JP2021530247A - 癌の診断のためのＢＣｌ−２抗体とイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトＢＣＬ−２をその天然形態で認識するモノクローナル抗体に関する。本発明はまた、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、および癌を診断するためのＢＣＬ−２の量を定量化するためのＥＬＩＳＡおよびラテラルフローアッセイ試験などのイムノアッセイに関する。

Description

癌マーカーとしてのＢＣＬ−２の利用は特許文献１乃至３に記載されている。これらの特許文献がＢＣＬ−２に対する抗体を開示していたものの、規定の製造条件を満たし、さらなる特異性を有する抗体が求められていた。

いくつかの抗ＢＣＬ−２モノクローナル抗体が文献に示されてはいるものの、特有の遺伝的構造およびアミノ酸構造を有し、結合や機能に係る特有の特徴を有する新たな抗ＢＣＬ−２抗体が求められている。

米国特許第８０３４５４９号 米国特許出願公開第２０１１−０３１８７６３号 米国特許出願公開第２０１６−０２５８９６０号

Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｎ， Ｂｅｒｍｕｄｅｚ Ｙ， Ｂａｄｇｗｅｌｌ Ｄ， Ｃｈｅｎ Ｒ， Ｎｉｃｏｓｉａ Ｓ， Ｂａｓｔ Ｊｒ． Ｒ， Ｋｒｕｋ Ｐ． Ｕｒｉｎａｒｙ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｃｃｌ−２ ａｒｅ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１２ （２００９） ６０−６７． Ｃｈａｔｚｉｈａｒａｌａｍｂｏｕｓ Ｄ， Ｌｙｇｉｒｏｕ Ｖ， Ｌａｔｏｓｉｎｓｋａ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ＥＬＩＳＡ Ａｓｓａｙｓ ｉｎ Ｕｒｉｎｅ： Ｏｎｅ Ｍｏｒｅ Ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ ｔｏｗａｒｄｓ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ １１（２）：ｅ０１４９４７１． Ｋｏｉ：１０．１３７／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ ０１４９４７１． ２０１６． Ｔａｙｌｏｒ Ｔ， Ｊａｎｅｃｈ， Ｍ， Ｓｌａｔｅ Ｅ， ｅｔ． ａｌ． Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍａｔｒｉｘ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｔｅｓ． Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ７ （２０１２） １−８．

本発明は、ヒトＢＣＬ−２に結合する抗体およびその断片に関する。該抗体は、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、化学発光標識、コロイド粒子、および放射性同位体標識からなる群から選択された、一つまたは複数の標識で標識されてもよい。

本発明はまた、該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、および、癌を治療し、該抗体またはその抗原結合フラグメントを用いてエキソソームを精製する方法に関する。

本発明はまた、癌を診断する方法に関し、該方法は、抗ＢＣＬ−２抗体を被験者から採取したサンプルに反応させ、該サンプル中のＢＣＬ−２タンパク質を検出し、該サンプル中のＢＣＬ−２タンパク質レベルが、通常のサンプルよりも高い場合に癌と診断し、該被験者から採取したサンプルは、尿サンプル、唾液サンプル、組織サンプル、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、涙、または粘液サンプルからなる群から選択される少なくとも１つの臨床サンプルである。

本発明における抗体は、好ましくはヒトＢＣＬ−２タンパク質に対し特異的結合性を有する単離モノクローナル抗体であり、より好ましくは天然形態のヒトＢＣＬ−２に特異的結合性を有する。

本発明はまた、抗ＢＣＬ−２抗体をベースにした卵巣癌を検出するイムノアッセイに関する。

ヒトＢｃｌ−２配列および二次構造予測。 ＢＣＬ−２とＢＣＬ−ｘの相同性。 ヒトおよびマウスのＢｃｌ−２の相同性。 Ｂｃｌ−２に対するエピトープのアラインメントを示す図。 Ｂｃｌ−２の結合部位の構造予測。 Ｂｃｌ−２の結合部位の構造予測。 Ｂｃｌ−２の結合部位の構造予測。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体の電気泳動図。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体の電気泳動図。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体の電気泳動ゲルの画像。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体のクロマトグラフ。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体の等電ゲル。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体の電気泳動ゲルの画像 本発明におけるＢｃｌ−２抗体のクロマトグラフ。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体の等電ゲル。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体の電気泳動ゲルの画像。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体の等電ゲル。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体のクロマトグラフ。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体の電気泳動ゲルの画像。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体のクロマトグラフ。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体の等電ゲル。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体の電気泳動ゲルの画像。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体の等電ゲル。 本発明におけるＢｃｌ−２抗体のクロマトグラフ。 本発明における抗体の吸光度を示すグラフ。 クローン１０Ａ１２の重鎖のＤＮＡアミノ酸アラインメント。 クローン１０Ａ１２の軽鎖のＤＮＡアミノ酸アラインメント。 クローン１４Ａ０９の重鎖のＤＮＡアミノ酸アラインメントのＤＮＡ。 クローン１４Ａ０９の軽鎖のＤＮＡアミノ酸アラインメントのＤＮＡ。 ラテラルフローアッセイの写真。 ラテラルフローアッセイの写真。 ラテラルフローアッセイの写真。 ラテラルフローアッセイの写真。 ラテラルフローアッセイの写真。 ラテラルフローアッセイの写真。 ラテラルフローアッセイの写真。 ラテラルフローアッセイの写真。 ラテラルフローアッセイの写真。 カセット内のラテラルフローアッセイの写真。

本発明はヒトＢＣＬ−２に結合する抗体およびその断片に関する。抗体は、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、化学発光標識、コロイド粒子、および放射性同位体標識からなる群から選択された、一つまたは複数の標識で標識されていてもよい。

本発明はまた、該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、および、癌を治療し、該抗体またはその抗原結合フラグメントを用いてエキソソームを精製する方法に関する。

本発明はまた、癌を診断する方法に関し、該方法は、抗ＢＣＬ−２抗体を被験者から採取したサンプルに反応させ、該サンプル中のＢＣＬ−２タンパク質を検出し、該サンプル中のＢＣＬ−２タンパク質レベルが、通常のサンプルよりも高い場合に癌と診断し、被験者から採取したサンプルは、組織サンプル、尿サンプル、唾液サンプル、血液サンプル、血清サンプル、および血漿サンプルからなる群から選択された、少なくとも１つのサンプルである。

本発明における抗体は、好ましくはヒトＢＣＬ−２タンパク質に対し特異的結合性を有する単離モノクローナル抗体であり、より好ましくは天然形態のヒトＢＣＬ−２に特異的結合性を有する。

本発明の一形態は、一次抗体がＢｃｌ−２に結合し、基質に固定し、二次抗体は識別のために標識されているＥＬＩＳＡを有する。標識は、通常はビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、化学発光標識、コロイド粒子、および放射性同位体標識から選択される。

「抗体」という用語は、ここでは免疫系（免疫グロブリンまたはＩｇＧ）によりその産生が誘導される、自然発生抗体または抗原結合タンパク質を示すときに用いる。「通常の」抗体は、ジスルフィド結合で結合された２本の重鎖と、２本の軽鎖とを有し、それぞれの重鎖には１本の軽鎖がジスルフィド結合で結合している。それぞれの重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続くいくつかの定常ドメイン（抗体のクラスにより、３個か４個の定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を有する。それぞれの軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を、もう一方の端に定常ドメイン（ＣＬ）を有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の１つ目の定常ドメインとそれぞれ整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインとそれぞれ整列する。このタイプの抗体は、２本の重鎖のみからなる軽鎖の欠けた「特殊な」自然発生抗体と共に、ラクダ、ヒトコブラクダ、およびラマに存在する。他の「特殊な」自然発生抗体は、コモリザメ（コモリザメ科）やオオセ（ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ ｓｈａｒｋ）（オオセ科）の血清に存在する。この後者の抗体は、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）と呼ばれる。これらは、ジスルフィド結合したホモ二量体であり、５個の定常ドメイン（ＣＮＡＲ）と、１個の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）とを有する。軽鎖が無く、個々の可変ドメインは溶液中では独立して存在し、疎水性界面を超えた結合をしないとみられる（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． １９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７４， １６８−１７３； Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ． ２００１， Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３８， ３１３−３２６； Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ． ２００２， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５４， ５０１−５１２； Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ． ２００３， Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７０， ３５４３−３５５４）。ラクダ科とサメの抗体は、重鎖二量体構造という特徴から、「重鎖ミニ抗体」（ｍｎＨＣＡｂ）、または単に「ミニ抗体」（ｍｎＡｂ）と呼ばれることがある（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ＆ Ｈｕｄｓｏｎ ２００５， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３， １１２６−１１３６）。ラクダ抗体とサメ抗体の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）（約１６−２１アミノ酸および約１６−２７アミノ酸をそれぞれ有する）は通常、マウスのＶＨ領域のＣＤＲ３（約９アミノ酸を有する）よりも長い（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ７， １１２９−１１３５； Ｄｏｏｌｅｙ ＆ Ｆｌａｊｎｉｋ ２００５， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３５， ９３６−９４５）。軽鎖が無くとも、これらの重鎖抗体は、Ｖａｂ（ラクダ科抗体）またはＶ−ＮＡＲ（サメ抗体）と呼ばれる重鎖免疫グロブリンの可変抗原結合ドメインである１つのドメインのみで、各抗原に結合する。これらの完全に独立で機能する最小の抗原結合フラグメントＶａｂは、ナノ抗体またはナノボディと呼ばれる（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ２００１， Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７４， ２７７−３０２）。潜在的に細胞内取り込み量や保持力が高いことから、多価の（２価、３価、４価、および５価など）ＶａｂやＶ−ＮＡＲドメインは場合によっては好まれることがあり、組み換え技術や国際公開第２０１０／０３３９１３号に記載されるような化学的手法により作成されてもよい。軽鎖や重鎖の可変ドメインは、抗体の抗原への結合に直接的に関与する。自然発生の軽鎖および重鎖の可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に連結された、一定の一般的な構造である４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を有する（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．を参照）。軽鎖または重鎖のＣＤＲは、ＦＲに近接して保持され、抗原結合部位の形成に寄与する。「抗体断片」という用語は、抗体（親抗体）の１つまたは複数の断片（通常は一つまたは複数のＣＤＲ）を有し、親抗体と同じ抗原に結合するような分子を指す。抗体断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ等）、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、単一可変ＶＨドメイン、および単一可変ＶＬドメインを含む（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ＆ Ｈｕｄｓｏｎ ２００５， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３， １１２６−１１３６）。該用語は更に、マイクロ抗体、言い換えると、通常１つのＣＤＲのみを有する親抗体の最小認識単位を含む（Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ． ２００５， Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８６， １７９１−１８００）。いずれの断片も、多価や多特異的な大きな分子、例えば、単一または二特異的なＦａｂ．ｓｕｂ．２、単一または三特異的なＦａｂ．ｓｕｂ．３、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ（単一または二特異的）、二特異性抗体（単一または二特異的）、三特異性抗体（例えば三価で単一特異的）、四特異性抗体（例えば４価で単一特異的）、およびミニ抗体等に組み込まれ得る（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ＆ Ｈｕｄｓｏｎ ２００５， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３， １１２６−１１３６）。いずれの断片も更に、例えばサメ抗体のＶ−ＮＡＲドメインやラクダ科抗体（ナノ抗体）のＶｈＨドメインに組み込まれ得る。これらは全て「抗体断片」という用語に含まれる。

「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団のことを指す。一般に異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対する。「モノクローナル」の語は、特定の方法で抗体を作成することを要するとは解されない。例えば、本発明おいて用いられるモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ １９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５−４９７にて最初に記載されたハイブリドーマ法で作成されてもよく、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号）で作成されてもよい。モノクローナル抗体はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５２， ６２４−６２８ ｏｒ Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２， ５８１−５９７に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離されてもよく、その他の手法や技術を用いて作成されてもよい。

ハイブリドーマ法において、マウスや、他のハムスターやマカク属サル等の適切な宿主動物は、免疫付与に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、もしくは産生可能な末梢血リンパ球に対し免疫付与される（Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ； Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８８）。

本発明はまた、本発明の抗体をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施例においては、抗原特異的抗体における重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とを異なる核酸分子がコードしている。他の実施例においては、抗原特異的抗体における重鎖と軽鎖の可変領域を同じ核酸分子がコードしている。

本発明のモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、単離され、通常の手順を用いて、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞から配列が決定されてもよい（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いる）。一般に、配列を決定するためは、目的とする遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部を単離する必要がある。通常、そのためには、モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡ、または、好ましくはｍＲＮＡ（つまりｃＤＮＡ）のクローニングをする必要がある。クローニングは、標準的な技術を用いて行われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ， Ｖｏｌｓ １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照。本発明ではこれが参照され、組み込まれている）。例えば、ポリＡ＋ｍＲＮＡの逆転写によりｃＤＮＡライブラリを作成してもよく、好ましくは膜関連ｍＲＮＡであり、ライブラリのスクリーニングにはヒト免疫グロブリンポリペプチドの遺伝子配列に特異的なプローブを用いる。ヌクレオチドとプローブの反応および他のヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応は、特定の条件において互いにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドの同定が可能な条件において行われる。

条件の設定例は、以下の通りである：４２oＣ、ｐＨ６．８の５０％ホルムアミド、５×希釈塩化ナトリウムクエン酸塩「ＳＳＣ」、２０ｍＭリン酸ナトリウム中でストリンジェントなハイブリダイゼーション、および、５５oＣ、１×ＳＳＣ中で３０分洗浄。同等のハイブリダイゼーションの条件の計算や、所望のストリンジェンシーレベルを達成するための他の条件を選択するための計算式は周知である。当技術分野では、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９４）， ｐｐ． ６．０．３ ｔｏ ６．４．１０．に記載されているように、温度およびバッファー、または塩濃度を変化させることにより、同等のストリンジェンシーの条件を達成できることが知られている。ハイブリダイゼーション条件の変更では、プローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対の長さと割合に基づいて、経験的に決定または正確に計算することができる。ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， （Ｅｄｓ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ｐｐ． ９．４７ ｔｏ ９．５１に記載されているように計算することができる。

本発明のイムノアッセイは、任意の適切な臨床検体に対し使用することができる。好ましい検体には、尿、唾液、血液、血清、および血漿が含まれる。検体は、本発明のイムノアッセイを使用して試験される前に、従来の方法で採取および処理される。

（ヒトＢＣＬ−２抗原性決定）
サンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットで機能するヒトＢＣＬ−２タンパク質に対する、モノクローナル抗体のペアを作成することが課題であった。これを達成するために、ＢＣＬ−２タンパク質に対して特異性を生み出す可能性が高いが、ＢＣＬ−ｘと交差反応しない領域に対する抗原としてペプチドを設計した。

ハイブリドーマプロジェクトの抗原として開発するペプチドを選択するための最適な選択肢を予測しようとするとともに、タンパク質を分析するために、バイオインフォマティクスツールを使用した。ただし、この分析はコンピュータによる予測であり、プロセスを決定する手がかりとして役に立つが、これらの予測は、個々のプロジェクトまたは全体の目標の成功を保証するものとは見なされ得ない。
（ヒトＢＣＬ−２の配列および二次構造予測）
図１は二次構造を図示する。予測アルファヘリックスはピンクの円柱で示され、ベータストランドは黄色の矢印で示され、ターンは青い矢印で示される。構造が不明、またはループの領域は、灰色の曲線で示す。
（ＢＣＬ−２とＢＣＬ−ｘの相同性）
図２を参照すると、ＢＣＬ−２のＢＣＬ−ｘに対する相同性は全体で４１％である。しかし、２つのタンパク質間ではいくつかの構造ドメインが保存されており、構造的な相同性は、配列の相同性によって予測されるよりも高い可能性がある。注目すべきは、２つのタンパク質の配列が大きく異なる３０〜１００（ＢＣＬ−２配列）と２０５〜２４１の２つの領域である。これら２つの領域間の領域は、配列レベルと構造レベルの両方でかなり保存されているため、これら２つの非相同配列は、ＢＣＬ−２をターゲットとし、ＢＣＬ−ｘと交差反応しない抗体を得るために最も適切な領域である可能性がある。
（ヒトとマウスにおけるＢＣＬ−２の相同性）
モノクローナル抗体はマウスで生成されるため、ヒトとマウスにおけるＢＣＬ−２タンパク質の類似性を考慮する必要がある。図３を参照すると、二種間の相同性は全体で９０％であるが、３５残基から８１残基の間において分化のレベルが最も高いことを示す領域がある。ＡＡ９９を除いて、残りのタンパク質は１００％同一である。したがって、抗体を生成するのに最も適した領域はこの領域にある。
（リニアエピトープ予測）
抗原性を持つ可能性があり、そして抗体を作成するために適切なターゲットとなる可能性のある領域を予測するために、潜在的なエピトープの分析を、タンパク質の配列に基づいてリニアエピトープを予測する２つの方法を使用して行った。これは、免疫付与に使用するためのペプチドを特定するのに役立つ。結果を以下の表１に示し、非相同（マウスとヒト間における）な領域内にあるものを黄色でハイライトする。

（ハイブリドーマ作成）
（抗原の生成）
Ｃ末端１０×Ｈｉｓ ＢＣＬ−２断片 ＨｕＢｃｌ−２ １０×Ｈｉｓ ｐＥＴ３０３を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株で生成し、得られたタンパク質を固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ（ＲＬ／Ｐ０００３））で精製した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４、４０ｍＭイミダゾール、２０％グリセロール、および２ｍＭ ＤＴＴを結合に使用し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４、５００ｍＭイミダゾール、２０％グリセロール、および２ｍＭ ＤＴＴを溶出に用いた。５．２ｇｍのタンパク質を回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、および５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡ中で、最終濃度０．７ｍｇ／ｍＬ、最終容量７．５ｍＬで再構成した。図６を参照すると、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ Ｐｒｏ２６０ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓで測定したところ、純度は９５％を超えていると判定された。分子量は約２６ＫＤであった。このプロセスを２回繰り返したところ、９９％の純度を得た。図７を参照。
（ハイブリドーマ１）
Ｃ５７ＢＬマウスを用いて抗体を生成し、ハイブリドーマを作成した。Ｂｃｌ−２−４１ Ｐｅｐ−ＫＬＨ−ＢＡ−１．３−１７Ｄ０７−０２Ｄ１２細胞株のＭＢＳアクセッション番号１５−０２６４ＲＢ２をビオチンとコンジュゲートし、モル比を（４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）（「ＨＡＢＮ」）アビジンアッセイで定量したところ、このハイブリドーマからのコンジュゲート抗体あたり３．５分子のビオチンが測定された。抗体は、０．５Ｍ塩化ナトリウムを添加した０．１Ｍクエン酸／リン酸バッファーの、ｐＨ＝９．０の結合バッファーと、０．１５Ｍ塩化ナトリウムと０．１Ｍクエン酸／リン酸の、ｐＨ＝３．０の溶出バッファーを用いたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。抗体は、ｐＨ４．７〜３．３の範囲での溶出において、直線勾配に沿って溶出した。図８を参照のこと。２８．３ｍｇの抗体が得られた。

図９に示すように、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、純度は１００％であることが判定された。１００ｖで１時間、２５０ｖで１時間、５００ｖで３０分の条件でウェルあたり２０μｌを使用したところ、図１０に示すように、等電点は約７．８であることが判定された。
（ハイブリドーマ２）
Ｃ５７ＢＬマウスを用いて抗体を生成し、ハイブリドーマを作成した。Ｂｃｌ−２−４１ Ｐｅｐ−ＫＬＨ−ＢＡ−１．３−１０Ａ１２−０２Ｆ０２細胞株のＭＢＳアクセッション番号１５−０２６４ＲＢ１をビオチンとコンジュゲートし、ＨＡＢＮアビジンアッセイでモル比を定量したところ、このハイブリドーマからコンジュゲート抗体あたり６．２分子のビオチンが測定された。抗体は、０．５Ｍ塩化ナトリウムを添加した０．１Ｍクエン酸／リン酸バッファーの、ｐＨ＝９．０の結合バッファーと、０．１５Ｍ塩化ナトリウムと０．１Ｍクエン酸／リン酸の、ｐＨ＝３．０の溶出バッファーを用いたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。抗体は、ｐＨ６．２〜３．９の範囲での溶出において、直線勾配に沿って溶出した。図１１を参照のこと。３３．０ｍｇの抗体が回収された。

図１２に示すように、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、純度は１００％であることが判定された。１００ｖで１時間、２５０ｖで１時間、５００ｖで３０分の条件でウェルあたり２０μｌを使用したところ、図１３に示すように、等電点は約６．７であることが判定された。
（ハイブリドーマ３）
Ｃ５７ＢＬマウスを用いて抗体を生成し、ハイブリドーマを作成した。Ｂｃｌ−２−６１ Ｐｅｐ−ＫＬＨ−ＢＡ−１．１−１８Ｅ１０−０２Ｇ０２細胞株のＭＢＳアクセッション番号１５−０２７１ＲＢ１をビオチンとコンジュゲートし、ＨＡＢＮアビジンアッセイでモル比を定量したところ、このハイブリドーマからコンジュゲート抗体あたり６．２分子のビオチンが測定された。抗体は、０．５Ｍ塩化ナトリウムを添加した０．１Ｍクエン酸／リン酸バッファーの、ｐＨ＝９．０の結合バッファーと、０．１５Ｍ塩化ナトリウムと０．１Ｍクエン酸／リン酸の、ｐＨ＝３．０の溶出バッファーを用いたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。抗体は、ｐＨ６．７〜４．６の範囲での溶出において、直線勾配に沿って溶出した。図１４を参照のこと。３３．０ｍｇの抗体が回収された。

図１５に示すように、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、純度は１００％であることが判定された。１００ｖで１時間、２５０ｖで１時間、５００ｖで３０分の条件でウェルあたり２０μｌを使用したところ、図１６に示すように、等電点は約６．７であることが判定された。
（ハイブリドーマ４）
Ｃ５７ＢＬマウスを用いて抗体を生成し、ハイブリドーマを作成した。Ｂｃｌ−２−６１ Ｐｅｐ−ＫＬＨ−ＢＡ−１．１−０２Ｃ１０−０２Ｄ０２−０２Ｂ０７細胞株のＭＢＳアクセッション番号１５−０２７１ＲＢ２をビオチンとコンジュゲートし、ＨＡＢＮアビジンアッセイでモル比を定量したところ、このハイブリドーマからコンジュゲート抗体あたり１０．５分子のビオチンが測定された。抗体は、０．５Ｍ塩化ナトリウムを添加した０．１Ｍクエン酸／リン酸バッファーの、ｐＨ＝９．０の結合バッファーと、０．１５Ｍ塩化ナトリウムと０．１Ｍクエン酸／リン酸の、ｐＨ＝３．０の溶出バッファーを用いたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。抗体は、ｐＨ６．４〜３．９の範囲での溶出において、直線勾配に沿って溶出した。図１７を参照のこと。２１．８ｍｇの抗体が回収された。

図１８に示すように、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、純度は１００％であることが判定された。１００ｖで１時間、２５０ｖで１時間、５００ｖで３０分の条件でウェルあたり２０μｌを使用したところ、図１９に示すように、等電点は約６．５であることが判定された。
（ハイブリドーマ５）
Ｃ５７ＢＬマウスを用いて抗体を生成し、ハイブリドーマを作成した。Ｂｃｌ−２−６１ Ｐｅｐ−ＫＬＨ−ＢＡ−１．１−１４Ａ０９−０２Ｃ０８−０２Ｆ０６細胞株のＭＢＳアクセッション番号１５−０２７１ＲＢ３をビオチンとコンジュゲートし、ＨＡＢＮアビジンアッセイでモル比を定量したところ、このハイブリドーマからコンジュゲート抗体あたり７．０分子のビオチンが測定された。抗体は、０．５Ｍ塩化ナトリウムを添加した０．１Ｍクエン酸／リン酸バッファーの、ｐＨ＝９．０の結合バッファーと、０．１５Ｍ塩化ナトリウムと０．１Ｍクエン酸／リン酸の、ｐＨ＝３．０の溶出バッファーを用いたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。抗体は、ｐＨ４．７〜３．３の範囲での溶出において、直線勾配に沿って溶出した。図２０を参照のこと。２３．５ｍｇの抗体が回収された。

図２１に示すように、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、純度は１００％であることが判定された。１００ｖで１時間、２５０ｖで１時間、５００ｖで３０分の条件でウェルあたり２０μｌを使用したところ、図２２に示すように、等電点は約６．７であることが判定された。

（ＥＬＩＳＡ）
臨床的に関連する１〜２０ｎｇ／ｍＬの感度範囲でサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットを使用して、ヒト尿サンプルマトリックス中のＢｃｌ−２を特異的に検出可能なモノクローナル抗体ペアを同定するための研究を行った。
（市販試薬を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの事前作業）
最初のアッセイに使用した市販のＢｃｌ−２試薬を表２に示す。

Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製と自社製タンパク質である上記ｒＢｃｌ−２タンパク質を用いて、Ｂｅｎｄｅｒ社のＰｌａｔｉｎｕｍ Ｂｃｌ−２キットの検量線性能を再現するサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。ｍＡｂ Ｂｃｌ−２／１００およびｍＡｂ ４Ｄ７の遊離型およびビオチン標識型を、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のタンパク質と交差させた。

最も感度の高い結果は、Ｂｃｌ−２／１００キャプチャ抗体と４Ｄ７ビオチンのコンジュゲートで得られた。ただし、感度は、この抗体ペアリングで観察された高いネガティブサンプルの光学密度（ＯＤ）によって制限されている。

Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製タンパク質と自社製タンパク質とを並べて比較したころ、機能的に同等であることが示された。タンパク質の、関連する濃度のＯＤ値は、Ｂｅｎｄｅｒ社のＰｌａｔｉｎｕｍ ＥＬＩＳＡの添付文書に記載されている平均ＯＤと直接比較可能であった。

しかしながら、アッセイフォーマットの最適化過程において、タンパク質キャリブレータでの再現性が日を追うごとに失われていることがわかった。保管はマイナス８０°Ｃでされており、凍結―解凍サイクルとともに活性が低下していると見られた。

これにより、複数のストレージバッファーとアッセイバッファーとを用いて究明を行った。シグナルを最大化しつつバックグラウンドを最小化するために、ブロッキング、サンプル希釈液、およびコンジュゲート希釈液のＰＢＳ−ＢＳＡシステムを選択した。解凍時にタンパク質ストックを時間をかけて再可溶化することは、整合性に関する問題の一部分であると理論付けた。また、問題はタンパク質の免疫の安定性にあることが考えられ、これは異なる抗体ペアにより軽減される可能性がある。

これらの試薬を使用した最終アッセイには、ＳＫＯＶ−３およびＨＥＫ２９３のライセートが含まれていた。それぞれサンプル希釈液で１：５に希釈して実行した。ＳＫＯＶ−３サンプルのＯＤはブランクを差し引いて０．１であり、ネガティブＨＥＫ２９３ライセートによって０．０９混濁していた。１０ｎｇ／ｍＬのタンパク質サンプルは０．６７で実行され、これはＰｌａｔｉｎｕｍ ＥＬＩＳＡキットと一致している。Ｂｃｌ−２を発現しているライセートはＯＤ値０．２４で実行したが、たった１回のアッセイで製品のバイアルを全て使用した。

正常な被験者では２ｎｇ／ｍＬ未満、癌患者では平均４ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で尿中のＢｃｌ−２を測定することを目標としており（非特許文献１）、より感度の高いＥＬＩＳＡが必要である。尿サンプルマトリックスはイムノアッセイに干渉することが知られているが（非特許文献２、３）、サンプルを希釈することによりしばしば改善される。アッセイの感度が高いほど、ターゲットの感度範囲を維持しつつ希釈係数を高くすることができる
この目標を念頭に置いて、生成された抗Ｂｃｌ−２ハイブリドーマ産物は、市販の抗体とのペアリングと平行してｒＢｃｌ−２のサンドイッチを検出するためにスクリーニングされる。
（ハイブリドーマ融合産物のマッチドペアアッセイによる特性評価）
（材料）
ハイブリドーマプロジェクトのＢＣＬ２−４１Ｐｅｐ−ＫＬＨ−１．３から、１９の精製（ＭｕｌｔｉＰｕｒｅ）融合産物が生成され、それぞれのサンプルはビオチンにコンジュゲートされた。１９のうち４つは、０．２ｍｇ未満の抗体を産生し、他の試験から除外された。

ハイブリドーマプロジェクトのＢＣＬ２−６１Ｐｅｐ−ＫＬＨ−ＢＡ−１．１から、２０の精製（ＭｕｌｔｉＰｕｒｅ）融合産物が生成され、それぞれのサンプルはビオチンにコンジュゲートされた。２０のうち３つは、０．２ｍｇ未満の抗体を産生し、他の試験から除外された。

市販のｍＡｂＢｃｌ−２／１００キャプチャ抗体と市販のｍＡｂ４Ｄ７−ビオチンのコンジュゲート
ｒＢｃｌ−２タンパク質−ＭＢＳ ロット番号１６１０７１ＢＰ．１Ｐ
マッチしたペアのスクリーニングは、１５Ｐｅｐ−４１キャプチャ×１７ Ｐｅｐ−６１−ビオチンコンジュゲート、および１７Ｐｅｐ−６１キャプチャ×１５Ｐｅｐ−４１ビオチンコンジュゲートの２方向で実施された。すべてのコーティングは２ｕｇ／ｍＬで、すべてのビオチンは１ｕｇ／ｍＬとした。サンプル：ネガティブ（サンプル希釈液）およびサンプル希釈液中の２５ｎｇ／ｍＬのｒＢｃｌ−２。比較のために、市販のｍＡｂとのペアリングをプレート全体で繰り返した。

表３および表４を参照すると、最初のヒートマップは、トレーサー抗体として１４Ａ０９および１８Ｅ１０を使用した時のキャプチャとしての１０Ａ１２の明らかな優位性を示した。表５は簡約したヒートマップである

なお、関連するペアリングのネガティブサンプルのＯＤはすべて０．０８以下である。

図２３のように、後続のＥＬＩＳＡにおいて、１６の候補キャプチャ抗体のそれぞれが４つの異なるビオチンコンジュゲートとペアで試験された。サンプルは０〜２０ｎｇ／ｍＬの範囲のｒＢｃｌ−２であり、２ｕｇ／ｍＬのｒＢｃｌ−ＸＬを含んでいた。２ｕｇ／ｍＬのｒＢｃｌ−ＸＬサンプルに対して交差反応性を示したペアは無かった。キャプチャおよびコンジュゲートの抗体の濃度は、最初のスクリーニングから変更されていない。以下のデータは、結果としてのサンプルの検量線を示す。

表６は、融合がポジティブな全ての特性をまとめたものである。

網掛け部は、ＩＥＦプロファイルにより考え得る姉妹クローンを示す。

良好な感度を示したペアリングは、コーティング条件とコンジュゲート濃度に対して半最適化された。Ｂｃｌ−２ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＥＬＩＳＡキットと同様のアッセイフォーマットが用いられた。

これらの抗体ペアは、ｒＢｃｌ−２タンパク質をあらゆる希釈の正常なヒト尿（Ｌｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社、ロット番号９９１−０３−Ｐ）で強化することによるマトリックス効果について試験された。なお、この尿サンプルは、どのペアリングでも検出可能なレベルのＢｃｌ−２を示さなかった。

以下の表７は、これらのペアリングの相対感度（ｒＢｃｌ−２キャリブレーターの吸光度値）と、強化したｒＢｃｌ−２（４または５ｎｇ／ｍＬ）の回復を示す。

ペプチド４１抗体は太字、ペプチド６１抗体は通常フォントで示す。

１０Ａ１２／１８Ｅ１０と１０Ａ１２／１４Ａ０９の上位２つのペアは、感度が際立っていた。ペプチド４１ハイブリドーマプロジェクトにおけるキャプチャを用いた尿中の強化サンプルの回復率が高い傾向がみられた。ただし、感度の低いペアリングでの回復率は、非常に低い吸光度値で実行される４〜５ｎｇ／ｍＬのサンプルの影響を受けやすい。

（シーケンシング）
上記の例で作成された抗体の配列が決定された。クローン１０Ａ１２および１４Ａ０９のおよそ２×１０６細胞を含む２つのクライオチューブは、シーケンシングのためにＬａｋｅ Ｐｈａｒｍａ社に送られた。Ｌａｋｅ Ｐｈａｒｍａ社は、各サンプルからＲＮＡを単離し、ＲＡＣＥ ＰＣＲとそれに続く適切なベクターへのライゲーションによって重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）のクローンを作成した。各クローンの複数の分離株における、各ＶＨおよびＶＬについて配列が決定された。

Ｌａｋｅ Ｐｈａｒｍａ社により各クローンについて得られたヌクレオチド配列をＩｇＢｌａｓｔに入力して、各クローンについてＶｈ、Ｄｈ、およびＪｈ重鎖（ＨＣ）の遺伝子利用とＶ１およびＪ１軽鎖（ＬＣ）の遺伝子利用とを決定するとともに、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）およびフレームワーク領域（「ＦＲ」）領域を決定した。
（クローン１０Ａ１２）
図２４を参照すると、重鎖のタンパク質配列はＱＶＱＬＱＱＳＧＰＱＬＶＲＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＤＰＳＤＳＥＴＲＬＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＲＰＴＦＥＤＳＡＶＹＹＣＥＲＧＤＹＹＹＧＳＳＹＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１４）である。

ＣＤＲ１はＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号１５で、ＣＤＲ２はＩＤＰＳＤＳＥＴ（配列番号１６）で、ＣＤＲ３はＥＲＧＤＹＹＹＧＳＳＹＦＡＹ（配列番号１７）である。

アミノ酸配列は配列番号１８のＤＮＡ配列にコードされている：ＣＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＴＴＣＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＴＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＡＴＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＣＧＡＴＡＧＴＧＡＡＡＣＴＡＧＧＴＴＡＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＡＴＴＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＧＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡ（配列番号１８）。

図２５を参照すると、軽鎖のタンパク質配列はＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＩＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＴＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＭＧＧＴＴＹＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＭＹＦＣＡＬＷＦＳＮＨＦＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１９）である。

ＣＤＲ１はＴＧＡＶＴＴＳＮＹ（配列番号２０）で、ＣＤＲ２はＧＴＴ（配列番号２１）で、ＣＤＲ３はＡＬＷＦＳＮＨＦＷＶ（配列番号２２）である。

アミノ酸配列は配列番号２３のＤＮＡ配列にコードされている：ＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＡＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＣＣＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＴＴＧＧＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＴＡＧ（配列番号２３）
上記重鎖アミノ酸配列と高い相同性を有する配列を、上記軽鎖アミノ酸配列と高い相同性を有する配列と組み合わせることにより、ＢＣＬ−２に対し高い特異性を有する抗体を選択することができる。相同性は、一般に、８０％以上の相同性、好ましくは９０％以上の相同性、より好ましくは９５％、９６％、９７％、または９８％以上の相同性、最も好ましくは９９％以上の相同性である。さらに、重鎖または軽鎖アミノ酸配列中の１個から数個のアミノ酸残基の置換、欠失、または付加を含むアミノ酸配列を組み合わせることにより、上記の抗体のそれぞれと同等の細胞毒性活性を有する抗体を選択することも可能である。置換、欠失、または付加されるアミノ酸残基の数は、一般に１０個以下、好ましくは５〜６個以下、より好ましくは２〜３個以下、最も好ましくは１である。
（クローン１４Ａ０９）
図２６を参照すると、重鎖のタンパク質配列はＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＮＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＬＤＷＶＫＱＳＨＧＥＳＦＥＷＩＧＲＡＮＰＹＮＧＶＴＮＳＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＭＳＳＳＴＡＦＭＥＬＮＳＬＴＦＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＳＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２４）である。

ＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＤＹＹ（配列番号２５）で、ＣＤＲ２はＡＮＰＹＮＧＶＴ（配列番号２６）で、ＣＤＲ３はＡＲＳＳＦＤＶ（配列番号２７）である。

アミノ酸配列は配列番号２８のＤＮＡ配列にコードされている：ＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＧＴＧＣＣＡＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＧＴＴＡＣＴＡＡＣＴＣＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＴＴＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＴＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号２８）。

図２７を参照すると、軽鎖のタンパク質配列はＤＩＶＩＴＱＤＥＬＳＨＰＶＴＳＧＥＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＹＫＤＧＫＴＹＬＮＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＶＳＴＲＡＳＧＶＳＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＥＩＳＲＶＫＡＥＤＶＧＶＹＹＣＱＱＰＶＥＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２９）である。

ＣＤＲ１はＫＳＬＬＹＫＤＧＫＴＹ（配列番号３０）で、ＣＤＲ２はＬＶＳ（配列番号３１）で、ＣＤＲ３はＱＱＰＶＥＹＰＦＴ（配列番号３２）である。

アミノ酸配列は配列番号３３のＤＮＡにコードされている：ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣＴＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＡＴＣＡＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＴＡＡＧＡＧＴＣＴＣＣＴＡＴＡＴＡＡＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＣＣＧＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＧＴＣＴＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＴＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＧＡＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＧＡＧＴＡＴＣＣＡＴＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ（配列番号３３）。

上記重鎖アミノ酸配列と高い相同性を有する配列を、上記軽鎖アミノ酸配列と高い相同性を有する配列と組み合わせることにより、ＢＣＬ−２に対し高い特異性を有する抗体を選択することができる。相同性は、一般に、８０％以上の相同性、好ましくは９０％以上の相同性、より好ましくは９５％、９６％、９７％、または９８％以上の相同性、最も好ましくは９９％以上の相同性である。さらに、重鎖または軽鎖アミノ酸配列中の１個から数個のアミノ酸残基の置換、欠失、または付加を含むアミノ酸配列を組み合わせることにより、上記の抗体のそれぞれと同等の細胞毒性活性を有する抗体を選択することも可能である。置換、欠失、または付加されるアミノ酸残基の数は、一般に１０個以下、好ましくは５〜６個以下、より好ましくは２〜３個以下、最も好ましくは１である。

（ラテラルフローアッセイ）
実施例２に記載の抗体は、ラテラルフローアッセイでの使用について試験された。

キャプチャについては、適度なフローのニトロセルロース膜を用いた４ｍｍ幅のストリップ（５つクローンのそれぞれについてネガティブサンプルおよび１００ｎｇ／ｍＬのポジティブサンプルを分析できるようにクローンあたり１０本のストリップ）に、基本的なストリッピングバッファー中の５つのクローンのそれぞれを０．５ｍｇ／ｍＬでスポットし、またコントロールスポット（ｒＰＡ）をした。サンプルパッドとニトロセルロースは未処理であった。

ディテクタについては、標準のコンジュゲーションプロトコルを用いて５つのクローンのそれぞれを４０ｎｍの金にコンジュゲートした。標準のコンジュゲーションプロトコルでは、ｐＨは中程度、金への抗体のロードは中程度の強さ、金ブロッカーは標準的なものであり、金コンジュゲートと、糖、バッファー、タンパク質および界面活性剤を含む基本的なコンジュゲート希釈液（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｄｉｌｕｅｎｔ）とを１：１となるよう混合した。金＋ＣＤの混合物を各試験ストリップにスポット、乾燥し、上記ストリップセット毎に、５つのコンジュゲートのそれぞれ＋ＣＤの混合物を一度に２本ずつとした（５つのコンジュゲート×それぞれ２本のストリップ＝５つのクローンセットのそれぞれで１０本のストリップ＝５０本のストリップ）。

簡単な「合成」ランニングバッファーを使用し、ポジティブサンプルについて１００ｎｇ／ｍＬのＢＣＬ−２でスパイクした。
Ａ＝１０Ａ１２
Ｂ＝１４Ａ０９
Ｃ＝１８Ｅ１０
Ｄ＝０２Ｃ１０
Ｅ＝１７Ｄ０７
ネガティブシグナルとポジティブシグナルの間で、偽陽性が最小である、最良のシグナルノイズ（ｓ／ｎ）を探した。偽陽性はゼロである必要はない。

図２８は、セット「Ａ」（Ａ＝キャプチャ）を示す。結果は２０分で記録され、最良の結果を図２８に四角で囲んで示す。セットＡではＢが最良のディテクタであった。ＣとＤは問題無いように見えたが、Ｃ／Ｄ／Ｅのコンジュゲートが溶液からクラッシュしたため、Ａキャプチャとの実行可能なペアとしてＢコンジュゲートディテクタのみが残った）
図２９のセットＢを参照すると、セットＢには最良のディテクタは無かった。図３０のセットＣを参照すると、セットＣの最良のディテクタはＡ（囲み部）であった。図３１および３２を参照すると、セットＤおよびＥはディテクタについてＡより悪かった。これは、Ｃ、Ｄ、Ｅの金コンジュゲートがすべて時間の経過とともに溶液からクラッシュしたためかもしれず、このアッセイの難しさが示された。また、Ｅはパッドからうまくリリースされなかった。セットＤからの最良のディテクタはＡであった。セットＥからは最良のディテクタは得られなかった。Ｅディテクタではシグナル全体が最も強かったが、Ｅはターゲットとターゲットのないサンプルとで特異性を示さなかったため、Ｅは良いキャプチャではなかった。

図３３〜３５を参照して、上記の３つの「最良の」ペアリングのそれぞれについて、０．５ｍｇ／ｍＬのＡ／Ｃ／Ｄの最良のキャプチャ抗体を、標準ストライピングバッファーとヤギ抗マウスコントロールラインとを用いて、３つのキャプチャ抗体のそれぞれについてストリッピングした。
最良のペア：
ＡキャプチャとＢディテクタ（図３３）
ＣキャプチャとＡディテクタ（図３４）
ＤキャプチャとＡディテクタ（図３５）：最良
各画像について、３セットを実行した。各セット内で、０、＋１、＋１０、＋１００ｎｇ／ｍＬのＢＣＬ−２の４ストリップを実行した。３セットのそれぞれは、ローディングとｐＨの比較の異なるコンジュゲート条件であった。

コンジュゲートと、特にコンジュゲート希釈液をさらに４ラウンドの最適化した後、「ディップストリップ」（直立）ラテラルフローアッセイフォーマットで最適な条件を選択し（図３６を参照、そしてそれをカセット形式（図３７）にて試験したところ、カセット用に設計されたリーダーを使用してデジタル読み取り値も取得することができた。図３７では、最良の条件を上位から選択し、ＣＤ／ＣＧの比率を実行した。ディップストリップとカセットとの比較には、さらなる最適化が必要である。

最良のペアは（１）０２Ｃ１０キャプチャ（「Ｄ」）と１０Ａ１２ディテクタ（「Ａ」）であり、（２）１８Ｅ１０キャプチャ（「Ｃ」）と１０Ａ１２ディテクタ（「Ａ」）のセット＃２よりわずかに優れており、（３）１０Ａ１２キャプチャ（「Ａ」）と１４Ａ０９ディテクタ（「Ｂ」）のセット＃３よりも明らかに優れている。

（ＥＩＡによるクローンの再試験）
ＢＣＬ−２クローンについて、ＥＩＡテストの追加試験を行った。ウェルキャプチャプレートをウェルあたり２００ｎｇで、１×ＰＢＳ中で１時間コーティングし、１％ＢＳＡでブロッキングし、４×（ｔｗｅｅｎを含むリン酸緩衝生理食塩水）ですすぎ、Ｓｔａｂｉｌｇｕａｒｄ（登録商標）イムノアッセイスタビライザーで安定化した。

２ｎｇ／ｍＬのｒＢＣＬ−２を使用した場合と使用しない場合とで、１：１ＫのＳＡ−ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素とコンジュゲートしたストレプトアビジン）で１：１Ｋ希釈した各ビオチン化モノクローナルを試験し、室温で３０分間振盪インキュベートし、そして４×ＰＢＳＴで洗浄した。プレートを３，３’，５，５’ ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン−テトラメチルベンジジン（「ＴＭＢ」）基質とともに７分間インキュベートし、適切な停止液を用いて停止し、４０５ｎｍで読み取った。結果を表８に示す。

（＋）＝２ｎｇ／ｍＬ；３０分のインキュベーション、１：１Ｋ ディテクタ＋１：１Ｋ ＳＡ−ＨＲＰ；４×ＰＢＳＴ洗浄、Ｘｔｒｅｍｅ ＴＭＢで７分、停止；４０５ｎｍで読み取り（ウェルあたり２００ｎｇのキャプチャ抗体を１×ＰＢＳ中で１時間、ｓｔａｂｉｌｃｏａｔとともにＧｒｅｉｎｅｒプレート上でＢＳＡブロッキング）
シグナルとノイズの比を以下の表９に示す。

最良のペアを太字で示す。ＬＦＳに最適なペアはＡ１２ディテクタと、Ｅ１０またはＣ１０キャプチャである。２番目のセットはＡ０９ディテクタとＡ１２キャプチャである。

ＥＩＡに最適なペアはＡ１２ディテクタと、Ｅ１０またはＣ１０キャプチャである。２番目のセットはＡ０９ディテクタとＡ１２キャプチャである。

Claims (63)

1. ヒトＢｃｌ−２タンパク質に結合する単離抗体であって、前記抗体は、配列番号２、配列番号３、または配列番号１１から生成されるハイブリドーマ細胞株により産生されることを特徴とする単離抗体。
2. ヒトＢｃｌ−２タンパク質に結合する単離抗体であって、重鎖は配列番号１４または配列番号２４から選択され、軽鎖は配列番号１９または配列番号２９から選択されることを特徴とする単離抗体。
3. 前記重鎖は配列番号１４であり、前記軽鎖は配列番号１９であることを特徴とする請求項２に記載の抗体。
4. 請求項３に記載の抗体と少なくとも９５％の相同性を有することを特徴とする抗体。
5. ＣＤＲ１は配列番号１５であり、ＣＤＲ２は配列番号１６であり、ＣＤＲ３は配列番号１７であることを特徴とする請求項３に記載の抗体の重鎖。
6. ＣＤＲ１は配列番号２０であり、ＣＤＲ２は配列番号２１であり、ＣＤＲ３は配列番号２２であることを特徴とする請求項３に記載の抗体の軽鎖。
7. 前記重鎖は配列番号２４であり、前記軽鎖は配列番号２９であることを特徴とする請求項２に記載の抗体。
8. 請求項７に記載の抗体と少なくとも９５％の相同性を有することを特徴とする抗体。
9. ＣＤＲ１は配列番号２５であり、ＣＤＲ２は配列番号２６であり、ＣＤＲ３は配列番号２７であることを特徴とする請求項３に記載の抗体の重鎖。
10. ＣＤＲ１は配列番号２０であり、ＣＤＲ２は配列番号２１であり、ＣＤＲ３は配列番号２２であることを特徴とする請求項３に記載の抗体の軽鎖。
11. Ｂｃｌ−２ポリペプチドの天然配列に結合することを特徴とする請求項１に記載の抗体の抗原結合フラグメント。
12. ＢＣＬ−２タンパク質に結合する、請求項２に記載の抗体の抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、新生細胞またはその抗原に結合することを特徴とする抗原結合フラグメント。
13. 患者のサンプルと請求項１に記載のモノクローナル抗体とを反応させるステップと、前記サンプル中のＢＣＬ−２タンパク質レベルを検出するステップとを有し、被験者から採取される前記サンプルは、尿サンプル、唾液サンプル、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプルからなる群から選択される少なくとも１つのサンプルであることを特徴とするＢＣＬ−２を検出する方法。
14. 前記モノクローナル抗体は標識されていることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
15. 前記モノクローナル抗体は、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、化学発光標識、コロイド粒子、および放射性同位体標識からなる群から選択された、１つまたは複数の標識で標識されていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. 標識を更に有することを特徴とする請求項２に記載の抗体。
17. 前記標識は、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、コロイド粒子、化学発光標識、および放射性同位体標識からなる群から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の抗体。
18. 標識を更に有することを特徴とする請求項３に記載の抗体。
19. 前記標識は、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、コロイド粒子、化学発光標識、および、放射性同位体標識からなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の抗体。
20. 標識を更に有することを特徴とする請求項４に記載の抗原結合フラグメント。
21. 前記標識は、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、コロイド粒子、化学発光標識、および、放射性同位体標識からなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の抗原結合フラグメント。
22. ２４〜２７分にクロマトグラフィーのピークを有することを特徴とするＢｃｌ−２に対する単離抗体。
23. 約６．５〜約７の等電点を有することを特徴とするＢｃｌ−２に対する単離抗体。
24. 請求項１に記載の抗体に由来することを特徴とするｃＤＮＡ。
25. 請求項２４に記載のｃＤＮＡを有することを特徴とする発現ベクター。
26. キャプチャ抗体１０Ａ１２。
27. キャプチャ抗体１０Ａ１２を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
28. 抗体１８Ｅ１０。
29. キャプチャ抗体１８Ｅ１０を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
30. 抗体１４Ａ０９。
31. キャプチャ抗体１４Ａ０９を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
32. キャプチャ抗体１０Ａ１２と標識抗体１４Ａ０９とを含むことを特徴とするイムノアッセイ。
33. 前記アッセイは、ＥＬＩＳＡまたはラテラルフローアッセイから選択されることを特徴とする請求項３２に記載のアッセイ。
34. キャプチャ抗体１０Ａ１２と標識抗体１４Ａ０９とを含むイムノアッセイを用いて患者の尿または唾液中のＢＣＬ−２を検出するステップを有し、２ｎｇ／ｍｌ以上の濃度のＢＣＬ−２の検出は、癌であることを示すことを特徴とする患者の癌を検出する方法。
35. 前記アッセイは、ＥＬＩＳＡまたはラテラルフローアッセイから選択されることを特徴とする請求項３４に記載のアッセイ。
36. キャプチャ抗体１０Ａ１２と標識抗体１８Ｅ１０とを含むことを特徴とするイムノアッセイ。
37. 前記アッセイは、ＥＬＩＳＡまたはラテラルフローアッセイから選択されることを特徴とする請求項３６に記載のアッセイ。
38. キャプチャ抗体１０Ａ１２と標識抗体１８Ｅ１０とを含むイムノアッセイを用いて患者の尿または唾液中のＢＣＬ−２を検出するステップを有し、２ｎｇ／ｍｌ以上の濃度のＢＣＬ−２の検出は、癌であることを示すことを特徴とする患者の癌を検出する方法。
39. 前記アッセイは、ＥＬＩＳＡまたはラテラルフローアッセイから選択されることを特徴とする請求項３８に記載のアッセイ。
40. 軽鎖は配列番号１４であり、重鎖は配列番号１４であることを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
41. 軽鎖の相補性決定領域は、配列番号１５、１５および１７を含み、前記軽鎖の相補性決定領域は、配列番号２０、２１および２２を含むことを特徴とするＢＣＬ−２に対する抗体。
42. 請求項３１に記載の抗体と少なくとも９０％の相同性を有することを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
43. 請求項３１に記載の抗体と少なくとも９５％の相同性を有することを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
44. 請求項３１に記載の抗体と少なくとも９６％の相同性を有することを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
45. 請求項３１に記載の抗体と少なくとも９７％の相同性を有することを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
46. 請求項３１に記載の抗体と少なくとも９８％の相同性を有することを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
47. 請求項３１に記載の抗体と少なくとも９９％の相同性を有することを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
48. 軽鎖は配列番号２４であり、重鎖は配列番号２９であることを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
49. 軽鎖の相補性決定領域は、配列番号２５、２６および２７を含み、軽鎖の相補性決定領域は、配列番号３０、３１および３２を含むことを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
50. 請求項３６に記載の抗体と少なくとも９０％の相同性を有することを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
51. 請求項３６に記載の抗体と少なくとも９５％の相同性を有することを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
52. 請求項３６に記載の抗体と少なくとも９６％の相同性を有することを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
53. 請求項３６に記載の抗体と少なくとも９７％の相同性を有することを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
54. 請求項３６に記載の抗体と少なくとも９８％の相同性を有することを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
55. 請求項３６に記載の抗体と少なくとも９９％の相同性を有することを特徴とするＢｃｌ−２に対する抗体。
56. 請求項３６に記載の抗体のアミノ酸配列をコードすることを特徴とするＤＮＡ配列。
57. 請求項３６に記載の抗体のアミノ酸配列をコードすることを特徴とするＤＮＡ配列。
58. 請求項３６に記載の抗体のアミノ酸配列をコードすることを特徴とするＤＮＡ配列。
59. 請求項３６に記載の抗体のアミノ酸配列をコードすることを特徴とするＤＮＡ配列。
60. 請求項２９に記載の抗体と請求項３６に記載の抗体とを有することを特徴とするＥＬＩＳＡ。
61. 配列番号１４、配列番号１９、配列番号２４または配列番号２９のタンパク質をコードすることを特徴とするｃＤＮＡ。
62. 前記ｃＤＮＡは、配列番号１８、配列番号２３、配列番号２８または配列番号３３から選択されることを特徴とする請求項５７に記載のｃＤＮＡ。
63. 配列番号１４、配列番号１９、配列番号２４または配列番号２９のタンパク質をコードすることを特徴とするＲＮＡ。
    

Images