있다. 하지만, 본 발명의 사상에 기초하여, 용어 "RNA" 또는 "RNA 분자" 또는 "리보핵산 분자"은 또한 우선적으로 (즉, 80% 이상 또는 바람직하게는 90% 이상) 리보뉴클레오티드를 포함하지만, 선택적으로 최소한 하나의 비-리보뉴클레오티드 분자, 예를 들어 최소한 하나의 데옥시리뉴클레오티드 및/또는 최소한 하나의 뉴클레오티드 유사물질을 포함하는 폴리머를 의미한다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드 유사물질" 또는 "핵산 유사물질"은 또한 여기에서 변경된 뉴클레오티드/핵산 또는 변형된 뉴클레오티드/핵산으로도 언급되었는바, 비-가닥 뉴클레오티드를 의미하며, 천연발생적이 아닌 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드들을 포함한다. 바람직한 뉴클레오티드 유사물질들은 어떤 위치에서도 변형되어, 뉴클레오티드의 특정 화학 특성을 변경하는 반면 상기 뉴클레오티드 유사물질의 본연의 기능 수행 성능은 유지하도록 한다. 예를 들면, 잠금 핵산(LNA, locked nucleic acid)들은 상보적 DNA 또는 RNA에 대해 매우 높은 친화도와 우수한 특이성을 보유하는 뉴클레오티드 유사물질의 일종이다. LNA 올리고뉴클레오티드들은 안티센스 분자로서 실험실내 및 체내에서 사용되어 왔다 (Jepsen J.S. 외, Oligonucleotides, 2004, 14(2):130-146).
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "RNA 유사물질"은, 대응하는 비변경 또는 비변형 RNA와 비교시 최소한 하나의 변경 또는 변형 뉴클레오티드를 갖지만, 성질 또는 기능은 동일하거나 유사하게 보유하는 폴리뉴클레오티드 (예, 화학합성된 폴리뉴클레오티드)를 의미한다. 상술한 바와 같이, 상기 올리고뉴클레오티드들은, 인산디에스테르 결합을 가진 RNA 분자와 비교할 때, 더 낮은 RNA 유사물질 가수분해가 생기게 하는 결합들로 연결될 수도 있다. RNA 유사물질들의 예에는 당- 및/또는 골격- 변형 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드들이 있을 수 있다. 이와 같은 변경 또는 변형에는 상기 RNA의 말단이나 내부 등에 비-뉴클레오티드 물질이 첨가되는 경우 또한 해당될 수 있다(하나 이상의 RNA 뉴클레오티드에서).
용어 "포함하는", "이루어지는" 및 "필수적으로 구성되는"은 그들의 표준 의미에 따라 한정된다. 상기 용어들은 연관된 특정 의미를 표현하기 위해 본 출원 전반에 걸쳐서 달리 치환될 수도 있다.
용어 "분리된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 천연 상태에서 발견될 때 통상적으로 동반되는 물질들(요소들)로부터 상당부분 또는 완전히 유리된 물질을 의미한다.
본 설명에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나", "상기"는 본문에서 특별히 달리 지정하지 않는다면 다수의 그러한 것을 참조하는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어 "하나의 항체"에 대한 참조는 하나 이상의 그러한 항체를 포함하는 것이다. "하나의 분자"에 대한 참조는 하나 이상의 그러한 분자 등을 포함하는 것이다.
본 발명의 실제 실험은 달리 지정되지 않는 한, 업계 통상의 기술에 속하는 기존의 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 전기생리학, 및 약리학 기술들을 채용할 수 있다. 이러한 기술들은 문헌에서 완전하게 설명되어 있다(예, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover Ed. 1985); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan Eds., Academic Press, Inc.); Transcription and Translation (Hames 외, Eds. 1984); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller 외 Eds. 1987) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (2nd ed., Springer-Verlag); and PCR: A Practical Approach (McPherson 외 Eds. (1991) IRL Press), 이들 각각의 전문은 여기에 병합참조된다.
하기에 본 발명을 시험하기 위한 물질들, 방법들, 공정들을 나타내는 실시예들을 제공한다. 하기 실시예들은 이해를 돕기 위한 것으로, 구성을 한정하기 위한 것은 아니다.
도 1은 Bcl-2의 뇨 수치를 나타내는 히스토그램이다. Bcl-2의 뇨 수치는 정 상인 건강한 지원자들과 비교시 난소암 환자들에게서 더 높다. 뇨는 정상 건강한 지원자들과 난소암 환자들(조직적합적 하부유형 장액, 점액 포함) 및 복막액 암 환자들로부터 수집되었다. 장액 난소암들은 병기 1(장액 군에서 좌측부터 3개의 막대), 병기 2(장액 군에서 다음 8개 막대 (즉, 상기 장액 군의 좌측부터 막대 4-11), 병기 3(상기 장액 군의 우측부 11개 막대 (즉, 상기 장액 군의 좌측부터 막대 12-22)로 더욱 세분되었다. 상기 뇨는 Bcl-2에 대해 ELISA에 의해 삼중체로 분석되었다(Bender MedSystems, catalog #BMS244/3 출처 ELISA 키트), 그리고 결과물들은 평균 ng/ml Bcl-2 ± S.E.로 표현되었다. 상기 데이터들은 일정하게 증가된 수치의 암 환자의 뇨 Bcl-2를 나타낸다. 학생 t-test 분석은 정상과 암 표본 간에 p＜0.00001 통계적 차이를 보여주었다.
도 2는 정상 및 암 환자들 속 Bcl-2의 뇨 수치를 나타내는 히스토그램이다. 추가적 뇨 표본들이 정상 건강한 지원자들과 난소암 환자들(조직적합적 하부유형 자궁내막모양, 장액, 점액 포함) 및 복막액 암 환자들로부터 수집되었다. 장액 난소암들은 병기 1(장액 군에서 좌측부터 7개의 막대), 병기 2(상기 장액 군의 좌측부터 막대 8-17), 병기 3(상기 장액 군의 우측부 12개 막대)로 더욱 세분되었다. 상기 뇨는 Bcl-2에 대해 ELISA에 의해 삼중체로 분석되었다(Bender MedSystems 출처 ELISA 키트), 그리고 결과물들은 평균 ng/ml Bcl-2로 표현되었으며, 실험된 전체 정상 및 수술전 암 뇨 표본들을 대표한다. 도 1과 일관되게, 상기 데이터들은 일정하게 증가된 수치의 암 환자의 뇨 Bcl-2를 나타낸다. 학생 t-test 분석은 정상과 암 표본 간에 p＜0.00001 통계적 차이를 보여주었다.
도 3A 및 3B는 뇨 Bcl-2가 종양 병기 및 분화도와 각각 관련이 있음을 나타내는 히스토그램이다. 뇨 Bcl-2 수치들은 모든 입수가능한 조직적합성 난소암 하부유형들로부터의 종양 병기에 대해 플롯되었다(장액, 자궁내막모양, 점액). 병기 I, II, III 및 Ⅴ는 로마숫자로 표시되었다. 정상 대조군들보다 훨씬 높지만, 도 3A는 뇨 Bcl-2 수치가 난소와 복막강 내에 질병이 편재한 병기 I, II 종양에서 가장 낮았음을 보여준다(평균 ng/ml Bcl-2=2.2). 뇨 Bcl-2 수치는 상기 질병이 난소 위로 퍼지거나 재발성 질환인 경우, 병기 III 및 Ⅴ 중에서 최고였다 (평균 ng/ml Bcl-2=4.22).
도 4A 및 4B는 난소암 발견에 있어서 혈장 CA125의 측정(도 4B)에 비해 뇨 Bcl-2(도 4A)의 성능을 나타내는 한 쌍의 히스토그램이다. 도 1-3에서 보여진 것처럼, 뇨 Bcl-2 수치는 동일한 정상 건강한 지원자들과 암 환자들로부터의 혈장 CA125 수치와 비교되었다. 후자 군에는 점액 난소암(Muc), 일기 복막액 암(PP), 장액 난소암(장액)을 가진 환자들이 포함되었다. CA125 수치는 ELISA(Bio-Quant, San Diego, CA, Catalog #BQ1013T 출처 ELISA 키트)에 의해 삼중체로 결정되었다. 그리고 데이터들은 평균 ng/ml Bcl-2 (A) 및 로 평균 U/ml CA125 (도 4B)로 표현되었다. 증가된 수치의 뇨 Bcl-2에 의한 난소암 발견을 위한 민감성과 특이성은 거의 100%였다. 반면에, CA125 혈액 수치는 ＞35 U/ml, 난소암 발견 목적 현재 표준, 68% 난소암 환자들 만을 판정하였다.
도 5는 뇨 Bcl-2가 환자 연령과 관계없음을 나타내는 히스토그램이다. 암 환자에서 증가된 뇨 Bcl-2 수치가 환자 연령과 연관되는 지를 검사하기 위해, 뇨 Bcl-2 수치가 환자 연령별로 비교되었다. 비록 정상 대조군의 평균 연령 (54.8 세)은 난소암 여성들 (66.2세)보다 다소 낮았지만, 그 차이점이 그다지 통계적으로 중요하지는 않았다. 추가적으로, 암 환자들의 평균 연령이 문헌 및 임상 데이터들과 일치하면서, 난소암이 일반적으로 peri-, post-menopausal 여성들을 목표로 함을 알 수 있다. 하지만, 데이터들은 뇨 Bcl-2가 환자 연령과 관계없음이 나타났다.
도 6은 뇨 Bcl-2가 난소 종양 크기와 관계없음을 나타내는 히스토그램이다. 암 환자에서 증가된 뇨 Bcl-2 수치가 종양 크기와 연관되는 지를 검사하기 위해, 뇨 Bcl-2 수치가 종양 크기별로 비교되었다. 종양들은 1=현미경적, 3= 3㎝ 미만, 6=3과 6㎝ 사이, 10=6㎝보다 크고 10㎝에 이름, 11=10㎝보다 큼으로 묶어졌다. 하지만, 데이터들은 뇨 Bcl-2가 종양 크기와 관계없음이 나타났다.
도 7A 및 7B는 뇨 Bcl-2가 난소암 절제술 이후 줄어드는 것을 나타내는 한 쌍의 히스토그램이다. 난소암 발견을 위해 뇨 Bcl-2에 대한 정확도를 더욱 검증하기 위해서, 뇨 Bcl-2의 수치들이 난소암 환자들에서 초기 절제술 직후(검은 막대), 및 모든 가시적 종양 제거를 위한 초기 절제술 후 2주 내에(회색 막대) 비교되었다(도 7A). 뇨 샘플들이 초기 절제술 전과 후에 수집된 7명의 환자들에게서는, 종양 절제 후에 Bcl-2수치가 100%까지 줄어들었으며, 이로부터 종양의 존재가 난소암 환자들에서 증가된 뇨 Bcl-2와 매우 관련이 높다는 것을 암시하였다. 추가적으로, 도 7A에서는 초기 절제술 후 7 내지 11개월에 걸친 임상 방문에서 뇨 샘플들이 7명 중 5명에게서 추출되었으며, Bcl-2가 측정되었다 (파란색)(도 7B). 뇨 Bcl-2 수치들은 3 방문 환자들에서는 낮았고(#41, 43, 54), 2 환자들에서는 증가되었다(#5, 27). 예비 챠트 검토에 의하면 #41, 43, 54 환자들은 수술후 방문시에 화학요법을 진행하고 있었고, 그들의 난소암 질환이 관리중이었음을 알 수 있었다. 반면, 챠트 검토에서 #5, 27 환자들은 재발성 질환을 가졌고, #27 환자는 추가 종양 절제술을 받았음을 암시한다. 상기 임상 정보에 부합하여, 화학요법을 진행중이며 명백하거나 최소한의 질환이 존재하지 않는 환자들(#41, 43, 54)에게서는 뇨 속의 Bcl-2 수치가 낮게 유지되었다. 또한, 뇨 속의 증가된 Bcl-2 수치는 재발성 질환(#5, 27)의 존재와 관련이 있었으며, 이어진 질환 절제술(#27c)로 감소하였다.
도 8A 및 8B는 양성 부인과 질환을 지닌 환자들에게서 Bcl-2 실험의 결과를 나타낸다. 양성 부인과 질환 여성들에게서 뇨 샘플들이 ELISA에 의해 Bcl-2가 검사되었다. 상기 뇨는 Bcl-2에 대해 삼중체로 분석되었고 데이터들은 평균 ng/ml Bcl-2 ± S.E.로 표현되었다(도 8A). 양성 부인과 질환 샘플들은 내부 양성 컨트롤로 작용하는 난소암 환자 샘플 #41 (흰색 막대)와 함께 유형에 따라 양성 낭기형종, 단순 낭종, 평활근종, 다낭 난소질환, 난소 샘섬유종, 점액 낭샘종 및 장액 낭샘종으로 세분화되었다. 양성 질환 중 평균 뇨 Bcl-2 ng/ml ± S.E.는 각각 머리부 아래로 표시되었다. 도 2와 도 3A 샘플들은 이번 연구 군(n=92)를 위해 Bcl-2발현의 분포를 보여주기 위해 재-플롯되었으며, 도 8B에 보여진다. 양성, 암, 정상 개체들에서의 Bcl-2 수치는 0.115-1.016 ng/ml, 1.12-9.8 ng/ml, 0-1.26 ng/ml 범위였으며, 평균 0.614 ng/ml, 3.4 ng/ml, 0.21ng/ml이었다.
도 9는 Bcl-2가 세포 배양 조절배지로 배출될 수 있음을 보여주는 히스토그램이다. 조절배지(CM)는 난소(OV2008, SKOV3, PA1), 자궁경부(Hela), 전립 선(LNCap, DU145, PC-3), 두경부(HN5a), 림프종(Raji) 암으로 대표되는 암 세포주들로부터 수집되었으며, Bcl-2 존재여부에 대해 ELISA로 검사되었다. 데이터들은 삼중체 샘플들의 평균으로 표현된다. 난소, 자궁경부, 전립선 암 세포 배양들에서 Bcl-2의 존재는 이들 암 세포들이 Bcl-2를 생산하고 배출함을 의미한다.
도 10은 Bcl-2가 몇몇 암세포들에서 과발현되는 것을 보여준다. 난소(SW626, C13), 자궁경부(Hela), 전립선(DU145), 두경부(HN5a) 암으로 대표되는 암 세포주들로부터의 세포 용리액이 Bcl-2를 위해 웨스턴 블롯팅되었다. 액틴이 탑재 컨트롤로, FHIOSE118 세포들(SV-40 대형 T 항원 감염 사람 난소 표면 상피세포)이 정상, 비-악성 난소 표면 상피 컨트롤 세포로 작용하였다. 농도 분석 후, Bcl-2 수치는 액틴으로 정상화되었으며, 상기 블롯팅 아래로 나타났다. 정상 세포들은 무시할 만한 수준의 Bcl-2를 함유한 반면, 난소 및 자궁경부 암 세포들은 최고 수준의 Bcl-2를 함유하였다.
도 11은 저장 후 Bcl-2 단백질 농도를 보여준다. 정상 건강 개체들(#506, 508) 및 난소암 환자들(#77, 97)에서의 뇨 샘들은 본 연구의 일부(컨트롤)로서 Bcl-2가 실험되었고, 저장되었다. ELISA 키트(BenderMed Systems)를 사용하여 모든 샘플들은 이중체로 실험되었다.
도 12는 LPA 처리 후 전립선 암 세포주인 DU145를 포함하는, 암 세포주들의 조절배지(CM) 내 Bcl-2 단백질 농도를 보여준다. 본 도면은 LPA 처리가 일부 암 세포 유형들의 CM 속으로의 Bcl-2의 배출을 자극함을 보여준다. 이들 암 세포주들은 그들의 CM 내로 Bcl-2를 배출함에 따라, 그들 세포주들의 체내 종양 상대편 파트너 들은 잠재적으로 Bcl-2를 생물학적 유체, 뇨 및/또는 혈액 내로 배출하고, 본 발명을 이용하여 검출할 수도 있다.
서열목록에 대한 간단의 설명
서열목록 제1호는 사람 Bcl-2 DNA (유전자은행 등록번호 M14745); 암호화영역(CDS): 염기 32-751이다.
서열목록 제2호는 사람 Bcl-2 단백질 (유전자은행 등록번호 AAA35591)이다.
서열목록 제3호는 사람 Bcl-2 DNA, 전사체 변이 알파 (유전자은행 등록번호 NM_000633); CDS: 염기 494-1216이다.
서열목록 제4호는 사람 Bcl-2 단백질, 전사체 변이 베타 (유전자은행 등록번호 NP_000624)이다.
서열목록 제5호는 사람 Bcl-2 DNA, 전사체 변이 베타 (유전자은행 등록번호 NM_000657); CDS: 염기 494-1111이다.
서열목록 제6호는 사람 Bcl-2 단백질, 전사체 변이 베타 (유전자은행 등록번호 NP_000648)이다.
물질들 및 방법들
환자 코호트 ( cohort ).
사전 기관 승인과 함께, H. Lee Moffitt Cancer Center에서 뇨와 혈액 샘플 들이 정상 건강 대조군 지원자들 (N=21), 양성 부인과 질환 여성들(N=35) 및 난소암 환자들(N=34)로부터 수집되었다. 8 개의 표본을 제외한 전부는 초기 제거수술 이전에 수집되었으며, 후자 8개의 표본은 당해 연구 시작 시점에 재발성 질환을 지닌 채로 제공되었다. 파라핀 블럭이 식별되었고, 슬라이드들이 FIGO 점수에 따라 조직적합성 진단을 확인하기 위해 점검하였다. 이들 여성들의 의료 기록들 또한 점검되었으며, 환자 연령, 종양 유형, 병기, 분화도, 크기 및 수술적 치료에 관한 정보가 입수되었다.
샘플 준비
환자가 동의함에 따라, 뇨 및 혈장 샘플이 환자들로부터 채취되고, 환자 신분 보호를 위해 익명처리 및 암호화되고, 본 연구 프로토콜을 위해 H. Lee Moffitt Cancer Center로부터 내보내졌다. 모든 샘플들은 냉동 보관되었다. 뇨 샘플들은 표준 프로테아제 억제자 칵테일로 처리되고(80 ㎍/㎖ 4-(2 아미노에틸)-벤젠 술포닐 플루오라이드, 200 ㎍/㎖ EDTA, 0.2 ㎍/㎖ leupeptin, 0.2 ㎍/㎖ pepstatin, Sigma Scientific, St. Louis, MI), 3000 x g에서 원심분리되었다. 뇨 침전물들과 혈장 샘플들은 이후 부분표본(aliquot)되고 -20℃에서 보관되었다.
효소-연결 면역흡착 분석
환자 뇨 속의 Bcl-2 수치를 측정하기 위해, 샘플들이 정량적 샌드위치 효소-연결 면역흡착 분석 (ELISA; R&D Systems, Minneapolis, MN)을 이용하여 제조자의 사용설명에 따라 분석되었다. 숙주 혈장 속의 CA125 수치를 측정하기 위해, 샘플들이 ELISA (Bio-Quant, San Diego, CA)에 의해 제조자의 사용설명에 따라 분석되었 다. 상기 효소 반응들은 Dynex MRX 평판 리더(Dynex Technologies, Chantilly, VA)를 사용하여 450nm에서 검출되었으며, Bcl-2 결과들은 삼중체(triplicate) 샘플 ± S.E 평균 흡광도를 나타낸 반면, CA125 결과들은 이중체(duplicate) 샘플들의 평균 흡광도를 나타냈다.
통계적 분석방법
Bcl-2 ELISA용 샘플들은 삼중체 상태로 진행되었고, 상기 데이터는 일반 분포를 위해 Kruskal-Wallis 테스트 대상이 되었다. 정상 대조군, 양성 질환 환자들 및 난소암 환자들 샘플들 간의 통계적 중요도를 결정하기 위해서, 데이터들은 이후 Mann-Whitney U-test에 의해 분석되었다. 또한, SAS 시스템을 이용한 분리 분석(discrimination analysis)법들이 각 군(정상 대 양성 대 암)에서 적절한 구성원을 결정하기 위해 이용되었다.
실시예 1- 난소암 환자들에서 뇨 Bcl -2 수치가 증가함
뇨와 혈액이 정상 대조군(N=21), 양성 부인과 질환 여성들(N=35), 난소암 여성들 (N=34)에게서 수집된 샘플들로 된 90 개체에서 채취되었다. 상기 후자 군은 장액 난소암(N=24)와 난소암과 종종 연관되는 일기 복막액암(N=2) 뿐만 아니라, 자궁내막모양(N=1), 점액(N=7) 난소암으로 진단받은 여성들로 이루어졌다. 양성 부인과 질환 여성들로부터 수집된 샘플들은 양성 낭기형종(N=2), 단순 낭종(N=10), 평활근종(N=8), 다낭 난소질환(N=1), 난소 샘섬유종(N=4), 점액 낭샘종(N=2) 및 장액 낭샘종(N=8)을 가진 여성들로 이루어졌다. 비록 이러한 코호트가 소규모 파일럿 수 준의 연구를 포함하지만, 조직적합성, 분화도 및 병기 분포에 있어서는 전형적인 임상실험의 대표이다.
뇨 Bcl-2 수치의 신규한 난소암 분자표지로서의 잠재 적합성을 결정하기 위해서, 정상 대조군, 양성 부인과 질환 여성들, 난소암 환자들 표본들로부터의 뇨 샘플들이 ELISA 분석법으로 스크리닝되었다 (도 1). 뇨 Bcl-2의 양은 정상 대조구 샘플들에서는 일반적으로 무시할만한 수준(평균 0.21 ng/ml)이었다. 반면, 난소암 및 일기 복막액 암과 연관된 뇨 Bcl-2의 양은 일반적으로 정상 대조군에서 발견된 것의 10배를 초과(3.4 ng/ml)하였다 (도 1A). 정상 뇨 샘플 중에서는 어느 것도 1.8 ng/ml이 넘는 Bcl-2를 함유하지 않았으며, 암 샘플들 중 오직 2개가 1.8 ng/ml 미만 (1.12 ng/ml 및 1.78 ng/ml) Bcl-2를 나타냈다. 장액 세포종은 상피성 난소암의 대다수를 차지하기 때문에, 장액 낭샘종을 가진 환자들 속의 뇨 Bcl-2 수치는 분화도(도 1A) 및 병기(도 1B)로 검사되었다. 비록 종양 분화도와 병기가 증가하면서 증가된 Bcl-2 수치 경향을 보였지만, 종양 분화도와 병기 간의 Bcl-2 수치 차이가 통계적으로 중요하지는 않았다. 마찬가지로, 혈청 크레아티닌이 뇨 채취시 측정되었으며, 뇨 Bcl-2 수치가 신이작용(renal dysfunction)과는 무관함을 보여주었다 (데이터는 보여지지 않음). 특이하게도, 한 명의 환자 (#77)가 다른 눈에 띨만한 임상 증후가 없는 상태에서 엄청나게 증가한 뇨 Bcl-2 수치 (＞9 ng/ml)를 보여주었다.
표 2는 뇨 표본들에 있어서 평균 Bcl-2 수치들에 대해 도 1 및 도 2에서 제공된 결과들을 요약하고 있다. 괄호 속 숫자들은 각각의 개별 군 속 샘플들의 숫자 를 의미한다. 또한, 데이터들은 정상 개체들과 난소암 조직 하부유형들, 종양 분화도(Grade) 및 종양 병기(Stage) 간의 평균 Bcl-2 수치 (ng/ml)를 보여주기 위해서 그룹화되어 있다. 데이터들은 건강한 지원자들의 뇨 속 Bcl-2 평균 수치가 0.204 ng/ml인 반면, 모든 암 환자들의 것은 보통 10배 이상 (3.12 ng/ml)임을 보여준다. 추가로, 장액 난소암들(최빈발 난소암 유형) 사이에서 뇨 Bcl-2 수치들은 종양 병기와 강하게 연관되고, 종양 분화도와 보통으로 연관된 것으로 보인다.
정상 및 난소암 내 뇨 Bcl -2 수치
샘플 Bcl-2 (ng/ml)
정상 (21) 0.204
자궁내막모양(1) 3.168
점액(4) 2.35
복막액(2) 1.78
장액(29) Grade1 (7) 2.76
Grade2 (10) 3.98
Grade3 (12) 3.94
Stage1 (3) 1.92
Stage2 (4) 3.23
Stage3 (14) 4.07
Stage5 (8) 4.04
실시예 2- 양성 부인과 질환 환자들에서 뇨 Bcl -2 수치가 증가하지 않음
양성 부인과 질환을 가진 35 명의 여성(환자 처리 직전 뇨 채취)으로부터 뇨 Bcl-2를 ELISA 측정한 결과, 평균 0.02 ng/ml이었으며, 전부 1.8 ng/ml을 초과하지 않았다(도 8A). 이들 양성 질환에는 양성 낭기형종, 단순 낭종, 평활근종, 다낭 난소, 샘섬유종, 낭샘종이 포함된다. 이들 값들은 정상 대조군과 유사하였지만, 중요하게도 1.8 ng/ml이 넘는 증가된 뇨 Bcl-2 수치가 난소암과 연관된다는 난소암 샘플들보다는 작았다.
데이터들의 정상 분포를 시험하기 위해 Kruskal-Wallis 테스트가 사용되었다. 상기 '정상' 군은 소규모 샘플 숫자 탓에 정상 분포에 실패하였기 때문에, 군 사이의 차이는 Mann-Whitney U-test에 의해 분석되었다. 그 결과 정상과 양성 사이에는 중요한 차이가 보이지 않았지만(p＜0.5), 정상과 암, 또는 양성과 암 군 사이에는 p＜0.001 이 보였다. 이러한 시험 군에 대한 뇨 Bcl-2 수치에 대한 요약이 도 8B에 제공된다. 마찬가지로, SAS 시스템을 이용한 분리 분석 결과, 정상/양성 또는 암 그룹 내 적절한 구성원 가능성이 ＞90%임이 나타났다.
실시예 3- 뇨 Bcl -2가 환자 연령 또는 종양 크기와 무관함
임상 파라미터들을 비교한 결과, 뇨 Bcl-2 수치가 환자 연령과는 관련이 없다는 것이 제시되었다 (도 5 참조). 비록 정상 대조군의 연령대 및 평균 연령 (29-81세, 평균 48.5 ± S.D. 12.7년)과 양성 부인과 질환 여성들 (28-84세, 평균 55.9 ± S.D. 13.9년)은 난소암 여성들 (26-92세, 평균 62.2 ± S.D. 13.8년)보다 다소 낮았지만, 그 차이점이 이번 연구에서 그다지 통계적으로 중요하지는 않았다. 유사하게, 뇨 Bcl-2 수치들은 절제술에서 측정된 종양 크기, 현미경적 크기부터 ＞10㎝에 이르는 범위의 크기와 관계가 없었으며(도 6), 개체들 간의 생물학적 변화 또는 종양 조성에 있어서의 변화를 반영할 수 있다.
실시예 4- 뇨 Bcl -2는 혈액 내 CA125 보다 더욱 정확하게 난소암을 검출함
증가된 뇨 Bcl-2가 난소암에 대해 암 항원 125(CA125) 보다 나은 진단 표지자인지를 확인하기 위해서, 12명 정상 대조군과 23명 난소암 환자들에서 뇨 Bcl-2가 CA125 수치와 비교되었다(도 4A 및 4B). 시험된 환자들 중에서, 난소암 발견과 관련한 증가된 뇨 Bcl-2는 거의 100%였다. 증가된 뇨 Bcl-2 (＞1.8 ng/ml)는 17/17 장액 낭샘종 환자들, 4/4 점액 난소암 환자들, 1/2 일기 복막액암 환자들을 난소암 양성으로 판정하였다(도 4A). 정상 대조군 중에서는 누구도 뇨 Bcl-2 수치가 ＞1.8 ng/ml를 나타내지 않았으며, 이후 정확하게 암-음성으로 분류되었다. 반면에, CA125의 혈액 수치 ＞35 U/ml, 난소암 발견 목적 현재 표준,은 13/17 또는 76% 장액 낭샘종 환자들을 판정하였다(도 4B). 마찬가지로, 비록 이 환자들에서 CA125의 수치는 41-43 U/ml 범위이었지만 CA125 분석결과가 3/4 또는 75% 점액 난소암 환자들을 판정하였으며, 1/2 또는 50% 일기 복막액암 환자들을 암 양성으로 판정하였다. 증가된 CA125 수치는 또한 부정확하게 2/12 또는 16% 건강한 개체들을 암-양성으로 판정하면서, 증가된 뇨 Bcl-2가 CA125 보다 정확하게 난소암을 검출하는 것으로 보인다고 제시하였다.
실시예 5- 절제술 후 뇨 Bcl -2가 감소함
난소암 발견을 위해 고 수준 뇨 Bcl-2에 대한 정확도를 검증하기 위해서, 뇨 Bcl-2의 수치들이 7명 난소암 환자들에서 초기 절제술 직후(도 7A 및 7B, 검은 막대), 및 모든 가시적 종양 제거를 위한 초기 절제술 후 2주 내에(흰 막대) 비교되었다. 뇨 샘플들이 초기 절제술 전과 후에 수집된 환자들에게서는, 종양 절제 후에 Bcl-2수치가 100%까지 줄어들었으며, 이로부터 종양의 존재가 난소암 환자들에서 증가된 뇨 Bcl-2와 매우 관련이 높다는 것을 암시하였다.
현재, 전임상 연구들은 Bcl-2를 억제하는 제제들의 개발에 집중되고 있는바, 안티센스 올리고뉴클레오티드들과 Bcl-2의 소형 분자 억제자들이 포함된다. 비록 이러한 연구들은 치료적 시술 목적 Bcl-2를 표적으로 하고 있지만, 본 데이터들은 ELISA-기반 분석들에 의한 뇨 Bcl-2 정량이 신규하고, 안전하고, 민감하고, 특이적이고, 경제적이면서, 미국뿐만 아니라 의료적으로 혜택받지 못하는 지역들과 특히 난소암이 진행중인 고위험 여성들을 포함한 전세계 모든 여성들에게 이익이 될 난소암 발견 방법을 제공할 수 있음을 보여준다. 더욱이, 약 25,000명 여성들이 매년 미국에서 난소암 진단을 받는다고 가정할 때, 초기 및 말기 병기 상태의 난소암에 대한 뇨 Bcl-2 검출로 난소암 진단을 확인할 뿐만 아니라, 수천개의 미리 진단받지 못한 난소암을 잠재적으로 발견하는 것 또한 가능할 것이다. 이것은 10% 미만으로 진단받지만 질환 난소에 대한 수술적 절제로 환자 생존율을 90% 이상 올리게 되고, 평생 의료비를 감소시킬 것으로 예상되는 초기 난소암 발견에 있어서 특히 중요한 의미를 갖는다. 마지막으로, 새로운 진단 기능을 수행함에 더하여, Bcl-2의 뇨 수치는 치료 및 예후 결과에 영향을 줄 수도 있는, 질병 과정을 통해서 난소암의 존재를 모니터하기 위해 사용될 수도 있다. 분명하게, 난소암에서 증가된 뇨 Bcl-2에 대해 책임있는 분자 기작 연구뿐만 아니라, 보다 다수의 구성원 연구들이, 난소암에 대한 생물표지로서 기능하기 위한 Bcl-2의 뇨 수치에 대한 잠재성을 입증하는 데에 이용된다. 하지만, 난소암에 대한 생물표지로서 뇨 검출 또는 Bcl-2를 사용하는 것에 대한 아무런 보고도 존재하지 않기 때문에, 본 파일럿 연구로 인해 ELISA에 의한 뇨 Bcl-2의 측정이 개혁적이고, 간단한 모든 난소암 발견 방법 및, 가능하게는 매년 수천명의 여성을 치사시키는 잠행성 질환의 치사율 감소 방법을 제공할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6- Bcl -2 테스트용 뇨 저장 조건
뇨 Bcl-2의 저장 안정성을 실험하는 연구들은, 샘플들이 프로테아제 억제자 칵테일의 첨가로 준비될 때 이들 뇨 샘플들이 1년 이상 Bcl-2 검출 손실없이 -20℃에서 저장될 수도 있음을 보여준다 (도 11의 'Control' & '-20℃' 참조). 이는 이전 샘플들을 현재의 것들과 재실험하는 것이 바람직할 수 있는 개체들에서 이익이 될 것이다. 선택적으로, 이러한 샘플들은 또한 뇨 Bcl-2의 검출에 역효과 없이 4℃에서 4일 동안에 걸쳐 보관될 수도 있다. 이들은, 만약 프로테아제 억제자들이 뇨 샘플에 첨가되고 뇨 샘플이 차갑게 보관된다면, Bcl-2 실험을 위해 환자의 뇨 샘플들을 (잠재적으로 원거리 지역에서) 실험실로 옮기는 데 소요되는 예상 시간이 뇨 Bcl-2 검출 결과에 역효과를 주지는 않을 것으로 판단한다는 점에서 중요한 결과이다. 하지만, 감소된 Bcl-2가 실온에서 4일 동안 저장된 샘플들에서 측정되었으며, Bcl-2가 -80℃에서 보관된 뇨 샘플에서는 검출될 수 없었다; 따라서, 실온에서나 -80℃에서 Bcl-2 검출용 뇨 샘플을 저장하는 것은 금지된다.
여기에 참조되었거나 인용된, 모든 도면과 표를 포함하는 모든 특허, 특허출원, 가출원, 및 공개특허들은 본 발명의 명확한 교시와 일치하지 않는 범위에 이르기까지 그 전문이 참조문헌으로 병합 참조된다.
여기에 언급된 실험들과 실시예들은 이해를 돕기 위한 목적일 뿐이며, 다양한 변형이나 경미한 변화가 업계 기술자에게 제시될 수 있고, 본 출원의 사상 및 범위 이내에서 포함될 수 있을 것으로 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> University of South Florida Kruk, Patricia A. <120> Detection of Cancer by Elevated Levels of Bcl-2 <130> USF-254XC1 <150> 60/771,677 <151> 2006-02-09 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 6030 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <301> Cleary,M.L., Smith,S.D. and Sklar,J. <302> Cloning and structural analysis of cDNAs for bcl-2 and a hybrid bcl-2/immunoglobulin transcript resulting from the t(14;18) translocation <303> Cell <304> 47 <305> 1 <306> 19-28 <307> 1986 <400> 1 gttggccccc gttacttttc ctctgggaaa tatggcgcac gctgggagaa cagggtacga 60 taaccgggag atagtgatga agtacatcca ttataagctg tcgcagaggg gctacgagtg 120 ggatgcggga gatgtgggcg ccgcgccccc gggggccgcc cccgcgccgg gcatcttctc 180 ctcgcagccc gggcacacgc cccatacagc cgcatcccgg gacccggtcg ccaggacctc 240 gccgctgcag accccggctg cccccggcgc cgccgcgggg cctgcgctca gcccggtgcc 300 acctgtggtc cacctgaccc tccgccaggc cggcgacgac ttctcccgcc gctaccgccg 360 cgacttcgcc gagatgtcca ggcagctgca cctgacgccc ttcaccgcgc ggggacgctt 420 tgccacggtg gtggaggagc tcttcaggga cggggtgaac tgggggagga ttgtggcctt 480 ctttgagttc ggtggggtca tgtgtgtgga gagcgtcaac cgggagatgt cgcccctggt 540 ggacaacatc gccctgtgga tgactgagta cctgaaccgg cacctgcaca cctggatcca 600 ggataacgga ggctgggatg cctttgtgga actgtacggc cccagcatgc ggcctctgtt 660 tgatttctcc tggctgtctc tgaagactct gctcagtttg gccctggtgg gagcttgcat 720 caccctgggt gcctatctgg gccacaagtg aagtcaacat gcctgcccca aacaaatatg 780 caaaaggttc actaaagcag tagaaataat atgcattgtc agtgatgttc catgaaacaa 840 agctgcaggc tgtttaagaa aaaataacac acatataaac atcacacaca cagacagaca 900 cacacacaca caacaattaa cagtcttcag gcaaaacgtc gaatcagcta tttactgcca 960 aagggaaata tcatttattt tttacattat taagaaaaaa agatttattt atttaagaca 1020 gtcccatcaa aactcctgtc tttggaaatc cgaccactaa ttgccaagca ccgcttcgtg 1080 tggctccacc tggatgttct gtgcctgtaa acatagattc gctttccatg ttgttggccg 1140 gatcaccatc tgaagagcag acggatggaa aaaggacctg atcattgggg aagctggctt 1200 tctggctgct ggaggctggg gagaaggtgt tcattcactt gcatttcttt gccctggggg 1260 ctgtgatatt aacagaggga gggttcctgt ggggggaagt ccatgcctcc ctggcctgaa 1320 gaagagactc tttgcatatg actcacatga tgcatacctg gtgggaggaa aagagttggg 1380 aacttcagat ggacctagta cccactgaga tttccacgcc gaaggacagc gatgggaaaa 1440 atgcccttaa atcataggaa agtatttttt taagctacca attgtgccga gaaaagcatt 1500 ttagcaattt atacaatatc atccagtacc ttaagccctg attgtgtata ttcatatatt 1560 ttggatacgc accccccaac tcccaatact ggctctgtct gagtaagaaa cagaatcctc 1620 tggaacttga ggaagtgaac atttcggtga cttccgcatc aggaaggcta gagttaccca 1680 gagcatcagg ccgccacaag tgcctgcttt taggagaccg aagtccgcag aacctgcctg 1740 tgtcccagct tggaggcctg gtcctggaac tgagccgggg ccctcactgg cctcctccag 1800 ggatgatcaa cagggcagtg tggtctccga atgtctggaa gctgatggag ctcagaattc 1860 cactgtcaag aaagagcagt agaggggtgt ggctgggcct gtcaccctgg ggccctccag 1920 gtaggcccgt tttcacgtgg agcatgggag ccacgaccct tcttaagaca tgtatcactg 1980 tagagggaag gaacagaggc cctgggccct tcctatcaga aggacatggt gaaggctggg 2040 aacgtgagga gaggcaatgg ccacggccca ttttggctgt agcacatggc acgttggctg 2100 tgtggccttg gcccacctgt gagtttaaag caaggcttta aatgactttg gagagggtca 2160 caaatcctaa aagaagcatt gaagtgaggt gtcatggatt aattgacccc tgtctatgga 2220 attacatgta aaacattatc ttgtcactgt agtttggttt tatttgaaaa cctgacaaaa 2280 aaaaagttcc aggtgtggaa tatgggggtt atctgtacat cctggggcat taaaaaaaaa 2340 atcaatggtg gggaactata aagaagtaac aaaagaagtg acatcttcag caaataaact 2400 aggaaatttt tttttcttcc agtttagaat cagccttgaa acattgatgg aataactctg 2460 tggcattatt gcattatata ccatttatct gtattaactt tggaatgtac tctgttcaat 2520 gtttaatgct gtggttgata tttcgaaagc tgctttaaaa aaatacatgc atctcagcgt 2580 ttttttgttt ttaattgtat ttagttatgg cctatacact atttgtgagc aaaggtgatc 2640 gttttctgtt tgagattttt atctcttgat tcttcaaaag cattctgaga aggtgagata 2700 agccctgagt ctcagctacc taagaaaaac ctggatgtca ctggccactg aggagctttg 2760 tttcaaccaa gtcatgtgca tttccacgtc aacagaattg tttattgtga cagttatatc 2820 tgttgtccct ttgaccttgt ttcttgaagg tttcctcgtc cctgggcaat tccgcattta 2880 attcatggta ttcaggatta catgcatgtt tggttaaacc catgagattc attcagttaa 2940 aaatccagat ggcaaatgac cagcagattc aaatctatgg tggtttgacc tttagagagt 3000 tgctttacgt ggcctgtttc aacacagacc cacccagagc cctcctgccc tccttccgcg 3060 ggggctttct catggctgtc cttcagggtc ttcctgaaat gcagtggtgc ttacgctcca 3120 ccaagaaagc aggaaacctg tggtatgaag ccagacctcc ccggcgggcc tcagggaaca 3180 gaatgatcag acctttgaat gattctaatt tttaagcaaa atattatttt atgaaaggtt 3240 tacattgtca aagtgatgaa tatggaatat ccaatcctgt gctgctatcc tgccaaaatc 3300 attttaatgg agtcagtttg cagtatgctc cacgtggtaa gatcctccaa gctgctttag 3360 aagtaacaat gaagaacgtg gacgctttta atataaagcc tgttttgtct tctgttgttg 3420 ttcaaacggg attcacagag tatttgaaaa atgtatatat attaagaggt cacgggggct 3480 aattgctggc tggctgcctt ttgctgtggg gttttgttac ctggttttaa taacagtaaa 3540 tgtgcccagc ctcttggccc cagaactgta cagtattgtg gctgcacttg ctctaagagt 3600 agttgatgtt gcattttcct tattgttaaa aacatgttag aagcaatgaa tgtatataaa 3660 agcctcaact agtcattttt ttctcctctt cttttttttc attatatcta attattttgc 3720 agttgggcaa cagagaacca tccctatttt gtattgaaga gggattcaca tctgcatctt 3780 aactgctctt tatgaatgaa aaaacagtcc tctgtatgta ctcctcttta cactggccag 3840 ggtcagagtt aaatagagta tatgcacttt ccaaattggg gacaagggct ctaaaaaaag 3900 ccccaaaagg agaagaacat ctgagaacct cctcggccct cccagtccct cgctgcacaa 3960 atactccgca agagaggcca gaatgacagc tgacagggtc tatggccatc gggtcgtctc 4020 cgaagatttg gcaggggcag aaaactctgg caggcttaag atttggaata aagtcacaga 4080 atcaaggaag cacctcaatt tagttcaaac aagacgccaa cattctctcc acagctcact 4140 tacctctctg tgttcagatg tggccttcca tttatatgtg atctttgttt tattagtaaa 4200 tgcttatcat ctaaagatgt agctctggcc cagtgggaaa aattaggaag tgattataaa 4260 tcgagaggag ttataataat caagattaaa tgtaaataat cagggcaatc ccaacacatg 4320 tctagctttc acctccagga tctattgagt gaacagaatt gcaaatagtc tctatttgta 4380 attgaactta tcctaaaaca aatagtttat aaatgtgaac ttaaactcta attaattcca 4440 actgtacttt taaggcagtg gctgttttta gactttctta tcacttatag ttagtaatgt 4500 acacctactc tatcagagaa aaacaggaaa ggctcgaaat acaagccatt ctaaggaaat 4560 tagggagtca gttgaaattc tattctgatc ttattctgtg gtgtcttttg cagcccagac 4620 aaatgtggtt acacactttt taagaaatac aattctacat tgtcaagctt atgaaggttc 4680 caatcagatc tttattgtta ttcaatttgg atctttcagg gatttttttt ttaaattatt 4740 atgggacaaa ggacatttgt tggaggggtg ggagggagga acaattttta aatataaaac 4800 attcccaagt ttggatcagg gagttggaag ttttcagaat aaccagaact aagggtatga 4860 aggacctgta ttggggtcga tgtgatgcct ctgcgaagaa ccttgtgtga caaatgagaa 4920 acattttgaa gtttgtggta cgacctttag attccagaga catcagcatg gctcaaagtg 4980 cagctccgtt tggcagtgca atggtataaa tttcaagctg gatatgtcta atgggtattt 5040 aaacaataaa tgtgcagttt taactaacag gatatttaat gacaaccttc tggttggtag 5100 ggacatctgt ttctaaatgt ttattatgta caatacagaa aaaaatttta taaaattaag 5160 caatgtgaaa ctgaattgga gagtgataat acaagtcctt tagtcttacc cagtgaatca 5220 ttctgttcca tgtctttgga caaccatgac cttggacaat catgaaatat gcatctcact 5280 ggatgcaaag aaaatcagat ggagcatgaa tggtactgta ccggttcatc tggactgccc 5340 cagaaaaata acttcaagca aacatcctat caacaacaag gttgttctgc ataccaagct 5400 gagcacagaa gatgggaaca ctggtggagg atggaaaggc tcgctcaatc aagaaaattc 5460 tgagactatt aataaataag actgtagtgt agatactgag taaatccatg cacctaaacc 5520 ttttggaaaa tctgccgtgg gccctccaga tagctcattt cattaagttt ttccctccaa 5580 ggtagaattt gcaagagtga cagtggattg catttctttt ggggaagctt tcttttggtg 5640 gttttgttta ttataccttc ttaagttttc aaccaaggtt tgcttttgtt ttgagttact 5700 ggggttattt ttgttttaaa taaaaataag tgtacaataa gtgtttttgt attgaaagct 5760 tttgttatca agattttcat acttttacct tccatggctc tttttaagat tgatactttt 5820 aagaggtggc tgatattctg caacactgta cacataaaaa atacggtaag gatactttac 5880 atggttaagg taaagtaagt ctccagttgg ccaccattag ctataatggc actttgtttg 5940 tgttgttgga aaaagtcaca ttgccattaa actttccttg tctgtctagt taatattgtg 6000 aagaaaaata aagtacagtg tgagatactg 6030 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met 1 5 10 15 Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala 20 25 30 Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile 35 40 45 Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Thr Ala Ala Ser Arg Asp 50 55 60 Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr 85 90 95 Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe 100 105 110 Ala Glu Met Ser Arg Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly 115 120 125 Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp 130 135 140 Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu 145 150 155 160 Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp 165 170 175 Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn 180 185 190 Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro 195 200 205 Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala 210 215 220 Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Gly His Lys 225 230 235 <210> 3 <211> 6492 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <301> Saltman,B., Singh,B., Hedvat,C.V., Wreesmann,V.B. and Ghossein,R. <302> Patterns of expression of cell cycle/apoptosis genes along the spectrum of thyroid carcinoma progression <303> Surgery <304> 140 <305> 6 <306> 899-905 <307> 2006 <300> <301> Haydee Cottliar,A.S., Noriega,M.F., Narbaitz,M., Rodriguez,A. Slavutsky,I.R. <302> Association between telomere length and BCL2 gene rearrangements in low- and high-grade non-Hodgkin lymphomas <303> Cancer Genet. Cytogenet. <304> 171 <305> 1 <306> 1-8 <307> 2006 <300> <301> Maluf,F.C., Cordon-Cardo,C., Verbel,D.A., Satagopan,J.M., Boyle,M.G., Herr,H. Bajorin,D.F. <302> Assessing interactions between mdm-2, p53, and bcl-2 as prognostic variables in muscle-invasive bladder cancer treated with neo-adjuvant chemotherapy followed by locoregional surgical <303> Ann. Oncol. <304> 17 <305> 11 <306> 1677-1686 <307> 2006 <300> <301> Porebska,I., Wyrodek,E., Kosacka,M., Adamiak,J., Jankowska,R. Harlozinska-Szmyrka,A. <302> Apoptotic markers p53, Bcl-2 and Bax in primary lung cancer <303> In Vivo <304> 20 <305> 5 <306> 599-604 <307> 2006 <400> 3 tttctgtgaa gcagaagtct gggaatcgat ctggaaatcc tcctaatttt tactccctct 60 ccccgcgact cctgattcat tgggaagttt caaatcagct ataactggag agtgctgaag 120 attgatggga tcgttgcctt atgcatttgt tttggtttta caaaaaggaa acttgacaga 180 ggatcatgct gtacttaaaa aatacaacat cacagaggaa gtagactgat attaacaata 240 cttactaata ataacgtgcc tcatgaaata aagatccgaa aggaattgga ataaaaattt 300 cctgcatctc atgccaaggg ggaaacacca gaatcaagtg ttccgcgtga ttgaagacac 360 cccctcgtcc aagaatgcaa agcacatcca ataaaatagc tggattataa ctcctcttct 420 ttctctgggg gccgtggggt gggagctggg gcgagaggtg ccgttggccc ccgttgcttt 480 tcctctggga aggatggcgc acgctgggag aacagggtac gataaccggg agatagtgat 540 gaagtacatc cattataagc tgtcgcagag gggctacgag tgggatgcgg gagatgtggg 600 cgccgcgccc ccgggggccg cccccgcacc gggcatcttc tcctcccagc ccgggcacac 660 gccccatcca gccgcatccc gggacccggt cgccaggacc tcgccgctgc agaccccggc 720 tgcccccggc gccgccgcgg ggcctgcgct cagcccggtg ccacctgtgg tccacctgac 780 cctccgccag gccggcgacg acttctcccg ccgctaccgc cgcgacttcg ccgagatgtc 840 cagccagctg cacctgacgc ccttcaccgc gcggggacgc tttgccacgg tggtggagga 900 gctcttcagg gacggggtga actgggggag gattgtggcc ttctttgagt tcggtggggt 960 catgtgtgtg gagagcgtca accgggagat gtcgcccctg gtggacaaca tcgccctgtg 1020 gatgactgag tacctgaacc ggcacctgca cacctggatc caggataacg gaggctggga 1080 tgcctttgtg gaactgtacg gccccagcat gcggcctctg tttgatttct cctggctgtc 1140 tctgaagact ctgctcagtt tggccctggt gggagcttgc atcaccctgg gtgcctatct 1200 gggccacaag tgaagtcaac atgcctgccc caaacaaata tgcaaaaggt tcactaaagc 1260 agtagaaata atatgcattg tcagtgatgt accatgaaac aaagctgcag gctgtttaag 1320 aaaaaataac acacatataa acatcacaca cacagacaga cacacacaca cacaacaatt 1380 aacagtcttc aggcaaaacg tcgaatcagc tatttactgc caaagggaaa tatcatttat 1440 tttttacatt attaagaaaa aaagatttat ttatttaaga cagtcccatc aaaactcctg 1500 tctttggaaa tccgaccact aattgccaag caccgcttcg tgtggctcca cctggatgtt 1560 ctgtgcctgt aaacatagat tcgctttcca tgttgttggc cggatcacca tctgaagagc 1620 agacggatgg aaaaaggacc tgatcattgg ggaagctggc tttctggctg ctggaggctg 1680 gggagaaggt gttcattcac ttgcatttct ttgccctggg ggctgtgata ttaacagagg 1740 gagggttcct gtggggggaa gtccatgcct ccctggcctg aagaagagac tctttgcata 1800 tgactcacat gatgcatacc tggtgggagg aaaagagttg ggaacttcag atggacctag 1860 tacccactga gatttccacg ccgaaggaca gcgatgggaa aaatgccctt aaatcatagg 1920 aaagtatttt tttaagctac caattgtgcc gagaaaagca ttttagcaat ttatacaata 1980 tcatccagta ccttaagccc tgattgtgta tattcatata ttttggatac gcacccccca 2040 actcccaata ctggctctgt ctgagtaaga aacagaatcc tctggaactt gaggaagtga 2100 acatttcggt gacttccgca tcaggaaggc tagagttacc cagagcatca ggccgccaca 2160 agtgcctgct tttaggagac cgaagtccgc agaacctgcc tgtgtcccag cttggaggcc 2220 tggtcctgga actgagccgg ggccctcact ggcctcctcc agggatgatc aacagggcag 2280 tgtggtctcc gaatgtctgg aagctgatgg agctcagaat tccactgtca agaaagagca 2340 gtagaggggt gtggctgggc ctgtcaccct ggggccctcc aggtaggccc gttttcacgt 2400 ggagcatggg agccacgacc cttcttaaga catgtatcac tgtagaggga aggaacagag 2460 gccctgggcc cttcctatca gaaggacatg gtgaaggctg ggaacgtgag gagaggcaat 2520 ggccacggcc cattttggct gtagcacatg gcacgttggc tgtgtggcct tggcccacct 2580 gtgagtttaa agcaaggctt taaatgactt tggagagggt cacaaatcct aaaagaagca 2640 ttgaagtgag gtgtcatgga ttaattgacc cctgtctatg gaattacatg taaaacatta 2700 tcttgtcact gtagtttggt tttatttgaa aacctgacaa aaaaaaagtt ccaggtgtgg 2760 aatatggggg ttatctgtac atcctggggc attaaaaaaa aaatcaatgg tggggaacta 2820 taaagaagta acaaaagaag tgacatcttc agcaaataaa ctaggaaatt tttttttctt 2880 ccagtttaga atcagccttg aaacattgat ggaataactc tgtggcatta ttgcattata 2940 taccatttat ctgtattaac tttggaatgt actctgttca atgtttaatg ctgtggttga 3000 tatttcgaaa gctgctttaa aaaaatacat gcatctcagc gtttttttgt ttttaattgt 3060 atttagttat ggcctataca ctatttgtga gcaaaggtga tcgttttctg tttgagattt 3120 ttatctcttg attcttcaaa agcattctga gaaggtgaga taagccctga gtctcagcta 3180 cctaagaaaa acctggatgt cactggccac tgaggagctt tgtttcaacc aagtcatgtg 3240 catttccacg tcaacagaat tgtttattgt gacagttata tctgttgtcc ctttgacctt 3300 gtttcttgaa ggtttcctcg tccctgggca attccgcatt taattcatgg tattcaggat 3360 tacatgcatg tttggttaaa cccatgagat tcattcagtt aaaaatccag atggcaaatg 3420 accagcagat tcaaatctat ggtggtttga cctttagaga gttgctttac gtggcctgtt 3480 tcaacacaga cccacccaga gccctcctgc cctccttccg cgggggcttt ctcatggctg 3540 tccttcaggg tcttcctgaa atgcagtggt gcttacgctc caccaagaaa gcaggaaacc 3600 tgtggtatga agccagacct ccccggcggg cctcagggaa cagaatgatc agacctttga 3660 atgattctaa tttttaagca aaatattatt ttatgaaagg tttacattgt caaagtgatg 3720 aatatggaat atccaatcct gtgctgctat cctgccaaaa tcattttaat ggagtcagtt 3780 tgcagtatgc tccacgtggt aagatcctcc aagctgcttt agaagtaaca atgaagaacg 3840 tggacgtttt taatataaag cctgttttgt cttttgttgt tgttcaaacg ggattcacag 3900 agtatttgaa aaatgtatat atattaagag gtcacggggg ctaattgctg gctggctgcc 3960 ttttgctgtg gggttttgtt acctggtttt aataacagta aatgtgccca gcctcttggc 4020 cccagaactg tacagtattg tggctgcact tgctctaaga gtagttgatg ttgcattttc 4080 cttattgtta aaaacatgtt agaagcaatg aatgtatata aaagcctcaa ctagtcattt 4140 ttttctcctc ttcttttttt tcattatatc taattatttt gcagttgggc aacagagaac 4200 catccctatt ttgtattgaa gagggattca catctgcatc ttaactgctc tttatgaatg 4260 aaaaaacagt cctctgtatg tactcctctt tacactggcc agggtcagag ttaaatagag 4320 tatatgcact ttccaaattg gggacaaggg ctctaaaaaa agccccaaaa ggagaagaac 4380 atctgagaac ctcctcggcc ctcccagtcc ctcgctgcac aaatactccg caagagaggc 4440 cagaatgaca gctgacaggg tctatggcca tcgggtcgtc tccgaagatt tggcaggggc 4500 agaaaactct ggcaggctta agatttggaa taaagtcaca gaattaagga agcacctcaa 4560 tttagttcaa acaagacgcc aacattctct ccacagctca cttacctctc tgtgttcaga 4620 tgtggccttc catttatatg tgatctttgt tttattagta aatgcttatc atctaaagat 4680 gtagctctgg cccagtggga aaaattagga agtgattata aatcgagagg agttataata 4740 atcaagatta aatgtaaata atcagggcaa tcccaacaca tgtctagctt tcacctccag 4800 gatctattga gtgaacagaa ttgcaaatag tctctatttg taattgaact tatcctaaaa 4860 caaatagttt ataaatgtga acttaaactc taattaattc caactgtact tttaaggcag 4920 tggctgtttt tagactttct tatcacttat agttagtaat gtacacctac tctatcagag 4980 aaaaacagga aaggctcgaa atacaagcca ttctaaggaa attagggagt cagttgaaat 5040 tctattctga tcttattctg tggtgtcttt tgcagcccag acaaatgtgg ttacacactt 5100 tttaagaaat acaattctac attgtcaagc ttatgaaggt tccaatcaga tctttattgt 5160 tattcaattt ggatctttca gggatttttt ttttaaatta ttatgggaca aaggacattt 5220 gttggagggg tgggagggag gaagaatttt taaatgtaaa acattcccaa gtttggatca 5280 gggagttgga agttttcaga ataaccagaa ctaagggtat gaaggacctg tattggggtc 5340 gatgtgatgc ctctgcgaag aaccttgtgt gacaaatgag aaacattttg aagtttgtgg 5400 tacgaccttt agattccaga gacatcagca tggctcaaag tgcagctccg tttggcagtg 5460 caatggtata aatttcaagc tggatatgtc taatgggtat ttaaacaata aatgtgcagt 5520 tttaactaac aggatattta atgacaacct tctggttggt agggacatct gtttctaaat 5580 gtttattatg tacaatacag aaaaaaattt tataaaatta agcaatgtga aactgaattg 5640 gagagtgata atacaagtcc tttagtctta cccagtgaat cattctgttc catgtctttg 5700 gacaaccatg accttggaca atcatgaaat atgcatctca ctggatgcaa agaaaatcag 5760 atggagcatg aatggtactg taccggttca tctggactgc cccagaaaaa taacttcaag 5820 caaacatcct atcaacaaca aggttgttct gcataccaag ctgagcacag aagatgggaa 5880 cactggtgga ggatggaaag gctcgctcaa tcaagaaaat tctgagacta ttaataaata 5940 agactgtagt gtagatactg agtaaatcca tgcacctaaa ccttttggaa aatctgccgt 6000 gggccctcca gatagctcat ttcattaagt ttttccctcc aaggtagaat ttgcaagagt 6060 gacagtggat tgcatttctt ttggggaagc tttcttttgg tggttttgtt tattatacct 6120 tcttaagttt tcaaccaagg tttgcttttg ttttgagtta ctggggttat ttttgtttta 6180 aataaaaata agtgtacaat aagtgttttt gtattgaaag cttttgttat caagattttc 6240 atacttttac cttccatggc tctttttaag attgatactt ttaagaggtg gctgatattc 6300 tgcaacactg tacacataaa aaatacggta aggatacttt acatggttaa ggtaaagtaa 6360 gtctccagtt ggccaccatt agctataatg gcactttgtt tgtgttgttg gaaaaagtca 6420 cattgccatt aaactttcct tgtctgtcta gttaatattg tgaagaaaaa taaagtacag 6480 tgtgagatac tg 6492 <210> 4 <211> 239 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met 1 5 10 15 Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala 20 25 30 Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile 35 40 45 Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp 50 55 60 Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr 85 90 95 Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe 100 105 110 Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly 115 120 125 Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp 130 135 140 Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu 145 150 155 160 Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp 165 170 175 Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn 180 185 190 Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro 195 200 205 Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala 210 215 220 Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Gly His Lys 225 230 235 <210> 5 <211> 1207 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tttctgtgaa gcagaagtct gggaatcgat ctggaaatcc tcctaatttt tactccctct 60 ccccgcgact cctgattcat tgggaagttt caaatcagct ataactggag agtgctgaag 120 attgatggga tcgttgcctt atgcatttgt tttggtttta caaaaaggaa acttgacaga 180 ggatcatgct gtacttaaaa aatacaacat cacagaggaa gtagactgat attaacaata 240 cttactaata ataacgtgcc tcatgaaata aagatccgaa aggaattgga ataaaaattt 300 cctgcatctc atgccaaggg ggaaacacca gaatcaagtg ttccgcgtga ttgaagacac 360 cccctcgtcc aagaatgcaa agcacatcca ataaaatagc tggattataa ctcctcttct 420 ttctctgggg gccgtggggt gggagctggg gcgagaggtg ccgttggccc ccgttgcttt 480 tcctctggga aggatggcgc acgctgggag aacagggtac gataaccggg agatagtgat 540 gaagtacatc cattataagc tgtcgcagag gggctacgag tgggatgcgg gagatgtggg 600 cgccgcgccc ccgggggccg cccccgcacc gggcatcttc tcctcccagc ccgggcacac 660 gccccatcca gccgcatccc gggacccggt cgccaggacc tcgccgctgc agaccccggc 720 tgcccccggc gccgccgcgg ggcctgcgct cagcccggtg ccacctgtgg tccacctgac 780 cctccgccag gccggcgacg acttctcccg ccgctaccgc cgcgacttcg ccgagatgtc 840 cagccagctg cacctgacgc ccttcaccgc gcggggacgc tttgccacgg tggtggagga 900 gctcttcagg gacggggtga actgggggag gattgtggcc ttctttgagt tcggtggggt 960 catgtgtgtg gagagcgtca accgggagat gtcgcccctg gtggacaaca tcgccctgtg 1020 gatgactgag tacctgaacc ggcacctgca cacctggatc caggataacg gaggctgggt 1080 aggtgcactt ggtgatgtga gtctgggctg aggccacagg tccgagatgc gggggttgga 1140 gtgcgggtgg gctcctgggg caatgggagg ctgtggagcc ggcgaaataa aatcagagtt 1200 gttgcta 1207 <210> 6 <211> 205 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met 1 5 10 15 Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala 20 25 30 Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile 35 40 45 Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp 50 55 60 Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr 85 90 95 Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe 100 105 110 Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly 115 120 125 Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp 130 135 140 Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu 145 150 155 160 Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp 165 170 175 Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn 180 185 190 Gly Gly Trp Val Gly Ala Leu Gly Asp Val Ser Leu Gly 195 200 205

Claims (41)

  1. 생물학적 샘플 내 Bcl-2의 존재여부를 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 소정의 자극역치를 초과하는 Bcl-2 수치가 상기 숙주 내 암의 표지자인 것인, 숙주 내에서 암을 발견하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 검출하는 단계가 상기 생물학적 샘플 내 Bcl-2 단백질을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 검출하는 단계가 상기 생물학적 샘플 내 Bcl-2 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 검출하는 단계가: (a) 복합체를 형성하기 위하여 상기 생물학적 샘플을 Bcl-2 단백질을 결합하는 결합제와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 복합체를 검출하는 단계; 및 상기 검출된 복합체를 상기 샘플 내 Bcl-2 단백질에 연관시키는 단계를 포함하며, 이때 증가된 Bcl-2 단백질의 존재가 암 표지자인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 뇨(urine), 전혈(whole blood), 혈청, 혈장, 복수, 및 복막액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생물학적 유체인 방 법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 뇨인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 암이 난소암, 원발성 복막암(primary peritoneal cancer), 및 자궁내막암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 암이 난소암인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 뇨(urine) 또는 혈액이고, 상기 암이 난소암인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 암이 유방암, 자궁내막암, 자궁경부암, 폐암, 결장암, 전립선암, 흑색종, 아교모세포종, 육종, 방광암, 및 두경부암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 뇨 또는 혈액이고, 상기 암이 전립선암인 방법.
  12. 제4항에 있어서, 상기 결합제는 지지체 상에 고정되어 있는 방법.
  13. 제4항에 있어서, 상기 결합제는 단일클론 항체 또는 다클론 항체인 방법.
  14. 제4항에 있어서, 상기 단계(b)는 상기 결합제 상에 표지(label)를 연결하거나 부착하는 단계를 더 포함하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 단계(b)는 ELISA-기반 면역효소 검출을 이용하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 Bcl-2를 검출하는 단계 이전, 도중, 또는 이후에, 숙주에서 획득한 동일하거나 상이한 생물학적 샘플 내에서 암에 대한 생물 마커를 검출하는 단계를 더 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 암에 대한 생물 마커는 부인암의 생물 마커인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 생물 마커는 CA125,LPA, 또는 OVXI인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 숙주가 암으로 고통받고 있으며, 상기 발견하는 단계가 상기 암 치료 이전, 도중, 또는 이후에 상기 숙주에 대한 모니터링의 일환으로서 간격을 두고 수차례 수행되는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플 내 Bcl-2 수치를 정상 대조구 샘플 내의 Bcl-2 수치와 비교하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 정상 대조구 샘플 내의 수치에 비해서 더 높은 상기 생물학적 샘플 내 Bcl-2 수치가 난소암 등의 암에 대한 표지가 되는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 숙주는 상기 검출하는 단계가 진행되는 시점에 아무런 암의 증후를 나타내지 않는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 숙주는 상기 검출하는 단계가 진행되는 시점에 하나 이상의 암의 증후를 나타내는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 숙주가 골반통, 이상 질출혈, 복부 종창 또는 팽만, 지속성 등통, 지속성 위경련, 배변 또는 배뇨 변화, 성교통, 10파운드 이상의 비자발적 체중감소, 외음부 또는 질 이상, 유방 변화, 및 피로로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 증후를 나타내는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 숙주는 상기 검출하는 단계가 진행되는 시점에 혈액 내 증가된 CA125 수치를 가지는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 숙주는 상기 검출하는 단계가 진행되는 시점에 혈액 내 증가된 CA125 수치를 갖지 않는 방법.
  26. a) 숙주에게서 획득한 생물학적 샘플 내 Bcl-2 수치를 결정하는 단계;
    b) 단계(a)에서 결정된 수치를 암을 보유하지 않은 정상 숙주에게서 획득한 생물학적 샘플 내 존재하는 것으로 알려진 Bcl-2의 범위와 비교하는 단계; 및
    c) 단계(b) 비교에 기초하여 상기 숙주의 예후를 결정하는 단계를 포함하며,
    여기서 단계(a) 단계에서 높은 수치의 Bcl-2는 분명하게 암을 표지하고, 따라서 빈약한 예후를 표지하는 것인,
    암을 보유하고 있거나, 보유하는 것으로 의심되는 숙주의 예후 평가를 위한 방법.
  27. 신체 분비액의 샘플을 주입받기 위한 어플리케이션 존; 상기 샘플 내의 Bcl-2에 결합하는 결합제를 포함하는 라벨링 존; 및 신호를 보내기 위해 Bcl-2-결합 결합제를 보유하는 디텍션 존을 포함하며,
    여기서 역치 농도보다 낮은 Bcl-2 수치를 가진 숙주로부터의 샘플에 대해 주어진 신호가, 역치 농도보다 높은 Bcl-2 수치를 가진 숙주로부터의 샘플에 대해 주어진 신호와 상이한 것인,
    신체 분비물의 샘플 내 Bcl-2의 신속한 검출을 위한 장치.
  28. 제27항에 있어서, 상기 신체 분비액은 뇨이고, 상기 역치 농도는 0 ng/ml과 2.0 ng/ml 사이인 장치.
  29. 제27항에 있어서, 상기 신체 분비액은 뇨이고, 상기 역치 농도는 1.8 ng/ml인 장치.
  30. 제27항에 있어서, 상기 역치 농도와 동일한 Bcl-2 수치를 갖는 숙주로부터의 샘플에 대해 상기 디텍션 존에서 주어진 신호와 동일한 강도를 갖는 신호를 포함하는 표준 존(reference zone)을 포함하는 장치.
  31. 제27항에 있어서, 상기 결합제는 태그되어 있는 항체인 장치.
  32. 제27항에 있어서, 상기 항체는 콜로이드 금으로 태그되어 있는 장치.
  33. 제27항에 있어서, 상기 디텍션 존은 고정된 항-Bcl-2 항체를 포함하는 장치.
  34. 제27항에 있어서, 상기 장치는 상기 디텍션 존 하방에 상기 디텍션 존을 통과하는 결합제를 보유하는 컨트롤 존을 포함하는 장치.
  35. 제27항에 있어서, 상기 컨트롤 존 및 상기 표준 존은 동일한 존인 장치.
  36. 제27항에 있어서, 상기 결합제는 태그되어 있는 단일클론 항체인 장치.
  37. (a) 신체 분비액 샘플을 숙주에게서 습득하는 단계;
    (b) 상기 샘플을 샘플 내 Bcl-2에 결합하는 결합제와 접촉시키는 단계;
    (c) Bcl-2-결합 결합제를 분리하는 단계;
    (d) 단계(c)에서 분리된 상기 결합제와 연관된 신호를 감지하는 단계; 및
    (e) 단계(d)에서 감지된 신호를, 역치 농도와 동일 수준의 Bcl-2를 지닌 숙주로부터의 샘플에서 주어진 신호에 해당하는 참조 신호와 비교하는 단계를 포함하는, 신체 분비액 내 Bcl-2를 측정하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 신체 분비액은 뇨이고, 상기 역치 농도는 0 ng/ml과 2.0 ng/ml 사이인 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 신체 분비액은 뇨이고, 상기 역치 농도는 1.8 ng/ml인 방법.
  40. Bcl-2에 특이적인 결합제, 및 상기 결합제를 이용하여 생물학적 유체 내 암 발견을 위한 인쇄된 사용설명을 포함하는, 생물학적 샘플 내 암 발견을 위한 키트.
  41. 제40항에 있어서, 생물학적 샘플에 사용되는 하나 이상의 프로테아제 억제자를 더 포함하는 키트.
KR1020087019574A 2006-02-09 2007-02-09 증가된 ｂｃｌ-2에 의한 암의 발견 KR20080114689A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77167706P 2006-02-09 2006-02-09
US60/771,677 2006-02-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080114689A true KR20080114689A (ko) 2008-12-31

Family

ID=38345845

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087019574A KR20080114689A (ko) 2006-02-09 2007-02-09 증가된 ｂｃｌ-2에 의한 암의 발견

Country Status (16)

Country Link
US (4) US8034549B2 (ko)
EP (1) EP1996940B1 (ko)
JP (1) JP4896994B2 (ko)
KR (1) KR20080114689A (ko)
CN (1) CN101384903A (ko)
AT (1) ATE538386T1 (ko)
AU (1) AU2007212278A1 (ko)
BR (1) BRPI0707645B8 (ko)
CA (1) CA2642051C (ko)
IL (1) IL192866A (ko)
NO (1) NO20083820L (ko)
NZ (1) NZ570008A (ko)
RU (1) RU2436098C2 (ko)
SG (1) SG169395A1 (ko)
WO (1) WO2007092627A2 (ko)
ZA (1) ZA200805787B (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021112635A3 (ko) * 2019-12-06 2021-07-29 주식회사 프로티나 Bcl2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 방법

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060078893A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
GB0307403D0 (en) * 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
GB0307428D0 (en) * 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
US20050221339A1 (en) * 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
AU2006335290A1 (en) 2006-01-11 2007-07-19 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors
ATE538386T1 (de) 2006-02-09 2012-01-15 Univ South Florida Nachweis von krebs anhand von erhöhten bcl-2- konzentrationen
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
US20080014589A1 (en) 2006-05-11 2008-01-17 Link Darren R Microfluidic devices and methods of use thereof
CN101449162B (zh) * 2006-05-18 2013-07-31 分子压型学会股份有限公司 确定针对病状的个性化医疗介入的系统和方法
US8768629B2 (en) * 2009-02-11 2014-07-01 Caris Mpi, Inc. Molecular profiling of tumors
WO2008021123A1 (en) 2006-08-07 2008-02-21 President And Fellows Of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
WO2008097559A2 (en) 2007-02-06 2008-08-14 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
US8592221B2 (en) * 2007-04-19 2013-11-26 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
US20100256610A1 (en) * 2007-10-25 2010-10-07 Basil Rigas Apparatus and method of detection and localized treatment of abnormal conditions
EP4047367A1 (en) 2008-07-18 2022-08-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting target analytes with droplet libraries
EP2338056B1 (en) * 2008-10-10 2018-01-03 Dana Farber Cancer Institute Chemical modulators of pro-apoptotic bax and bcl-2 polypeptides
EP2411148B1 (en) 2009-03-23 2018-02-21 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
WO2010115196A1 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Candela Corporation Skin resurfacing at 1930 nm
PL2456889T3 (pl) * 2009-07-24 2015-02-27 Geadic Biotec Aie Markery diagnostyczne raka błony śluzowej trzonu macicy
EP2486409A1 (en) 2009-10-09 2012-08-15 Universite De Strasbourg Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
WO2011056688A2 (en) * 2009-10-27 2011-05-12 Caris Life Sciences, Inc. Molecular profiling for personalized medicine
US10837883B2 (en) 2009-12-23 2020-11-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets
EP2534267B1 (en) 2010-02-12 2018-04-11 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US9562897B2 (en) 2010-09-30 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
ES2627061T3 (es) * 2010-11-05 2017-07-26 Morphotek, Inc. Folato receptor alfa como diagnóstico y pronóstico para el folato marcador receptor de los cánceres expresores de alfa
EP3412778A1 (en) 2011-02-11 2018-12-12 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
EP2675819B1 (en) 2011-02-18 2020-04-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
CN103688174A (zh) * 2011-02-23 2014-03-26 麦多索有限公司 用于个人肿瘤作图治疗的组合物和方法
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
DE202012013668U1 (de) 2011-06-02 2019-04-18 Raindance Technologies, Inc. Enzymquantifizierung
EP2729486B1 (en) * 2011-07-09 2017-12-13 The Regents of The University of California Leukemia stem cell targeting ligands and methods of use
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
EP2742358A4 (en) * 2011-09-08 2015-08-12 Univ Ben Gurion METHOD FOR THE DIAGNOSIS OF CANCER
CA2849817A1 (en) * 2011-09-22 2013-03-28 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Detecting ovarian cancer
JP2014531031A (ja) * 2011-10-21 2014-11-20 デシマドックス， エルエルシー 小分析物の定量的検出のためのポイントオブケア免疫アッセイ
EP3495817A1 (en) 2012-02-10 2019-06-12 Raindance Technologies, Inc. Molecular diagnostic screening assay
WO2013165748A1 (en) 2012-04-30 2013-11-07 Raindance Technologies, Inc Digital analyte analysis
WO2014172288A2 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
ES2951470T3 (es) 2013-08-19 2023-10-23 Shuwen Biotech Co Ltd Métodos y kits para la subtipificación molecular de tumores
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
EP3090063B1 (en) 2013-12-31 2019-11-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detection of latent retrovirus
CA2951514A1 (en) 2014-06-18 2015-12-23 Clear Gene, Inc. Methods, compositions, and devices for rapid analysis of biological markers
CA2961613A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Hologic, Inc. Method of partial lysis and assay
GB201417281D0 (en) * 2014-09-30 2014-11-12 Ge Healthcare Uk Ltd Methods and devices relating to the detection of oral cancer biomarkers
JP5995117B2 (ja) * 2015-01-26 2016-09-21 国立大学法人 筑波大学 可溶型ｃｄ１５５タンパク質を用いた癌の検出方法
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
AU2016369603A1 (en) 2015-12-18 2018-07-05 Clear Gene, Inc. Methods, compositions, kits and devices for rapid analysis of biological markers
US10998178B2 (en) 2017-08-28 2021-05-04 Purdue Research Foundation Systems and methods for sample analysis using swabs
WO2020010304A2 (en) * 2018-07-05 2020-01-09 Ovation Diagnostics Llc BCl-2 Antibodies and Immunoassay for Diagnosis of Cancer
CN109374897B (zh) * 2018-11-22 2021-11-02 大连大学 一种用于肝癌检测的试剂盒
US20230183808A1 (en) * 2020-04-21 2023-06-15 Carlo M. Croce Methods of Detecting and Treating Cancers Characterized by Loss of miR15 and miR16 Expression
CN111679076A (zh) * 2020-06-15 2020-09-18 吉林医药学院 一种用于检测cyclinD1和BCL-2抗体的检测试剂盒
WO2023239572A1 (en) * 2022-06-01 2023-12-14 Northeastern University Enhanced specificity mass tag dna adductomics

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3654090A (en) 1968-09-24 1972-04-04 Organon Method for the determination of antigens and antibodies
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US4016043A (en) 1975-09-04 1977-04-05 Akzona Incorporated Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies
US4381291A (en) 1979-02-23 1983-04-26 Ab Fortia Measurement of free ligands
US4260678A (en) 1979-02-23 1981-04-07 Corning Glass Works Determining creatine kinase isoenzmes via immobilized antibody-isoenzyme complexes
US4343312A (en) 1979-04-16 1982-08-10 Vitafin N.V. Pacemaker output circuit
FR2455743A1 (fr) 1979-05-02 1980-11-28 Goella Laboratoires Procede et dispositif pour le dosage des lipoproteines seriques
US4357311A (en) 1980-10-03 1982-11-02 Warner-Lambert Company Substrate for immunoassay and means of preparing same
US4867973A (en) 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
JPS59500735A (ja) 1983-04-18 1984-04-26 エス・ア−ル・アイ・インタ−ナシヨナル 人間の癌診断のための方法および試験キツト
US4582789A (en) 1984-03-21 1986-04-15 Cetus Corporation Process for labeling nucleic acids using psoralen derivatives
US4617261A (en) 1984-03-21 1986-10-14 Cetus Corporation Process for labeling nucleic acids and hybridization probes
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5015568A (en) * 1986-07-09 1991-05-14 The Wistar Institute Diagnostic methods for detecting lymphomas in humans
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5356817A (en) 1988-06-09 1994-10-18 Yale University Methods for detecting the onset, progression and regression of gynecologic cancers
US5312922A (en) 1992-04-06 1994-05-17 Nordion International Inc. Europium and terbium chelators for time-resolved fluorometric assays
KR100295970B1 (ko) * 1993-03-17 2001-11-22 에프.지.엠. 헤르만스 ; 이.에이치. 리링크 특이적반응물질을검출하는장치
US5539094A (en) * 1993-11-12 1996-07-23 La Jolla Cancer Research Foundation DNA encoding Bcl-2-associated proteins
US5695944A (en) * 1995-05-05 1997-12-09 Thomas Jefferson University Modulation of bcl-2 phosphorylation
US6811995B1 (en) 1996-04-26 2004-11-02 Children's Medical Center Corporation Non-invasive enzyme screen for cancer
US5821082A (en) * 1996-05-23 1998-10-13 St. Louis University Health Sciences Center Anti-proliferation domain of a human Bcl-2 and DNA encoding the same
DE19936618A1 (de) 1999-08-04 2001-03-15 Monotec Gmbh Diagnostisches Kit und dessen Verwendung
AU2001233156A1 (en) * 2000-02-01 2001-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Bcl-2-like polynucleotides, polypeptides, and antibodies
KR100414637B1 (ko) 2000-02-08 2004-01-13 (주)에스제이바이오메드 사람 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임들에대한 항체와 면역학적 제제 및 심장질환 진단키트
AU2001253140A1 (en) 2000-04-03 2001-10-15 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Tumor markers in ovarian cancer
US6492127B2 (en) * 2001-01-23 2002-12-10 Varian, Inc. Lateral flow testing device with on-board chemical reactant
WO2002090931A2 (en) 2001-05-07 2002-11-14 The Burnham Institute Methods for determining the prognosis for cancer patients using tucan
ATE366938T1 (de) * 2001-05-07 2007-08-15 Burnham Inst Verfahren zur bestimmung der prognose von krebspatienten mittels tucan
DK1918386T3 (da) * 2002-03-13 2012-01-02 Genomic Health Inc Genekspressionsprofiler i biopsier af tumorvæv
KR20030092378A (ko) 2002-05-29 2003-12-06 박영미 고형암의 진행 정도를 진단하는 방법 및 키트
WO2003105899A1 (en) * 2002-06-13 2003-12-24 Neuropro Technologies, Inc. Apparatus and methods for detecting cerebrospinal fluid
CN1402004A (zh) * 2002-09-27 2003-03-12 江西中德生物工程有限公司 一种免疫层析一步法检测β－肾上腺素激动剂类药物的方法及试纸的制备
US20040137538A1 (en) * 2003-01-10 2004-07-15 Bradford Sherry A. Cancer comprehensive assay kit for identifying cancer protein patterns
US7288383B2 (en) 2003-01-15 2007-10-30 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Eosinophil-derived neurotoxin as a marker for ovarian cancer
DE602005012299D1 (de) * 2004-09-30 2009-02-26 Quidel Corp Analysevorrichtungen mit primären und sekundären strömungswegen
ATE538386T1 (de) 2006-02-09 2012-01-15 Univ South Florida Nachweis von krebs anhand von erhöhten bcl-2- konzentrationen

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021112635A3 (ko) * 2019-12-06 2021-07-29 주식회사 프로티나 Bcl2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 방법

Also Published As

Publication number Publication date
ATE538386T1 (de) 2012-01-15
US8034549B2 (en) 2011-10-11
EP1996940A2 (en) 2008-12-03
CN101384903A (zh) 2009-03-11
RU2008136193A (ru) 2010-03-20
SG169395A1 (en) 2011-03-30
US11156613B2 (en) 2021-10-26
CA2642051C (en) 2017-01-24
WO2007092627A3 (en) 2008-11-13
EP1996940B1 (en) 2011-12-21
JP2009526234A (ja) 2009-07-16
BRPI0707645B1 (pt) 2019-04-09
RU2436098C2 (ru) 2011-12-10
US20160258960A1 (en) 2016-09-08
EP1996940A4 (en) 2009-10-21
IL192866A (en) 2013-04-30
NO20083820L (no) 2008-11-07
AU2007212278A1 (en) 2007-08-16
US20110318763A1 (en) 2011-12-29
US20080009005A1 (en) 2008-01-10
CA2642051A1 (en) 2007-08-16
BRPI0707645B8 (pt) 2021-07-27
WO2007092627A2 (en) 2007-08-16
BRPI0707645A2 (pt) 2011-05-10
JP4896994B2 (ja) 2012-03-14
WO2007092627A9 (en) 2007-10-18
ZA200805787B (en) 2009-05-27
NZ570008A (en) 2011-10-28
US20190072556A1 (en) 2019-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11156613B2 (en) Detection of cancer by elevated levels of bcl-2
KR101051435B1 (ko) 대장암 관련 마커를 이용한 대장암 진단 키트 및 이를 이용한 대장암 진단 방법
US20100184049A1 (en) Glycoprotein Profiling of Bladder Cancer
US20180238890A1 (en) Methods and materials for detection, diagnosis and management of ovarian cancer
CA2517076A1 (en) Serum macrophage migration inhibitory factor (mif) as marker for prostate cancer
BRPI0707642A2 (pt) taxas de expressço de gene de urina para detecÇço de cÂncer
WO2012027631A2 (en) Methods for detecting anti-he4 antibodies and methods of diagnosis and/or prognosis of conditions associated with he4-expressing cells
WO2016195051A1 (ja) 膵がんを診断するための血漿バイオマーカーパネル
KR20130040294A (ko) 소세포폐암 진단용 조성물 및 소세포폐암 진단키트
US20050136405A1 (en) Novel method for the detection of cancer biomarkers in cervical specimens
KR101901457B1 (ko) 간암 암 줄기세포 특성에 기초한 간암의 신규 바이오마커 및 그의 용도
US20150093768A1 (en) Detection of prostate and bladder cancer
EP2895863A1 (en) New biomarkers for the diagnosis and/or prognosis of clear cell renal cell carcinoma
MX2008010297A (en) Detection of cancer by elevated levels of bcl-2
Kruk Detection ofcancer by elevated levels of BCL-2

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid