JP6677655B2 - 胆道癌の検出方法及び胆道癌検出用キット - Google Patents
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Description
(1)被験体の体液試料中におけるAPOA2タンパク質のバリアントの量を測定して胆道癌を検出する方法であって、(A)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるAPOA2−ATQタンパク質のC末端領域と特異的に結合する抗APOA2−ATQ末端抗体と、該C末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗APOA2−ATQ非末端抗体とを用いて、試料中のAPOA2−ATQタンパク質の量を測定する第1の工程、(B)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるAPOA2−ATタンパク質のC末端領域と特異的に結合する抗APOA2−AT末端抗体と、該C末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗APOA2−AT非末端抗体とを用いて、試料中のAPOA2−ATタンパク質の量を測定する第2の工程、(C)第1の工程で得たAPOA2−ATQタンパク質の量の測定値と第2の工程で得たAPOA2−ATタンパク質の量の測定値とを予め設定した判別式に入力して得た被験体の判別値が、健常体の判別値と比較して統計学的に有意に差があるときに被験体が胆道癌に罹患していると決定する第3の工程、を含む胆道癌の検出方法。
(2)APOA2−ATQタンパク質及びAPOA2−ATタンパク質の前記C末端領域が、それぞれC末端を含む6以上の連続したアミノ酸を含む配列からなる、(1)に記載の検出方法。
(3)前記判別式が、ロジスティック回帰式、サポートベクターマシーンの解析で作成された式、ニューラルネットワークの解析で作成された式、及び判別分析の解析で作成された式からなる群から選択されるいずれか1つである、(1)又は(2)に記載の検出方法。
(4)前記ロジスティック回帰式で作成された判別式が
数式1:a (APOA2−ATQ) + b (APOA2−AT) + d
数式2:a (APOA2−ATQ) + b (APOA2−AT)+ c [(APOA2−ATQ) × (APOA2−AT)] + d
数式3:c [(APOA2−ATQ) × (APOA2−AT)] + d
のいずれかである(3)に記載の検出方法。
(式中、a,b,c,dはゼロでない任意の実数、APOA2−ATQは、APOA2−ATQタンパク質の量の前記測定値、APOA2−ATは、APOA2−ATタンパク質の量の前記測定値を表す。)
(5)前記判別式から得た被験体の判別値が、健常体の判別値の3分の2以下である、(4)に記載の方法。
(6)前記体液試料が、血液である、(1)〜(5)のいずれかに記載の検出方法。
(7)前記胆道癌が早期胆道癌である(1)〜(6)のいずれかに記載の検出方法。
(8)重鎖のCDR1、CDR2及びCDR3が、それぞれ配列番号4、5及び6、又は10、11及び12、で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3が、それぞれ配列番号7、8及び9、又は13、14及び15、で示されるアミノ酸配列からなる抗APOA2−ATQ末端モノクローナル抗体又はその断片と、重鎖のCDR1、CDR2及びCDR3が、それぞれ配列番号16、17及び18、又は22、23及び24、で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3が、それぞれ配列番号19、20及び21、又は25、26及び27、で示されるアミノ酸配列からなる抗APOA2タンパク質非末端モノクローナル抗体又はその断片の中から、1種類以上のモノクローナ抗体又はその断片を含む、胆道癌の検出用キット。
本発明の第一の態様は、抗APOA2抗体(抗APOA2タンパク質末端抗体及び抗APOA2タンパク質非末端抗体を含む)、及びその断片である。
本明細書において「APOA2タンパク質」とは、各生物種のAPOA2タンパク質が該当するが、好ましくはヒト由来のAPOA2タンパク質(GenBankアクセッションNo.NP_001634.1)である。具体的には、配列番号1、2又は3に示されるヒト由来の野生型APOA2タンパク質のバリアントが含まれ、さらに、それらの天然変異体、及びそれらの断片も含む。
本発明において、抗APOA2タンパク質末端抗体を作製する場合には、まず免疫原(抗原)としてのAPOA2タンパク質のバリアントを調製する。本発明において免疫原として使用可能なAPOA2タンパク質のバリアントは、例えば、配列番号1〜3のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するAPOA2タンパク質若しくはその変異体又はそれらのポリペプチド断片、あるいはそれらと他のペプチド(例えば、シグナルペプチド、標識ペプチド等)との融合ポリペプチドが挙げられる。免疫原としてのAPOA2タンパク質のバリアントは、例えば、配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法等により合成することができる。例えば、以下の方法によって調製することができる。
(組み換え型APOA2タンパク質の調製)
以下で、配列番号1〜3のいずれかで示される組み換え型APOA2タンパク質(組み換え型APOA2タンパク質のバリアント)の調製について詳述する。
APOA2タンパク質の各種バリアントの発現に用いるベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドを使用することができる。例えば、プラスミドであれば、大腸菌由来のプラスミド(pET30a、pGEX6p、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等)、枯草菌由来のプラスミド(pUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド(YEp13、YEp24、YCp50等)が挙げられる。また、ファージであれば、λファージ(λgt11、λZAP等)が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターも用いることができる。
得られたAPOA2タンパク質のバリアント発現ベクターを、その発現ベクターを発現し得る宿主中に導入して、APOA2タンパク質のバリアントを発現し得る形質転換体(バリアント発現形質転換体)を得る。使用する宿主については、使用したベクターに適する宿主であって、APOA2タンパク質のバリアントを発現できるものであれば特に限定されない。例えば、細菌(大腸菌(例えば、エシェリキア・コリ:Escherichia coli)、枯草菌(例えば、バチルス・サブチリス:Bacillus subtilis)等)、酵母、昆虫細胞、動物細胞(COS細胞、CHO細胞(Journal of immunology、1998、Vol.160、3393−3402))等が好適に用いられる。細菌への前記ベクターの導入方法は、細菌に該ベクターを導入する公知の方法であれば特に限定されない。例えば、ヒートショック法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。これらの技術は、いずれも当該分野で公知であり、様々な文献に記載されている。例えば、Green &Sambrook、2012、Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New Yorkを参照されたい。また、動物細胞の形質転換には、リポフェクチン法(PNAS、1989、Vol.86、6077;PNAS、1987、Vol.84、7413)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(Virology、1973、Vol.52、456−467)、DEAE−Dextran法等が好適に用いられる。
続いて、上記作製したバリアント発現形質転換体を培養する。バリアント発現形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、細菌を宿主とする場合、培地は、細菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、かつ生育、増殖可能なものであれば、特に限定はしない。天然培地、合成培地のいずれを用いることもできる。より具体的な例としては、LB培地が挙げられるが、もちろんこれに限定はされない。また、バリアント発現形質転換体の培養を選択的に行うために、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養は、通常、通気攪拌培養等の好気的条件下、37℃で6〜24時間行う。培養期間中、pHは中性付近に保持することが好ましい。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。バリアント発現形質転換体がCHO細胞等の動物細胞である場合には、Life Technologies社(現Thermo Fisher Scientific社)製DMEM培地に1×105細胞/mLとなるように宿主細胞を接種し、37℃の5%CO2インキュベータにて培養すればよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、APOA2タンパク質のバリアントが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を回収して破砕することにより目的のタンパク質を抽出することができる。また、APOA2タンパク質のバリアントが菌体外又は細胞外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去し、上清を使用すればよい。その後、一般的なタンパク質の精製方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組合せて用いることにより、前記培養物中からAPOA2タンパク質のバリアントを単離精製することができる。APOA2タンパク質のバリアントが得られたか否かは、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認すればよい。
1−3−1.抗APOA2モノクローナル抗体及びハイブリドーマ作製方法
本発明の抗APOA2モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下に記載する方法によって作製することができる。ただし、本方法に限定されるものではなく、当該分野で公知の他のあらゆる方法で作製することもできる。
(1)抗APOA2モノクローナル抗体作製方法
APOA2タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号1、2又は3で示されるAPOA2タンパク質のいずれかのC末端領域と特異的に結合する抗APOA2タンパク質末端モノクローナル抗体を作製するには、APOA2タンパク質のバリアント若しくはAPOA2タンパク質のバリアントのC末端領域を含むペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、その後、配列番号1〜3のいずれかで示されるAPOA2タンパク質自体若しくはAPOA2タンパク質のバリアントのC末端領域を含むペプチドを用いてAPOA2タンパク質の特定のバリアントにのみ結合する抗体をスクリーニングすればよい。例えば、抗APOA2−ATQ末端モノクローナル抗体については、配列番号1で示されるAPOA2−ATQタンパク質のC末端領域と特異的に結合し、配列番号2又は3で示されるAPOA2タンパク質のバリアントとは結合しないか、又はほとんどしないことを指標にスクリーニングできる。また、抗APOA2−AT末端モノクローナル抗体については、配列番号2で示されるAPOA2−ATタンパク質のC末端領域と特異的に結合し、配列番号1又は3で示されるAPOA2タンパク質のバリアントとは結合しないか、又はほとんどしないことを指標にスクリーニングできる。
(2)抗APOA2抗体の産生細胞の作製
前記1−2で得られた免疫原である組換え型APOA2タンパク質を、緩衝液に溶解して免疫原溶液を調製する。この際、免疫を効果的に行うために、必要であればアジュバントを添加してもよい。アジュバントの例としては、市販の完全フロイントアジュバント(FCA)、不完全フロイントアジュバント(FIA)等が挙げられ、これらを単独で又は混合して用いてもよい。
(1)免疫動物からの抗体産生細胞の回収と細胞融合
免疫動物から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことで、APOA2タンパク質の特定の領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製することができる。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、一般に入手可能なマウス等由来の株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生育できる性質を有するものが好ましい。また、株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、BALB/cマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ(HGPRT)欠損細胞株である、P3X62−Ag.8株(ATCCTIB9)、P3X63−Ag.8.U1株(JCRB9085)、P3/NSI/1−Ag4−1株(JCRB0009)、P3x63Ag8.653株(JCRB0028)又はSP2/0−Ag14株(JCRB0029)等が挙げられる。
(2)目的とするハイブリドーマの選抜
細胞融合処理後の細胞から目的とする抗APOA2モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選別方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。細胞懸濁液を、例えば、ウシ胎児血清含有RPMI1640培地等で適当に希釈後、96ウェルマイクロタイタープレート上に2×106個/ウェル程度播種し、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は20〜40℃、好ましくは約37℃とする。ミエローマ細胞がHGPRT欠損株又はチミジンキナーゼ(TK)欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む選択培地(HAT培地)を用いることにより、抗体産生細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択的に生育、増殖させることができるため、選択培地で培養開始後約10日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして選択すればよい。
(3)ハイブリドーマを用いた抗体産生
本発明におけるハイブリドーマは、マウスを用いて腹水化することにより抗体生産に用いることができる。具体的には、ハイブリドーマを作製する際の融合パートナーに用いた細胞の由来のマウスや、ヌードマウスの腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を適宜採取することにより、抗体を含む腹水液を回収することができる。より具体的には、SP2/0細胞を融合パートナーとしたハイブリドーマを、プリスタン接種後10日間を経たBALB/cマウスの腹腔中に接種することにより、抗体を含む腹水液を回収できる。
(4)組換え抗APOA2モノクローナル抗体又はその断片の組換えDNA操作による作製方法
本発明の抗体又はその断片は、当該抗体のアミノ酸配列をコードするcDNA配列を利用して、組換えDNA操作によって得ることもできる。
得られた抗APOA2モノクローナル抗体が特異的に認識するAPOA2タンパク質のバリアントの種類については、該タンパク質の遺伝子を基にPCR反応等を用いて各種のAPOA2タンパク質のバリアント遺伝子を作製し、該遺伝子から得られるAPOA2タンパク質の各種バリアントとモノクローナル抗体の結合性を解析することにより決定できる。
抗APOA2ポリクローナル抗体は、当該技術分野で公知の方法によって作製することができる。以下に、例として、APOA2タンパク質の特定のバリアントのみと特異的に結合する抗APOA2タンパク質末端抗体の取得法を具体的に示す。
抗APOA2タンパク質末端ポリクローナル抗体の作製は、1−3−1(2)に記載の抗APOA2抗体の産生細胞の作製方法と同様に行えばよい。抗原には特定のAPOA2タンパク質のバリアント配列上の少なくとも6アミノ酸以上の長さを持つC末端断片、例えば配列番号28又は29で示されるペプチドを用いればよい。最終免疫の日から2〜5日後、好ましくは3日後に免疫動物の血液からAPOA2タンパク質を認識するポリクローナル抗体を含む抗血清が回収できる。
(1)ペプチド固定化カラムの作製
APOA2タンパク質のC末端領域ペプチド、及びAPOA2タンパク質のC末端領域ペプチドのC末端にアミド基を付加したペプチドをそれぞれ固定化したアフィニティーカラムを作製する。詳しい方法は「抗ペプチド抗体実験プロトコール」、第2版、秀潤社に記載されている。アフィニティーカラムに使用する担体は、ホルミルセルロファインやCNBrアガロースのように、担体上の官能基をペプチドのアミノ基へ結合可能なもの、若しくは担体に共有結合させたマレイミド基を介して、ペプチド配列上のシステイン残基へ結合可能なものなどが利用可能である。また、固定化するペプチドの長さは、APOA2タンパク質のC末端を含む限り、6アミノ酸以上、好ましくは10アミノ酸以上、好ましくは18アミノ酸以上、より好ましくは30アミノ酸以上である。
(2)抗体精製
抗APOA2タンパク質末端ポリクローナル抗体は、前記抗血清からペプチド固定化アフィニティーカラムを用いて精製することができる。例えば、前記抗血清を適切な緩衝液で希釈し、抗血清に含まれるIgG抗体を、APOA2タンパク質のC末端領域ペプチドを固定化したアフィニティーカラムに吸着させ、この吸着画分を回収する。続いて、C末端をアミド化したAPOA2タンパク質ペプチドを固定化したアフィニティーカラムを用いて、ペプチドのC末端領域以外への結合性を示すイムノグロブリンを吸着除去する。最終的に、この非吸着画分を特定のAPOA2タンパク質のバリアントを特異的に認識する抗APOA2タンパク質末端ポリクローナル抗体として取得する。
本発明の第二の態様は、胆道癌をインビトロで検出する診断補助方法に関する。本発明は、2種のAPOA2タンパク質バリアント、すなわちAPOA2−ATQタンパク質及びAPOA2−ATタンパク質のそれぞれのC末端領域を特異的に認識する末端抗体(抗APOA2タンパク質末端抗体)又はその断片と、C末端領域以外の領域のアミノ酸配列を認識する抗APOA2タンパク質抗体(抗APOA2タンパク質非末端抗体)又はその断片を使用して、前記2種のAPOA2タンパク質バリアントを測定することを特徴とする。さらに、測定した2種のAPOA2タンパク質バリアントの測定値を用いた多変量解析により、胆道癌を検出する方法を特徴とする。
「胆道癌検出用マーカー測定工程」とは、被験体由来の体液中に存在する胆道癌検出用マーカーの量、すなわち、APOA2−ATQタンパク質及びAPOA2−ATタンパク質からなる、2種のAPOA2タンパク質バリアントの量をインビトロで測定する工程である。
「罹患決定工程」とは、前記胆道癌検出用マーカー測定工程で測定されたタンパク質の量に基づいてインビトロで胆道癌の罹患を決定(又は評価)する工程である。測定された胆道癌検出用マーカー、すなわち、被験体の体液試料中におけるAPOA2タンパク質バリアントの量(APOA2−ATQタンパク質及びAPOA2−ATタンパク質の量)を測定して、胆道癌の検出を行い、胆道癌の罹患の有無を決定し、又は罹患の可能性を評価する。本工程は、さらに第1工程〜第3工程の3つの工程で構成される。以下、それぞれの工程について詳細に説明する。
(第1の工程)
第1の工程では、配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるAPOA2−ATQタンパク質のC末端領域と特異的に結合する抗APOA2−ATQ末端抗体と、該C末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗APOA2−ATQ非末端抗体を用いて、被験体の体液試料中におけるAPOA2−ATQタンパク質の量を測定する。
(第2の工程)
次に、第2の工程では、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるAPOA2−ATタンパク質のC末端領域と特異的に結合する抗APOA2−AT末端抗体と、該C末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗APOA2−AT非末端抗体を用いて、APOA2−ATタンパク質の量を測定する。ここで、APOA2−ATQタンパク質及びAPOA2−ATタンパク質の前記C末端領域は、それぞれC末端を含む6以上の連続したアミノ酸を含む配列であることが望ましい。APOA2タンパク質バリアントの量は、例えばELISA法により測定することができるが、この方法に限定されない。さらに、第1の工程において抗APOA2−ATQ末端抗体と共に用いる抗APOA2−ATQ非末端抗体と、第2の工程において抗APOA2−AT末端抗体と共に用いる抗APOA2−AT非末端抗体は、抗APOA2タンパク質非末端抗体として同一であってもよい。例えば、第1の工程において抗APOA2−AT非末端抗体を、また第2の工程において抗APOA2−ATQ非末端抗体を用いることができる。
(第3の工程)
第3の工程では、第1の工程で得たAPOA2−ATQタンパク質の量の測定値と第2の工程で得たAPOA2−ATタンパク質の量の測定値を、予め設定した判別式に入力して被験体における判別値を求め、健常体における判別値と比較して統計学的に有意に差があるときに胆道癌に罹患していると決定する。ここで用いる判別式は、後述する方法にて設定することができる。
胆道癌への罹患の有無を決定し又は罹患の可能性を評価するための分析法としては、ロジスティック回帰分析を用いて判別式を得る方法を使用できる。
・数式2:a x (APOA2−ATQ) + b x (APOA2−AT)+ c x (APOA2−ATQ) x (APOA2−AT) +d
・数式3:c x (APOA2−ATQ) x (APOA2−AT) + d
(数式1〜3において、a,b,c,dはゼロでない任意の実数、(APOA2−ATQ)はAPOA2−ATQタンパク質の測定値、(APOA2−AT)はAPOA2−ATタンパク質の測定値である。)
ロジスティック回帰式として判別式を得た場合には、被験体と健常体から得られたAPOA2−ATQタンパク質又はAPOA2−ATタンパク質の測定値を前記ロジスティック回帰式に入力して得た判別値を比較し、被験体が胆道癌に罹患していると決定することができる。例えば、前記統計学的に有意に差のあるときの被験体の判別値が、健常体の判別値の3分の2以下である場合に、より好ましくは2分の1以下、さらに好ましくは4分の1以下である場合に、被験体が胆道癌に罹患していると決定することができる。
本発明の第三の態様は、胆道癌検出用キットである。
(比較例1)血中APOA2−ATQタンパク質の量による胆道癌の判別
国立がんセンター中央病院において、インフォームドコンセントを得た胆道癌患者44名と健常者109名から採取した血漿を対象に、ELISA法により血中APOA2―ATQタンパク質の検出を行った。
(比較例2)血中APOA2−ATタンパク質の量による胆道癌の判別
血中APOA2−ATタンパク質の量の測定は、比較例1と同様の血漿を対象に、前記抗APOA2−AT末端ポリクローナル抗体と前記抗APOA2タンパク質非末端ポリクローナル抗体のPOD標識体を用いたサンドイッチELISA法により行った。抗APOA2タンパク質非末端ポリクローナル抗体のPOD標識化、及びサンドイッチELISAについても、比較例1と同様に行った。得られた測定値に対して、組換え型ヒト由来タンパク質APOA2−ATタンパク質の抗原溶液を標品として、血中のタンパク質濃度を算出した。また、血漿の希釈倍率は6000倍とした。図2に、健常者と胆道癌患者について、血中のタンパク質濃度をプロットした結果を示す。健常者と胆道癌患者の分布は重なっており、判別が困難であることが明らかとなった。次に、APOA2―ATタンパク質の測定値を用いて、以下の統計処理により、健常者と胆道癌患者の判別を行った。目的変数として、胆道癌患者を「1」、健常者を「0」と定義し、APOA2―ATタンパク質の測定値を説明変数として、ロジスティック回帰分析を行い、判別式とAUC値を算出した。本手法はAUC値=0.770を示し、胆道癌判別性能が高いとは言えないことが明らかとなった。
(実施例1)血中APOA2−ATQタンパク質と血中APOA2−ATタンパク質の量の積による胆道癌の判別
比較例1及び2の結果、APOA2タンパク質バリアント(APOA2−ATQとAPOA2−AT)のそれぞれの量の測定値を用いて胆道癌患者と健常者の判別を行ったところ、判別性能は低いことが示された。そのため、次に、前記2種のAPOA2タンパク質バリアントの量を組み合わせることにより、胆道癌の判別を試みた。図3に、比較例1と2で得られたAPOA2―ATQタンパク質とAPOA2―ATタンパク質の血中濃度をプロットした散布図を示す。その結果、健常者と胆道癌患者は散布図上で異なる分布を示すことが明らかとなった。図4に、健常者と胆道癌患者について、APOA2―ATQタンパク質とAPOA2―ATタンパク質の濃度の積をプロットした結果を示す。図1及び2と比較して、健常者と胆道癌患者の分布が分かれ、判別しやすくなっている。
(式中、c, dはゼロでない任意の実数、APOA2−ATQは、APOA2−ATQタンパク質の前記測定値、APOA2−ATは、APOA2−ATタンパク質の量の前記測定値を表す。)
本手法はAUC値=0.937を示し、比較例1及び2と比べて、非常に高い胆道癌判別精度を示すことが確かめられた。
(実施例2)血中APOA2−ATQタンパク質と血中APOA2−ATタンパク質の量を組み合わせた胆道癌の判別
APOA2タンパク質バリアントであるAPOA2―ATQタンパク質とAPOA2―ATタンパク質の量の測定値を用いて、以下の統計処理により、健常者と胆道癌患者の判別を行った。目的変数として、胆道癌患者を「1」、健常者を「0」と定義し、比較例1及び比較例2で得られた2種のAPOA2タンパク質バリアント(APOA2―ATQタンパク質とAPOA2―ATタンパク質)の測定値を説明変数として、ロジスティック回帰分析を行い、判別式とAUC値を算出した。作成した判別式は以下に示す通りとなった。
(式中、a, b, dはゼロでない任意の実数、APOA2−ATQは、APOA2−ATQタンパク質の前記測定値、APOA2−ATは、APOA2−ATタンパク質の量の前記測定値を表す。)
本手法はAUC値=0.943を示し、比較例1及び2と比べて、非常に高い胆道癌判別精度を示すことが確かめられた。
(実施例3)血中APOA2−ATQタンパク質量と血中APOA2−ATタンパク質量、及び血中APOA2−ATQタンパク質量と血中APOA2−ATタンパク質量の積を組み合わせた胆道癌の判別
APOA2タンパク質バリアントであるAPOA2−ATQタンパク質とAPOA2−ATタンパク質の量の測定値と、その積を用いて、以下の統計処理により、健常者と胆道癌患者の判別を行った。目的変数として、胆道癌患者を「1」、健常者を「0」と定義し、比較例1及び比較例2で得られた2種のAPOA2タンパク質のバリアント(APOA2−ATQタンパク質とAPOA2−ATタンパク質)の測定値とその積を説明変数としてロジスティック回帰分析を行い、判別式とAUC値を算出した。作成した判別式は以下に示す通りとなった。
(式中、a, b, c,dはゼロでない任意の実数、APOA2−ATQは、APOA2−ATQタンパク質の前記測定値、APOA2−ATは、APOA2−ATタンパク質の量の前記測定値を表す。)
表1に、得られた判別式における、AUC値、症例データの判別成績(感度、特異度)の算出結果と、前記比較例1及び2と実施例1及び2で得られた結果を示す。APOA2−ATQタンパク質とAPOA2−ATタンパク質の測定値のいずれか一方を説明変数とした場合、特異度97%の条件下において、感度は22%となった。一方、APOA2−ATQタンパク質とAPOA2−ATタンパク質の測定値の積を説明変数とした場合、感度は65%となった。APOA2−ATQタンパク質とAPOA2−ATタンパク質の測定値を説明変数とした場合、感度は70%となった。さらに、APOA2−ATQタンパク質、APOA2−ATタンパク質の測定値とその積を説明変数とした場合、AUC値=0.946へと向上するとともに感度も72%へと向上した。その結果、比較例1及び2と比べて、高感度な胆道癌検出が可能となることが確認された。
CA19−9を用いて早期胆道癌の判別を行った。早期胆道癌患者は、前記実施例1で用いた胆道癌患者のうち、UICC(Unio Internationalis Contra Cancrum)のステージ分類において、0、IA、IB、IIA、IIB、である12名を対象とし、健常者109名との判別を行った。CA19−9を用いた判別は、次に示す通りに行った。被験者から採集した血漿を対象にCA19−9の量を、免疫学的方法により測定した。通常、CA19−9により健常者と胆道癌患者の判別を行う際、37(U/mL)以下を基準値とし、CA19−9の量が基準値内である場合を健常者、基準値を上回る場合は胆道癌患者であると判別される(臨床検査データブック 2013−2014、高久史麿監修、医学書院、p.636−637)。本比較例では、前記基準値をもとに、CA19−9を用いて胆道癌と健常者を判別した。その結果、胆道癌の判別性能は、感度は41%(特異度95%)となり、胆道癌の検出性能は低いことが確認された。
(実施例4)APOA2を用いた早期胆道癌の判別
APOA2タンパク質バリアントであるAPOA2−ATQタンパク質とAPOA2−ATタンパク質の量の測定値を用いて早期胆道癌の判別を行った。早期胆道癌患者は、前記比較例3と同様の検体を対象とした。本手法では、前記実施例3において健常者と胆道癌患者の判別に用いた際と同様の判別式(APOA2−ATQタンパク質、APOA2−ATタンパク質、APOA2−ATQタンパク質とAPOA2−ATタンパク質の測定値の積、の組み合わせ)を用いて判別を行った。その結果、判別性能は、感度58%(特異度97%)となり、前記CA19−9を用いた判別法と比較して、高精度な胆道癌検出が可能となることが確認された。
Claims (8)
- 被験体の体液試料中におけるAPOA2タンパク質のバリアントの量を測定して胆道癌を検出する方法であって、
(A)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるAPOA2−ATQタンパク質のC末端領域と特異的に結合する抗APOA2−ATQ末端抗体と、該C末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗APOA2−ATQ非末端抗体とを用いて、試料中のAPOA2−ATQタンパク質の量を測定する第1の工程、
(B)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるAPOA2−ATタンパク質のC末端領域と特異的に結合する抗APOA2−AT末端抗体と、該C末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗APOA2−AT非末端抗体とを用いて、試料中のAPOA2−ATタンパク質の量を測定する第2の工程、
(C)第1の工程で得たAPOA2−ATQタンパク質の量と第2の工程で得たAPOA2−ATタンパク質の量とを予め設定した判別式に入力して得た被験体の判別値が、健常体の判別値と比較して統計学的に有意に差があるときに被験体が胆道癌に罹患していると決定する第3の工程を含む胆道癌の検出方法。 - APOA2−ATQタンパク質及びAPOA2−ATタンパク質の前記C末端領域が、それぞれC末端を含む6以上の連続したアミノ酸を含む配列からなる、請求項1に記載の検出方法。
- 前記判別式が、ロジスティック回帰式、サポートベクターマシーンの解析で作成された式、ニューラルネットワークの解析で作成された式、及び判別分析の解析で作成された式からなる群から選択されるいずれか1つである、請求項1又は2に記載の検出方法。
- 前記ロジスティック回帰式で作成された判別式が
数式1:a (APOA2−ATQ) + b (APOA2−AT) + d
数式2:a (APOA2−ATQ) + b (APOA2−AT)+ c [(APOA2−ATQ) × (APOA2−AT)] + d
数式3:c [(APOA2−ATQ) × (APOA2−AT)] + d
のいずれかである請求項3に記載の検出方法。
(式中、a,b,c,dはゼロでない任意の実数、APOA2−ATQは、APOA2−ATQタンパク質の前記測定値、APOA2−ATは、APOA2−ATタンパク質の前記測定値を表す。) - 前記判別式から得た被験体の判別値が、健常体の判別値の3分の2以下である、請求項4に記載の方法。
- 前記体液試料が、血液である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記胆道癌が早期胆道癌である請求項1〜6のいずれか一項に記載の検出方法。
- 重鎖のCDR1、CDR2及びCDR3が、それぞれ配列番号4、5及び6、又は10、11及び12、で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3が、それぞれ配列番号7、8及び9、又は13、14及び15、で示されるアミノ酸配列からなる抗APOA2−ATQ末端モノクローナル抗体又はその断片と、重鎖のCDR1、CDR2及びCDR3が、それぞれ配列番号16、17及び18、又は22、23及び24、で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3が、それぞれ配列番号19、20及び21、又は25、26及び27、で示されるアミノ酸配列からなる抗APOA2タンパク質非末端モノクローナル抗体又はその断片の中から、1種類以上のモノクローナ抗体又はその断片を含む、胆道癌の検出用キット。
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