KR20080034851A - 향상된 면역분석 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은
(a) 항체에 특이적인 다수의 상이한 양의 항원을 검체 시료에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 항체 및 상기 항원 사이의 특이적 결합의 양을 검출하는 단계;
(c) 단계 (a)에서 사용된 항원의 각각의 양에 대하여, 항원의 양에 대한 상기 특이적 결합의 양의 곡선을 그리거나 또는 연산하는 단계; 및,
(d) 사용된 각각 상이한 항원 농도에서 상기 항체 및 상기 항원 사이의 특이적 결합의 양에 근거하여 상기 질병 또는 질병 감수성의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 항체는 질병 상태 또는 질병 감수성의 생물학적 표지인 것을 특징으로 하는 상기 포유동물 개체의 체액을 포함하는 검체 시료에서 항체의 검출을 포함하는 포유동물 개체에서 질병 상태 또는 질병 감수성 검출 방법에 관련한다.
Description
본 발명은 일반적으로 진단 또는 예후 분석 분야에 관련되고, 특히 환자의 체액을 포함하는 시료에서의 항체 검출을 위한 분석의 최적화에 관련되며, 상기 항체는 질병 상태 또는 질병 감수성의 생물학적 표지로써 사용된다.
많은 진단, 전조 및/또는 감시 분석은 특정 질병 상태 또는 질병 감수성의 생물학적 표지의 검출에 의존한다. 이런 생물학적 표지는 일반적으로 특정 질병의 특징을 나타내거나 또는 질병 감수성과 연관되는 단백질 또는 폴리펩티드이다.
최근 항체 및 특히 자가항체가 질병 또는 질병 감수성의 생물학적 표지로써의 역할도 수행할 수 있는 것이 명백하게 되었다. 자가항체란 비록 항원이 실제로 개체로부터 생겼더라도 개체의 면역 시스템이 외부의 것으로 인식하는 항원에 집중되는 자연발생 항체이다. 그것들은 그들의 표적 표지 단백질에 결합하는 자가항체로 구성되는 순환 면역 복합체의 형태 또는 순환이 없는 자가항체로써 순환 과정에 존재할 것이다. 정상 세포에서 발현된 야생형 단백질과 질병에 걸린 세포에 의해 또는 질병 과정 진행 동안 생산된 변형된 형태의 단백질 간의 차이점은 어떤 경우에는 개체의 면역 시스템에 의해 비-자가로써 인식되어서 상기 개체의 면역 반응을 유도하는 변형된 단백질을 유도할 것이다. 상기는 변형된 단백질에 면역학적으로 특이적인 자가항체의 생산을 유도하는 체액성(즉, B 세포-연관된) 면역 반응일 것이다. 국제공개 특허 WO 99/58978 호는 두 개 또는 그 이상의 별개의 종양 표지에 대해 개체의 면역 반응 평가에 근거한 종양의 검출/진단에 이용하는 방법을 기술한다. 상기 방법은 각각 분리된 종양 표지 단백질로부터 유래된 두 개 또는 그 이상의 별개의 종양 표지 항원을 개체로부터 수득한 체액 시료에 접촉시키는 단계 및 종양 표지 단백질에 면역학적으로 특이적인 순환 자가항체에 결합하는 종양 표지 항원의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 순환 자가항체의 존재는 종양 존재의 징후로써 여겨진다.
자가항체 생산에 의한 종양 표지 단백질의 존재에 대한 개체의 면역 반응을 측정하는 분석은 체액에 종양 표지 단백질의 검출 또는 직접적인 검출에 대한 대안을 제공한다. 상기 분석은 본질적으로 종양 표지 단백질의 존재의 간접적인 검출을 구성한다. 면역 반응의 특성상, 자가항체가 매우 작은 양의 순환 종양 표지 단백질에 의해 유도될 수 있고, 따라서 종양 표지에 대한 면역 반응의 검출에 의한 간접적인 방법이 체액에서의 종양 표지의 직접적인 검출 방법보다 더욱 민감할 것이다. 따라서 자가항체의 검출에 근거한 분석 방법은 초기 질병 과정에서 특별한 척도가 될 것이고, 아마도 또한 무증상 개체의 개체군 중에서 질병이 발병된 개체를 확인하기 위한, 예를 들면 무증상 개체의 개체군 중에서 질병이 발병하고 있는 위험한 상태의 개체를 확인하기 위한 선발에서 무증상 환자의 선발에 관련될 것이다. 게다가 자가항체의 검출에 근거한 방법은 초기 질병 과정의 특별한 척도가 될 것이고, 아마도 또한 증상이 있는 개체의 개체군 중에서 질병이 발병된 개체를 확 인하기 위해 사용될 것이다. 더불어, 그것들은 재발한 질병의 초기 검출에 유용할 것이다. 분석 방법은 또한 질병의 치료법의 선택 또는 감시에도 유용할 것이다.
항체와 자가항체는 또한, 류마티스 관절염, 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematous, SLE), 원발성 담즙성 간경변증(primary biliary cirrhosis, PBC), 자가면역 갑상선염[autoimmune thyroiditis; 예를 들면 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis)], 자가면역 위염[autoimmune gastritis; 예를 들면 악성 빈혈(pernicious anaemia)], 자가면역 부신염[autoimmune adrenalitis; 예를 들면 애디슨병(Addison's disease)], 자가면역 부갑상선기능저하증(autoimmune hypoparathyroidism), 자가면역 당뇨병[autoimmune diabetes; 예를 들면 유형 1 당뇨병(Type 1 diabetes)], 중증근무력증(myasthenia gravis) 등의 다른 질병 상태 또는 질병 감수성의 생물학적 표지의 역할을 수행할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 항체 검출에 기반을 둔 분석이 개체군 내의 개체의 질병 상태, 질병 진행 또는 질병 감수성을 평가하기 위하여 진단 또는 예후에 사용되었을 때, 항체의 절대량이 개체간에 극적으로 다양하게 존재하기 때문에 선발될 실험 대상의 모든 개체군에 대한 표준화된 검사 방법론을 고안하는 것에 있어서 문제가 발생할 수 있다는 것을 인식하였다. 상기는 예를 들면 항체 량이 낮은 개체들 중에서 음성오류(false negative) 결과의 높은 발생률을 생성할 수 있다. 유사하게 개체간의 항체의 절대량의 다양성은 선발된 개체군의 모든 개체에게 적당한 양성 검사 결과를 위한 역치 값 설정의 어려움을 의미하기 때문에 진양성(true positive) 결과의 기록에 어려움이 있다.
이에 본 발명자들은 성능 및 더욱 특이적으로 임상학적 유용성 및 질병의 생물학적 표지로써의 항체, 특히 자가항체의 검출에 근거한 검사의 신뢰도가 항원 적정 단계 포함에 의해 극적으로 증가할 수 있는 것을 결정하였다. 일련의 상이한 양의 항원에 대한 항체를 포함할 것으로 예상되는 시료의 검사 및 적정 곡선을 그림으로써 시료에 존재하는 항체의 절대량과 상관없이 신뢰할 수 있는 진양성 선발 결과를 확인하는 것이 가능하다. 이러한 시도는 단지 실제 환자 시료에서 항체의 검출에 사용될 가장 최적의 항원 농도를 확인할 수 있는 보정 곡선을 그리기 위해 항원을 적정하는 이전의 방법에 반대된다. 상기 방법에서는 실제 진단에 있어서 오직 단일 지점 측정만이 제안되었다. 그러므로 상기 방법은 논의된 바와 같이 가양성 및 음성오류의 발생을 초래할 개체간의 검출될 항체 량의 다양성을 검출하지 못할 것이다. 본 발명자들은 명세서에서 논의된 본 발명의 항원 적정 방법이 단일 항원 농도에서의 자가항체 반응도의 측정 또는 항원이 아닌 혈청 시료가 적정된 방법 보다 더 좋은 특이성 및 감수성을 나타내는 것을 발견하였다.
본 발명의 요약
본 발명의 첫 번째 측면에 따라,
(a) 항체에 특이적인 다수의 상이한 양의 항원을 검체 시료에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 항체 및 상기 항원 사이의 특이적 결합의 양을 검출하는 단계;
(c) 단계 (a)에서 사용된 항원의 각각의 양에 대하여, 항원의 양에 대한 상기 특이적 결합의 양의 곡선을 그리거나 또는 연산하는 단계; 및,
(d) 사용된 각각 상이한 항원 농도에서 상기 항체 및 상기 항원 사이의 특이적 결합의 양에 근거하여 상기 질병 또는 질병 감수성의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 항체는 질병 상태 또는 질병 감수성의 생물학적 표지인 것을 특징으로 하는 상기 포유동물 개체의 체액을 포함하는 검체 시료에서 항체의 검출을 포함하는 포유동물 개체에서 질병 상태 또는 질병 감수성 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 두 번째 측면에 따라,
(a) 항체에 특이적인 다수의 상이한 양의 항원을 검체 시료에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 항체 및 상기 항원 사이의 특이적 결합의 양을 검출하는 단계;
(c) 단계 (a)에서 사용된 항원의 각각의 양에 대하여, 항원의 양에 대한 상기 특이적 결합의 양의 곡선을 그리거나 또는 연산하는 단계를 포함하고, 상기 항체는 포유동물 개체에 주입된 외부 기질에 집중되는 것을 특징으로 하는 포유동물 개체의 체액을 포함하는 검체 시료의 항체 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 세 번째 측면에 따라,
(a) 항체에 특이적인 다수의 상이한 양의 항원을 검체 시료에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 항체 및 상기 항원 사이의 특이적 결합의 양을 검출하는 단계;
(c) 단계 (a)에서 사용된 항원의 각각의 양에 대하여, 항원의 양에 대한 상기 특이적 결합의 양의 곡선을 그리거나 또는 연산하는 단계를 포함하고, 상기 항체는 질병 상태 또는 질병 감수성의 생물학적 표지인 것을 특징으로 하는 포유동물 개체의 체액을 포함하는 검체 시료의 항체 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 모든 측면에서, 포유동물 개체는 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 모든 측면에서, 방법은 바람직하게는 포유동물 개체으로부터 수득하거나 또는 준비한 체액을 포함하는 검체 시료에서 in vitro 수행된다.
본 발명의 모든 측면에서 본 발명의 상세한 특징은 관련된 항체가 검체 시료에 존재하는 지 여부에 대한 판단은 검사된 각각의 상이한 항원 농도에서 관찰된 특이적 결합 량, 바꾸어 말하면 단일 농도에서 측정된 것이 아닌 집합적인 수치에 근거한다. 그러므로 질병 상태 또는 질병 감수성 또는 환자 시료에서 외부 기질에 대한 항체의 존재 여부의 결정은 집합적인 수치에 직접적으로 근거하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 특이적 결합의 양이 항원의 양에 대하여 그렸을 때, 판단은 일반적으로 S-자형 또는 시그모이달 곡선의 형태를 기초로 한다. 본 명세서의 실시예에서 명백해질 것처럼, 본 발명자들은 본 발명의 항원 적정 방법이 단일 측정에 근거한 진단 또는 검출 방법보다 높은 특이성 및 감수성을 가지고, 가양성 및 음성오류 결정의 발생을 감소시키는 것을 관찰하였다.
도면의 간단한 설명
도 1: 항원 적정 곡선을 이용한 혈청에서의 자가항체의 측정. 종양 환자 혈청 17766(C)은 시그모이달 곡선(-◆-)의 특성으로 검사 항원에 강하게 결합하였으나, 음성 대조군, VOL(-■-)에는 결합하지 않았다. 이와 비교할 때, 정상 개체의 혈청, 18052(N)는 검사 항원(-▲-) 또는 음성 대조군(-←)에 결합하지 않았다.
도 2: 항원 적정 검사에 의해 측정된 정상인 개체와 원발성 유방암(primary breast cancer; PBC) 환자에서 p53 자가항체 수준의 비교. 자가항체 수준은 시료 항원(p53)과의 결합에 의한 OD650 값에서 음성 대조군과의 결합에 의한 값을 뺀 값으로 표현된다. 정상 컷-오프(-----)는 정상 개체군의 평균 + 2 표준 편차로써 연산되었다.
도 3은 항원 적정 검사를 이용하여 측정된 정상 개체군 및 폐암 환자에게서 p53 및 NY-ESO 자가항체 수준의 비교를 나타낸다. 자가항체 수준은 시료 항원(p53 또는 NY-ESO)과의 결합에 의한 OD650 값에서 음성 대조군과의 결합에 의한 값을 뺀 값으로 표현된다. 정상 컷-오프(-----)는 정상 개체군의 평균 + 2 표준 편차로써 연산되었다.
도 4는 유방암 환자로부터 수득한 복수액 시료에서 p53 및 NY-ESO에 대한 자가항체의 검출을 위한 적정 곡선을 나타낸다. 상기 환자는 c-myc에 대한 자가항체를 생산하지 않는 것으로 관찰되었다.
도 5는 유방암(유관 상피내암; ductal carcinoma in situ) 환자에게서 수득한 혈청 시료에서 BRCA1, BRCA2 및 HER2 에 대한 자가항체의 검출을 위한 적정 곡선을 나타낸다.
도 6은 폐암 환자의 혈청 시료에서 NY-ESO에 대한 자가항체의 검출을 위한 적정 곡선을 나타낸다. 상기 환자는 p53 또는 c-myc에 대한 자가항체를 생산하지 않는 것으로 관찰되었다.
도 7은 폐암 환자의 혈청 시료에서 NY-ESO및 p53 에 대한 자가항체의 검출을 위한 적정 곡선을 나타낸다. 상기 환자는 c-myc에 대한 자가항체를 생산하지 않는 것으로 관찰되었다.
도 8(a) 및 8(b)는 "정상" 개체(즉, 종양의 증거가 없는 개체)의 혈청 시료에서 p53, c-myc 및 NY-ESO-1 에 대한 자가항체의 두 개의 독립적인 적정 검사 결과를 나타낸다.
도 9(a) 및 9(b)는 상이한 항원의 범위를 이용하여 침윤성 유방암(invasive breast cancer) 환자 한 명의 혈청 시료에서 수행된 두 개의 독립적인 적정 검사 결과를 나타낸다.
도 10(a) 및 10(b)는 바이오틴이 표지 된 항원 BRCA2, HER2, c-myc 및NY-ESO-1 및 바이오틴이 표지 되지 않은 항원 BRCA1 및 바이오틴 태그 외의 추가적인 항원을 표지 하지 않은 "공" 벡터 VOL의 대조군 발현 산물을 이용하여 자가항체의 존재여부가 검사된 임상학적으로 정상인 개체의 혈청 시료에서 적정 검사 결과를 나타낸다.
도 11은 항원 p53, c-myc 및 NY-ESO-1 및 "공" 벡터 VOL의 대조군 발현 산물에 관한 본 발명의 항원 적정 검사를 이용하여 원발성 유방암 환자의 자가-항체 검사 결과를 나타낸다.
도 12는 정상인의 혈청을 이용하여 도 11에서 보여진 검사의 반복 수행 결과를 나타낸다.
도 13은 원발성 유방암 환자이면서 또한 바이오틴에 대한 항원 반응을 나타내는 환자에 대해서 본 발명의 항원 적정 검사를 이용하여 수득된 추가 결과를 나타낸다.
도 14는 항원이 본 발명에 따라 적정 되는 자가-항체 검출 검사 및 항원 량이 일정하게 유지되나 혈청이 적정 되는 자가-항체 검출 검사간의 정상 시료에서의 실험적 비교 결과를 나타낸다.
도 15는 항원이 본 발명에 따라 적정 되는 자가-항체 검출 검사 및 항원 량이 일정하게 유지되나 혈청이 적정 되는 자가-항체 검출 검사간의 원발성 유방암 환자 시료에서의 실험적 비교 결과를 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 일반적으로 항체의 존재 여부를 검사할 시료가 항체에 특이적인 상이한 양의 항원에 대한 특이적 결합에 대해 검사되고, 적정 곡선은 검사된 항원의 양에 대한 항체/항원 결합으로 생성되는 것을 특징으로 하는 질병 상태 또는 질병 감수성에 대한 생물학적 표지의 역할을 수행하는 항체의 검출을 위한 면역분석 방법을 제공한다.
면역분석, 예를 들면, ELISA, 방사면역측정법(radioimmunoassay) 등의 일반적 특징은 당업자에게 잘 알려져 있다(Immunoassay, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996 참조). 특유의 면역학적 특이성을 갖는 항체 검출을 위한 면역분석은 일반적으로 검사 중인 항체와 특이한 면역학적 반응성을 나타내는 반응물(항원)의 이용을 필요로 한다. 검사 형식에 따라, 상기 항원은 고형 담체에 고정화될 것이다. 항체의 존재 여부가 검사될 시료는 항원에 접촉되고, 만약 필요한 면역학적 특이성의 항체가 시료에 존재하면, 시료는 항원과 면역학적으로 반응하여 검출되거나 정량적으로 측정될 항체-항원 복합체를 형성할 것이다.
본 발명의 방법은 항원의 존재 여부에 대해 검사될 표준화된 시료가 다수의 상이한 양의 항원(물론, 본 명세서에서 일련의 적정으로 불린다)에 대해 검사되는 것을 특징으로 한다. 시료는 적어도 2 개 및 바람직하게는 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 상이한 양의 항체에 대해 검사된다. 전형적인 분석은 물론 항원이 포함되지 않은 음성 대조군을 포함할 것이다.
본 명세서에서, 용어 "항원"은 적어도 하나의 항원성 결정소 또는 검출될 표적 항체와 특이적으로 상호작용할 수 있는 에피토프를 포함하는 기질 또는 상기 항체의 가변 부위 또는 상보적 결정 부위에 특이적으로 상호작용할 수 있는 모든 포획제를 나타낸다. 상기 항원은 전형적으로 예를 들면, 단백질 또는 펩티드, 다당류 또는 핵산과 같은 자연발생 또는 합성된 생물학적 고분자일 것이고, 항-유전자형 항체와 같은 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
당업자들은 본 발명의 방법에서 항원성 결정소 또는 표적 항체에 결합할 수 있는 에피토프의 양이 일련의 적정을 수립하는 데에 중요하다는 것을 인정할 것이다. 많은 분석 형태에서, 항원성 결정소 또는 결합할 수 있는 에피토프의 양은 항원 분자 존재 양과 직접적으로 관련되어 있다. 그러나 어떤 고상 검사 시스템과 같은 다른 구체화에서 노출된 항원성 결정소 또는 에피토프의 양은 항원의 양과는 직접적으로 연관성이 없을 것이고, 고체 표면에 부착과 같은 다른 인자에 의존적일 것이다. 상기 구체화에서, 본 명세서의 일련의 적정에서 "상이한 양의 항원"은 항원성 결정소 또는 에피토프의 상이한 양을 나타내는 것으로 여겨질 것이다.
항체와 항원 사이의 특이적 결합의 상대적 또는 절대적 양은 사용된 항원(항원성 결정소 또는 에피토프)의 각각의 상이한 양에 대해 결정되고, 검사된 항원의 각각의 양에 대하여, 항원의 양에 대한 (상대적 또는 절대적) 특이적 결합의 양의 곡선을 그리거나 또는 연산하기 위해 사용된다. 유일한 예시의 방법으로써 대표적인 결과를 많은 상이한 항체의 검출을 위한 포함된 도면에 나타내었다. 검사에 사용된 항체에 반응하는 항원의 검체 시료에 존재 여부는 각 항원의 양에서 관찰되는 특이적 결합의 양에 근거하여 결정되고, 일반적으로 S-자형 또는 시그모이달 곡선에 의해 일반적으로 지시된다. 항체 및 항원 사이의 특이적 결합의 절대적 양은 정량 측정을 산출하려고 하지 않는 한 일반적으로는 중요하지 않다. 항체의 존재 여부의 단순한 예/아니오 결정을 위하여 오직 정확한 모양의 곡선이 생성되는 것으로 충분하다. 검사된 항원의 상이한 양에서 검출될 수 있는 결합의 변화가 없었다면, 상기는 검출될 수 있는 양의 항체가 없는 것으로 기록될 수 있다. 발명의 바람직한 구체화에서 방법은 비-정량적이다. 신호 크기에 독립적인 무차원의 비례 관계를 사용하여 항체의 존재 여부의 예/아니오 결정이 수행될 수 있다.
특정 시료에 존재하는 항체 양의 측정은 원한다면 항원 적정 검사의 결과로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 방법은 존재하는 표적 항체의 절대 량이 환자 간에 엄청나게 다양하게 존재하는 임상적 진단, 예후, 예상 및/또는 감시 분석에 사용되기에 유리하다. 본 발명자들은 만약 상기 분석이 단일 양/농도의 검사 항체를 사용한 항체 결합의 검출에 근거하였다면, 전 개체군의 항체양의 정상적인 생리적인 범위의 매우 낮거나 매우 높은 한도에서의 항체 양을 포함하는 환자 시료는 검사 방법론의 제한 때문에 놓칠 수 있다; 항체의 양이 낮은 시료는 음성오류의 결과로 기록될 것이고, 항체의 양이 매우 높은 시료는 선발된 분석 방법론에서 정확한 검출을 위한 규모를 벗어날 것이다.
발명의 적정 분석 방법은 또한 표적 항원에 대한 항체/자가항체의 특이성 및 친화성에서 환자 간에 심각한 변화가 있는 질병 상태 또는 감수성의 생물학적 표지로써 항체/자가항체의 검출에 특히 적합할 것이다. 그들의 진짜 특성에 의한 자가항체 반응은 자가항체의 절대 존재 양과 자가항체의 특이성/친화성에서 발생할 수 있는 다양성으로 인해 환자 간에 상당히 다를 수 있다. 본 발명의 방법은 상기 환자 간의 다양성을 고려할 수 있고, 그러므로 모든 주어진 항체/자가항체에 대해 개발되도록 표준 분석 형식을 가능하게 한다.
자가항체와 이의 표적 항원간의 상호작용은 일반적으로 친화도가 낮으나, 결합의 강도는 상기에서 윤곽을 드러낸 대로 환자 간에 다양할 것이다. 본 발명의 방법은 양성 결과를 적정 곡선의 모양으로부터 추론할 수 있으므로 특히 낮은 친화도 결합의 검출에 적합하다.
본 발명의 방법은 또한 진단, 예후 및/또는 감시(질병 상태 또는 치료) 목적의 자가항체/항체의 검출에 사용되는 면역분석의 실행에서 나날의 변화에 대한 보호를 제공한다. 환자의 체액을 포함하는 시료에서 항체의 검출에 면역분석을 수행할 때, 신호 강도에서 상당한 나날의 변화가 수시로 관찰된다. 상기 변화는 예를 들면 검사 전에 시료가 수득되고 저장되는 방법의 차이 때문에 발생할 것이다. 상기 요인들은 예를 들면, 항체/항원 결합의 간단한 역치 값을 기초로 하는 확실성을 갖는 임상학적 검사의 결과 기록을 어렵게 만든다. 본 발명은 항체의 존재에 대한 양성 결과가 신호 강도와 관련 없이 적정 곡선의 모양에서 명확하게 분명하기 때문에 상기 나날의 변화의 효과를 극소화한다.
본 발명의 방법의 추가의 이점은 환자의 시료의 희석을 허용하고, 일관성 있는 결과를 생성하고, 및 또한 한 개체의 다른 출처로부터의 체액[예를 들면, 피 또는 복수 수액(ascites fluid) 또는 흉막삼출액(pleural effusion)]에 대한 혈청을 이용하여, 비록 항체의 절대 농도가 다른 수액에서 다를 지라도, 일반적으로 동일한 정량적 선별 결과(양성/음성)를 생성한다.
본 발명의 방법은 항체를 포함하는 것으로 예상되는 시료와 다중의 상이한 양의 항원 사이의 접촉을 가능하게 하는 모든 적절한 형식으로 수행될 것이다. 편리하게도, 시료와 상이한 양의 항원 사이의 접촉은 분리되어 발생하나, 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)의 웰과 같은 반응 챔버에서 발생할 것이다. 항원의 다양한 양은 마이크로타이터 플레이트의 웰의 도처에 항원 모액(stock)으로부터 일련의 희석물의 제조에 의하여 마이크로타이터 플레이트의 웰에 코팅될 수 있다. 항원 모액은 농도를 알거나 모를 수 있다. 그리고 검체 시료의 분배물은 각 웰에서 일정하게 유지되는 검체 시료의 부피 및 희석으로 플레이트의 웰에 첨가될 것이다. 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가된 항원의 절대 양은 표적 항체의 특성, 검사에서 시료의 특성, 검체 시료의 희석 등과 같이 당업자에게 평가될 것과 같이 상기 요인에 따라 다를 것이다. 일반적으로 항원의 양 및 검체 시료의 희석은 방법에서 항체/항원 결합의 검출을 위해 수락할 수 있는 판독의 검출 범위 이내에 있는 신호 강도의 범위를 생성하도록 선택될 것이다. 항-종양 표지 자가항체를 포함하는 것으로 예측되는 인간 혈청 시료의 검사를 위한 일반적인 양 및 희석은 함께 포함된 실시예에서 주어졌다. 편리하게도 항원의 검사된 양은 0.01 ㎍/㎖ 부터 10 ㎍/㎖까지 다양할 것이다.
전술한 것과 같이, 또한 항원 모액의 절대 농도가 불분명할 때에도, 항원의 단일 모액에서 시작한 적정 곡선을 그리는 것도 가능하다. 동일한 단일 모액이 사용되고 동일한 방법으로 희석되어 제공된다면, 상이한 초기 검체 시료에서 진행하는 상기 항원을 위해 분리되는 적정 분석의 결과를 비교하는 것이 가능하다.
추가의 구체화에서 항원(항원성 결정소 또는 에피토프)의 상이한 양은 고형 지지체의 분리된 위치 또는 반응 위치에 고정화 될 것이다. 전체 지지체는 그 후 검체 시료에 접촉될 것이고, 항원과 항체의 결합은 각각의 분리된 위치 또는 반응 위치에서 개별적으로 검출 또는 측정될 것이다. 또한 적당한 고형 지지체는 마이크로 어레이, 예를 들면 어레이의 분리된 위치 또는 스팟에 상이한 양의 항원을 포함하는 어레이를 포함한다. 마이크로어레이는 어레이 상의 분리된, 분해할 수 있는 반응 위치에 상이한 양의 특정 항원의 고정화에 의해 제조될 수 있다. 다른 구체화에서, 고정화된 항원 분자의 실제양은 대체로 유지될 것이지만, 유효한 결합 에피토프의 상이한 양에서 위치 또는 스팟의 일련의 적정을 제공하는 유효한 에피토프의 결합 양을 달라지게 하기 위해 어레이 상의 위치 또는 스팟의 크기는 다양하다. 상기 구체화에서, 항원 상의 결합 에피토프(들)의 2차원 표면 농도는 항원의 절대량 보다는 일련의 적정 제공에 중요하다. 단백질/펩티드 마이크로어레이의 제조 및 심문을 위한 기술을 당업자에게 일반적으로 알려져 있다.
상기 논의로부터 본 발명의 모든 구체화에서 항원의 양의 다양화는 검사될 시료에 대한 항원 또는 에피토프 밀도의 변화에 의해 또는 항원 또는 에피토프의 밀도를 유지하지만 항원이 고정된 표면 면적을 증가시킴으로써 또는 두 가지 방법 모두에 의해 달성될 것이 자명하다.
마이크로어레이는 동시에 단일 시료에서 상이한 특이성의 항체들의 다중 검사 수행에 사용될 것이다. 상기는 상이한 항원의 다중 세트를 포함하는 어레이를 이용하여 수행될 수 있고, 각각의 세트는 다중의 상이한 양 또는 농도에서 특정 항원을 포함한다. 용어 "상이한 항원"은 상이한 단백질 또는 폴리펩티드로부터(상이한 유전자에 의해 암호화된 비관련성 단백질로부터 유래된 항원과 같은) 유래한 항원과 또한 단일 단백질 또는 폴리펩티드의 상이한 펩티드 에피토프로부터 유래한 항원을 포함한다. 일정한 마이크로어레이는 독점적으로 상이한 단백질 또는 폴리펩티드로부터 유래된 상이한 항원의 세트 또는 독점적으로 단일 단백질의 상이한 펩티드 에피토프로부터 유래된 상이한 항원의 세트, 또는 일정한 비율의 두 개의 혼합물을 포함할 것이다. 본 발명의 어떤 구체화에서 상이한 양 또는 농도의 각각 개별의 항원 세트는 일반적으로 그들의 혼합물이 아닌 단일의 항원을 포함할 것이다.
용어 "체액"이 본 명세서에서 사용된 것처럼, 상기 방법을 이용하여 항체의 존재 여부가 검사될 물질을 나타낼 때, 특히, 혈장, 혈청, 전체 혈액, 소변, 땀, 림프액, 대변, 뇌척수액, 복수, 흉막 삼출, 정액, 가래, 젖꼭지 흡인물(nipple aspirate), 수술후 장액종 또는 상처 배액을 포함한다. 전술한 것처럼, 본 발명의 방법은 검사 대상으로부터 제거된 체액을 포함하는 검체 시료 상에서 생체 밖에서 수행되는 것이 바람직하다. 사용될 체액의 유형은 검사될 항체의 단일성 및 사용된 분석의 임상학적 상황에 따라 다양할 것이다. 일반적으로 혈청 또는 혈장의 시료 상에서 분석을 수행하는 것이 바람직하다. 검체 시료는 체액에 추가로 예를 들면 희석제, 보존제, 안정제, 완충 용액등과 같은 성분을 포함할 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항원"은 넓은 의미에서 검출될 표적 항체와 특이한 면역학적 반응성을 나타내는 모든 물질을 나타낸다. 적당한 항원은 자연 발생 단백질, 재조합 또는 합성 단백질 단백질 또는 폴리펩티드, 합성 펩티드, 펩티드 유사 유도체 등, 또한 다당류 및 핵산을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 본 명세서에서 사용된 "항원"은 인간 기원, 포유동물 기원 또는 그 외의 기원이든지 간에 검출될 항체의 가변성 또는 상보적 결정 부위와 특이적 면역학적 상호작용이 가능한 모든 포획제를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들면, 항-유전자형 항체는 파아지 발현에 의해 생성된 항원일 것처럼 상기 목적을 위해 항원으로 여겨질 것이다.
어떤 항원은 자연적인 출처로부터 분리된 단백질 또는 폴리펩티드로 구성되거나 또는 유래될 것이고, 환자의 조직 또는 체액으로부터 분리된 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 구체화에서 항원은 실제로 모든 자연 발생 단백질 즉, 실제로 자연적인 출처로부터 분리된 형태의 단백질을 포함할 것이고, 또는 자연 발생 단백질의 단편으로 구성될 것이다. 본 발명의 방법에서 항원으로써 효과적이기 위하여, 모든 상기 "단편"은 검사에 사용될 항체와 면역학적인 반응성을 유지해야 한다. 적당한 단편은 예를 들면, 분리된 단백질의 화학적 또는 효소적 절단반응에 의해 제조될 것이다.
사용될 분석의 명확한 특징에 따라, 항원은 자연 발생 단백질, 또는 단백질에 자연적으로 존재하지 않는 어떤 필요한 특성을 부가하는 하나 또는 그 이상의 추가의 분자에 연결된 이의 단편을 포함할 것이다. 예를 들면, 단백질 또는 단편은 예를 들면, 형광 표지, 착색 표지, 발광성 표지, 방사성 표지 또는 콜로이드 금과 같은 중금속과 같은 노출된 표지에 결합될 것이다. 다른 구체화에서, 단백질 또는 단편은 융합 단백질로 발현될 것이다. 실례로서 융합 단백질은 재조합 발현 항원의 정제를 돕기 위해 N- 또는 C- 말단에 태그 펩티드를 포함할 것이다.
사용될 분석의 형식에 다라, 항원은 예를 들면, 마이크로타이터 판, 마이크로어레이 비드 또는 칩의 웰 또는 자성 비드와 같은 고형 지지체에 고정화될 것이다. 고정화는 비-공유성 흡착 또는 공유성 부착을 통해 이루어질 것이다.
유의한 범위에서 표적 항체와 면역학적으로 반응하기 위한 항원의 능력에 불리한 영향을 제공하지 않는 다면, 어떠한 적당한 부착 수단도 사용될 것이다.
본 발명은 고상 분석에 한정되지 않고, 모든 또는 부분에서, 액상에서 수행되는 분석, 예를 들면 용액 상태 비드 분석을 포함한다.
하나의 구체화에서 항원은 고정화를 촉진하는 바이오틴과 같은 리간드로 표지 될 것이다. 그리고 항원은 적절한 적정 범위에서 희석될 수 있고, 용액에서 환자 시료의 자가항체와 반응하게 될 것이다. 최종 면역 복합체는 리간드-수용체 상호작용(예를 들면, 바이오틴-스트렙타비딘)에 의해 고형 지지체 상에 고정화 될 수 있고, 검사의 나머지 단계는 하기에 기술된 것처럼 수행될 수 있다.
본 발명의 분석 방법에서 사용하기 위한 바이오틴화된 항원의 생성을 촉진하기 위해, 전장 항원, 이의 절단된 버전 또는 이의 항원성 단편을 암호화 하는 cDNAs는 효소반응을 통해 바이오틴 공동-인자가 부착될 단백질 또는 폴리펩티드 태그로 표지 된 융합 단백질로써 발현될 것이다. 재조합 바이오틴화된 항원의 생성을 위한 벡터는 많은 출처로부터 상업적으로 가능하다.
포함된 실시예에서 나타낸 것처럼, 바이오틴화된 항원으로 시도된 적정 곡선 사용의 추가적인 이점은 상기 분석이 바이오틴 성분과 항-바이오틴 항체의 결합과 항원과 이의 같은 기원의 항체의 결합 사이의 구별이 가능한 것이다. 본 발명자들은 상당히 많은 인간 개체군이 바이오틴화된 항원의 사용을 기반으로 하는 검사에서 가양성 결과를 생성하는 항-바이오틴 항체를 자연적으로 생산하는 것을 관찰하였다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따라 항체를 검출하기 위하여 사용된 "면역분석"은 다중의 항원의 양이 적정 곡선을 생성하기 위해 사용된 것을 제외하고는 당분야에서 알려진 표준 기술에 기반을 둘 것이다. 가장 바람직한 구체화에서, 면역분석은 ELISA일 것이다. ELISA는 당분야에서 일반적으로 잘 알려져 있다. 전형적인 "간접적" ELISA에서, 검사에서 항체에 대해 특이성을 갖는 항원은 고체 표면(예를 들면, 표준 마이크로타이터 분석 판의 웰, 또는 마이크로비드 또는 마이크로어레이의 표면)에 고정화 되고, 항체의 존재 여부에 대해 검사될 체액을 포함하는 시료는 고정화된 항원과 접촉하게 된다. 시료에서 원하는 특이성을 나타내는 모든 항체는 고정화된 항원에 결합할 것이다. 그 후, 결합한 항체/항원 복합체는 모든 적당한 방법을 사용하여 검출될 것이다. 하나의 바람직한 구체화에서, 인간 면역글로불린의 하나 또는 그 이상의 종류에서 일반적인 에피토프를 특이적으로 인지하는 표지 된 이차 항-인간 면역글로불린 항체가 항체/항원 복합체의 검출을 위해 사용될 것이다. 일반적으로 이차 항체는 항- IgG 또는 항-IgM일 것이다. 이차 항체는 보통 검출 가능한 산물, 예를 들면 발색, 화학발광 또는 형광 산물을 생성하는 효소의 기질을 추가함으로써 정량적 검출이 가능하게 하는 검출 가능한 표지, 전형적으로 예를 들면 퍼옥시다아제 또는 알카라인 포스파타제와 같은 효소 표지로 표지 된다. 당분야에 알려진 검출 가능한 표지의 다른 형태들도 동등한 효과로 함께 사용될 것이다.
본 발명은 질병 상태 또는 질병 감수성의 생물학적 표지인 항체 검출 방법에 관련한다. 상기 본 발명의 상세한 면에서 바람직하게는 종양 표지로의 백신 접종을 제외한 백신 접종 또는 면역화 프로토콜의 결과로서 생산된 항체를 검사하기 위해 설계된 분석을 배제한다. 그러므로 본 발명의 상기 면에 의한 분석은 바람직하게는 백신접종/면역화에 따른 항-바이러스 또는 항-박테리아 항체의 존재 여부를 검사하도록 설계된 검사를 포함하지 않는다.
본 발명의 특정 구체화에서, 항체는 자가항체일 것이다. 상기에서 지시된 것처럼, 용어 "자가항체"는 항원이 개체에서 실제로 발생했을 지라도 개체의 면역체계가 외부의 것으로 인식하는 항원에 대한 자연 발생 항체를 나타낸다. 자가항체는 질병에 걸린 세포에 의해 또는 질병 과정 중에 생성된 자연 발생 단백질의 변형된 형태에 대응하는 항체를 포함한다. 변형된 형태의 단백질은 개체로부터 유래하였더라도 개체의 면역체계에 의해 "비-자가"로 판단될 것이고, 따라서 변형된 단백질에 면역학적으로 특이적인 자가항체의 형태로 상기 개체의 면역 반응을 유도할 것이다. 상기 변형된 형태의 단백질은 예를 들면, 선택적으로 2차, 3차 또는 4차 구조의 변화를 수반하는 변형된 아미노산 서열을 갖는 돌연변이체, 절단된 형태, 접합 변형체, 변형된 단백당형 등을 포함할 수 있다. 다른 구체화에서 유전자 증폭 또는 비정상의 전사 조절의 결과로써 자가항체는 질병 상태에서 과발현 된 단백질에 집중될 것이다. 상당한 양으로 면역체계의 세포에 의해 정상적으로 마주치지 않는 단백질의 과발현은 자가항체의 생성을 유도하는 면역 반응을 유발할 수 있다. 게다가 추가의 구체화에서 자가항체는 질병 상태에서 발현되는 단백질의 태아 상태의 형태(fetal form)에 집중될 것이다. 만약 면역체계가 기능적이기 이전에 발달의 초기 단계에서만 정상적으로 발현되는 태아 단백질이 질병 상태에서 발현되었다면, 태아 단백질은 면역체계에 의해 "외부"의 것으로 인지될 것이고, 자가항체의 생성을 유도하는 면역 반응을 유발할 것이다.
하나의 구체화에서 항체는 종양 표지 단백질에 특이적인 자가항체일 것이고, 더욱 특이적으로 "종양-관련" 항-종양 자가항체일 것이다.
용어 "종양-관련" 항-종양 자가항체는 종양 질병 상태에서 우선적으로 발현되는 종양 표지 단백질의 형태에 존재하는 에피토프에 대항하여 집중되는 자가항체를 나타낸다. 상기 자가항체의 존재는 종양 질병 상태를 나타내거나 또는 무증상 환자에게서 종양의 사전성향(pre-diposition)을 나타낸다.
바람직한 적용에서, 본 발명의 방법은 인간 검사 대상 또는 환자에게서 종양-관련 항-종양 자가항체의 존재를 검출하기 위해 사용될 것이고, 가장 바람직하게는 생체외 면역분석의 형태로 수행될 것이고, 검사 대상/환자로부터 수득한 체액의 시료를 포함하는 검체 시료에서 수행될 것이다. 체액의 시료는 적당한 완충용액으로 희석되거나, 또는 장기 보관을 위해 처리되거나 그렇지 않으면 검사 전에 처리될 것이다.
생체외 면역분석은 비-파괴적이고 "위험성이 있는" 개체의 선발에서 질병의 시작 전에 또는 질병의 진행 동안 환자에게서 자가항체 생성의 추이의 확립이 필요한 것으로 생각될 때마다 반복될 수 있다 (발명의 바람직한 적용에 대해서는 하기에서 추가로 논의되었다).
특히, 제한되지 않은 본 발명의 방법의 구체화는 동일한 또는 관련된 종양 표지 단백질[예를 들면 단일 유전자에 의해 암호화된 상이한 아형(isoform) 또는 변이체]의 상이한 에피토프 또는 상이한 종양 표지 단백질(상이한 유전자에 의해 암호화된 단백질을 의미)의 에피토프에 대한 특이성을 갖는 두 개 또는 그 이상의 유형의 자가항체를 (동시에) 검출하기 위한 면역분석을 포함할 것이다. 상기 방법들은 일반적으로 두 개 또는 그 이상의 항원 세트의 패널의 이용을 포함할 것이고, 비록 앞에서 언급한 것처럼 항원 세트가 동일한 종양 표지 단백질의 상이한 에피토프를 포함할 수 있을 지라도, 각각의 항원 세트는 보통 상이한 종양 표지 단백질로부터 유래될 것이다(상기 문맥에서 상이한 것은 상이한 유전자의 산물인 단백질을 의미함). 항원 세트는 본 발명의 방법에서 상이한 양/농도로 검사될 단일 항원을 나타낸다. 이하에서 "패널 분석"으로 나타내질 상기 방법은 종양 또는 다른 발암성/종양의 변화에 대한 다른 개체의 전반적인 면역 반응을 감시하기 위하여 두 개 또는 그 이상의 항원 세트의 패널을 이용한다. 상기 방법은 따라서 주어진 개체에서 면역 반응의 "추이"를 검출하여, 종양 표지가 면역반응을 유도하여 자가항체의 생성을 기인하였음을 지시한다. 두 개 또는 그 이상의 상이한 종양 표지에 대한 자가항체의 생성을 감시하기 위한 두 개 또는 그 이상의 항원 세트의 패널의 용도는 일반적으로 단일 표지에 대한 자가항체의 검출보다 더욱 민감하고, 음성오류 결과의 매우 낮은 빈도를 제공한다(본 명세서에 참조로써 포함된 WO 99/58978 및 WO 2004/044590 참조).
그러므로 제한되지 않은 구체화에서 본 발명은
(a)두 개 또는 그 이상의 항원 세트와 검체 시료를 접촉시키는데 있어서, 상기 항원 세트의 각각 하나는 검체 시료에서 검출될 상기 항원의 하나에 대해 특이적이고 각각의 항원 세트는 다수의 상이한 양의 상기 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 단계;
(b) 상기 항체와 상기 항원 사이의 특이적 결합의 양을 검출하는 단계; 및,
(c) 단계 (a)에서 사용된 각각의 항원 세트의 항원의 양에 대한 상기 특이적 결합의 양의 곡선을 그리거나 또는 연산하는 단계를 포함하는 상기 항체들 중의 적어도 하나가 질병 상태 또는 질병 감수성의 생물학적 표지인 것을 특징으로 하는 포유동물 개체으로부터 수득한 체액을 포함하는 검체 시료에서 두 개 또는 그 이상의 항체의 검출 방법을 제공한다.
하나의 구체화에서, 상기 두 개 또는 그 이상의 항체는 질병 상태 또는 질병 감수성의 생물학적 표지일 것이지만, 본 발명의 범위에서는 동일한 검체 시료에서 질병 표지 항원에 대한 적정 분석과 항원 표지일 수도 있고 아닐 수도 있는 어떠한 다른 유형의 항체에 대한 적정 분석을 결합하기 위함이다.
검체 시료에서 관련 항체의 존재 여부에 대한 판단이 어느 쪽이든 검사에서 각각의 상이한 항원에 관해서는 각각의 상이한 항원 농도에서 관찰된 특이적 결합의 양, 바꾸어 말하면, 각각의 항원에 대한 단일 농도에서 예측하는 것 보다 각각의 항원에 대한 집합적인 수치에 기초한다. 그러므로 두 개 또는 그 이상의 유형의 항체의 존재 여부에 기초한 질병 상태 또는 질병 감수성 또는 환자 시료에서 외부 기질에 대한 항체의 존재 여부의 결정은 각각의 항원의 상기 집합적인 수치에 기초할 수 있다. 바람직하게는 판단은 검사에서 존재한 어떠한 또는 모든 항원에 대한 일반적인 S-자형 또는 시그모이달 곡선의 모양에 기반하여 내려질 수 있다.
불확실성을 제거하기 위한 목적으로, 항체 검출을 위한 단일 유형의 항원의 이용에 기반한 분석은 본 명세서에서 "단일 표지 분석"으로 나타낼 것이고, 반면에 두 개 또는 그 이상의 항원의 이용에 기반한 분석은 "패널 분석"으로 나타낸다.
본 발명의 방법은 특히 적당한 항원으로 준비될 모든 종양 표지 단백질에 대한 자가항체의 검출에서 사용되기 위하여 단일 표지 분석으로써 또는 패널 분석의 성분으로써 변형될 것이다. 특히, 상기 방법은 표피성장인자 수용체 단백질[epidermal growth factor receptor protein; EGFR; Downward et al (1984) Nature. 307: 521-527; Robertson et al. (2001) Archives of Pathology and Laboratory Medicine 126;177-81], 당단백질 MUC1[Batra, S. K. et al. (1992) Int. J. Pancreatology. 12: 271-283] 및 신호 전달/세포 주기 조절 단백질 Myc[Blackwood, E. M. et al. (1994) Molecular Biology of the Cell 5: 597-609], p53[Matlashewski, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 3257-3262; Wolf, D. et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 1887-1893] 및 ras(또는 Ras)[Capella, G. et al. (1991) Environ Health Perspectives. 93: 125-131], 및 또한 BRCA1[Scully, R. et al. (1997) PNAS 94: 5605-10], BRCA2[Sharan, S. K. et al. (1997) Nature. 386: 804-810], APC[Su, L. K. et al. (1993) Cancer Res. 53: 2728-2731; Munemitsu, S. et al. (1995) PNAS 92: 3046-50], CA125[Nouwen, E. J. et al. (1990) Differentiation. 45: 192-8], PSA[Rosenberg, R. S. et al. (1998) Biochem Biophys Res Commun. 248: 935-939], 암배항원 CEA[carcinoembryonic antigen CEA; Duffy, M.J. (2001) Clin Chem, Apr 47(4):624-30], CA19.9[Haga, Y. et al (1989 Oct) Clin Biochem 22(5): 363-8], NY-ESO-1[cancer/testis antigen; 종양/정소 항원; Chen, Y.-T. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 94: 1914-1918, 1997], PSMA[prostate specific membrane antigen; 전립선 특이 막 항원; Israeli, R. S. et al., Cancer Res. 53: 227-230, 1993], PSCA[prostate stem cell antigen; 전립선 줄기세포 항원; Reiter, R. E. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 1735-1740, 1998] 및 EpCam[epithelial cellular adhesion molecule; 상피성 세포 접착 분자; Szala, S. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 3542-3546, 1990], HER2[c-erbB2로도 알려짐, Coussens, L. et al., Science 230: 1132-1139, 1985], CAGE[Jager D, et al., Cancer Res. 1999 Dec 15;59(24):6197-204; Mashino K, et al., Br J Cancer. 2001 Sep 1;85(5):713-20], 싸이토케라틴[cytokeratin, Moll R, et al., Cell. 1982 Nov;31(1):11-24; Braun S, et al., N Engl J Med. 2000; 342: 525-533], 리커버린[recoverin, Maeda A, et al., Cancer Res. 2000 Apr 1;60(7):1914-20], 칼리크레인[kallikreins, Kim H, et al., Br J Cancer 2001;84:643-650; Yousef GM, et al., Tumor Biol 2002;23:185-192]; 아넥신[annexins, Hudelist G, et al., Breast Cancer Res Treat. 2004 Aug;86(3):281-91], α-페토프로테인[α-fetoprotein, Stiller D, et al., Acta Histochem Suppl. 1986;33:225-31], GRP78[Block TM, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Jan 18;102(3):779-84; Hsu WM, et al., Int J Cancer. 2005 Mar 1;113(6):920-7], CA125[Norum LF, et al., Tumour Biol. 2001 Jul-Aug;22(4):223-8; Perey L, et al., Br J Cancer. 1990 Oct;62(4):668-70; Devine PL, et al., Anticancer Res. 1992 May-Jun;12(3):709-17]; 맘모글로빈[mammoglobin, Zehentner BK, et al., Clin Chem. 2004 Nov;50(11):2069-76; Zehentner BK, Carter D. Clin Biochem. 2004 Apr;37(4):249-57], raf[Callans LS. et al., Ann Surg Oncol. 1995 Jan;2(1):38-42; Pratt MA, et al., Mol Cell Biochem. 1998 Dec;189(1-2):119-25], 베타-인간 융모막 성 생식선 자극 호르몬 b-HCG[beta-human chorionic gonadotropin b-HCG, Ayala AR, et al., Am J Reprod Immunol. 1983 Apr-May;3(3):149-51; Gregory JJ Jr, et al., Drugs. 1999 Apr;57(4):463-7], 또는 4-5 항원[Krause P, et al., J Immunol Methods. 2003 Dec;283(1-2):261-7]에 대한 자가항체의 검출/측정을 위하여 변형될 것이다. 그러나 본 발명은 상기 특정 종양 표지에 대한 자가항체의 검출에 제한되지 않는다.
항 종양-표지 자가항체의 검출(단일 표지 또는 패널 분석 형태)에 기반한 본 발명에 따른 분석 방법은 다양한 상이한 임상학적 상태에서 사용될 것이다. 특히, 상기 방법은 종양의 검출 또는 진단, 종양으로 진단된 환자의 예후 평가, 치료에 대한 반응의 예상, 환자에서 종양의 진행 또는 다른 종양성 질환의 진행을 감시, 무증상 인간 개체에서 초기 종양성 또는 초기 발암성 변화의 검출, 종양 발병 위험성이 증가된 무증상 인간 실험 대상을 확인하거나 종양의 존재를 진단하기 위한 무증상 인간 개체의 개체군의 선발, 항-종양 치료(예를 들면, 백신접종, 항-성장인자 또는 신호 전달 치료, 방사선 요법, 내분비계 치료, 인간 항체 치료, 화학요법)에 대한 종양 환자의 반응의 예상, 항-종양 치료(예를 들면, 백신접종, 항-성장인자 또는 신호 전달 치료, 방사선 요법, 내분비계 치료, 인간 항체 치료, 화학요법)에 대한 환자의 반응의 감시, 종양 존재양의 감소를 위한 항-종양 치료를 경험한 이미 종양에 걸린 것으로 진단된 환자에게서 순환 질병의 검출 또는 특정 환자에서 사용되기 위한 항-종양 치료법(예를 들면, 백신접종, 항-성장인자 또는 신호 전달 치료, 방사선 요법, 내분비계 치료, 인간 항체 치료, 화학요법)의 선택에 사용될 것이다.
본 발명자들은 일반적으로 질병 상태에서 종양-관련 자가항체의 수준이 양성 관련을 나타내는 것을 관찰하였다(본 명세서에 참조로써 포함된 WO 99/58979 참조). 그러므로 본 발명의 방법이 임상학적 적용에 사용될 때, 적당한 대조군과 비교하여 항-종양 표지 자가항체의 증가된 수준은 일반적으로 종양 질병 상태의 징후가 될 것이다.
예를 들면, 면역분석이 종양 진단에 사용될 때, "정상" 대조군 개체와 비교하여 자가항체의 증가된 수준의 존재는 상기 개체가 종양에 걸린 것의 징후가 될 것이다. 상기 "정상" 대조군 개체는 바람직하게는 임상학적, 화상 진찰 및/또는 생화학적 조건에 기초한 모든 종양 진단 결과, 종양에 걸리지 않은 나이가 맞춰진 대조군일 것이다.
면역분석이 항-종양 치료(예를 들면, 백신접종, 항-성장인자 또는 신호 전달 치료, 방사선 요법, 내분비계 치료, 인간 항체 치료, 화학요법)에 대한 종양 환자의 반응의 예상에 사용될 때, "정상" 대조군 개체와 비교하여 자가항체의 증가된 수준의 존재는 개체가 항-종양 치료에 반응할 가능성이 있는 개체인지 여부의 징후가 될 것이다. "정상" 대조군 개체는 바람직하게는 임상학적, 화상 진찰 및/또는 생화학적 조건에 기초한 모든 종양 진단 결과, 종양에 걸리지 않은 나이가 맞춰진 대조군일 것이다. 상기 열거된 각각의 모든 치료법에 대하여, 대조군과 비교한 자가항체의 수준과 치료 성공 사이의 관계는 자가항체 수준이 치료를 통해 감시된 환자에서 상기 치료의 결과의 관찰에 의해 설립될 수 있다. 게다가 이미 설립된 관계는 자가항체 상태의 평가에 기반한 주어진 환자에서 각각의 치료에 대한 성공 가능성의 예측에 사용될 것이다.
면역분석이 환자에서의 종양 또는 다른 종양성 질환의 진행의 감시에 사용될 때, "정상 대조군"과 비교하여 자가항체의 증가된 수준의 존재는 환자에서 종양 존재의 징후가 될 것이다. "정상 대조군"은 바람직하게는 나이가 맞춰진, 임상학적, 화상 진찰 및/또는 생화학적 조건에 기초한 모든 종양 진단 결과, 종양에 걸리지 않은 대조군 개체에 존재하는 자가항체의 수준일 것이다. 선택적으로, 상기 "정상 대조군"은 검사에서 특정 환자를 위해 설립된 "기본선" 수준일 것이다. 상기 "기본선" 수준은 예를 들면, 첫 번째 종양 진단 또는 순환 종양이 진단되었을 때의 자가항체 존재 수준일 것이다. 기본선 수준 이상의 모든 증가는 환자에서 종양 존재량이 증가된 것의 징후가 될 것이고, 반면에 기본선 수준 이하의 모든 감소는 환자에서 종양 존재량이 감소된 것의 징후가 될 것이다. "기본선" 수치는 또한 예를 들면, 새로운 치료법이 시작되기 전의 수준일 것이다. 자가항체 수준의 변화는 치료법의 유효성의 징후가 될 것이다. 치료에 대한 양성 반응을 지시하는 "변화"의 방향(즉, 증가 대 감소)은 치료의 정확한 특성에 기인할 것이다. 모든 주어진 치료법에 대하여 양성 결과를 지시하는 자가항체 수준에서 "변화"의 방향은 예를 들면, 치료에 대한 반응의 다른 임상학적 또는 생화학적 지표와 비교하여 자가항체 수준의 감시에 의해 손쉽게 결정될 것이다.
종양 발병의 위험성이 증가된 무증상 인간 개체를 확인하기 위하여 면역분석이 무증상 인간 개체의 개체군의 선발에 사용될 때, "정상" 대조군 개체와 비교하여 자가항체의 수준이 증가된 개체는 종양 발병의 "위험이 있는" 것으로 확인된다. "정상" 대조군 개체는 바람직하게는 종양 발병에 대한 어떠한 경향 또는 종양 발병의 어떠한 중대한 증가된 위험성이 확인되지 않은 나이가 맞춰진 대조군일 것이다. 상기의 예외는 나이 자체가 중요한 위험 인자인 경우 일 것이다.
면역분석이 무증상 인간 개체의 개체군의 선별에 사용될 때, 이미 종양이 발병한 무증상 인간 개체에게서 정상 대조군 개체와 비교하여 자가항체의 수준이 증가한 종양 또는 발암성 변화의 어떤 형태를 갖는 것으로 기록된 개체를 종양 진단하기 위함일 것이다. "정상" 대조군 개체는 바람직하게는 종양 발병에 대한 어떠한 경향 또는 종양 발병의 어떠한 중대한 증가된 위험성이 확인되지 않은 나이가 맞춰진 대조군일 것이다. 상기의 예외는 나이 자체가 중요한 위험 인자인 경우 일 것이다. 선택적으로, "정상 대조군"은 검사에서 특정 환자에 대해 설립된 "기본선" 수준일 것이다. "기본선" 수준은 예를 들면, 환자가 첫 번째 검사되어 상기 "정상 대조군" 개체군보다 증가된 수준을 갖지 않는 것으로 발견되었을 때 자가항체 존재 수준일 것이다. 그에 따라, 상기 기본선 측정에 대한 모든 증가는 그 개체에서 종양 존재의 징후가 될 것이다. 그러므로 상기 개체는 상기 기본선 검사를 통해 앞으로의 자가항체 측정을 위한 고유의 대조군이 될 수 있다.
면역분석이 항-종양 치료(예를 들면, 백신접종, 항-성장인자 또는 신호 전달 치료, 방사선 요법, 내분비계 치료, 인간 항체 치료, 화학요법)에 대한 종양 환자의 반응의 감시에 사용될 때, 치료 후에 자가항체의 변경된 수준의 존재는 상기 환자가 치료에 양성적으로 반응한 것에 대한 징후가 될 것이다. 치료 개시 전에 수득한 자가항체의 기본선 수준은 치료가 자가항체 수준에 "증가 또는 감소"의 결과를 나타내는 지 여부를 결정하기 위한 비교 목적을 위해 사용될 것이다. 자가항체 수준의 변화는 치료의 효율성의 징후가 될 것이다. 치료에 대한 양성 반응을 지시하는 "변화"의 방향(즉, 증가 대 감소)은 치료의 정확한 특성에 기인할 것이다. 모든 주어진 치료법에 대하여 양성 결과를 지시하는 자가항체 수준에서 변화의 "방향"은 예를 들면, 치료에 대한 다른 임상학적 또는 생화학적 지표와 비교하여 자가항체 수준의 감시에 의해 손쉽게 결정될 것이다.
본 발명의 방법은 본질적으로 모든 알려진 항-종양 치료법에 대한 개체의 반응의 예상 및/또는 감시에 사용될 것이다. 상기는 예를 들면, 인간 항체 치료법을 포함할 것이고, 단일클론 또는 다클론 항체가 환자에게 주입되고, 제한되지 않은 특이한 예로 항-성장인자 항체 허셉틴[Herceptin,Baselga, J., D. Tripathy et al., J Clin Oncol., 14(3), 737-744, 1996]으로 치료되는 것을 특징으로 한다. 자연적인 자가항체 반응의 존재는 인위적으로 주입된 치료상의 항체 처리의 효율성을 향상 또는 억제할 것이다. 본 발명의 방법의 사용에서, 항체 치료법을 포함하는 모든 항-종양 처리에 대한 반응을 어떤 환자 또는 환자 그룹에서 치료 이전 및 치료 과정에서 자가항체의 자연적 수준과 관련시키는 것이 가능하다. 상기 인식은 이번에는 다른 환자(또는 반복 치료의 경우에서 동일한 환자)가 동일한 치료에 어떻게 반응할 지 예측하는데 사용될 것이다.
면역분석이 순환 질환의 검출에 사용될 때, "정상 대조군"과 비교하여 환자에서의 자가항체의 증가된 수준의 존재는 질환이 순환된 것의 징후가 될 것이다. "정상 대조군"은 대조군 개체에서의 자가항체의 존재량일 것이고, 바람직하게는 임상학적, 화상 진찰 및/또는 생화학적 조건에 기초한 모든 종양 진단 결과, 종양에 걸리지 않은 나이가 맞춰진 대조군일 것이다. 선택적으로, 상기 "정상 대조군"은 검사에서 특정 환자에게서 설립된 "기본선" 수준일 것이다. 상기 "기본선" 수준은 예를 들면, 임상학적, 화상 진찰 및/또는 생화학적 조건에 기초한 질병의 완화 시기 동안의 자가항체의 존재량일 것이다.
본 발명의 분석 방법은 예를 들면, 유방암, 방광암, 결장암, 전립선암, 폐암, 췌장암 및 난소암의 많은 상이한 유형의 종양의 검출에 적용될 것이다. 상기 분석은 현존하는 선발 및 감시 방법을 보완할 것이다. 예를 들면, 원발성 유방암의 경우에서, 자가항체에 대한 면역분석은 방사선 사진에서 의심되는 것으로 나타나지 않는 유방 X선 사진에서 작은 병변을 생체검사하기 위하여 임상의에게 경고하기 위하여 또는 유방 영상촬영을 수행하기 위해 또는 계획보다 빨리 영상 진찰을 반복하기 위하여 사용될 것이다. 임상에서, 발명의 분석 방법은 성공은 작동자 의존적일 수 있는 현재의 영상 기술(즉, 유방 X선 촬영법 및 초음파)과 비교하여 더욱 객관적이고 재현성이 있는 것으로 기대된다.
"패널 분석"은 특정 임상학적 적용에 대해 고려하여 맞춰질 것이다. 적어도 p53및 c-erbB2에 대한 자가항체의 검출을 위한 항원의 패널은 특히 많은 유형의 종양에 유용하고, 특정 종양, 또는 특정 종양의 단계와 관련이 알려진 검출될 다른 표지가 선택적으로 제공될 수 있다. 유방암의 예를 들면, 패널은 MUC 1 및/또는 c-myc 및/또는 BRCA1 및/또는 BRCA2 및/또는 PSA, 반면에 방광암에서는 선택적으로 MUC 1 및/또는 c-myc, 결장암에서는 ras 및/또는 APC, 전립성암에서는 PSA 및/또는 BRCA 1 및/또는 BRCA2 또는 난소암에서는 BRCA1 및/또는 BRCA2 및/또는 CA125를 포함할 것이다. 다른 바람직한 구체화에서 p53 또는 c-erbB2는 반드시 가장 중요한 것은 아니다.
유방암의 경우에서 적당한 패널은 하기로부터 선택될 것이다:
p53 및 MUC 1과 선택적으로 c-erbB2 및/또는 c-myc, 및/또는 BRCA1 및/또는 BRCA2 및/또는 PSA 및/또는 NY-ESO-1 및/또는 BRC1;
p53 및 c-myc과 선택적으로 c-erbB2 및/또는 MUC1 및/또는 BRCA1 및/또는 BRCA2 및/또는 PSA 및/또는 NY-ESO-1 및/또는 BRC1;
p53 및 BRCA1과 선택적으로 c-erB2 및/또는 MUC 1 및/또는 c-myc 및/또는 BRCA2 및/또는 PSA 및/또는 NY-ESO-1 및/또는 BRC1;
p53 및 BRCA2과 선택적으로 c-erbB2 및/또는 MUC 1 및/또는 c-myc 및/또는 BRCA1 및/또는 PSA 및/또는 NY-ESO-1 및/또는 BRC1;
c-erbB2 및 MUC 1과 선택적으로 p53 및/또는 c-myc, 및/또는 BRCA1 및/또는 BRCA2 및/또는 PSA 및/또는 NY-ESO-1 및/또는 BRC1;
c-erbB2 및 c-myc과 선택적으로 p53 및/또는 MUC1 및/또는 BRCA1 및/또는 BRCA2 및/또는 PSA 및/또는 NY-ESO-1 및/또는 BRC1;
c-erbB2 및 BRCA1과 선택적으로 p53 및/또는 MUC 1 및/또는 c-myc 및/또는 BRCA2 및/또는 PSA 및/또는 NY-ESO-1 및/또는 BRC1;
c-erbB2 및 BRCA2과 선택적으로 p53 및/또는 MUC 1 및/또는 c-myc 및/또는 BRCA1 및/또는 PSA;
p53, c-myc, NY-ESO-1 및 BRCA2.
결장암의 경우에서는 적당한 패널은 하기로부터 실시 예를 위해 선택될 것이다:
p53 및 ras와 선택적으로 c-erbB2 및/또는 APC;
p53 및 APC와 선택적으로 c-erbB2 및/또는 Ras;
Ras 및 APC와 선택적으로 p53 및/또는 c-erbB2
상기 패널은 또한 CEA 또는 CA19-9를 포함할 것이다.
전립선암의 경우에서는 적당한 패널은 하기로부터 실시 예를 위해 선택될 것이다:
p53 및 PSA와 선택적으로 BRCA1 및/또는 BRCA2 및/또는 c-erbB2;
c-erbB2 and PSA와 선택적으로 p53 및/또는 BRCA1 및/또는 BRCA2;
PSMA, PSCA 및 칼리크레인(kallikreins).
난소암의 경우에서는 적당한 패널은 하기로부터 실시 예를 위해 선택될 것이다:
p53 및 CA125와 선택적으로 c-erbB2 및/또는 BRCA1 및/또는 BRCA2;
c-erbB2 및 CA125와 선택적으로 p53 및/또는 BRCA1 및/또는 BRCA2;
HER2, 아넥신(annexins), CAGE 및 4-5.
폐암의 경우에서는 적당한 패널은 하기로부터 선택될 것이다:
p53 및 NY-ESO-1, 선택적으로 추가의 표지들;
HER2, 아넥신, CAGE 및4-5.
본 발명의 방법이 상이한 단백질로부터 유래된 두 개 또는 그 이상의 종양 표지 항원에 기반한 "패널 분석"을 수행하기 위해 사용되는 데 있어서, 패널의 항원의 적어도 하나는 적정 곡선을 형성하기 위한 다중의 상이한 양의 항원의 검사에 기초한 본 발명에 따라 분석에서 검사되어야 한다. 바람직하게는 패널을 형성하는 각각의 항원은 본 발명의 분석 및 패널의 각각의 개별적인 항원에 대해 그리거나/연산된 적정 곡선에 따라 검사된다.
발명은 또한 동일한 환자 시료에서 적어도 하나의 항-종양 표지 항체의 검출을 위한 적정 분석이 적어도 하나의 종양 표지 단백질(적정 분석에서 사용된 항원과 관련 또는 관련되지 않을 것인)을 검출하기 위해 설계된 분석과 공동으로 사용될 것을 계획한다. 그러므로 항-종양 표지 자가항체에 대한 분석 및 종양 표지 단백질에 대한 분석은 단일 환자 시료에서 병행하여 수행될 것이다.
추가의 구체화에서, 본 발명의 면역 분석 방법은 특정 환자에서 사용되기 위한 항-종양 백신의 선택에 사용될 것이다. 상기 구체화에서 상기 환자로부터 수득한 체액의 시료는 상이한 종양 표지 단백질의 각각에 대한 환자의 면역 반응의 상대적 강도를 결정하기 위하여 각각 상이한 종양 표지 단백질에 대응하는 두 개 또는 그 이상의 항원의 패널을 이용하여 검사된다. 주어진 종양 표지 단백질 또는 단백질들에 대한 "면역 반응의 강도"는 면역분석을 이용하여 검출된 종양 표지 단백질에 특이적인 종양-관련 자가항체의 존재 및/또는 양에 의해 지시된다; 자가항체는 정량됨에 있어서, 종양-관련 자가-항체의 더 큰 수준은 더 강한 면역 반응으로. 환자에서 가장 강한 면역 반응 또는 강한 반응을 유도하는 것(즉, 자가항체의 가장 높은 수준)으로 확인된 종양 표지 단백질 또는 단백질들은 그 다음에 상기 환자에서 사용된 항-종양 백신의 기초를 형성하기 위해 선택된다.
본 발명의 방법의 유용은 비록 분석이 항-종양 자가항체의 검출 목적에 유용할지라도, 이에 제한되지 않는다. 종양은 자가항체의 검출이 질병 상태/질병 감수성에 대한 생물학적 표지로써 사용되는 질병의 예시 중의 하나에 불과하다. 본 발명자들은 환자 시료에서 자가항체 검출을 위해 적정 시도의 이용이 상당한 이점이 있는 것을 나타내었다. 그러므로 유사한 이점이 종양이 아닌 질환에 생물학적 표지인 자가항체를 검출하기 위한 적정 시도의 이용에 의해 얻을 수 있는 것으로 결론짓는 것이 정당하다. 그러므로 방법은 자가항체 생성과 관련된 나타낸(또는 나타내질 수 없는) 어떠한 질병에서 질병 상태 또는 질병 감수성에 대한 생물학적 표지로서 이용될 수 있는 어떠한 자가항체의 검출에 적당하다.
본 발명의 방법의 다른 적용은 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 류마티스 관절염, 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematous, SLE), 원발성 담즙성 간경변증(primary biliary cirrhosis, PBC), 자가면역 갑상선염[autoimmune thyroiditis; 예를 들면 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis)], 자가면역 위염[autoimmune gastritis; 예를 들면 악성 빈혈(pernicious anaemia)], 자가면역 부신염[autoimmune adrenalitis; 예를 들면 애디슨병(Addison's disease)], 자가면역 부갑상선기능저하증(autoimmune hypoparathyroidism), 자가면역 당뇨병[autoimmune diabetes; 예를 들면 유형 1 당뇨병(Type 1 diabetes)] 또는 중증근무력증(myasthenia gravis) 등과 같은 자가 면역 질병의 생물학적 표지인 자가항체의 검출 및 신장 또는 간장 기관의 기능 부전 또는 쇠약을 유도하는 각 기관의 환자 시료의 선발, 및 질환 조직(인-시츄 이식이 남아 있는) 또는 이식된 조직에 집중된 항체의 존재의 검출을 위한 이식 후 환자 시료의 선발을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 포유동물 개체으로부터 수득한 체액을 포함하는 검체 시료에서 항체를 확인하는 방법에 관한 것으로, 상기 항체는 상기 포유동물 개체에 주입된 외부 기질에 집중되는 것을 특징으로 하는,
(a) 상기 검체 시료와 상기 항체에 특이적으로 결합하는 다수의 상이한 양의 항원을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 항체 및 상기 항원 사이의 특이적 결합의 양을 검출하는 단계;
(c) 단계 (a)에서 사용된 각각의 항원의 양에 대하여, 상기 항원의 양에 대한 특이적 결합의 양의 곡선을 그리거나 또는 연산하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 상기 구체화에서 상기 방법은 단계 (d)로써 사용된 각각 상이한 항원 농도에서 상기 항체 및 상기 항원 사이의 특이적 결합의 양, 바꾸어 말하면 특정 항원에 대해 관찰된 집합적인 수치에 근거한 상기 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 분석에서 사용된 항원과 반응성인 항체의 검체 시료 내의 존재는 일반적으로 S-자형 또는 시그모이달 곡선에 의해 지시된다.
본 발명의 상기 측면에서, 적정 방법론은 포유동물 개체, 바람직하게는 인간 개체에 주입된 모든 외부 기질에 대한 상기 개체의 면역반응의 평가를 위해 사용될 것이다.
하나의 구체화에서 외부 기질은 예를 들면 약제 또는 프로드러그(prodrug), 인간 항체 요법 또는 백신과 같은 치료제일 것이다. 본 발명의 방법은 환자에게 치료제의 투약이 치료제의 에피토프 또는 치료제와 함께 투약된 전달체, 부형제, 운반체 등에 특이적인 항체의 생성을 유도하는 면역 반응을 촉진할 지 여부를 평가하기 위하여 사용될 것이다.
치료제의 정확한 특성은 본 발명에 제한되지 않는다. 제한되지 않은 구체화에서, 본 발명의 방법은 선택적으로 부형제, 운반체 또는 전달체와 조합된 합성 소 분자, 자연 발생 기질, 자연 발생 또는 합성 생성된 생물학적 약품, 또는 두 개 또는 그 이상의 앞서 기술된 것들의 조합물에 대한 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 것이다.
하나의 유용한 구체화에서 본 발명의 방법은 치료제 또는 백신의 비-표적 부위에 대한 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 것이다. "비-표적 부위"는 치료제의 경우 치료 활성에 직접적으로 공헌하지 않고 또는 백신의 경우 숙주에서 항체의 생성을 촉진하지 않는 투약된 치료제 또는 백신의 조성 일부를 의미한다. "비-표적 부위"는 예를 들면 치료제 또는 백신의 정제를 위해 존재할 것이고, 치료제/백신의 전달, 섭취 또는 표적화 돕기 위하여 설계될 것이다. 상기 비-표적 부위의 예로는 바이오틴 표지, 히스티딘 태그 등과 같은 재조합으로 발현된 폴리펩티드에 일반적으로 부착된 링커 또는 표지 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 구체화에서, 외부 기질은 진균류, 박테리아, 바이러스 또는 기생충과 같은 전염성 병원체일 것이다.
본 발명은 하기 제한되지 않은 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다:
실시예
1 자가항체 분석에서 항원의 적정을 위한 일반적인 프로토콜
(바이오틴화된) 종양 표지 항원의 시료는 하기 WO 99/58978에 기술된 것과 유사한 방법으로 재조합 발현에 의해 제조될 것이다.
간략하게, 관심 표지 항원을 코딩하는 cDNA는 발현 단백질의 정제용 바이오틴 태그와 6x히스티딘 태그를 암호화하도록 변형된 pET21벡터(Invitrogen)에 클로닝 되었다. 수득한 클론은 적당한 박테리아 숙주 세포에서 배양되었고(봉입체에서), 박테리아는 용해 및 변성되었고, 발현된 항원은 Nickel 킬레이트 친화도 컬럼(Hi-trap, Amersham, 제조업자의 프로토콜을 따름)에 의해 회수되었다. 발현된 항원은 적당한 완충용액에서 투석에 의해 재생되었고, 발현된 단백질의 수율은 SDS-PAGE, 웨스턴 블랏 및 ELISA에 의해 평가되었고 저장에 앞서 정량 분석되었다.
음성 대조군 VOL은 His 및 바이오틴 태그 서열은 포함하는 공벡터이다(즉, cDNA가 클로닝 되지 않았음).
많은 표지 cDNA의 GenBank accession number는 하기와 같다:
P53: B003596
c-myc: V00568
ECD6 (HER2) 세포외 도메인(extracellular domain): M11730
NY-ESO: NM_001327
BRCA2: U43746
BRCA1 delta 9-10: NM_007302
1. 항원 및 VOL(음성 대조군)은 0.1 M 카모네이트 완충용액에 적당한 농도로 희석되었고, 이후 세미-로그 적정 범위를 형성하기 위해 연속적으로 희석되었다(표 1 참조). 항원 희석물은 전자 멀티-채널 파이펫을 이용하여 플레이트 배치에 따라 Falcon 마이크로타이터 플레이트의 열에 50 ㎕/웰로 분주되었다. 플레이트를 덮은 후, 4℃에서 48시간 동안 저장하였다
2. 플레이트를 자동 플레이트 세척기를 이용하여 PBS + 0.1% tween 20으로 한번 세척하였고, 티슈 페이퍼 위에서 가볍게 두들겨서 건조하였다.
3. 플레이트를 한 시간 동안 또는 사용하기 전(4℃에서 덮은 후 저장)까지 200 ㎕/웰 고염 인큐베이션 완충용액(HSB, PBS + 0.5M NaCl + 0.1% casein)으로 차단하였다.
4. 혈청 시료를 녹인 후, 볼텍싱하였고 실온에서 HSB으로 1/100으로 희석하였다.
5. 플레이트를 비운 후, 티슈페이퍼 위에서 가볍게 두들겨서 건조하였다. 각각 희석된 혈청 시료는 전자 멀티-채널 파이펫을 이용하여 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 50 ㎕/웰 씩 분주되었다. 대조군 항체는 HSB에 1/1000으로 희석되었고, 최종 플레이트의 적당한 웰에 분주되었다. 플레이트를 덮은 후, 교반하면서 실온에서 1.5 시간 동안 인큐베이션 하였다.
6. 세척 단계: 플레이트를 자동 플레이트 세척기를 이용하여 PBS + 0.1% tween 20으로 세번 세척하였고, 티슈페이퍼 위에서 가볍게 두들겨서 건조하였다.
7. 양고추냉이과산화효소 결합된 래빗 항-인간 Ig[Horseradish peroxidise(HRP) conjugated rabbit anti-human Ig; Jackson, 1/10,000 in HSB]를 마이크로타이터 플레이트의 모든 웰에 50 ㎕/웰로 분주하였다. HRP-결합된 래빗 항-인간 Ig(1/1000 in HSB)를 항-항원 항체를 포함하는 대조군 웰에 분주하였다. 플레이트를 교반하면서 한 시간 동안 실온에서 인큐베이션 하였다.
8. 플레이트를 단계 6에서처럼 세척하였다.
9. 사전-준비된 TMB기질을 50 ㎕/웰로 첨가하였고, 플레이트를 10분 동안 벤치 위에서 인큐베이션하였다. 섞어주기 위하여 플레이트를 천천히 가볍게 두드렸다.
10. 웰의 광학 밀도(Optical density)는 표준 플레이트 리더 프로토콜을 이용하여 650 ㎚에서 결정되었다.
| P53 플레이트 | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | p53 10 ㎍/㎖ | c-myc 10 ㎍/㎖ | NY-ESO 10 ㎍/㎖ | VOL 10 ㎍/㎖ | ||||||||
| B | p53 3 ㎍/㎖ | c-myc 3 ㎍/㎖ | NY-ESO 3 ㎍/㎖ | VOL 3 ㎍/㎖ | ||||||||
| C | p53 1 ㎍/㎖ | c-myc 1 ㎍/㎖ | NY-ESO 1 ㎍/㎖ | VOL 1 ㎍/㎖ | ||||||||
| D | p53 0.3 ㎍/㎖ | c-myc 0.3 ㎍/㎖ | NY-ESO 0.3 ㎍/㎖ | VOL 0.3 ㎍/㎖ | ||||||||
| E | p53 0.1 ㎍/㎖ | c-myc 0.1 ㎍/㎖ | NY-ESO 0.1 ㎍/㎖ | VOL 0.1 ㎍/㎖ | ||||||||
| F | p53 0.03 ㎍/㎖ | c-myc 0.03 ㎍/㎖ | NY-ESO 0.03 ㎍/㎖ | VOL 0.03 ㎍/㎖ | ||||||||
| G | p53 0.01 ㎍/㎖ | c-myc 0.01 ㎍/㎖ | NY-ESO 0.01 ㎍/㎖ | VOL 0.01 ㎍/㎖ | ||||||||
| H | 카보네이트 완충용액 | 카보네이트 완충용액 | 카보네이트 완충용액 | 카보네이트 완충용액 | ||||||||
| BRCA 플레이트 | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | BRCA1 10 ㎍/㎖ | BRCA2 10 ㎍/㎖ | ECD-6 10 ㎍/㎖ | VOL 10 ㎍/㎖ | ||||||||
| B | BRCA1 3 ㎍/㎖ | BRCA2 3 ㎍/㎖ | ECD-6 3 ㎍/㎖ | VOL 3 ㎍/㎖ | ||||||||
| C | BRCA1 1 ㎍/㎖ | BRCA2 1 ㎍/㎖ | ECD-6 1 ㎍/㎖ | VOL 1 ㎍/㎖ | ||||||||
| D | BRCA1 0.3 ㎍/㎖ | BRCA2 0.3 ㎍/㎖ | ECD-6 0.3 ㎍/㎖ | VOL 0.3 ㎍/㎖ | ||||||||
| E | BRCA1 0.1 ㎍/㎖ | BRCA2 0.1 ㎍/㎖ | ECD-6 0.1 ㎍/㎖ | VOL 0.1 ㎍/㎖ | ||||||||
| F | BRCA1 0.03 ㎍/㎖ | BRCA2 0.03 ㎍/㎖ | ECD-6 0.03 ㎍/㎖ | VOL 0.03 ㎍/㎖ | ||||||||
| G | BRCA1 0.01 ㎍/㎖ | BRCA2 0.01 ㎍/㎖ | ECD-6 0.01 ㎍/㎖ | VOL 0.01 ㎍/㎖ | ||||||||
| H | 카보네이트 완충용액 | 카보네이트 완충용액 | 카보네이트 완충용액 | 카보네이트 완충용액 | ||||||||
실시예
2 원발성 유방암에서 자가항체의 검출
하기 데이터는 원발성 유방암(primary breast cancer; PBC)에서 적정 자가항체 분석의 패널의 감수성 및 재현성을 평가하기 위한 사전 조사에서 수득되었다. 상기 조사는 종양의 증거가 없는 17 명의 여성으로부터 수득한 혈청 및 원발성 유방암에 걸린 20 명의 여성으로부터 수득한 사전-수술된 혈청 시료를 포함한다. 정상 및 종양 시료는 나이를 맞춰주었다. 하나의 정상 및 세 개의 종양 시료는 항-바이오틴 항체 반응 증거를 나타냈고 그래서 본 형식의 분석을 이용하여 평가될 수 없기 때문에 조사로부터 제거되어야 했다. 대략 10%의 개체군은 바이오틴에 대한 면역 반응을 발생하는 것으로 여겨졌다.
분석은 항원 p53, c-myc, NY-ESO-1 및 BRCA2을 이용한 실시예 1에서 주어진 프로토콜에 따라 수행되었다.
도 1은 항원 적정 분석이 혈청에서 p53 자가항체를 측정하기 위해 사용되었을 때 수득한 곡선의 예를 나타낸다. 종양 환자의 혈청 17766(C)이 검사 항원(p53)에 시그모이달 곡선의 형태로 강하게 결합하지만 음성 대조군 VOL에는 결합하지 않는 것을 볼 수 있었다. 대조적으로, 정상 개체의 혈청, 18052(N)은 검사 항원 또는 음성 대조군과의 결합에 대한 적정 곡선을 나타내지 않는다.
자가항체 수준은 검사 항원과의 결합에 기인하는 광학밀도(650 ㎚)에서 음성 대조군(VOL)과의 결합에 기인하는 광학밀도를 뺀 값으로 표시되었다. 정상 컷-오프는 정상 그룹의 95번째 백분위수(평균 + 2 표준 편차)로써 연산되었다. 상기는 도 2에서 점선으로 나타내었고 정상 개체에서 항-p53 자가항체 수준이 종양 환자와 비교되었다. 종양 그룹이 일반적으로 높은 자가항체 수준을 나타내고 또한 컷-오프 상위의 수준으로 개체가 보다 큰 부분을 차지하는 것을 볼 수 있다.
패널은 네 개의 항원; p53, c-myc, NY-ESO-1 및 BRCA2으로 구성되었다. 개체 분석의 감수성은 원발성 유방암(63%)의 검출에서 네 개의 항원의 패널의 결합된 감수성과 함께 표 2에 주어졌다.
| p53 | c-myc | NY-ESO-1 | BRCA2 | 패널 |
| 6/17 (35%) | 5/17 (29%) | 4/17 (24%) | 4/17 (24%) | 63% |
네 개의 상이한 항원에 대한 자가항체가 측정되었고, 패널의 조합된 감수성이 연산되었다. 컷-오프 수준은 정상 시료 세트의 평균 + 2 표준 편차로써 연산되었다. 항-바이오틴 항체 반응을 갖는 개체는 평가되지 않아서 제외되었다.
적정 자가항체 분석을 이용하여 수득한 측정이 재현성이 있는지 여부를 평가하기 위하여, 분리된 3일에 분석이 수행되었고, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 모든 세 개의 결과가 일치할 경우 분석이 재현성이 있는 것으로 여겨졌다. 정상 혈청에서 수행된 측정의 재현성은 94%(15/16)이었고, 유방암 시료에서는 88%(14/16)이었다.
분석은 분리된 3일(Runs A, B 및 C)에 원발성 유방암 환자(PBC) 또는 정상 대조군으로부터 수득한 혈청 시료에서 수행되었다. 컷-오프 수준은 정상 시료 세트의 평균 + 2 표준 편차로써 실험일에 따라 연산되었다. AB는 항-바이오틴 항체 반응의 증거를 보여서, 본 분석 형식에 의해 평가될 수 없는 개체를 나타낸다. 모든 세 개의 결과가 일치하면, 분석이 재현성있는 것으로 여겨졌다. 정상 개체의 재현성은 94%(15/16)이었고, PBC 환자는 88%(14/16)이었다.
실시예 3 폐암에서 자가항체의 검출
사전 폐암 조사(10 정상인 및 9 폐암 혈장)에서 2 개의 항원(p53 및 NY-ESO)에 대한 자가항체 반응의 분석은 78%의 검출 율을 나타내었다(도 3).
분석은 혈청 대신에 혈장 시료를 사용한 것 외에는 실시예 1의 일반적인 프로토콜에 따라 수행되었다.
양성 환자 시료는 도 1에 나타난 것과 유사한 시그모이달 적정 곡선을 보였다. 도 3은 항원 적정 분석을 사용하여 측정된 정상 개체 및 폐암 환자에서 p53 및 NY-ESO 자가항체 수준의 비교결과를 나타낸다. 정상 컷-오프는 정상 개체군의 평균 + 2 표준 편차로써 연산되었다.
실시예
4 추가 적정 곡선
하기 추가 적정 곡선은 실시예 1에서 기술된 일반적인 방법론에 기초한 분석에서 모두 생성되었다. 상기 결과는 적정 곡선 시도가 상이한 유형의 체액 및 상이한 질병에서(상이한 유형의 종양으로 예시된) 다양한 상이한 항원의 검출에 적용될 것임을 지시하고, 또한 "진" 및 "오류" 양성 결과 사이의 구별에 있어서 발명의 방법의 이점을 나타낸다.
도 4는 유방암 환자로부터 수득한 복수액의 시료에서 p53 및 NY-ESO에 대한 자가항체의 검출용 적정 곡선을 나타낸다.
도 5는 유방암(유관 상피내암) 환자로부터 수득한 혈청 시료에서 BRCA1, BRCA2 및 HER2에 대한 자가항체의 검출용 적정 곡선을 나타낸다.
도 6은 폐암 환자로부터 수득한 혈청 시료에서 NY-ESO에 대한 자가항체의 검출용 적정 곡선을 나타낸다. 상기 환자는 검사결과 p53 또는 c-myc 자가항체를 생산하지 않는 것으로 나타났다.
도 7은 폐암 환자로부터 수득한 혈청 시료에서 NY-ESO 및 p53에 대한 자가항체의 검출용 적정 곡선을 나타낸다. 상기 환자는 검사결과 c-myc에 대한 자가항체를 생산하지 않는 것으로 나타났다.
도 8(a) 및 8(b)는 "정상" 개체(즉, 종양의 증거가 없는 개체)으로부터 수득한 혈청 시료에서 p53, c-myc 및 NY-ESO-1에 대한 자가항체에 대한 두 개의 독립적인 적정 분석 결과를 나타내었다. 도 8(a)에서 나타낸 분석에서 평평한 선은 항원의 증가하는 양과 함께 관찰되었고, 혈청 시료가 검사된 모든 항원에 대한 자가항체를 포함하지 않는 것을 지시하였다. 동일한 환자의 혈청 시료의 두 번째 분배물이 동일한 분석 방법론을 사용하여 다시 검사되었을 때, 분석은 도 8(b)에서 나타난 예외의 결과를 생성하지 못했다. 증가하는 항원의 양의 특성을 갖는 적정 곡선의 부재는 상기가 진양성보다는 오히려 예외의 결과임을 지시한다. 상기 시료가 단일의 고정된 항원의 양을 이용한 단일 지점 분석으로 검사되었다면, "가양성" 결과로서 나타났을 것이다. 그러므로 상기 결과는 진양성 및 "가양성" 결과 사이의 구별에서 적정 곡선 시도의 이점을 나타낸다.
도 9(a) 및 9(b)는 일련의 상이한 항원을 사용하여 침윤성 유방암(invasive breast cancer) 환자 한 명으로부터 수득한 혈청 시료에서 수행된 두 개의 독립된 적정 분석의 결과를 나타낸다. 상기 특정 환자는 NY-ESO-1, HER2 및 BRCA2에 대한 자가항체를 나타낸다. 각각의 양성 항원에 대해서, 양성 분석 결과는 항원 농도 증가에 따라 증가하는 신호강도 즉, 적정 신호에 의해 지시되었다.
도 10(a) 및 10(b)는 항-바이오틴 반응 및 특이 항원(즉, 종양 표지)에 대한 "진" 자가항체 사이의 구별에서 본 발명의 유용성을 나타낸다. 상기 분석에서 임상학적으로 정상인 인간 실험 대상의 혈청 시료는 바이오틴 표지 된 항원 BRCA2, HER2, c-myc 및 NY-ESO-1, 바이오틴이 표지 되지 않은 BRCA1 및 바이오틴 태그를 제외한 추가의 항원을 코딩하지 않는 "공" 벡터 VOL의 대조군 발현 산물을 이용하여 자가항체의 존재여부에 대해 검사되었다. 검사된 개체는 바이오틴 표지 된 항원과 효과적으로 바이오틴만 있는 공 벡터 VOL 모두에 대해 적정 반응을 나타내었으나, 바이오틴 표지 되지 않은 항원 BRCA1에 대해선 반응이 없었고, 이는 바이오틴 표지 된 표지와의 "양성" 결과는 사실은 상기 개체에서 항-바이오틴 항체의 존재에 기인한 것임을 지시한다.
실시예 5 단일 지점 측정과 비교한 항원 적정 분석의 감수성 및 특이성의 분석
자가항체(AAb) 측정은 원발성 유방암(PBC) 환자 100명의 여성 및 종양 질환의 증거가 없는 80명의 여성을 대상으로 적정 방법 및 단일 농도 항원(10 ㎎/㎖)에서의 측정을 이용하여 수행되었다. 두 방법의 직접적인 비교를 나타내는 표는 하기에 나타난다:
항원 적정 곡선에서 여러 지점을 이용함으로써 단일 지점 측정과 비교하여 높은 감수성 및 특이성 모두를 수득할 수 있는 것으로 보여진다.
실시예 6 항원 적정 분석에서 높은 감수성 및 특이성이 가능한 잠재적 이유
이론에 얽매이지 않더라도, 실시자들은 항원이 적정 되는 분석에서 높은 특이성 및 감수성이 관찰되는 데에는 많은 이유가 있음을 간주한다.
(i) 도 11은 다양한 농도에서 p53, c-myc 및 NY-ESO-1 항원을 이용한 유방암 환자의 혈청의 AAb 분석 결과를 나타낸다. 상기 결과는 어떤 경우에는 적정 곡선이 고 항원 수준(NY-ES0-1 곡선)에 속하는 것을 증명한다. 상기는 면역화학에서 일반적으로 관찰되는 현상이다. 만일 10 ㎍/㎖에서의 단일 지점 측정이 사용되었다면, 사실 상의 분명한 양성 반응이 있을 때 상기 환자는 NY-ESO-1 자가항체에 관하여 음성으로 분류될 것이다.
(ii) 도 12는 적정된 p53, c-myc 및 NY-ESO-1 항원을 이용한 정상 개체의 혈청 분석 결과를 나타낸다. 상기 도는 항원 측정의 기본선(상기 경우에서는 p53)이 음성 대조군(VOL)의 그것의 위의 수준으로 이동되는 실시자들이 분석의 대략 10%에서 관찰한 영향을 증명한다. 상기는 부정하게 높은 기록을 생성한다. 상기 유형의 결과는 적정 분석에 의해 쉽게 인지될 수 있으나 단일 지점 분석의 세트에서는 구분되지 않을 것이다. 상기는 상기 가양성 결과에 기인한 감소된 감수성의 결과를 가져왔다(표 5 참조).
(iii) 실시예 4에서 논의된 바와 같이, 적정 AAb 분석에서 사용된 항원은 단백질의 정제에서 사용될 수 있는 바이오틴 태그를 포함한다. 그러나 개체군의 대략 10%가 비타민인 바이오틴에 반응하는 항체를 생성하는 것으로 알려졌다. 도 13은 PBC 환자에서 항-바이오틴 반응을 증명하였다. 상기 반응은 음성 대조군, VOL(역시 바이오틴으로 표지 된)에 대한 강한 항체 반응으로써 적정 곡선을 사용하여 명확하게 확인될 수 있다. 상기 개체는 상기 형식의 분석에서 평가불가로 간주되어야 한다. 그러나 만약 단일 지점 분석을 사용하였다면, 항-바이오틴 반응은 진짜 반응과 구별될 수 없다.
실시예
7 혈청 적정과 비교하여 항원 적정의
증가된
감수성의 증명
AAb 측정은 두 개의 완전히 분리된 실험에서 두 개의 방식으로 수행되었다. 첫 번째는 10 ㎍/㎖에서 0.01 ㎍/㎖으로 세미-로그 적정된 항원으로 코팅된 플레이트에서 표준 형식을 이용한 것이다. 차단 후, 혈청을 100 대 1로 희석하여 첨가하였다. 두 번째는 플레이트를 3 ㎍/㎖의 농도의 항원으로 코팅하였고, 차단 후, 혈청을 10에 1 에서 10,000에 1로 희석하여 세미-로그 적정 범위로 첨가하였다. 분석의 나머지 방법은 동일하였다. p53 및 c-myc에 양성으로 알려진 혈청의 두 개의 풀(pools)은 PBC 여성 환자의 8개의 혈청 및 정상 개체의 10개의 혈청으로 분석되었다. 결과는 하기 표 6에 나타났다.
항원의 적정을 포함하는 분석 형식이 혈청의 적정을 포함하는 형식보다 더욱 민감한 것으로 볼 수 있다. 강한 확실성인 시료들은 양쪽의 양식에서 모두 검출되었으나, 항원 적정 분석에서의 약한 확실성은 혈청 적정 분석에서는 일반적으로 검출되지 않았다.
혈청 적정 형식에 의해 증명된 낮은 감수성은 고농도 혈청의 고유의 비-특이적 결합에 기인한다. 상기는 정상 시료에서조차 단백질 결합 수준을 야기시키고(도 14 참조), 감수성의 수반되는 감소에 의해 정상 컷-오프 수치를 증가시킨다. 특이성은 또한 항원 적정 형식(BRCA2 = 100%)과 비교하여 혈청 적정 양식(BRCA2 = 90%)에서 감소하였다.
도 15는 원발성 유방암에 걸린 환자의 혈청을 이용하여 도 4에서 나타낸 실험을 반영한다. 상기 환자는 p53 및 c-myc에 대한 자가-항체에 양성인 것으로 밝혀졌으나, 본 발명의 항원 적정 방법이 사용될 때에는 BRCA2에 대한 자가-항체에 음성이었다. 그러나 자가-항체가 혈청 적정 범위에서 측정되었을 때, 자가-항체는 검출되지 않았다(표 6 참조). 상기는 특이 자가-항체 결합에 기인한 신호를 가리는 고농도 혈청[음성 대조군 단백질(VOL)에 대한 고수준의 결합에 의해 증명된]에 의해 존재한 비-특이적 결합에 기인한다. 결과는 혈청 적정에 의한 분석은 원발성 유방암 환자를 음성으로 명시할 수 있다는 것이다. 감수성 = 진양성/진양성+음성오류가기 때문에, 상기는 분모의 증가의 효과를 가지고 따라서 감수성을 감소시킨다.
요약하면, 실시자들은 항원 적정 자가항체 분석이 단일 항원 농도에서 측정된 자가항체 반응성 보다 더욱 민감하고 명확한 것을 나타내었다. 상기는 항원 적정이 고농도 항체뿐만 아니라 고농도 항원에서, 그렇지 않으면 고농도 항원에서 걸리거나, 적정 곡선 아래에서 최대로 추가 결합하는 낮은 존재량, 낮은 친화도의 항체를 검출하기 위한 유효범위를 제공하기 때문이다. 또한 단일 지점 측정으로는 가능하지 않은 진짜 결과로부터 평가불가 분석의 식별을 가능하게 한다. 높은 수준의 비특이적 결합이 정상 컷-오프 수준을 올려서 의하여 감수성을 감소시키는 고농도 혈청에서 관찰되었기 때문에 혈청의 단순한 적정보다 항원 적정 AAb 분석이 더욱 민감한 것으로 여겨진다.
Claims (47)
- (a) 항체에 특이적인 다수의 상이한 양의 항원을 검체 시료에 접촉시키는 단계;(b) 상기 항체 및 상기 항원 사이의 특이적 결합의 양을 검출하는 단계;(c) 단계 (a)에서 사용된 각각의 항원의 양에 대하여, 상기 항원의 양에 대한 특이적 결합의 양의 곡선을 그리거나 또는 연산하는 단계; 및,(d) 사용된 각각 상이한 항원 농도에서 상기 항체 및 상기 항원 사이의 특이적 결합의 양에 근거하여 상기 질병 상태 또는 질병 감수성의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 항체가 질병 상태 또는 질병 감수성의 생물학적 표지인 것을 특징으로 하는, 포유동물 개체의 체액을 포함하는 검체 시료에서 항체를 검출하는 단계를 포함하는 포유동물 개체에서 질병 상태 또는 질병 감수성을 확인하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 질병 상태 또는 질병 감수성의 존재여부는 검사된 모든 항원 농도에 대해서 특이적 결합의 양의 집합적인 수치에 근거하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 질병 상태 또는 질병 감수성의 존재여부는 일반적으로 S자형 또는 시그모이달 곡선의 존재에 대해 단계 (c)의 도면을 선발함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 전술한 모든 청구항에 있어서, 항체는 종양 표지 단백질에 특이적인 자가항체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 항원은 종양 표지 단백질 또는 항원성 단편 또는 이의 에피토프인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 종양 표지 단백질은 MUC1, MUC16, c-myc, EGRF, p53, ras, BRCA1, BRCA2, APC, HER2, PSA, CEA, CA19.9, NY-ESO-1, 4-5, CAGE, PSMA, PSCA, EpCam, 싸이토케라틴(cytokeratin), 리커버린(recoverin), 칼리크레인(kallikrein), 아넥신(annexin), AFP, GRP78, CA125, 맘모글로빈(mammoglobin) 또는 raf인 것을 특징으로 하는 방법.
- 암의 진단, 예후 또는 감시를 위한 제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 항의 방법의 용도.
- 암 발병의 위험이 증가되는 무증상 인간 개체를 확인하기 위한 무증상 인간 개체의 개체군 선발에 있어서의 제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 항의 방법의 용도로서, 상기 방법을 이용하여 검사될 시료는 상기 개체로부터 수득한 체액의 시료이고, 정상 대조군 개체와 비교하여 자가항체의 수준이 증가된 개체는 암 발병의 위험이 있는 것으로 확인되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 무증상 인간 개체에서 초기 종양 또는 초기 발암성 변화의 검출에 있어서의 제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 항의 방법의 용도로서, 상기 방법을 이용하여 검사될 시료는 상기 개체로부터 수득한 체액의 시료이고, 정상 대조군 개체와 비교하여 자가항체의 증가된 수준의 존재는 상기 개체에서 초기 종양 또는 초기 발암성 변화의 지표가 있는 것으로 여겨지는 것을 특징으로 하는 용도.
- 암이 발병된 무증상 인간 개체를 확인하기 위한 무증상 인간 개체의 개체군 선발에 있어서의 제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 항의 방법의 용도로서, 상기 방 법을 이용하여 검사될 시료는 상기 개체로부터 수득한 체액의 시료이고, 정상 대조군 개체와 비교하여 자가항체의 수준이 증가된 개체는 암에 걸린 것으로 진단되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 암이 발병된 증상이 있는 인간 개체를 확인하기 위한 증상이 있는 인간 개체의 개체군 검사에 있어서의 제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 항의 방법의 용도로서, 상기 방법을 이용하여 검사될 시료는 상기 개체로부터 수득한 체액의 시료이고, 정상 대조군 개체와 비교하여 자가항체의 수준이 증가된 개체는 암에 걸린 것으로 진단되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 환자에게서 종양 또는 다른 종양 관련 질병의 진행의 감시에 있어서의 제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 항의 방법의 용도로서, 상기 방법을 이용하여 검사될 시료는 인간 환자로부터 수득한 체액의 시료이고, 정상 대조군과 비교하여 자가항체의 증가된 수준의 존재는 상기 환자에 종양 존재의 지표가 있는 것으로 여겨지는 것을 특징으로 하는 용도.
- 종양에 걸린 것으로 이미 진단된 인간 환자에게서 순환 질병의 검출에 있어 서의 제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 항의 방법의 용도로서, 상기 환자는 종양 존재양의 감소를 위하여 항-종양 치료를 받은 적이 있고, 상기 방법을 이용하여 검사될 시료는 상기 환자로부터 수득한 체액의 시료이고, 정상 대조군과 비교하여 환자에게서 자가항체의 증가된 수준의 존재는 질병이 순환된 지표가 있는 것으로 여겨지는 것을 특징으로 하는 용도.
- 종양으로부터 예후의 평가에 있어서의 제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 항의 방법의 용도로서, 상기 방법을 이용하여 검사될 시료는 인간 환자로부터 수득한 체액의 시료이고, 정상 대조군과 비교하여 자가항체의 증가된 수준의 존재는 그들의 종양으로부터 환자의 예후의 지표가 있는 것으로 여겨지는 것을 특징으로 하는 용도.
- 항-종양 치료에 대한 반응의 예측에 있어서의 제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 항의 방법의 용도로서, 상기 방법을 이용하여 검사될 시료는 인간 환자로부터 수득한 체액의 시료이고, 자가항체의 수준 및 치료의 예상 결과 사이에서 이미 설립된 관계 및 상기 환자의 자가항체 수준의 비교는 환자가 상기 항-종양 치료에 반응할지 여부의 지표를 제공하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 15항에 있어서, 항-종양 치료는 백신접종, 항-성장인자 또는 신호 전달 치료, 방사선 요법, 내분비계 치료, 인간 항체 치료 또는 화학요법인 것을 특징으로 하는 용도.
- 항-종양 치료에 대한 인간 종양 환자의 반응의 감시에 있어서의 제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 항의 방법의 용도로서, 상기 방법을 이용하여 검사될 치료는 환자로부터 수득한 체액의 시료이고, 그리고 치료 후의 자가항체 수준의 변화는 환자가 치료에 반응하였는지 여부의 지표를 나타내는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 17항에 있어서, 치료는 백신접종, 항-성장인자 또는 신호 전달 치료, 방사선 요법, 내분비계 치료, 인간 항체 치료 또는 화학요법이고, 그리고 치료 후의 자가항체 수준의 변화는 환자가 치료에 실제적으로 반응하였는지 여부의 지표를 나타내는 것을 특징으로 하는 용도.
- 특정 인간 환자에게 사용될 항-종양 치료의 선택에 있어서의 제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 항의 방법의 단계 (a) 내지 (c)의 용도로서, 각각의 상이한 종양 표지 단백질에 대한 환자의 면역 반응의 상대적인 강도를 결정하기 위하여 각각의 상이한 종양 표지 단백질에 대응하는 두 개 또는 그 이상의 항원의 패널을 사용하여 수행되고, 종양 표지 단백질 또는 환자에게서 가장 강한 면역 반응 또는 강한 반응을 유도하는 것으로 확인된 단백질은 상기 환자에서 사용되기 위한 항-종양 치료의 기초를 이루기 위하여 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 19항에 있어서, 항-종양 치료는 백신접종이고 종양 표지 단백질 또는 환자에게서 가장 강한 면역 반응 또는 강한 반응을 유도하는 것을 확인된 단백질이 상기 환자에서 사용되기 위한 항-종양 백신의 기초를 이루기 위하여 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1항에 있어서, 항체는 자가면역 질환의 특성을 나타내거나 또는 자가면역 질환과 관련된 자가항체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 21항에 있어서, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematous, SLE), 원발성 담즙성 간경변증(primary biliary cirrhosis, PBC), 자가면역 갑상선염(autoimmune thyroiditis), 하시모토 갑상선 염(Hashimoto's thyroiditis), 자가면역 위염(autoimmune gastritis), 악성 빈혈(pernicious anaemia), 자가면역 부신염(autoimmune adrenalitis), 애디슨병(Addison's disease), 자가면역 부갑상선기능저하증(autoimmune hypoparathyroidism), 자가면역 당뇨병(autoimmune diabetes) 또는 중증근무력증(myasthenia gravis)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 항체는 신장 또는 간장 기관의 기능 부전 또는 쇠약을 유도하는 신장 또는 간장 질환의 특성을 나타내거나 이와 관련된 자가항체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 항체는 포유동물 개체에 이식된 조직에 존재하는 에피토프에 집중되는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 항체에 특이적인 다수의 상이한 양의 항원을 검체 시료에 접촉시키는 단계;(b) 상기 항체 및 상기 항원 사이의 특이적 결합의 양을 검출하는 단계; 및,(c) 단계 (a)에서 사용된 항원의 각각의 양에 대하여, 항원의 양에 대한 상 기 특이적 결합의 양의 곡선을 그리거나 또는 연산하는 단계를 포함하고, 상기 항체는 포유동물 개체에 도입된 외부 기질에 몰리는 것을 특징으로 하는 포유동물 개체의 체액을 포함하는 검체 시료의 항체 검출 방법.
- 제 25항에 있어서, 사용된 각각 상이한 항원 농도에서 상기 항체 및 상기 항원 사이의 특이적 결합의 양에 근거하여 상기 항체의 존재를 검출하는 단계 (d)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 상기 항체의 존재의 검출은 검사된 모든 항원 농도에 대해 특이적 결합의 양의 집합적인 수치에 근거하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25항 내지 제 27항 중의 어느 한 항에 있어서, 검사에 사용된 항원에 민감하게 반응하는 항체의 검체 시료내 존재는 일반적으로 S-자형 또는 시그모이달 곡선에 의해 지시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25항 내지 제 28 항 중의 어느 한 항에 있어서, 포유동물 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25항 내지 제 29 항 중의 어느 한 항에 있어서, 외부 기질은 치료제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 30항에 있어서, 치료제는 약제, 프로드러그(prodrug) 또는 항체 요법인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25항 내지 제 29 항 중의 어느 한 항에 있어서, 외부 기질은 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31항 또는 제 32 항에 있어서, 외부 기질은 치료제 또는 백신의 비-표적 부위인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 33항에 있어서, 비-표적 부위는 바이오틴인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25항 내지 29항에 있어서, 외부 기질은 진균류, 박테리아, 바이러스 또는 기생충과 같은 전염성 병원체인 것을 특징으로 하는 방법.
- a) 항체에 특이적인 다수의 상이한 양의 항원을 검체 시료에 접촉시키는 단계;b) 상기 항체와 상기 항원 사이의 특이적 결합의 양을 검출하는 단계; 및,c) 단계 (a)에서 사용된 항원의 각각의 양에 대하여, 항원의 양에 대한 상기 특이적 결합의 양의 곡선을 그리거나 또는 연산하는 단계를 포함하고, 상기 항체는 질병 상태 또는 질병 감수성의 생물학적 표지인 것을 특징으로 하는 포유동물 개체의 체액을 포함하는 검체 시료에서의 항체 검출 방법.
- 제 36항에 있어서, 분석에 사용된 항원에 민감하게 반응하는 항체의 검체 시료내 존재는 일반적으로 S-자형 또는 시그모이달 곡선에 의해 지시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 36항 또는 제 37항에 있어서, 항체는 종양 표지 단백질에 특이적인 자가항체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 36항 내지 제 38항에 있어서, 항원은 종양 표지 단백질 또는 항원 단편 또는 이의 에피토프인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 39항에 있어서, 종양 표지 단백질은 MUC1, MUC16, c-myc, EGRF, p53, ras, BRCA1, BRCA2, APC, HER2, PSA, CEA, CA19.9, NY-ESO-1, 4-5, CAGE, PSMA, PSCA, EpCam, 싸이토케라틴(cytokeratin), 리커버린(recoverin), 칼리크레인(kallikrein), 아넥신(annexin), AFP, GRP78, CA125, 맘모글로빈(mammoglobin) 또는 raf인 것을 특징으로 하는 방법.
- 종양의 진단, 예후 또는 감시를 위한 제 36항 내지 제 40항 중의 어느 한 항의 방법의 용도.
- 제 8항 내지 제 20항 중의 어느 한 항에 의해 확인된 모든 용도를 위한 제 36항 내지 제 40항 중의 어느 한 항의 방법의 용도.
- 제 36항에 있어서, 항체는 자가면역 질환의 특성을 나타내고 또는 이와 관련된 자가항체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 36항에 있어서, 자가항체는 기관의 기능 부전 또는 쇠약을 유도하는 질환의 특성을 나타내거나 또는 이와 관련된 자가항체인 것을 특징으로 하는 방법
- 제 44항에 있어서, 질환은 신장 또는 간장 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 36항에 있어서, 항체는 포유동물 개체에 이식된 조직에 존재하는 에피토프에 집중되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 36항 내지 제 46항 중의 어느 한 항에 있어서, 항원은 자연 발생 단백질 또는 폴리펩티드, 재조합 단백질 또는 폴리뉴클레오티드, 합성 단백질 또는 폴리펩티드, 합성 펩티드, 펩티드 유사 유도체, 다당류 또는 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
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| KR20170088437A (ko) * | 2009-10-26 | 2017-08-01 | 네스텍 소시에테아노님 | 항-ｔｎｆ 약물 및 자가항체의 검출을 위한 검정법 |
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