PT2275815E - Métodos de imunoensaio melhorados - Google Patents
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Description
ΕΡ 2 275 815/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Métodos de imunoensaio melhorados"
CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se genericamente ao campo dos ensaios de diagnóstico ou prognóstico e em particular refere-se à optimização de ensaios para a detecção de anticorpos numa amostra compreendendo fluido corporal de um paciente, em que esses anticorpos são utilizados como marcadores biológicos de um estado de doença ou susceptibilidade a doença.
ANTECEDENTES DO INVENTO
Muitos ensaios de diagnóstico, prognóstico e/ou monitorização assentam na detecção de um marcador biológico de um determinado estado de doença ou susceptibilidade a doença. Tais marcadores biológicos são vulgarmente proteínas ou polipéptidos que são caracteristicos de uma determinada doença ou estão associados a susceptibilidade a doença.
Em anos recentes tornou-se evidente que os anticorpos, e em particular os auto-anticorpos, podem servir também como marcadores biológicos de doença ou susceptibilidade a doença. Os auto-anticorpos são anticorpos de ocorrência natural dirigidos contra a um antigénio que o sistema imunitário de um indivíduo reconhece como estranho apesar desse antigénio ser de facto originário do indivíduo. Podem estar presentes na circulação como auto-anticorpos livres em circulação ou na forma de complexos imunitários em circulação consistindo em auto-anticorpos ligados à sua proteína marcadora alvo. As diferenças entre a proteína de tipo selvagem expressa por células "normais" e uma forma alterada da proteína produzida por uma célula doente ou durante um processo de doença podem, nalguns casos, conduzir a que a proteína alterada seja reconhecida pelo sistema imunitário de um indivíduo como "não própria" e desencadear assim uma resposta imunitária nesse indivíduo. Esta pode ser uma resposta imunitária humoral (i.e., mediada por células B) conduzindo à produção de auto- 2 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ anticorpos imunologicamente específicos para a proteína alterada.
Em WO 99/58978 descrevem-se métodos para utilizar na detecção/diagnóstico de cancro que são baseados na avaliação da resposta imunitária de um indivíduo a dois ou mais marcadores tumorais distintos. Estes métodos envolvem geralmente o contacto de uma amostra de fluido corporal tomada do indivíduo com um painel de dois ou mais antigénios marcadores tumorais distintos, cada um derivado de uma proteína marcadora tumoral separada, e a detecção da formação de complexos dos antigénios marcadores tumorais ligados a auto-anticorpos em circulação imunologicamente específicos para as proteínas marcadoras tumorais. A presença de tais auto-anticorpos em circulação é tomada como uma indicação da presença de cancro.
Os ensaios que medem a resposta imunitária do indivíduo à presença de proteína marcadora tumoral em termos de produção de auto-anticorpos proporcionam uma alternativa à medição ou detecção directa da proteína marcadora tumoral em fluidos corporais. Tais ensaios constituem essencialmente a detecção indirecta da presença de uma proteína marcadora tumoral. Devido à natureza da resposta imunitária, é provável que os auto-anticorpos possam ser desencadeados por uma quantidade muito pequena de proteína marcadora tumoral em circulação e os métodos indirectos que assentam na detecção da resposta imunitária aos marcadores tumorais serão consequentemente mais sensíveis que os métodos para a medição directa de marcadores tumorais em fluidos corporais. Os métodos de ensaio baseados na detecção de auto-anticorpos podem por isso ter um valor particular no início do processo de doença e possivelmente também em relação à pesquisa de pacientes assintomáticos, por exemplo em pesquisa para identificar indivíduos "em risco" de desenvolver doença entre uma população de indivíduos assintomáticos, para identificar indivíduos que tenham desenvolvido uma doença entre uma população de indivíduos assintomáticos. Adicionalmente, o método baseado na detecção de auto-anticorpos pode ter particular valor no início do processo de doença e possivelmente pode também ser utilizado para identificar indivíduos que tenham desenvolvido uma doença entre uma população de indivíduos assintomáticos. Para além 3 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ disso, podem ser úteis para detecção precoce de doença recorrente. Os métodos de ensaio podem também ter valor na selecção ou monitorização de terapias para uma doença.
Os anticorpos e auto-anticorpos podem também servir como marcadores biológicos de outros estados de doença ou susceptibilidades a doenças, dos quais a artrite reumatóide, o lúpus sistémico eritematoso (LSE), a cirrose biliar primária (CBP), a tiroidite auto-imune (p.ex., tiroidite de Hashimoto), a gastrite auto-imune (p.ex., anemia perniciosa), a adrenalite auto-imune (p.ex., doença de Addison), o hipoparatiroidismo auto-imune, a diabetes auto-imune (p.ex., diabetes de tipo 1), a miastenia grave são apenas exemplos.
Os presentes inventores reconheceram que quando são utilizados ensaios baseados na detecção de anticorpos em diagnóstico ou prognóstico para avaliar o estado de doença, a progressão da doença ou a susceptibilidade a doença de um indivíduo dentro de uma população, podem surgir dificuldades na elaboração de uma metodologia de ensaio padronizada apropriada para toda a população de indivíduos a pesquisar porque as quantidades absolutas de anticorpo presentes variam drasticamente de indivíduo para indivíduo. Isto pode produzir uma elevada incidência de resultados falsos-negativos, por exemplo entre indivíduos possuindo uma baixa quantidade de anticorpo. Semelhantemente existe uma dificuldade no registo de resultados positivos verdadeiros porque a variação em quantidades absolutas de anticorpo de indivíduo para indivíduo significa que é difícil estabelecer um limiar para um resultado positivo do ensaio que seja apropriado para todos os indivíduos dentro da população pesquisada.
Os presentes inventores determinaram agora que o desempenho e mais especificamente a utilidade clínica e a confiança dos ensaios com base na detecção de anticorpos, particularmente auto-anticorpos, como marcadores biológicos de doença podem ser drasticamente melhorados através da inclusão de um passo de titulação do antigénio. Através do teste da amostra suspeita de conter anticorpos contra uma série de quantidades diferentes de antigénio e da construção de uma curva de titulação é possível identificar com confiança resultados de pesquisa positivos verdadeiros independentemente 4 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ da quantidade absoluta de anticorpo presente na amostra. Uma tal abordagem é contrária aos métodos da arte anterior que titulam o antigénio meramente para construir uma curva de calibração para permitir a identificação da concentração de antigénio mais apropriada a utilizar para detecção de anticorpos em amostras de pacientes reais. Nestes métodos é proposta apenas uma medição pontual para um diagnóstico real. Assim, estes métodos não permitirão a variação nas quantidades de anticorpo a detectar de indivíduo para indivíduo resultando na incidência de falsos-positivos e falsos-negativos tal como discutido. Os presentes inventores verificaram que o método de titulação do antigénio do presente invento aqui discutido tem maior especificidade e sensibilidade que a medição da reactividade dos auto-anticorpos numa única concentração de antigénio ou os métodos nos quais é titulada a amostra de soro em vez do antigénio.
Rasmussen et al., Journal of Immunological Methods, 127 (1990) 139-145 descrevem um ELISA desenvolvido para a detecção de anticorpos citoplasmáticos anti-neutrófilos circulantes (ANCA).
SUMÁRIO DO INVENTO
De acordo com um primeiro aspecto do invento é proporcionado um método in vitro de determinação do perfil de um anticorpo numa amostra de teste compreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero em que o referido anticorpo é um auto-anticorpo que é um marcador biológico de um estado de doença ou susceptibilidade a doença, compreendendo o método: a) o contacto da amostra de teste com uma variedade de quantidades diferentes de um antigénio específico para o referido anticorpo, b) a detecção da quantidade de ligação específica entre o referido anticorpo e o referido antigénio, e c) o traçado ou cálculo de uma curva da quantidade da referida ligação específica versus a quantidade de antigénio para cada quantidade de antigénio utilizada no passo (a) , para construir um perfil de produção de anticorpos no referido 5 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ indivíduo, antes do início da doença ou durante o decorrer da doença, em que o método é repetido para construir um perfil de produção de anticorpos.
Em todos os aspectos do invento o indivíduo mamífero é de preferência um ser humano.
Em todos os aspectos do presente invento o método é de preferência realizado in vitro numa amostra de teste compreendendo um fluido corporal obtido ou preparado a partir do indivíduo mamífero.
Uma característica particular do presente invento em todos os seus aspectos é que a avaliação de se o anticorpo relevante está ou não está presente na amostra de teste se baseia na quantidade de ligação específica observada em cada concentração de antigénio diferente testada, por outras palavras os valores colectivos, em vez de apenas uma leitura numa única concentração. Assim, pode-se seguir a determinação da presença ou ausência de estado de doença ou susceptibilidade a doença ou anticorpos para uma substância estranha numa amostra de um paciente directamente com base nestes valores colectivos. De preferência, a avaliação é feita com base na apresentação de uma curva genericamente em forma de S ou sigmóide quando a quantidade de ligação especifica é traçada contra a quantidade de antigénio. Tal como será evidente a partir dos presentes Exemplos, os inventores observaram que os métodos de titulação do antigénio do presente invento têm maior especificidade e sensibilidade que os métodos de diagnóstico ou detecção baseados numa única leitura e reduzem a incidência de determinações falsas-positivas e falsas-negativas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1: Medição de auto-anticorpos no soro utilizando uma curva de titulação do antigénio. 0 soro de um paciente de cancro 17766(C) liga-se fortemente ao antigénio de teste com uma curva sigmóide caracteristica (— —) mas não se liga ao controlo negativo, VOL (— —) . Em comparação, o soro de um indivíduo normal, 18052(N) não se liga ao antigénio de teste (— —) nem ao controlo negativo (—<—) . 6 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ
Figura 2: Comparação dos níveis de auto-anticorpo para p53 em indivíduos normais e pacientes com cancro da mama primário (CMP) medidos utilizando o ensaio de titulação do antigénio. Os níveis de auto-anticorpo são expressos como a DO650 devida à ligação ao antigénio de teste (p53) menos a devida à ligação ao controlo negativo. A linha de limite de exclusão normal (----) foi calculada como a média mais 2 desvios padrão da população normal. A Figura 3 mostra uma comparação dos níveis do auto-anticorpo de p53 e NY-ESO em indivíduos normais e pacientes com cancro do pulmão tal como medido utilizando o ensaio de titulação do antigénio. Os níveis de auto-anticorpo são expressos como a Ό0β5ο devida à ligação ao antigénio de teste (p53 ou NY-ESO) menos a devida à ligação ao controlo negativo.
As linhas de limite de exclusão normais (----) foram calculadas como a média mais 2 desvios padrão da população normal. A Figura 4 mostra uma curva de titulação para a detecção de auto-anticorpos contra p53 e NY-ESO numa amostra de líquido de ascites tomada de uma paciente com cancro da mama. Esta paciente foi testada mas verificou-se que não produzia auto-anticorpos contra c-myc. A Figura 5 mostra uma curva de titulação para detecção de auto-anticorpos contra BRCA1, BRCA2 e HER2 numa amostra de soro de uma paciente com cancro da mama (carcinoma ductal in situ). A Figura 6 mostra uma curva de titulação para a detecção de auto-anticorpos contra NY-ESO numa amostra de soro de um paciente com cancro do pulmão. Este paciente foi testado mas verificou-se que não produzia auto-anticorpos contra p53 ou c-myc. A Figura 7 mostra uma curva de titulação para a detecção de auto-anticorpos contra NY-ESO e p53 numa amostra de soro de um paciente com cancro do pulmão. Este paciente foi testado mas verificou-se que não produzia auto-anticorpos contra c-myc. 7 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ
As Figuras 8 (a) e 8 (b) : ilustram os resultados em dois ensaios de titulação independentes para auto-anticorpos contra p53, c-myc e NY-ESO-1 em amostras de soro de um indivíduo "normal" (i.e. um indivíduo sem evidência de cancro).
As Figuras 9 (a) e 9 (b) mostram os resultados de dois ensaios de titulação independentes realizados em amostras de soro de uma única paciente com cancro da mama invasivo utilizando uma variedade de antigénios diferentes.
As Figuras 10(a) e 10(b) ilustram os resultados de ensaios de titulação em que amostras de soro de um indivíduo humano clinicamente normal foram testadas quanto à presença de auto-anticorpos utilizando antigénios BRCA2, HER2, c-myc e NY-ESO-1 biotinilados, BRCAl não biotinilado e produtos de expressão de controlo do vector "vazio" VOL, que codifica o marcador biotina mas nenhum antigénio adicional. A Figura 11 ilustra os resultados da análise de auto-anticorpos de uma paciente com cancro da mama primário utilizando o ensaio de titulação de antigénio do presente invento em relação aos antigénios p53, c-myc e NY-ESO-1 e aos produtos de expressão de controlo do vector "vazio" VOL. A Figura 12 ilustra os resultados de uma repetição do ensaio mostrado na Figura 11 mas com soro de um indivíduo normal. A Figura 13 ilustra mais resultados obtidos utilizando o ensaio de titulação de antigénio do presente invento numa paciente com cancro da mama primário mas que também apresenta uma resposta de anticorpos a biotina. A Figura 14 ilustra os resultados da comparação experimental em amostras normais entre um ensaio de detecção de auto-anticorpos quando o antigénio é titulado de acordo com o presente invento e um ensaio de detecção de auto-anticorpos em que a quantidade de antigénio permanece constante mas o soro é titulado. 8 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ A Figura 15 ilustra os resultados de uma comparação experimental, numa amostra de uma paciente com cancro da mama primário, entre um ensaio de detecção de auto-anticorpos quando o antigénio é titulado de acordo com o presente invento e um ensaio de detecção de auto-anticorpos quando a quantidade de antigénio permanece constante mas o soro é titulado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 invento proporciona em geral um método de imunoensaio para detecção de um anticorpo que serve como marcador biológico para um estado de doença ou susceptibilidade a doença, caracterizado por uma amostra a testar quanto à presença do anticorpo ser testada quanto à ligação especifica contra diferentes quantidades do antigénio especifico para o anticorpo e uma curva de titulação produzida para a ligação anticorpo/antigénio versus a quantidade de antigénio testada.
As caracteristicas gerais dos imunoensaios, por exemplo ELISA, radioimunoensaios e semelhantes, são bem conhecidas dos peritos na arte (ver "Immunoassay", E. Diamandis e T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996). Os imunoensaios para a detecção de anticorpos possuindo uma determinada especificidade imunológica requerem geralmente a utilização de um reagente (antigénio) que exibe reactividade imunológica especifica com o anticorpo em teste. Dependendo do formato do ensaio este antigénio pode ser imobilizado num suporte sólido. Uma amostra a testar quanto à presença do anticorpo é colocada em contacto com o antigénio e se estiverem presentes na amostra anticorpos com a especificidade imunológica requerida eles reagirão imunologicamente com o antigénio para formar complexos anticorpo-antigénio que podem então ser detectados ou medidos quantitativamente. 0 método do invento é caracterizado por uma amostra padronizada a testar quanto à presença do anticorpo ser testada contra uma variedade de diferentes quantidades de antigénio (também aqui referida como uma série de titulação). A amostra é testada contra pelo menos duas e de preferência pelo menos três, quatro, cinco, seis ou sete quantidades diferentes do antigénio. Os ensaios típicos podem também 9 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ incluir um controlo negativo que não contém qualquer antigénio.
Neste contexto o termo "antigénio" refere-se a uma substância compreendendo pelo menos um determinante antigénico ou epitopo capaz de interagir especificamente com o anticorpo alvo que se deseja detectar ou qualquer agente de captura que interaja especificamente com a região variável ou regiões determinantes de complementaridade do referido anticorpo. 0 antigénio será tipicamente uma macromolécula biológica de ocorrência natural ou sintética tal como, por exemplo, uma proteína ou péptido, um polissacárido ou um ácido nucleico, e pode incluir anticorpos ou seus fragmentos tais como anticorpos anti-idiotipicos.
Os leitores peritos apreciarão que no método do presente invento a quantidade de determinantes antigénicos ou epítopos disponíveis para ligação ao anticorpo alvo é importante para o estabelecimento de uma série de titulação. Em muitos formatos de ensaio a quantidade de determinantes ou epítopos antigénicos disponível para ligação está directamente correlacionada com a quantidade de moléculas de antigénio presentes. No entanto, noutras concretizações preferidas, tais como certos sistemas de ensaio de fase sólida, a quantidade de determinantes ou epítopos antigénicos expostos pode não se correlacionar directamente com a quantidade de antigénio mas pode depender de outros factores, tais como ligação à superfície sólida. Nestas concretizações, as referências aqui a "quantidades diferentes de antigénio" numa série de titulação podem ser tomadas para referir diferentes quantidades do determinante ou epitopo antigénicos. A quantidade relativa ou absoluta de ligação específica entre anticorpo e antigénio é determinada para cada quantidade diferente utilizada de antigénio (determinante ou epitopo antigénicos) e utilizada para traçar ou calcular uma curva da quantidade (relativa ou absoluta) de ligação específica versus a quantidade de antigénio para cada quantidade de antigénio testada. Os resultados tipicos são ilustrados, apenas como exemplo, nas Figuras anexas para detecção de vários anticorpos diferentes. A presença na amostra de teste de anticorpo reactivo com o antigénio utilizado no ensaio é determinada com 10 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ base da quantidade de ligação especifica observada em cada quantidade de antigénio e é geralmente indicada através de uma curva genericamente em forma de S ou sigmóide. As quantidades absolutas de ligação especifica entre anticorpo e antigénio são geralmente não materiais, a menos que se deseje produzir uma medição quantitativa. Para uma simples determinação de sim/não da presença ou ausência de anticorpos é apenas suficiente que seja produzida uma curva com a forma correcta. Se não houver variação na ligação detectável ao longo das diferentes quantidades de antigénio testadas então isto pode ser registado como uma ausência de uma quantidade detectável do anticorpo. Em concretizações preferidas do presente invento o método não é quantitativo. Pode assim dar uma determinação de sim/não da presença ou ausência de anticorpo utilizando uma relação bidimensional proporcional que é independente da força do sinal.
Uma medida da quantidade de anticorpo presente numa determinada amostra pode, se desejado, ser derivada dos resultados dos ensaios de titulação do antigénio. 0 método do invento é vantajoso para utilizar em ensaios clínicos de diagnóstico, prognóstico, preditivos e/ou de monitorização quando as quantidades absolutas de anticorpo alvo presentes podem variar enormemente de paciente para paciente. Os inventores observaram que se tais ensaios se basearem na detecção da ligação de anticorpo utilizando uma simples quantidade/concentração do antigénio de teste, as amostras dos pacientes contendo uma quantidade de anticorpo que esteja na extremidade mínima ou máxima do intervalo fisiológico normal da quantidade de anticorpo ao longo da população podem falhar devido a limitações da metodologia de ensaio; as amostras com uma quantidade baixa de anticorpo podem ser registadas como resultados falsos-negativos, enquanto aquelas com níveis muito elevados de anticorpo podem estar fora da escala de detecção precisa dentro da metodologia de ensaio escolhida. 0 método de ensaio de titulação do presente invento é também particularmente adequado para a detecção de anticorpos/auto-anticorpos como marcadores biológicos de estado de, ou susceptibilidade a, doença enquanto quando 11 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ houver uma considerável variação de paciente para paciente na especificidade e afinidade dos anticorpos/auto-anticorpos para o antigénio alvo. As respostas de auto-anticorpos pela sua própria natureza podem variar significativamente de paciente para paciente, com a variação a ocorrer tanto nas quantidades absolutas de auto-anticorpo presentes como na especificidade/afinidade dos auto-anticorpos. 0 método do presente invento pode ter em conta esta variação de paciente para paciente, permitindo assim que seja desenvolvido um formato de ensaio padrão para qualquer dado anticorpo/auto-anticorpo.
As interacções entre auto-anticorpos e os seus antigénios alvo são geralmente de baixa afinidade mas a força da ligação pode variar de paciente para paciente, tal como delineado acima. 0 método do presente invento é particularmente adequado para detecção de ligação de baixa afinidade, uma vez que um resultado positivo pode ser inferido a partir da forma da curva de titulação. 0 método do invento proporciona também uma garantia contra a variação de dia para dia no desempenho dos imunoensaios utilizados para detecção de auto-anticorpos/anticorpos para fins de diagnóstico, prognóstico e/ou monitorização (estado de doença ou terapia). É frequentemente observado que pode haver uma considerável variação de dia para dia na força do sinal quando se realizam imunoensaios para detecção de anticorpos em amostras compreendendo fluidos corporais de pacientes. Tal variação pode surgir, por exemplo, devido a diferenças no modo em que as amostras foram obtidas e armazenadas antes dos testes. Tais factores tornam difícil registar os resultados dos ensaios clínicos com certeza, por exemplo, com base num simples valor limiar da ligação anticorpo/antigénio. 0 presente invento minimiza os efeitos de tal variação de dia para dia uma vez que um resultado positivo para a presença de anticorpo é claramente evidente a partir da forma da curva de titulação, independentemente da força do sinal.
Ainda outras vantagens do método do presente invento são que este permite a diluição da amostra do paciente, produzindo ainda resultados consistentes e também que produzirá 12 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ geralmente ο mesmo resultado de pesquisa qualitativo (positivo/negativo) utilizando fluidos corporais de diferentes fontes num indivíduo (p.ex., sangue ou soro versus fluido de ascites ou efusão pleural), apesar da concentração absoluta dos anticorpos poder ser diferente nos diferentes fluidos. 0 método do presente invento pode ser realizado em qualquer formato adequado que permita o contacto entre uma amostra suspeita de conter o anticorpo e múltiplas quantidades diferentes de um antigénio. Convenientemente, o contacto entre a amostra e diferentes quantidades do antigénio pode ocorrer em câmaras de reacção separadas mas paralelas tais como os poços de uma placa de microtitulação. Quantidades variáveis do antigénio podem ser revestidas nos poços da placa de microtitulação através da preparação de diluições em série de uma reserva de antigénio ao longo dos poços da placa de microtitulação. A reserva de antigénio pode ser de concentração conhecida ou desconhecida. Alíquotas da amostra de teste podem então ser adicionadas aos poços da placa, sendo o volume e a diluição da amostra de teste mantidos constantes em cada poço. As quantidades absolutas de antigénio adicionadas aos poços da placa de microtitulação podem variar dependendo de factores tais como a natureza do anticorpo alvo, a natureza da amostra em teste, a diluição da amostra de teste, etc., tal como será apreciado pelos peritos na arte. Geralmente as quantidades de antigénio e a diluição da amostra de teste serão seleccionadas de modo a produzir um intervalo de força de sinal que caia dentro do intervalo de detecção aceitável da leitura escolhida para detecção da ligação anticorpo/antigénio no método. Quantidades e diluições típicas para testar amostras de soro humano suspeitas de conter auto-anticorpos marcadores antitumorais são dadas nos exemplos anexos. Convenientemente as quantidades de antigénio testadas podem variar no intervalo de 0,01 pg/ml a 10 pg/ml. Tal como anteriormente mencionado, é possível construir uma curva de titulação começando com uma única reserva de antigénio mesmo quando a concentração absoluta de antigénio na reserva é desconhecida. Desde que seja utilizada a mesma solução de reserva única e diluida em série do mesmo modo, é possível comparar os resultados de ensaios de titulação separados para este antigénio efectuados em diferentes amostras de teste iniciais. 13 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ
Noutra concretização quantidades diferentes do antigénio (determinantes ou epitopos antigénicos) podem ser imobilizadas em localizações discretas ou locais de reacção num suporte sólido. Todo o suporte pode então ser colocado em contacto com a amostra de teste e a ligação do anticorpo ao antigénio ser detectada ou medida separadamente em cada uma das localizações discretas ou locais de reacção. Suportes sólidos adequados incluem também microarrays, por exemplo arrays em que os locais discretos ou pontos no array compreendem quantidades diferentes do antigénio. Os microarrays podem ser preparados através da imobilização de diferentes quantidades de um determinado antigénio em locais de reacção resolúveis discretos no array. Noutras concretizações a quantidade real de moléculas de antigénio imobilizadas pode ser mantida substancialmente constante mas o tamanho dos locais ou pontos no array variado para alterar a quantidade de epítopo de ligação disponível, proporcionando uma série de titulação de locais ou pontos com diferentes quantidades de epítopo de ligação disponível. Em tais concretizações a concentração na superfície bidimensional do epítopo ou epitopos de ligação no antigénio é importante na preparação da série de titulação, em vez da quantidade absoluta do antigénio. As técnicas para a preparação e interrogação de microarrays de proteínas/péptidos são geralmente conhecidas na arte.
Será entendido a partir da discussão de cima que em todas as concretizações do presente invento a variação na quantidade de antigénio pode ser alcançada através da alteração da densidade do antigénio ou epítopo contra o qual a amostra é testada ou através da manutenção da densidade do antigénio ou epítopo mas aumentando a área de superfície sobre a qual o antigénio é imobilizado, ou ambas.
Podem ser utilizados microarrays para efectuar múltiplos ensaios para anticorpos de diferente especificidade numa única amostra em paralelo. Isto pode ser feito utilizando arrays compreendendo múltiplos conjuntos de diferentes antigénios, compreendendo cada conjunto um determinado antigénio em múltiplas quantidades ou concentrações diferentes. 0 termo "diferentes antigénios" engloba antigénios derivados de diferentes proteínas ou polipéptidos (tais como antigénios 14 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ derivados de proteínas não relacionadas codificadas por genes diferentes) e também antigénios que são derivados de diferentes epítopos peptídicos de uma única proteína ou polipéptido. Um dado microarray pode incluir exclusivamente conjuntos de diferentes antigénios derivados de diferentes proteínas ou polipéptidos ou exclusivamente conjuntos de diferentes antigénios derivados de diferentes epítopos peptídicos de uma única proteína ou polipéptido, ou uma mistura dos dois em qualquer proporção. Deve notar-se que cada conjunto individual de antigénios de diferentes quantidades ou concentrações em qualquer concretização do presente invento compreenderá geralmente apenas um antigénio e não misturas destes.
Tal como aqui se utiliza, o termo "fluido corporal", quando se refere ao material a testar quanto à presença de anticorpos utilizando o método do presente invento, inclui inter alia plasma, soro, sangue completo, urina, suor, linfa, fezes, líquido cerebrospinal, ascites, efusão pleural, fluido seminal, cuspo, aspirado do mamilo, seroma pós-operatório ou fluido de drenagem de feridas. Tal como mencionado anteriormente, os métodos do presente invento são de preferência realizados in vitro numa amostra de teste compreendendo fluido corporal removido do indivíduo de teste. 0 tipo de fluido corporal utilizado pode variar dependendo da identidade do anticorpo a testar e da situação clínica em que o ensaio é utilizado. Em geral, é preferível efectuar os ensaios em amostras de soro ou plasma. A amostra de teste pode incluir mais componentes para além do fluido corporal, tais como por exemplo diluentes, conservantes, agentes estabilizantes, tampões, etc. 0 termo "antigénio" é aqui utilizado num sentido amplo para referir qualquer substância que exiba reactividade imunológica específica com um anticorpo alvo a detectar. Antigénios adequados podem incluir, mas não se limitam a, proteínas de ocorrência natural, proteínas ou polipéptidos recombinantes ou sintéticos, péptidos sintéticos, imitadores peptídicos, etc., também polissacáridos e ácidos nucleicos. Especificamente, quando é aqui utilizado "antigénio" pretende-se englobar qualquer agente de captura, de origem humana, origem em mamífero ou outra, capaz de interacção 15 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ imunológica específica com as regiões variáveis ou determinantes de complementaridade do anticorpo a detectar. Por exemplo anticorpos anti-idiotípicos podem ser considerados como um antigénio para este fim tal como antigénios gerados através de apresentação fágica.
Certos antigénios podem compreender ou ser derivados de proteínas ou polipéptidos isolados de fontes naturais, incluindo mas não se limitando a proteínas ou polipéptidos isolados de tecidos ou fluidos corporais de pacientes. Em tais concretizações o antigénio pode compreender substancialmente toda a proteína de ocorrência natural, i.e., a proteína substancialmente na forma em que é isolada da fonte natural, ou pode compreender um fragmento da proteína de ocorrência natural. Para ser eficaz como antigénio no método do presente invento qualquer "fragmento" tem assim de manter reactividade imunológica com os anticorpos para os quais será utilizado para teste. Fragmentos adequados podem, por exemplo, ser preparados através de clivagem química ou enzimática da proteína isolada.
Dependendo da natureza exacta do ensaio em que será utilizado, o antigénio pode compreender uma proteína de ocorrência natural ou um fragmento desta, ligado a uma ou mais outras moléculas que confiram alguma caracteristica desejável não naturalmente presente na proteína. Por exemplo, a proteína ou fragmento pode ser conjugada com um marcador de revelação, tal como por exemplo um marcador fluorescente, marcador colorido, marcador luminescente, marcador radioactivo ou metal pesado tal como ouro coloidal. Noutras concretizações a proteína ou fragmento pode ser expressa como uma proteína de fusão. Por exemplo, as proteínas de fusão podem incluir um péptido marcador no terminal N ou C para auxiliar na purificação do antigénio expresso de forma recombinante.
Dependendo do formato do ensaio em que irá ser utilizado, o antigénio pode ser imobilizado num suporte sólido tal como, por exemplo, os poços de uma placa de microtitulação, contas de microarrays ou chips ou contas magnéticas. A imobilização pode ser efectuada através de adsorção não covalente ou ligação covalente. 16 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ
Pode ser utilizado qualquer meio de ligação adequado desde que este não afecte adversamente de modo significativo a capacidade do antigénio para reagir imunologicamente com o anticorpo alvo. 0 presente invento não se limita a ensaios de fase sólida, mas engloba também ensaios que, no todo ou em parte, são realizados em fase liquida, por exemplo ensaios de contas em fase de solução.
Numa concretização, os antigénios podem ser marcados com um ligando que facilitará a imobilização, tal como biotina. 0 antigénio pode então ser diluído num intervalo de titulação adequado e depois deixado reagir com auto-anticorpos em amostras de pacientes em solução. Os complexos imunitários resultantes podem então ser imobilizados num suporte sólido através de uma interacção ligando-receptor (p.ex., biotina-estreptavidina) e o restante do ensaio efectuado tal como descrito abaixo.
Para facilitar a produção de antigénios biotinilados para utilizar nos métodos de ensaio do presente invento, podem ser expressos ADNc codificando um antigénio inteiro, uma sua versão truncada ou um seu fragmento antigénico como uma proteína de fusão marcada com um marcador proteico ou polipeptídico ao qual o cofactor biotina pode ser ligado através de uma reacção enzimática. Os vectores para a produção de antigénios biotinilados recombinantes estão comercialmente disponíveis em várias fontes.
Tal como ilustrado nos exemplos anexos, uma vantagem adicional da utilização da abordagem da curva de titulação com antigénios biotinilados é que o ensaio é capaz de distinguir entre a ligação do componente biotina aos anticorpos anti-biotina e a verdadeira ligação do antigénio ao seu anticorpo cognato. Os inventores observaram que um número significativo da população humana produz naturalmente anticorpos anti-biotina que podem conduzir à produção de resultados falsos-positivos em ensaios baseados na utilização de antigénio biotinilado. 17 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ
Tal como acima mencionado, o "imunoensaio" utilizado para detectar anticorpos de acordo com o presente invento pode ser baseado em técnicas padrão conhecidas na arte, com a excepção de que são utilizadas múltiplas quantidades de antigénio para criar uma curva de titulação. Numa concretização muito preferida o imunoensaio pode ser um ELISA. Os ELISA são geralmente bem conhecidos na arte. Num ELISA "indirecto" típico um antigénio possuindo especificidade para os anticorpos em teste é imobilizado numa superfície sólida (p.ex., os poços de uma placa de ensaio de microtitulação padrão, ou a superfície de uma microconta ou microarray) e uma amostra compreendendo fluido corporal a testar quanto à presença de anticorpos é colocada em contacto com o antigénio imobilizado. Quaisquer anticorpos com a especificidade desejada presentes na amostra ligar-se-ão ao antigénio imobilizado. Os complexos anticorpo/antigénio ligados podem então ser detectados utilizando qualquer método adequado. Numa concretização preferida um anticorpo secundário anti-imunoglobulina humana marcado, que reconhece especificamente um epítopo comum a uma ou mais classes de imunoglobulinas humanas, é utilizado para detectar os complexos anticorpo/antigénio. Tipicamente o anticorpo secundário será anti-IgG ou anti-IgM. 0 anticorpo secundário é habitualmente marcado com um marcador detectável, tipicamente um marcador enzimático tal como, por exemplo, peroxidase ou fosfatase alcalina, permitindo a detecção quantitativa através da adição de um substrato para a enzima que gera um produto detectável, por exemplo um produto colorido, quimioluminescente ou fluorescente. Outros tipos de marcadores detectáveis conhecidos na arte podem ser utilizados com efeito equivalente. 0 presente invento refere-se a um método de detecção de anticorpos que sejam marcadores biológicos de um estado de doença ou susceptibilidade a doença. Este aspecto particular do presente invento exclui de preferência ensaios desenhados para testar anticorpos produzidos em resultado de um confronto de vacina ou protocolo de imunização, para além da vacinação com marcadores de cancro. Por essa razão, ensaios de acordo com este aspecto do presente invento não incluem de preferência ensaios desenhados para testar a presença de 18 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ anticorpos antivirais ou antibacterianos após vacinação/imunização.
Em certas concretizações do presente invento o anticorpo pode ser um auto-anticorpo. Tal como indicado acima, o termo "auto-anticorpo" refere-se a um anticorpo de ocorrência natural dirigido a um antigénio que o sistema imunitário de um indivíduo reconhece como estranho apesar desse antigénio ser de facto originário do indivíduo. Os auto-anticorpos incluem anticorpos dirigidos contra formas alteradas de proteínas de ocorrência natural produzidas por uma célula doente ou durante um processo de doença. A forma alterada da proteína é originária do indivíduo mas pode ser vista pelo sistema imunitário do indivíduo como "não sendo do próprio" e assim desencadear uma resposta imunitária nesse indivíduo na forma de auto-anticorpos imunologicamente específicos para a proteína alterada. Tais formas alteradas de uma proteína podem incluir, por exemplo, mutantes possuindo uma sequência de aminoácidos alterada, opcionalmente acompanhada de alterações na estrutura secundária, terciária ou quaternária, formas truncadas, variantes de processamento, glicoformas alteradas etc. Noutras concretizações o auto-anticorpo pode ser dirigido a uma proteína que seja sobre-expressa num estado de doença, como resultado de amplificação génica ou de regulação anormal da transcrição. A sobre-expressão de uma proteína que não seja normalmente encontrada pelas células do sistema imunitário em quantidades significativas pode desencadear uma resposta imunitária conduzindo à produção de auto-anticorpos. Ainda noutras concretizações o auto-anticorpo pode ser dirigido a uma forma fetal de uma proteína que se torna expressa num estado de doença. Se uma proteína fetal que é normalmente expressa apenas em estados iniciais do desenvolvimento antes do sistema imunitário estar funcional for expressa num estado de doença, a forma fetal pode ser reconhecida pelo sistema imunitário como "estranha", desencadeando uma resposta imunitária conduzindo à produção de auto-anticorpos.
Numa concretização o anticorpo pode ser um auto-anticorpo específico para uma proteína marcadora tumoral, e mais particularmente um auto-anticorpo antitumoral "associado a cancro 19 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ Ο termo auto-anticorpo antitumoral "associado a cancro" refere-se a um auto-anticorpo que é dirigido contra um epítopo presente em formas de proteinas marcadoras tumorais que são preferencialmente expressas no estado de doença cancerígena. A presença de tais auto-anticorpos é característica do estado de doença cancerígena ou de predisposição a cancro em pacientes assintomáticos.
Em aplicações preferidas o método do presente invento será utilizado para detectar a presença de auto-anticorpos antitumorais associados a cancro em indivíduos ou pacientes humanos e tomará de preferência a forma de um imunoensaio in vitro, efectuado numa amostra de teste compreendendo uma amostra de fluido corporal tomada do indivíduo/paciente. A amostra de fluido corporal pode ser diluída num tampão adequado ou pode ser tratada para armazenamento a longo prazo ou de outro modo antes dos testes.
Os imunoensaios in vitro são não invasivos e podem ser repetidos tão frequentemente conforme necessário para construir um perfil de produção de auto-anticorpos num paciente, antes do surgimento da doença, tal como na pesquisa de indivíduos "em risco", ou ao longo do curso da doença (mais discutido abaixo em relação a aplicações preferidas do método).
Em concretizações particulares, mas não limitantes, os métodos do presente invento podem compreender imunoensaios para (simultaneamente) detectar dois ou mais tipos de auto-anticorpos, cada um possuindo especificidade para diferentes epítopos na mesma proteína ou em proteínas marcadoras tumorais relacionadas (p.ex., diferentes isoformas ou variantes codificadas por um único gene) ou para epítopos em diferentes proteínas marcadoras tumorais (significando proteínas codificadas por genes diferentes). Estes métodos envolverão tipicamente a utilização de um painel de dois ou mais conjuntos de antigénios, sendo cada conjunto de antigénios habitualmente derivado de uma proteína marcadora tumoral diferente (significando diferente neste contexto proteínas que são produtos de genes diferentes) embora tal como observado acima um conjunto de antigénios possa também envolver diferentes epítopos na mesma proteína marcadora tumoral. Um 20 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ conjunto de antigénios refere-se a um único antigénio a testar a quantidades/concentrações diferentes no método do presente invento. Estes métodos que podem ser daqui em diante referidos como "ensaios de painel", utilizam um painel de dois ou mais conjuntos de antigénios para monitorizar a resposta imunitária global de um indivíduo a um tumor ou outra alteração carcinogénica/neoplásica. Estes métodos detectam assim um "perfil" da resposta imunitária num dado indivíduo, indicando que marcadores tumorais desencadeiam uma resposta imunitária resultando em produção de auto-anticorpos. A utilização de um painel de dois ou mais antigénios para monitorizar a produção de auto-anticorpos contra dois ou mais marcadores tumorais diferentes é geralmente mais sensível que a detecção de auto-anticorpos para marcadores únicos e dá uma frequência muito mais baixa de resultados falsos-negativos (ver WO 99/58978 e WO 2004/044590, cujos conteúdos são aqui incorporados na sua totalidade por referência).
Por essa razão, num segundo aspecto o invento proporciona um método in vitro de obtenção do perfil de dois ou mais anticorpos numa amostra de teste compreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero em que pelo menos um dos referidos anticorpos é um auto-anticorpo que é um marcador biológico de um estado de doença ou susceptibilidade a doença, compreendendo o método: a) o contacto da amostra de teste com dois ou mais conjuntos de antigénios, em que cada um dos referidos conjuntos de antigénios é específico para um dos referidos anticorpos a detectar na amostra de teste e em que cada conjunto de antigénios compreende uma variedade de diferentes quantidades do referido antigénio, b) a detecção da quantidade de ligação específica entre os referidos anticorpos e os referidos antigénios, e c) o traçado ou cálculo de uma curva da quantidade da referida ligação específica versus a quantidade de antigénio para cada conjunto de antigénios utilizado no passo (a), para construir um perfil de produção de anticorpos num paciente, antes do início da doença ou durante o decorrer da doença. 21 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ
Numa concretização cada um dos referidos dois ou mais anticorpos será um marcador biológico de um estado de doença ou susceptibilidade a doença, no entanto está dentro do âmbito do presente invento combinar um ensaio de titulação para um antigénio marcador de doença com um ensaio de titulação para qualquer outro tipo de anticorpo, que pode ou não ser um marcador de doença, na mesma de amostra de teste.
De qualquer modo a avaliação de se os anticorpos relevantes estão ou não presentes na amostra de teste baseia-se na quantidade de ligação especifica observada em cada uma das diferentes concentrações de antigénio em relação a cada antigénio diferente no teste, por outras palavras os valores colectivos para cada antigénio em vez de uma leitura de uma única concentração para cada antigénio. Assim, a determinação da presença ou ausência de estado de doença ou susceptibilidade a doença ou de anticorpos para uma substância estranha na amostra de um paciente com base na presença de dois ou mais tipos de anticorpos pode basear-se nestes valores colectivos para cada antigénio. De preferência, a avaliação é feita com base na apresentação de uma curva com uma forma genericamente em S ou sigmóide em relação a qualquer um ou a todos os antigénios presentes no teste.
Para evitar dúvidas, os ensaios baseados na utilização de um único tipo de antigénio para detectar anticorpos podem ser aqui referidos como "ensaios de um único marcador", enquanto os ensaios baseados na utilização de um painel de dois ou mais antigénios são referidos como "ensaios de painel". 0 método do presente invento pode ser adaptado para utilização na detecção de auto-anticorpos para essencialmente qualquer proteína marcadora tumoral para a qual possa ser preparado um antigénio adequado, como um ensaio de um único marcador ou como um componente de um ensaio de painel. Em particular, o método pode ser adaptado para detectar/medir auto-anticorpos para a proteína receptora do factor de crescimento epidérmico EGFR (Downward et al., Nature 307: 521-527, 1984; Robertson et al., Archives of Pathology and Laboratory Medicine 126: 177-81, 2001), a glicoproteína MUC1 (Batra, S.K. et al., Int. J. Pancreatology 12: 271-283, 1992) e as proteínas reguladoras de transdução de sinal/ciclo 22 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ celular Myc (Blackwood, E.M. et al., Molecular Biology of the Cell 5: 597-609, 1994), p53 (Matlashewski, G. et al., EMBO J. 3: 3257-3262, 1984; Wolf, D. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 1887-1893, 1985) e ras (ou Ras) (Capella, G. et al., Environ.
Health Perspectives 93: 125-131, 1991), e também BRCA1 (Scully, R. et al., PNAS 94: 5605-10, 1997), BRCA2 (Sharan,
S.K. et al., Nature 386: 804-810, 1997), APC (Su, L.K. et al., Câncer Res. 53: 2728-2731, 1993; Munemitsu, S. et al. , PNAS 92: 3046-50, 1995), CA125 (Nouwen, E.J. et al. ,
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Mol. Cell Biochem. 189(1-2): 119-25, Dez. 1998), beta-gonadotrofina coriónica humana b-HCG (Ayala, A.R., et al., Am. J. Reprod. Immunol. 3(3): 149-51, Abr-Mai 1983; Gregory, J.J. Jr, et al., Drugs 57(4): 463-7, Abr. 1999), ou antigénio 4-5 (Krause, P., et al., J. Immunol. Methods 283(1-2): 261-7, Dez. 2003). No entanto, não se pretende que o presente invento esteja limitado à detecção de auto-anticorpos para estes marcadores tumorais particulares.
Os métodos de ensaios de acordo com o presente invento baseados na detecção de auto-anticorpos marcadores antitumorais (numa forma de ensaio de um único marcador ou de painel) podem ser empregues numa variedade de situações clinicas diferentes. Em particular, o método pode ser utilizado na detecção ou diagnóstico de cancro, na avaliação do prognóstico de um paciente diagnosticado com cancro, na previsão da resposta à terapia, na monitorização da progressão do cancro ou de outra doença neoplásica num paciente, na detecção de uma alteração neoplásica ou carcinogénica precoce num indivíduo humano assintomático, na pesquisa de uma população de indivíduos humanos assintomáticos para identificar os indivíduos que estejam em maior risco de desenvolver cancro ou para diagnosticar a presença de cancro, na previsão da resposta de um paciente de cancro a tratamento anticanceroso (p.ex., vacinação, terapias anti-factor de crescimento ou transdução de sinal, radioterapia, terapia endócrina, terapia de anticorpos humanos, quimioterapia), na monitorização da resposta de um paciente de cancro a tratamento anticanceroso (p.ex., vacinação, terapias anti-factor de crescimento ou transdução de sinal, radioterapia, terapia endócrina, terapia de anticorpos humanos, quimioterapia), na detecção de doença recorrente num paciente anteriormente diagnosticado como possuindo cancro que tenha sido sujeito a tratamento anticanceroso para reduzir a quantidade de cancro presente, ou na selecção de uma terapia anticanceroso (p.ex., vacina, terapias anti-factor de crescimento ou transdução de sinal, radioterapia, terapia endócrina, tratamento de anticorpos humanos, quimioterapia), para utilização num determinado paciente.
Os inventores observaram geralmente que níveis de auto-anticorpos associados a cancro mostram uma correlação positiva 24 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ com ο estado de doença (ver também WO 99/58979, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência). Assim, quando o método do presente invento é utilizado em aplicações clinicas maiores níveis de auto-anticorpos marcadores antitumorais, em comparação com controlos adequados, são geralmente tomados como uma indicação do estado de doença cancerígena.
Por exemplo, quando são utilizados imunoensaios no diagnóstico de cancro, a presença de um nível elevado de auto-anticorpos, em comparação com indivíduos de controlo "normais", é tomada como uma indicação de que o indivíduo tem cancro. Os indivíduos de controlo "normais" serão provavelmente controlo da mesma idade não possuindo qualquer diagnóstico de cancro com base em critérios clínicos, de imagiologia e/ou bioquímicos.
Quando os imunoensaios são utilizados na previsão da resposta de um paciente de cancro a tratamento anticanceroso (p.ex., vacinação, terapias anti-factor de crescimento ou transdução de sinal, radioterapia, terapia endócrina, terapia de anticorpos humanos, quimioterapia), a presença de um nível elevado de auto-anticorpos, em comparação com indivíduos de controlo "normais", pode ser tomada tal como uma indicação de se é provável ou não que o indivíduo responda ao tratamento anticanceroso. Os indivíduos de controlo "normais" serão de preferência controlos da mesma idade não possuindo qualquer diagnóstico de cancro baseado em critérios clínicos, de imagiologia e/ou bioquímicos. Para cada um dos tratamentos listados acima, uma relação entre o nível de auto-anticorpos comparado com os controlos e o provável sucesso do tratamento pode ser estabelecida através da observação do resultado de tal tratamento em pacientes cujo status de auto-anticorpos é monitorizado ao longo do tratamento. A relação anteriormente estabelecida pode então ser utilizada para prever a probabilidade de sucesso para cada tratamento num dado paciente com base na avaliação do status de auto-anticorpos.
Quando os imunoensaios são utilizados na monitorização da progressão de cancro ou outra doença neoplásica num paciente, a presença de um nível elevado de auto-anticorpos, em comparação com o "controlo normal", é tomada como uma indicação da presença de cancro no paciente. 0 "controlo 25 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ normal" pode ser níveis de auto-anticorpos presentes em indivíduos de controlo, de preferência da mesma idade, não possuindo qualquer diagnóstico de cancro com base em critérios clínicos, de imagiologia e/ou bioquímicos. Alternativamente, o "controlo normal" pode ser um nível "limiar" estabelecido para o paciente particular em teste. 0 nível "limiar" pode ser, por exemplo, o nível de auto-anticorpos presente quando é feito um primeiro diagnóstico de cancro ou um diagnóstico de cancro recorrente. Qualquer aumento acima do nível limiar será tomado como uma indicação de que a quantidade de cancro presente no paciente aumentou, enquanto qualquer diminuição abaixo do limiar será tomada como uma indicação de que a quantidade de cancro presente no paciente diminuiu. 0 valor do "limiar" pode também ser, por exemplo, o nível antes de um novo tratamento começar. Uma alteração no nível de auto-anticorpos será tomada como uma indicação da eficácia da terapia. A direcção da "alteração" (i.e., aumento vs diminuição) indicando uma resposta positiva ao tratamento será dependente da natureza exacta do tratamento. Para qualquer dado tratamento a direcção da "alteração" nos níveis de auto-anticorpos indicando um resultado positivo pode ser facilmente determinada, por exemplo através da monitorização dos níveis de auto-anticorpos em comparação com outros indicadores clínicos ou bioquímicos da resposta ao tratamento.
Quando os imunoensaios são utilizados na pesquisa de uma população de indivíduos humanos assintomáticos estes podem ser para identificar os indivíduos que estejam em maior risco de desenvolver cancro, indivíduos possuindo um nível elevado de auto-anticorpos, em comparação com indivíduos de controlo "normais", são identificados como estando "em risco" de desenvolver cancro. Os indivíduos de controlo "normais" serão de preferência controlos da mesma idade não identificados como possuindo qualquer predisposição a desenvolver cancro ou qualquer risco significativamente elevado de desenvolver cancro. Uma excepção a isto pode ser quando a própria idade é um dos principais factores de risco. Quando os imunoensaios são utilizados na pesquisa de uma população de indivíduos humanos assintomáticos estes podem ser para diagnosticar cancro nos indivíduos que tenham já desenvolvido um cancro, sendo os indivíduos possuindo um nível elevado de auto-anticorpos em comparação com indivíduos de controlo "normais" 26 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ registados como possuindo cancro ou alguma forma de alteração neoplásica. Os indivíduos de controlo "normais" serão de preferência controlos com a mesma idade não identificados como possuindo qualquer predisposição para desenvolver cancro ou qualquer risco significativamente elevado de desenvolver cancro. Uma excepção a isto é quando a própria idade é um dos principais factores de risco. Alternativamente, o "controlo normal" pode ser um nivel "limiar" estabelecido para o paciente particular em teste. 0 nível "limiar" pode ser, por exemplo, o nível de auto-anticorpos presente quando o paciente é testado pela primeira vez e se verifica que tem níveis não elevados acima de uma população de "controlo normal". Qualquer aumento a partir dai contra esta medição limiar será tomada como uma indicação da presença de cancro nesse indivíduo. Assim o indivíduo pode torna-se o seu próprio controlo através de tal teste do limiar para futura medição de auto-anticorpos.
Quando os imunoensaios são utilizados na monitorização da resposta de um paciente de cancro a tratamento anticanceroso (p.ex., vacinação, terapias anti-factor de crescimento ou transdução de sinal, radioterapia, terapia endócrina, terapia de anticorpos humanos, quimioterapia), a presença de um nível alterado de auto-anticorpos após o tratamento é tomada como uma indicação de que o paciente respondeu positivamente ao tratamento. Um nivel limiar de auto-anticorpos tomado antes do tratamento começar pode ser utilizado para fins de comparação para determinar se o tratamento resulta num "aumento ou diminuição" dos níveis de auto-anticorpos. Uma alteração no nível de auto-anticorpos será tomada como uma indicação da eficácia da terapia. A direcção da "alteração" (i.e., aumento vs diminuição) indicando uma resposta positiva ao tratamento será dependente da natureza exacta do tratamento. Para qualquer dado tratamento a direcção da "alteração" nos níveis de auto-anticorpos indicando um resultado positivo pode ser facilmente determinada, por exemplo através da monitorização dos níveis de auto-anticorpos em comparação com outros indicadores clínicos ou bioquímicos da resposta ao tratamento. 0 método do presente invento pode ser utilizado na previsão e/ou monitorização da resposta de um indivíduo a essencialmente qualquer tratamento anticanceroso conhecido. Isto inclui, por exemplo terapia de anticorpos humanos em que 27 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ anticorpos monoclonais ou policlonais são infundidos no paciente, sendo um exemplo especifico não limitante o tratamento com o anticorpo anti-factor de crescimento Herceptin™ (Baselga, J., D. Tripathy et al., J. Clin. Oncol. 14(3): 737-744, 1996). A presença de uma resposta natural de auto-anticorpos pode aumentar ou inibir a eficácia do tratamento com anticorpos terapêuticos infundidos artificialmente. Utilizando o método do presente invento é possível correlacionar a resposta a qualquer tratamento anticanceroso, incluindo terapia de anticorpos, com níveis naturais de auto-anticorpos antes e durante o curso do tratamento em qualquer paciente ou grupo de pacientes. Este conhecimento pode então por sua vez ser utilizado para prever como outros pacientes (ou o mesmo paciente no caso de tratamento repetido) responderão ao mesmo tratamento.
Quando os imunoensaios são utilizados em detecção de doença recorrente, a presença de um nivel aumentado de auto-anticorpos no paciente, em comparação com um "controlo normal", é tomada como uma indicação de que a doença recorreu. 0 "controlo normal" pode ser os níveis de auto-anticorpos presentes em indivíduos de controlo, de preferência da mesma idade não possuindo qualquer diagnóstico de cancro com base em critérios clínicos, de imagiologia e/ou bioquímicos. Alternativamente, o "controlo normal" pode ser um nível "limiar" estabelecido para o paciente particular em teste. 0 nível "limiar" pode ser, por exemplo, o nível de auto-anticorpos presente durante um período de remissão da doença com base em critérios clínicos, de imagiologia e/ou bioquímicos. 0 método de ensaio do presente invento pode ser aplicado na detecção de muitos tipos diferentes de cancro, dos quais são exemplo o cancro da mama, da bexiga, colorrectal, da próstata, do pulmão, pancreático e do ovário. Os ensaios podem complementar métodos existentes de pesquisa e vigilância. Por exemplo, no caso de cancro da mama primário podem ser utilizados imunoensaios para auto-anticorpos para alertar os médicos para pequenas lesões de biópsias em mamografias que radiograficamente não pareçam suspeitas ou para realizarem imagiologia da mama ou para repetirem a imagiologia mais cedo do que o planeado. Na clínica, espera-se que os métodos de 28 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ ensaio do presente invento sejam mais objectivos e reprodutíveis em comparação com as técnicas de imagiologia actuais (i.e. mamografia e ultra-sons), cujo sucesso pode ser dependente do operador.
Os "ensaios de painel" podem ser feitos à medida tendo em conta a aplicação clínica particular. Um painel de antigénios para detecção de auto-anticorpos, para pelo menos p53 e c-erbB2, é particularmente útil para muitos tipos de cancro e pode ser opcionalmente suplementado com outros marcadores possuindo uma associação conhecida com o cancro particular ou um estado do cancro particular, a detectar. Por exemplo para cancro da mama o painel pode incluir MUC1 e/ou c-myc e/ou BRCA1 e/ou BRCA2 e/ou PSA enquanto para cancro da bexiga o painel pode opcionalmente incluir MUC1 e/ou c-myc, para cancro colorrectal ras e/ou APC, para cancro da próstata PSA e/ou BRCA1 e/ou BRCA2 ou para cancro do ovário BRCA1 e/ou BRCA2 e/ou CAI25. Existem outras concretizações preferidas nas quais p53 ou c-erbB2 não são necessariamente essenciais.
No caso de cancro da mama podem ser seleccionados painéis adequados a partir do seguinte: - p53 e MUC1 com c-erbB2 e/ou c-myc opcional, e/ou BRCA1 e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-1 e/ou BRC1; p53 e c-myc com c-erbB2 e/ou MUC1 e/ou BRCA1 e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-1 e/ou BRC1 opcional; - p53 e BRCA1 com c-erB2 e/ou MUC1 e/ou c-myc e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-1 e/ou BRC1 opcional; - p53 e BRCA2 com c-erbB2 e/ou MUC1 e/ou c-myc e/ou BRCA1 e/ou PSA e/ou NY-ESO-1 e/ou BRC1 opcional; - c-erbB2 e MUC1 com p53 e/ou c-myc, e/ou BRCA1 e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-1 e/ou BRC1 opcional; - c-erbB2 e c-myc com p53 e/ou MUC1 e/ou BRCA1 e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-1 e/ou BRC1 opcional; - c-erbB2 e BRCA1 com p53 e/ou MUC1 e/ou c-myc e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-1 e/ou BRC1 opcional; - c-erbB2 e BRCA2 com p53 e/ou MUC1 e/ou c-myc e/ou BRCA1 e/ou PSA opcional; - p53, c-myc, NY-ESO-1 e BRCA2. 29 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ
No caso de cancro colorrectal podem ser seleccionados painéis adequados por exemplo a partir do seguinte: - p53 e ras com c-erbB2 e/ou APC opcional; - p53 e APC com c-erbB2 e/ou Ras opcional; - Ras e APC com p53 e/ou c-erbB2 opcional.
Tais painéis podem também incluir opcionalmente CEA ou CA19-9.
No caso de cancro da próstata podem ser seleccionados painéis adequados por exemplo a partir do seguinte: - p53 e PSA com BRCA1 e/ou BRCA2 e/ou c-erbB2 opcional; - c-erbB2 e PSA com p53 e/ou BRCAl e/ou BRCA2 opcional; - PSMA, PSCA e calicreinas.
No caso de cancro do ovário podem ser seleccionados painéis adequados por exemplo a partir do seguinte: - p53 e CAI25 com c-erbB2 e/ou BRCAl e/ou BRCA2 opcional; - c-erbB2 e CA125 com p53 e/ou BRCAl e/ou BRCA2 opcional; - HER2, anexinas, CAGE e 4-5.
No caso de cancro do pulmão podem ser seleccionados painéis adequados a partir de: - p53 e NY-ESO-1, opcionalmente com mais marcadores; - HER2, anexinas, CAGE e 4-5.
Quando o método do presente invento é utilizado para efectuar um "ensaio de painel" baseado em dois ou mais antigénios marcadores tumorais derivados de diferentes proteínas, pelo menos um dos antigénios no painel pode ser testado num ensaio de acordo com o presente invento baseado em testes de múltiplas quantidades diferentes do antigénio para formar uma curva de titulação. De preferência cada um dos antigénios formando o painel é testado de acordo com o presente invento e uma curva de titulação traçada/calculada para cada antigénio individual no painel. 30 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ Ο presente invento contempla também que um ensaio de titulação para detecção de pelo menos um anticorpo marcador antitumoral pode ser utilizado em combinação com um ensaio desenhado para detectar pelo menos uma proteína marcadora tumoral (que pode estar relacionada ou não relacionada com o antigénio utilizado no ensaio de titulação) na mesma amostra do paciente. Assim os ensaios para auto-anticorpos marcadores antitumorais e ensaios para proteínas marcadoras tumorais podem ser efectuados em paralelo numa única amostra do paciente.
Noutra concretização, o método de imunoensaio do presente invento pode ser utilizado na selecção de uma vacina anticancerosa para utilizar num determinado paciente. Nesta concretização, uma amostra de fluido corporal tomada do paciente é testada utilizando um painel de dois ou mais antigénios, correspondendo cada um a uma proteína marcadora tumoral diferente, para determinar a força relativa da resposta imunitária do paciente a cada uma das diferentes proteínas marcadoras tumorais. A "força da resposta imunitária" a uma dada proteína ou proteínas marcadoras tumorais é indicada pela presença e/ou pela quantidade de auto-anticorpos associados a cancro específicos para essa proteína marcadora tumoral detectada utilizando o imunoensaio; quando são quantificados os auto-anticorpos, quanto maior for o nível de auto-anticorpos associados a cancro, mais forte é a resposta imunitária. A proteína ou proteínas marcadoras tumorais identificadas como desencadeando a resposta imunitária mais forte ou respostas fortes no paciente (i.e. o nível mais elevado de auto-anticorpos) é ou são então seleccionadas para formar a base de uma vacina anticancerosa para utilizar no paciente. A utilidade do método do presente invento não está limitada à detecção de auto-anticorpos antitumorais, embora o ensaio seja particularmente útil para este fim. O cancro é apenas um exemplo de uma doença em que a detecção de auto-anticorpos pode ser utilizada como marcador biológico para estado de doença/susceptibilidade a doença. Os inventores mostraram que se ganham vantagens substanciais através da utilização de uma abordagem de titulação para detectar auto-anticorpos em amostras de pacientes. É por isso razoável 31 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ concluir que se ganharão vantagens semelhantes através da utilização da abordagem de titulação para detectar auto-anticorpos que sejam marcadores biológicos para outras doenças que não cancro. 0 método é por isso aplicável à detecção de qualquer auto-anticorpo que sirva como marcador biológico para um estado de doença ou susceptibilidade a doença, em qualquer doença que se tenha mostrado (ou se possa mostrar) estar associada à produção de auto-anticorpos.
Outras aplicações do método do presente invento incluem, mas não se limitam a, detecção de auto-anticorpos que sejam marcadores biológicos de doença auto-imune, tal como por exemplo artrite reumatóide, lúpus sistémico eritematoso (LSE) , cirrose biliar primária (CBP), tiroidite auto-imune (p.ex., tiroidite de Hashimoto), gastrite auto-imune (p.ex., anemia perniciosa), adrenalite auto-imune (p.ex., doença de Addison), hipoparatiroidismo auto-imune, diabetes auto-imune (p.ex., diabetes Tipo 1) ou miastenia grave e pesquisa de amostras de pacientes quanto a doença renal ou hepática que conduza a insuficiência ou falha de um dos órgãos, e para pesquisa de amostras de pacientes após transplantação para detectar a presença de anticorpos dirigidos contra o tecido doente (que foi deixado in situ após a transplantação) ou contra o tecido transplantado. 0 invento será mais bem compreendido com referência aos seguintes exemplos experimentais não limitantes:
Exemplo 1 - Protocolo geral para titulação de antiqénio num ensaio de auto-anticorpos
Podem ser preparadas amostras de antigénios marcadores tumorais (biotinilados) através de expressão recombinante, seguindo métodos análogos aos descritos em WO 99/58978.
Resumidamente, ADNc codificando os antigénios marcadores de interesse foram clonados no vector pET21 (Invitrogen) que foi modificado para codificar um marcador de biotina e um marcador de 6x histidina para auxiliarem na purificação da proteína expressa. Os clones resultantes são criados numa célula hospedeira bacteriana adequada (em corpos de inclusão), as bactérias lisadas e desnaturadas e os antigénios expressos 32 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ recuperados através de colunas de afinidade de quelato de Níquel (Hi-trap, comercialmente disponível em Amersham, seguindo o protocolo do fabricante). Os antigénios expressos foram renaturados através de diálise em tampão apropriado e o rendimento da proteína expressa avaliado através de SDS-PAGE, western blot e ELISA e quantificado antes do armazenamento. 0 controlo negativo VOL é o vector vazio (i.e. sem ADNc clonado) que inclui ainda as sequências marcadoras His e biotina.
Os números de entrada do GenBank para vários ADNc marcadores são como se segue: P53: B003596 c-myc: V00568 domínio extracelular ECD6 (HER2): M11730 NY-ESO: NM_00132 7 BRCA2: U43746 BRCA1 delta 9-10: NM_007302 1. Os antigénios e VOL (controlo negativo) foram diluídos nas concentrações apropriadas em tampão carbonato 0,1 M depois diluídos em série para formar um intervalo de titulação semi-logarítmico (ver Tabela 1). As diluições de antigénio foram dispensadas a 50 μΐ/poço nas filas de uma placa de microtitulação Falcon de acordo com o desenho da placa utilizando uma pipeta electrónica multi-canais. As placas foram cobertas e armazenadas a 4°C durante 48 h. 2. As placas foram lavadas uma vez em PBS + Tween 20 a 0,1% utilizando um lavador automático de placas depois batidas para secar sobre papel absorvente. 3. As placas foram bloqueadas com tampão de incubação de elevada salinidade (HSB, PBS + NaCl 0,5 M + caseína a 0,1%) a 200 μΐ/poço durante uma hora ou até ser necessário utilizar (armazenar cobertas a 4°C). 4. As amostras de soro foram descongeladas, sujeitas a vórtice e diluídas 1/100 em HSB à temperatura ambiente. 33 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ 5. As placas foram esvaziadas e batidas para secar sobre papel absorvente. Cada amostra de soro diluída foi dispensada a 50 μΐ/poço para todos os poços da placa de microtitulação utilizando uma pipeta electrónica multi-canais. Os anticorpos de controlo foram diluídos 1/1000 em HSB e dispensados nos poços apropriados da placa final. As placas foram cobertas e incubadas durante 1,5 horas à temperatura ambiente com agitação. 6. Passo de lavagem: As placas foram lavadas três vezes em PBS + Tween 20 a 0,1% utilizando um lavador automático de placas depois batidas para secar sobre papel absorvente. 7. Anticorpo de coelho anti-Ig humana conjugado com peroxidase de rábano (Jackson, 1/10000 em HSB) foi dispensado a 50 μΐ/poço em todos os poços da placa de microtitulação. Anticorpo de coelho anti-Ig de ratinho conjugado com HRP (1/1000 em HSB) foi dispensado para poços de controlo contendo anticorpo anti-antigénio. As placas foram então incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação. 8. As placas foram lavadas tal como no passo 6. 9. Substrato TMP pré-preparado foi adicionado a 50 μΐ/poço e as placas foram incubadas na bancada durante 10 min. As placas foram suavemente batidas para misturar. 10. A densidade óptica dos poços foi determinada a 650 nm utilizando um protocolo de leitor de placas padrão. 34 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ
Tabela 1: Desenho padrão das placas
Placas de P53 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A p53 10 pg/ml c-myc 10 pg/ml NY-ESO 10 pg/ml VOL 10 pg/ml B p53 3 pg/ml c-myc 3 pg/ml NY-ESO 3 pg/ml VOL 3 pg/ml C p53 1 pg/ml c-myc 1 pg/ml NY-ESO 1 pg/ml VOL 1 pg/ml D p53 0,3 pg/ml c-myc 0,3 pg/ml NY-ESO 0,3 pg/ml VOL 0,3 pg/ml E p53 0,1 pg/ml c-myc 0,1 pg/ml NY-ESO 0,1 pg/ml VOL 0,1 pg/ml F p53 0,03 pg/ml c-myc 0,03 pg/ml NY-ESO 0,03 pg/ml VOL 0,03 pg/ml G p53 0,01 pg/ml c-myc 0,01 pg/ml NY-ESO 0,01 pg/ml VOL 0,01 pg/ml H tampão de carbonato tampão de carbonato tampão de carbonato tampão de carbonato
Placas de BRCA 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A BRCA1 10 pg/ml BRCA2 10 pg/ml ECD-6 10 pg/ml VOL 10 pg/ml B BRCA1 3 pg/ml BRCA2 3 pg/ml ECD-6 3 pg/ml VOL 3 pg/ml C BRCA1 1 pg/ml BRCA2 1 pg/ml ECD-6 1 pg/ml VOL 1 pg/ml D BRCA1 0,3 pg/ml BRCA2 0,3 pg/ml ECD-6 0,3 pg/ml VOL 0,3 pg/ml E BRCAl 0,1 pg/ml BRCA2 0,1 pg/ml ECD-6 0,1 pg/ml VOL 0,1 pg/ml F BRCA1 0,03 pg/ml BRCA2 0,03 pg/ml ECD-6 0,03 pg/ml VOL 0,03 pg/ml G BRCAl 0,01 pg/ml BRCA2 0,01 pg/ml ECD-6 0,01 pg/ml VOL 0,01 pg/ml H tampão de carbonato tampão de carbonato tampão de carbonato tampão de carbonato
Exemplo 2 - Detecção de auto-anticorpos em cancro da mama
Os seguintes dados foram obtidos a partir de um estudo piloto para avaliar a sensibilidade e reprodutibilidade de um painel de ensaios de titulação de auto-anticorpos em cancro da mama primário (CMP). 0 estudo incluiu soro de 17 mulheres sem evidência de cancro e amostras de soro pré-operatório de 20 mulheres com cancro da mama primário. As amostras normais e de cancro eram da mesma idade. Uma amostra normal e três de cancro tiveram de ser removidas do estudo porque mostraram evidência de respostas de anticorpo anti-biotina e por essa razão não podiam ser avaliadas utilizando o ensaio no seu actual formato. Pensa-se que aproximadamente 10% da população desenvolva uma resposta contra a biotina. 35 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ Ο ensaio foi efectuado de acordo com o protocolo dado no Exemplo 1 utilizando os antigénios p53, c-myc, NY-ESO-1 e BRCA2. A Figura 1 dá exemplos de curvas obtidas quando o ensaio de titulação do antigénio foi utilizado para medir auto-anticorpos de p53 no soro. Pode observar-se que o soro do paciente de cancro 17766 (C) se liga fortemente ao antigénio de teste (p53) com uma curva sigmóide caracteristica mas que não se liga ao controlo negativo, VOL. Em comparação, o soro de um indivíduo normal, 18052(N) não dá uma curva de titulação para a ligação ao antigénio de teste ou ao controlo negativo.
Os níveis de auto-anticorpos foram expressos como a densidade óptica (650nm) devido à ligação ao antigénio de teste menos a devida à ligação ao controlo negativo (VOL). A linha de limite de exclusão normal foi calculada como o percentil 95 (média + 2 desvios padrão) do grupo normal. Isto é mostrado como a linha ponteada da Figura 2, na qual os níveis de auto-anticorpos anti-p53 em indivíduos normais são comparados com os de pacientes de cancro. Pode observar-se que o grupo de cancro apresenta geralmente níveis de auto-anticorpos mais elevados e pode também ter uma maior proporção de indivíduos com níveis acima da linha de limite de exclusão. O painel consistiu em quatro antigénios; p53, c-myc, NY-ESO-1 e BRCA2. A sensibilidade dos ensaios individuais é dada na Tabela 2 juntamente com a sensibilidade combinada do painel de quatro antigénios na detecção de cancro da mama primário (63%) .
Tabela 2: Sensibilidade do ensaio de auto-anticorpos por titulação do antigénio. Auto-anticorpos contra quatro antigénios diferentes foram medidos e foi calculada a sensibilidade combinada do painel. Os níveis da linha de limite de exclusão foram calculados como a média + 2 desvios padrão do conjunto de amostras normais. Os indivíduos com respostas de anticorpos anti-biotina foram excluídos por não ser possível avaliá-los. p53 c-myc NY-ESO-1 BRCA2 Painel 6/17 (35%) 5/17 (29%) 4/17 (24%) 4/17 (24%) 63% 36 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ
Para avaliar se as medições obtidas utilizando o ensaio de auto-anticorpos de titulação eram ou não reprodutíveis, foram efectuados ensaios em três dias separados e os resultados são mostrados na Tabela 3. Um ensaio foi considerado ser reprodutível se todos os três resultados fossem concordantes. A reprodutibilidade das medições feitas em soro normal foi de 94% (15/16) e 88% (14/16) em amostras de cancro da mama. 37 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ
Tabela 3: Reprodutibilidade do ensaio de titulação do antigénio para auto-anticorpos de p53. Os ensaios foram efectuados em três dias separados (Corridas A, B e C) em amostras de soro de pacientes com cancro da mama primário (CMP) ou controlos normais. Os níveis da linha de limite de exclusão foram calculados numa base diária como a média + 2 desvios padrão do conjunto de amostras normais. AB denota indivíduos que apresentaram evidência de uma resposta de anticorpos anti-biotina e que não podem ser avaliados através do presente formato do ensaio. Um ensaio foi considerado ser reprodutível se todos os três resultados fossem concordantes. A reprodutibilidade dos indivíduos normais foi de 94% (15/16) e das pacientes de CMP de 88% (14/16).
Operação Operação
Normais A B C CMP A B C 18017 - + + 17733 + - - 18018 - - - 17734 AB + - - 18019 - - - 17735 - - - 18020 - - - 17742 + + + 18021 - - - 17743 + + + 18047 - - - 17744 + + + 18048 AB + - + 17755 - + - 18049 - - - 17756 - - - 18050 ND - - 17757 - - - 18051 - - - 17758 ND - - 18052 - - - 17759 + + + 18053 - - - 17766 + + + 18054 - - - 17774 - - - 18055 - - - 17775 AB + + - 18056 - - - 17776 - - - 18057 - - - 17777 - - ND 18058 - - - 17796 - - - 17797 AB + - - 17832 + + + 17450 — — —
Exemplo 3 - Detecção de auto-anticorpos em cancro do pulmão A análise das respostas de auto-anticorpos contra 2 antigénios (p53 e NY-ESO) num estudo piloto de cancro do 38 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ pulmão (10 plasmas normais e 9 com cancro do pulmão) revelou uma taxa de detecção de 78% (Figura 3). O ensaio foi efectuado de acordo com o protocolo geral do exemplo 1, excepto que foram utilizadas amostras de plasma em vez de soro.
As amostras de pacientes positivas exibiram curvas de titulação sigmóides semelhantes às mostradas na Figura 1. A Figura 3 mostra uma comparação dos níveis de auto-anticorpos de p53 e NY-ESO em indivíduos normais e pacientes com cancro do pulmão medidos utilizando o ensaio de titulação do antigénio. As linhas de limite de exclusão normais foram calculadas como a média mais 2 desvios padrão da população normal.
Exemplo 4 - Curvas adicionais de titulação
As seguintes curvas adicionais de titulação foram todas geradas em ensaios com base na metodologia geral descrita no Exemplo 1. Os resultados indicam que a abordagem da curva de titulação pode ser aplicada à detecção de uma variedade de diferentes antigénios, em diferentes tipos de fluidos corporais e em diferentes doenças (exemplificadas por diferentes tipos de cancro) e ilustram também a vantagem do método do presente invento na distinção entre resultados positivos "verdadeiros" e "falsos". A Figura 4 mostra uma curva de titulação para detecção de auto-anticorpos contra p53 e NY-ESO numa amostra de fluido de ascites tomada de uma paciente com cancro da mama. Esta paciente foi testada mas verificou-se que não produzia auto-anticorpos contra c-myc. A Figura 5 mostra uma curva de titulação para detecção de auto-anticorpos contra BRCA1, BRCA2 e HER2 numa amostra de soro de uma paciente com cancro da mama (carcinoma ductal in situ) . A Figura 6 mostra uma curva de titulação para detecção de auto-anticorpos contra NY-ESO numa amostra de soro de um paciente com cancro do pulmão. Este paciente foi testado mas 39 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ verificou-se que não produzia auto-anticorpos contra p53 ou c-myc. A Figura 7 mostra uma curva de titulação para detecção de auto-anticorpos contra NY-ESO e p53 numa amostra de soro de um paciente com cancro do pulmão. Este paciente foi testado mas verificou-se que não produzia auto-anticorpos contra c-myc.
As Figuras 8 (a) e 8 (b) ilustram os resultados em dois ensaios de titulação independentes para auto-anticorpos contra p53, c-myc e NY-ESO-1 em amostras de soro de um indivíduo "normal" (i.e. um indivíduo sem evidência de cancro). No ensaio mostrado na Figura 8 (a) observa-se uma linha plana com quantidades crescentes de antigénio, indicando que a amostra de soro não contém auto-anticorpos para nenhum dos antigénios testados. Quando uma segunda alíquota da mesma amostra de soro do paciente foi testada novamente utilizando a mesma metodologia de ensaio o ensaio não conseguiu produzir os resultados anómalos mostrados na Figura 8 (b) . A ausência da curva de titulação caracteristica com quantidades crescentes de antigénio indica que isto é um resultado anómalo, em vez de um positivo verdadeiro. Se esta amostra tivesse sido testada num ensaio de um único ponto utilizando uma única quantidade fixa de antigénio então podia ter aparecido como um resultado "falso-positivo". Assim, estes resultados ilustram a vantagem da abordagem da curva de titulação na distinção: entre resultados verdadeiros e falsos-positivos.
As Figuras 9 (a) e 9 (b) mostram os resultados de dois ensaios de titulação independentes efectuados em amostras de soro de uma única paciente com cancro da mama invasivo utilizando um intervalo de diferentes antigénios. Esta paciente particular mostra auto-anticorpos para NY-ESO-1, HER2 e BRCA2. Para cada antigénio positivo um resultado positivo do ensaio é indicado por aumento da força do sinal à medida que a concentração do antigénio aumenta, i.e. um sinal de titulação.
As Figuras 10(a) e 10(b) ilustram a utilidade do presente invento na distinção entre respostas anti-biotina e "verdadeiros" auto-anticorpos para um antigénio especifico (i.e. um marcador tumoral). Nestes ensaios amostras de soro de um indivíduo humano clinicamente normal foram testadas quanto 40 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ à presença de auto-anticorpos utilizando antigénios biotinilados BRCA2, HER2, c-myc e NY-ESO-1, BRCA1 não biotinilado e produtos de expressão de controlo do vector "vazio" VOL, que codifica o marcador de biotina mas nenhum antigénio adicional. O indivíduo testado exibe uma resposta de titulação a ambos os antigénios biotinilados e ao vector vazio VOL, que é efectivamente apenas biotina, mas nenhuma resposta ao antigénio BRCA1 não biotinilado, indicando que os resultados "positivos" com os marcadores biotinilados são de facto devido à presença de anticorpos anti-biotina neste indivíduo.
Exemplo 5 - Análise da sensibilidade e especificidade dos ensaios de titulação de antigénio em comparação com medição de um único ponto
As medições de auto-anticorpos (AAb) foram efectuadas em 100 mulheres com cancro da mama primário (CMP) e 80 mulheres sem evidência de doença maligna utilizando o método de titulação e através de medição numa única concentração de antigénio (10 yg/ml). As tabelas mostrando uma comparação directa dos dois métodos são mostradas abaixo:
Tabela 4. Comparação da sensibilidade do ensaio de AAb por titulação com uma medição numa única concentração de antigénio em CMP.
Antigénio p53 c-myc NY-ESO-1 BRCA2 HER2 MUC1
Painel (de 6 Ag)
Ponto Unico En 17,5% 6,2% 24, 7% 20,6% 23, 7% 18,5% 54, 6% aio de Titulação 18,9% 22,9% 25, 0% 31,3% 25, 0% 19, 8% 62,2% 41 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ
Tabela 5. Comparação da especificidade do ensaio de AAb por titulação com uma medição numa única concentração de antigénio em mulheres normais.
Ponto Único 93,8% 93,8% 90,0% 90,0% 91,3% 92,5% 71,3%
Antigénio p53 c-myc NY-ESO-1 BRCA2 HER2 MUC1 Painel (de 6 Ag)
Ensaio de Titulação 97, 3% 94, 6% 93,3% 94, 6% 95, 9% 95, 9% 78,4%
Pode observar-se que através da utilização de vários pontos na curva de titulação do antigénio, se obteve uma maior sensibilidade e especificidade em comparação com uma medição num único ponto.
Exemplo 6 - Potenciais razões para maior sensibilidade e especificidade com ensaio por titulação do antigénio
Sem estar preso à teoria, o requerente considera que existem várias razões para a maior especificidade e sensibilidade observadas num ensaio em que o antigénio é titulado. i) A Figura 11 mostra os resultados da análise de AAb do soro de uma paciente com cancro da mama primário (CMP) utilizando os antigénios p53, c-myc e NY-ESO-1 a concentração variável. Estes resultados demonstram que nalguns casos a curva de titulação se inclina a elevados níveis de antigénio (curva de NY-ESO-1). Isto é um fenómeno vulgarmente observado em imuno-histoquímica. Se for utilizada uma medição de um único ponto a 10 pg/ml, esta paciente terá sido classificada como negativa em relação a auto-anticorpos de NY-ESO-1 quando de facto há claramente uma resposta positiva. ii) A Figura 12 mostra a análise do soro de um indivíduo normal, utilizando também antigénio p53, c-myc e NY-ESO-1 42 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ titulados. Esta figura demonstra um efeito que os requerentes observaram em aproximadamente 10% dos ensaios nos quais o limiar da medição de antigénio (neste caso p53) é mudado para um nivel acima do do controlo negativo (VOL) . Isto produz uma leitura falsamente elevada. Este tipo de resultado é facilmente identificável com o ensaio de titulação, mas seria invisível num conjunto de ensaios de pontos únicos. Isto resultaria em menor especificidade devido a estes falsos-positivos (ver Tabela 5). iii) Tal como discutido no Exemplo 4, os antigénios que são utilizados no Ensaio de AAb por Titulação têm um marcador de biotina que pode ser utilizado na purificação da proteina. No entanto, sabe-se que aproximadamente 10% da população produz uma resposta de anticorpos à biotina, que é uma vitamina. A Figura 13 demonstra uma resposta anti-biotina numa paciente com CMP. Esta resposta pode ser claramente identificada utilizando a curva de titulação como uma forte resposta de anticorpos contra o controlo negativo, VOL (que é também biotinilado). Estes indivíduos têm de ser considerados como não avaliáveis com o ensaio neste formato. No entanto, se for utilizado um ensaio de um único ponto, aqueles que respondiam a anti-biotina não podiam ser distinguidos das respostas verdadeiras.
Exemplo 7 - Demonstração de maior sensibilidade da titulação de antigénio em comparação com a titulação de soro
As medições de AAb foram efectuadas de dois modos em duas experiências bastante separadas. A primeira foi efectuada utilizando o formato padrão no qual a placa foi revestida com antigénio numa titulação semi-logaritmica de 10 pg/ml até 0,01 pg/ml. Após bloqueio, o soro foi adicionado a uma diluição de 1 em 100. Na segunda, as placas foram revestidas com antigénio a uma concentração de 3 pg/ml e após bloqueio, foi adicionado soro num intervalo de titulação semi-logaritmico de uma diluição de 1 em 10 até 1 em 10000. Os métodos para o restante dos ensaios foram idênticos. Dois bancos de soro que se sabe serem positivos para p53 e c-myc foram ensaiados juntamente com 8 soros de mulheres com CMP e 43 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ 10 soros de indivíduos normais. Os resultados são mostrados na Tabela 6 abaixo.
Tabela 6. Sensibilidade de ensaios de AAb envolvendo a titulação de antigénio em comparação com os que envolvem a titulação de soro. CMP Antigénio p53 Soro p53 Antigénio c-myc Soro c-myc Antigénio BRCA2 Soro BRCA2 p53 +vo + + +++ + + + + - - c-myc +vo - - + + - - 17179 + + + +++ + + + + + + + + + 19451 + ++ - - - - 18237 + + ++ + + + + - 18489 - - - - + - 19510 - - - - - - 19190 + - - - + ++ 18610 + - + + - - 18458 + - + - - - positividade 70% 40% 60% 50% 40% 20%
Pode observar-se que o formato de ensaio envolvendo titulação de antigénio é mais sensível que o formato envolvendo titulação de soro. As amostras que foram fortemente positivas foram detectadas por ambos os formatos, no entanto os positivos fracos no ensaio de titulação do antigénio não foram geralmente detectados no ensaio de titulação do soro. A menor sensibilidade demonstrada pelo formato de titulação do soro é devida à inerente ligação não específica do soro a elevada concentração. Isto causa um nível de ligação às proteínas mesmo em amostras normais (ver Figura 14) , que eleva o valor normal da linha de limite de exclusão com subsequente redução na sensibilidade. A especificidade foi também reduzida no formato de titulação do soro (BRCA2 = 90%) em comparação com o formato de titulação do antigénio (BRCA2 = 100%). 44 ΕΡ 2 275 815/ΡΤ A Figura 15 reflecte as experiências mostradas na Figura 4 mas com soro de uma paciente com cancro da mama primário. Verificou-se que a paciente era positiva para auto-anticorpos contra p53 e c-myc mas negativa para auto-anticorpos contra BRCA2 quando era utilizado o método de titulação do antigénio do presente invento. No entanto, quando os auto-anticorpos eram medidos dentro de um intervalo de titulação de soro não eram detectados auto-anticorpos (ver Tabela 6). Isto é devido à ligação não especifica exibida pelo soro a elevadas concentrações (demonstrada pelo elevado nível de ligação à proteína de controlo negativo (VOL)) que mascara sinais devidos à ligação específica do auto-anticorpo. A consequência é que com a diluição do soro o ensaio pode designar uma paciente com cancro da mama primário, negativo. Uma vez que sensibilidade = Positivos verdadeiros/Positivos verdadeiros + falsos-negativos isto tem o efeito de aumentar o denominador e por essa razão diminuir a sensibilidade.
Em resumo, os requerentes mostraram que os ensaios de Auto-anticorpos por Titulação de Antigénios são mais sensíveis e específicos do que a medição da reactividade do auto-anticorpo a uma única concentração do antigénio. Isto é devido à titulação do antigénio proporcionar o âmbito para detectar tanto anticorpos de baixa abundância e baixa afinidade a elevadas concentrações de antigénio bem como anticorpos com elevada abundância que de outro modo se engatam a elevada concentração de antigénio mas se ligam ao máximo mais abaixo na curva de titulação. Permite também a discriminação de ensaios não avaliáveis de resultados verdadeiros, o que não é possível com uma medição num único ponto. Crê-se que os ensaios de AAb por titulação de antigénios sejam mais sensíveis que a mera titulação de soro porque o elevado nivel de ligação não específica observado com o soro a elevada concentração aumenta os níveis das linhas de limite de exclusão normais diminuindo deste modo a sensibilidade.
Lisboa, 2014-06-24
Claims (24)
- ΕΡ 2 275 815/ΡΤ 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Método in vitro de determinação do perfil de um anticorpo numa amostra de teste compreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero em que o referido anticorpo é um auto-anticorpo que é um marcador biolóqico de um estado de doença ou de susceptibilidade a doença, compreendendo o método: a) o contacto da amostra de teste com uma variedade de diferentes quantidades de um antigénio específico para o referido anticorpo, b) a detecção da quantidade de ligação específica entre o referido anticorpo e o referido antigénio, e c) o traçado ou cálculo de uma curva da quantidade da referida ligação específica versus a quantidade de antigénio para cada quantidade de antigénio utilizada no passo (a), para construir um perfil de produção de anticorpos no referido indivíduo, antes do início da doença ou durante o decorrer da doença, em que o método é repetido para construir um perfil de produção de anticorpos.
- 2. Método da reivindicação 1 em que o anticorpo é um auto-anticorpo especifico para uma proteína marcadora tumoral.
- 3. Método da reivindicação 2 em que o antigénio é uma proteína marcadora tumoral ou um seu fragmento antigénico ou epítopo.
- 4. Método da reivindicação 3 em que a proteína marcadora tumoral é MUC1, MUC16, c-myc, EGRF, p53, ras, BRCA1, BRCA2, APC, HER2, PSA, CEA, CA19.9, NY-ESO-1, 4-5, CAGE, PSMA, PSCA, EpCam, uma citoqueratina, recoverina, uma calicreína, uma anexina, AFP, GRP78, CA125, mamoglobina ou raf.
- 5. Utilização do método de qualquer uma das reivindicações 2 a 4 no diagnóstico, prognóstico ou monitorização de cancro.
- 6. Utilização do método de qualquer uma das reivindicações 2 a 4 para pesquisa de uma população de ΕΡ 2 275 815/ΡΤ 2/6 indivíduos humanos assintomáticos para identificar os indivíduos que estejam em maior risco de desenvolver cancro, em que as amostras a testar utilizando o método são amostras de fluido corporal tomadas dos indivíduos, e em que os indivíduos possuindo um nível elevado de auto-anticorpos, em comparação com um controlo normal que representa o nível de auto-anticorpos presentes em indivíduos de controlo ou um nível limiar para esse indivíduo, são identificados como estando em risco de desenvolver cancro.
- 7. Utilização do método de qualquer uma das reivindicações 2 a 4 para detecção de uma alteração neoplásica precoce ou carcinogénica precoce num indivíduo humano assintomático, em que a amostra a testar utilizando o método é uma amostra de fluido corporal tomada do indivíduo, e em que a presença de um nível elevado de auto-anticorpos, em comparação com um controlo normal que representa o nível de auto-anticorpos presentes em indivíduos de controlo ou um nível limiar para esse indivíduo, é tomada como uma indicação de alteração neoplásica precoce ou carcinogénica precoce no indivíduo.
- 8. Utilização do método de qualquer uma das reivindicações 2 a 4 para pesquisa de uma população de indivíduos humanos assintomáticos para identificar os indivíduos que tenham desenvolvido um cancro, em que as amostras a testar utilizando o método são amostras de fluido corporal tomadas dos indivíduos, e em que os indivíduos possuindo um nível elevado de auto-anticorpos, em comparação com um controlo normal que representa o nível de auto-anticorpos presentes em indivíduos de controlo ou um nível limiar para esse indivíduo, são diagnosticados como possuindo um cancro.
- 9. Utilização do método de qualquer uma das reivindicações 2 a 4 para teste de uma população de indivíduos humanos sintomáticos para identificar os indivíduos que tenham desenvolvido um cancro, em que as amostras a testar utilizando o método são amostras de fluido corporal tomadas dos indivíduos e em que os indivíduos possuindo um nível elevado de auto-anticorpos, em comparação com um controlo normal que representa o nível de auto-anticorpos presentes em indivíduos ΕΡ 2 275 815/ΡΤ 3/6 de controlo ou um nível limiar para esse indivíduo, são diagnosticados como possuindo um cancro.
- 10. Utilização do método de qualquer uma das reivindicações 2 a 4 para monitorização da progressão de cancro ou de outra doença neoplásica num paciente, em que a amostra a testar utilizando o método é uma amostra de fluido corporal tomada de um paciente humano, e em que o nível de auto-anticorpos presentes no referido paciente é comparado com um controlo normal que representa o nível de auto-anticorpos presentes em indivíduos de controlo ou um nível limiar estabelecido para esse paciente.
- 11. Utilização do método de qualquer uma das reivindicações 2 a 4 para avaliação do prognóstico de um paciente diagnosticado com cancro.
- 12. Utilização do método de qualquer uma das reivindicações 2 a 4 para previsão da resposta de um paciente de cancro a tratamento anticanceroso, tal como terapia anti-factor de crescimento ou transdução de sinal, radioterapia, terapia endócrina, terapia de anticorpos humanos, ou quimioterapia ou vacinação.
- 13. Utilização do método de qualquer uma das reivindicações 2 a 4 para monitorização da resposta de um paciente de cancro a tratamento anticanceroso, tal como terapia anti-factor de crescimento ou transdução de sinal, radioterapia, terapia endócrina, terapia de anticorpos humanos, quimioterapia ou vacinação.
- 14. Utilização do método de qualquer uma das reivindicações 2 a 4 para selecção de uma vacina anticancerosa para utilização num paciente de cancro.
- 15. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o anticorpo é um auto-anticorpo característico de, ou associado a, uma doença auto-imune.
- 16. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o auto-anticorpo é um auto-anticorpo caracteristico de, ou ΕΡ 2 275 815/ΡΤ 4/6 associado a, doença renal ou hepática que conduz a insuficiência ou falha de um destes órgãos.
- 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 em que o antigénio é uma proteína ou um polipéptido de ocorrência natural, uma proteína ou um polinucleótido recombinantes, uma proteína ou um polipéptido sintéticos, um péptido sintético, um imitador peptídico, um polissacárido ou um ácido nucleico.
- 18. Método in vitro de obtenção do perfil de dois ou mais anticorpos numa amostra de teste compreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero em que pelo menos um dos referidos anticorpos é um auto-anticorpo que é um marcador biológico de um estado de doença ou susceptibilidade a doença, compreendendo o método: (a) o contacto da amostra de teste com dois ou mais conjuntos de antigénios, em que cada um dos referidos conjuntos de antigénios é específico para um dos referidos anticorpos a detectar na amostra de teste e em que cada conjunto de antigénios compreende uma pluralidade de diferentes quantidades do referido antigénio, (b) a detecção da quantidade de ligação específica entre os referidos anticorpos e os referidos antigénios, e (c) o traçado ou cálculo de uma curva da quantidade da referida ligação específica versus a quantidade de antigénio para cada conjunto de antigénios utilizado no passo (a), para construir um perfil de produção de anticorpos num paciente, antes do início da doença ou durante o decorrer da doença.
- 19. Método da reivindicação 18 em que o perfil de cada anticorpo é determinado com base nos valores colectivos da quantidade de ligação específica para todas as concentrações de antigénio testadas para esse anticorpo.
- 20. Método de acordo com a reivindicação 18 ou 19 em que pelo menos um, ou cada um, dos referidos anticorpos é um auto-anticorpo específico para uma proteína marcadora tumoral. ΕΡ 2 275 815/ΡΤ 5/6
- 21. Método de acordo com a reivindicação 20 em que cada antigénio é uma proteína marcadora tumoral ou um seu fragmento antigénico ou epítopo.
- 22. Método de acordo com a reivindicação 21 em que cada uma das referidas proteínas marcadoras tumorais é seleccionada do grupo que consiste em MUC1, MUC16, c-myc, EGRF, p53, ras, BRCAl, BRCA2, APC, HER2, PSA, CEA, CA19.9, NY-ESO-1, 4-5, CAGE, PSMA, PSCA, EpCam, uma citoqueratina, recoverina, uma calicreína, uma anexina, AFP, GRP78, CA125, mamoglobina e raf.
- 23. Utilização do método de qualquer uma das reivindicações 20 a 22 no diagnóstico, prognóstico ou monitorização de cancro.
- 24. Utilização do método de qualquer uma das reivindicações 20 a 22 para: (a) pesquisa de uma população de indivíduos humanos assintomáticos para identificar os indivíduos que estão em maior risco de desenvolver cancro, em que as amostras a testar utilizando o método são amostras de fluido corporal tomadas dos indivíduos, e em que os indivíduos possuindo um nível elevado de auto-anticorpos, em comparação com um controlo normal que representa o nível de auto-anticorpos presentes nos indivíduos de controlo ou um nível limiar para esse indivíduo, são identificados como estando em risco de desenvolver cancro; ou (b) detecção de uma alteração neoplásica precoce ou carcinogénica precoce num indivíduo humano assintomático, em que a amostra a testar utilizando o método é uma amostra de fluido corporal tomada do indivíduo, e em que a presença de um nível elevado de auto-anticorpos, em comparação com um controlo normal que representa o nível de auto-anticorpos presentes em indivíduos de controlo ou um nível limiar para esse indivíduo, é tomada como uma indicação de alteração neoplásica precoce ou carcinogénica precoce no indivíduo; ou (c) pesquisa de uma de indivíduos humanos assintomáticos para identificar os indivíduos que tenham desenvolvido um cancro, em que as amostras a testar utilizando o método são amostras de fluido corporal tomadas dos indivíduos, e ΕΡ 2 275 815/ΡΤ 6/6 em que os indivíduos possuindo um nivel elevado de auto-anticorpos, em comparação com um controlo normal que representa o nível de auto-anticorpos presentes em indivíduos de controlo ou um nível limiar para esse indivíduo, são diagnosticados como possuindo um cancro; ou (d) teste de uma população de indivíduos humanos sintomáticos para identificar os indivíduos que tenham desenvolvido um cancro, em que as amostras a testar utilizando o método são amostras de fluido corporal tomadas dos indivíduos, e em que os indivíduos possuindo um nível elevado de auto-anticorpos, em comparação com um controlo normal que representa o nível de auto-anticorpos presentes em indivíduos de controlo ou um nível limiar para esse indivíduo, são diagnosticados como possuindo um cancro; ou (e) monitorização da progressão de cancro ou outra doença neoplásica num paciente, em que a amostra a testar utilizando o método é uma amostra de fluido corporal tomada de um paciente humano, e em que o perfil de auto-anticorpos presentes no referido paciente é comparado com um controlo normal que representa o nível de auto-anticorpos presentes em indivíduos de controlo ou um nível limiar estabelecido para esse paciente; ou (f) avaliação do prognóstico de um paciente diagnosticado com cancro; ou (g) previsão da resposta de um paciente de cancro a tratamento anticanceroso, tal como terapia anti-factor de crescimento ou transdução de sinal, radioterapia, terapia endócrina, terapia de anticorpos humanos, quimioterapia ou vacinação; ou (h) monitorização da resposta de um paciente de cancro a tratamento anticanceroso, tal como terapia anti-factor de crescimento ou transdução de sinal, radioterapia, terapia endócrina, terapia de anticorpos humanos, quimioterapia ou vacinação; ou (i) selecção de uma vacina anticancerosa para utilização num paciente de cancro. Lisboa, 2014-06-24
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