ES2328171T3

ES2328171T3 - Metodos de inmunoensayo mejorados.

Info

Publication number: ES2328171T3
Application number: ES06744011T
Authority: ES
Inventors: John Forsyth Russell Robertson; Tony Barnes; Andrea Murray; Caroline Chapman
Original assignee: Oncimmune Ltd
Current assignee: Oncimmune Ltd
Priority date: 2005-05-27
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2009-11-10
Anticipated expiration: 2026-05-26
Also published as: EP2275815B1; ES2458105T3; WO2006126008A3; PL2073008T3; SI2073008T1; PT2275815E; CA2609793C; PL1889059T3; DK2073008T3; GB0510943D0; EP1889059A2; EP1889059B1; CA2609793A1; DK2275815T3; WO2006126008A2; CN102749447B; GB2426581A; AU2006250923B2; DE602006007703D1; MX2007014815A

Abstract

Un método para detectar una patología o susceptibilidad a enfermedad en un sujeto mamífero que comprende detectar un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende un líquido corporal de dicho sujeto mamífero, en el que dicho anticuerpo es un autoanticuerpo que es un marcador biológico de una patología o susceptibilidad a enfermedad, comprendiendo el método: (a) poner en contacto dicha muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antígeno específico para dicho anticuerpo, (b) detectar la cantidad de unión específica entre dicho anticuerpo y dicho antígeno, (c) representar o calcular una curva de la cantidad de dicha unión específica frente a la cantidad de antígeno para cada cantidad de antígeno usado en la etapa (a) y (d) determinar la presencia o ausencia de dicha patología o susceptibilidad a enfermedad basándose en la cantidad de unión especifica entre dicho anticuerpo y dicho antígeno a cada concentración diferente de antígeno usada, en el que la presencia o ausencia de dicha patología o susceptibilidad a enfermedad se determina explorando la representación de la etapa (c) para la presencia de una curva generalmente con forma de S o sigmoidea.

Description

Métodos de inmunoensayo mejorados.

Campo de la invención

La invención se refiere generalmente al campo de ensayos de diagnóstico o pronóstico y, en particular, se refiere a la optimización de ensayos para la detección de anticuerpos en una muestra que comprende líquido corporal de paciente, donde tales anticuerpos se usan como marcadores biológicos de una patología o susceptibilidad a enfermedad.

Antecedentes de la invención

Muchos ensayos de diagnóstico, pronóstico y/o control dependen de la detección de un marcador biológico de una patología o susceptibilidad a enfermedad particular. Tales marcadores biológicos son de forma común proteínas o polipéptidos que son característicos de una enfermedad particular o están asociados con susceptibilidad a enfermedad.

En años recientes ha sido evidente que los anticuerpos y, en particular, autoanticuerpos, también pueden servir como marcadores biológicos de enfermedad o susceptibilidad a enfermedad. Los autoanticuerpos son anticuerpos de origen natural dirigidos contra un antígeno que el sistema inmune de un individuo reconoce como extraño incluso aunque ese antígeno en realidad se ha originado en el individuo. Pueden estar presentes en la circulación como autoanticuerpos libres circulantes o en forma de inmunocomplejos circulantes que consisten en autoanticuerpos unidos a su proteína marcadora diana. Las diferencias entre una proteína de tipo silvestre expresada por células "normales" y una forma alterada de la proteína producida por una célula enferma o durante un proceso patológico, en algunos casos, pueden conducir a que la proteína alterada se reconozca por el sistema inmune de un individuo como "no propia" y, por tanto, que provoque una respuesta inmune en ese individuo. Esta puede ser una respuesta inmune humoral (es decir, mediada por células B) que conduce a la producción de autoanticuerpos inmunológicamente específicos para la proteína alterada.

El documento WO 99/58978 describe métodos para el uso en la detección/diagnóstico de cáncer que están basados en la evaluación de la respuesta inmune de un individuo a dos o más marcadores tumorales distintos. Estos métodos implican generalmente poner en contacto una muestra de líquido corporal tomada del individuo con un panel de dos o más antígenos de marcador tumoral distintos, obtenidos cada uno de una proteína marcadora tumoral separada y detectar la formación de complejos de los antígenos de marcador tumoral unidos a autoanticuerpos circulantes inmunológicamente específicos para las proteínas marcadoras de tumor. La presencia de tales autoanticuerpos circulantes se toma como una indicación de la presencia de cáncer.

Los ensayos que miden la respuesta inmune del individuo a la presencia de proteína marcadora de tumor en términos de producción de autoanticuerpos proporcionan una alternativa a la medición directa o la detección de proteína marcadora de tumor en líquidos corporales. Tales ensayos constituyen esencialmente la detección indirecta de la presencia de proteína marcadora de tumor. Debido a la naturaleza de la respuesta inmune, es probable que los autoanticuerpos se puedan obtener por una cantidad muy pequeña de proteína marcadora de tumor circulante y por consiguiente, los métodos indirectos que dependen de la detección de la respuesta inmune a marcadores tumorales serán más sensibles que métodos para la medición directa de marcadores tumorales en líquidos corporales. Por lo tanto, los métodos de ensayo basados en la detección de autoanticuerpos pueden ser de valor particular de forma precoz en el proceso patológico, y también, posiblemente en relación a la exploración de pacientes asintomáticos, por ejemplo, durante la exploración para identificar individuos "en riesgo" de desarrollar enfermedad frente a una población de individuos asintomáticos, para identificar individuos que han desarrollado una enfermedad frente a una población de individuos asintomáticos. Adicionalmente, el método basado en la detección de autoanticuerpos puede ser de valor particular de forma precoz en el proceso patológico y, posiblemente, también se puede usar para identificar individuos que han desarrollado una enfermedad frente a una población de individuos sintomáticos. Además, pueden ser útiles para la detección más temprana de enfermedad recurrente. Los métodos de ensayo también pueden ser valiosos para seleccionar o controlar terapias para una enfermedad.

Los anticuerpos y autoanticuerpos también pueden servir como marcadores biológicos de otras patologías o susceptibilidades a enfermedad, de los que artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), cirrosis biliar primaria (PBC), tiroiditis autoinmune (por ejemplo, tiroiditis de Hashimoto), gastritis autoinmune (por ejemplo, anemia perniciosa), adrenalitis autoinmune (por ejemplo, enfermedad de Addison), hipoparatiroidismo autoinmune, diabetes autoinmune (por ejemplo, diabetes de Tipo 1), miastenia grave solamente son ejemplos.

Los presentes inventores han reconocido que cuando se usan ensayos basados en la detección de anticuerpos de forma diagnóstica o de forma pronóstica para evaluar la patología, la progresión de la enfermedad o la susceptibilidad a enfermedad de un individuo dentro de una población, pueden surgir dificultades al elaborar una metodología de ensayo normalizada apropiada para toda la población de sujetos a explorar debido a que las cantidades absolutas de anticuerpo presente varían espectacularmente de individuo a individuo. Esto puede producir una alta incidencia de resultados negativos falsos, por ejemplo, entre individuos que tienen una baja cantidad de anticuerpos. De forma similar, existe una dificultad en la puntuación de resultados positivos verdaderos debido a que la variación en las cantidades absolutas de anticuerpo de individuo a individuo significa que es difícil ajustar un umbral para un resultado de ensayo positivo que sea apropiado para todos los individuos dentro de la población explorada.

Ahora, los presentes inventores han determinado que el rendimiento y, más específicamente, la utilidad clínica y la fiabilidad de los ensayos basados en la detección de anticuerpos, particularmente autoanticuerpos, como marcadores biológicos de enfermedad se pueden mejorar espectacularmente mediante la inclusión de una etapa de titulación de antígeno. Ensayando la muestra de la que se sospecha que contiene anticuerpos frente a una serie de diferentes cantidades de antígeno y construyendo una curva de titulación es posible identificar de forma fiable resultados de exploración positivos verdaderos independientemente de la cantidad absoluta de anticuerpo presente en la muestra. Una estrategia de este tipo es contraria a métodos de la técnica anterior, que titulan antígeno meramente para construir una curva de calibración para permitir la identificación de la concentración de antígeno más apropiada a usar para detectar anticuerpos en muestras de paciente reales. En estos métodos se propone solamente una medición de un solo punto para el diagnóstico real. Por tanto, estos métodos no permitirán variación en las cantidades del anticuerpo a detectar de individuo a individuo, dando como resultado la incidencia de falsos positivos y falsos negativos, como se ha analizado. Los presentes inventores han observado que el método de titulación de antígenos de la invención que se analiza en este documento tiene una mayor especificidad y sensibilidad que la medición de reactividad de autoanticuerpo en una única concentración de antígeno o métodos en los que se titula la muestra de suero en vez del antígeno.

Sumario de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar una patología o susceptibilidad a enfermedad en un sujeto mamífero que comprende detectar un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende un líquido corporal de dicho sujeto mamífero, en el que dicho anticuerpo es un marcador biológico de una patología o susceptibilidad a enfermedad, comprendiendo el método:

(a): poner en contacto dicha muestra de ensayo con una pluralidad de diferentes cantidades de un antígeno específico para dicho anticuerpo,

(b): detectar la cantidad de unión específica entre dicho anticuerpo y dicho antígeno,

(c): representar o calcular una curva de la cantidad de dicha unión específica frente a la cantidad de antígeno para cada cantidad de antígeno usada en la etapa (a) y

(d): determinar la presencia o ausencia de dicha patología o susceptibilidad a enfermedad basándose en la cantidad de unión específica entre dicho anticuerpo y dicho antígeno en cada concentración de antígeno diferente usada.

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De acuerdo con un segundo aspecto de la invención se proporciona un método para detectar un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende un líquido corporal de un sujeto mamífero, en el que dicho anticuerpo se dirige contra una sustancia extraña introducida en dicho sujeto mamífero, comprendiendo el método:

(a): poner en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de diferentes cantidades de un antígeno específico para dicho anticuerpo,

(b): detectar la cantidad de unión específica entre dicho anticuerpo y dicho antígeno y

(c): representar o calcular una curva de la cantidad de dicha unión específica frente a la cantidad de antígeno para cada cantidad de antígeno usada en la etapa (a).

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De acuerdo con un tercer aspecto de la invención se proporciona un método para detectar un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende un líquido corporal de un sujeto mamífero en el que dicho anticuerpo es un marcador biológico de una patología o susceptibilidad a enfermedad, comprendiendo el método:

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En todos los aspectos de la invención, el sujeto mamífero preferiblemente es un ser humano.

En todos los aspectos de la invención, el método se realiza preferiblemente in vitro en una muestra de ensayo que comprende un líquido corporal obtenido o preparado a partir del sujeto mamífero.

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Una característica particular de la invención en todos sus aspectos es que la decisión de si el anticuerpo relevante está o no presente en la muestra de ensayo se basa en la cantidad de unión especifica observada a cada concentración de antígeno diferente ensayada, en otras palabras, los valores colectivos, en vez de solamente una lectura a una única concentración. Por tanto, la determinación de la presencia o ausencia de patología o susceptibilidad a enfermedad o anticuerpos contra una sustancia extraña en una muestra de paciente puede realizarse basándose directamente en estos valores colectivos. Preferiblemente, la decisión se realiza basándose en la representación de una curva generalmente con forma de S o sigmoidea cuando la cantidad de unión específica se representa frente a la cantidad de antígeno. Como será evidente a partir de los Ejemplos de este documento, los inventores han observado que los métodos de titulación de antígeno de la invención tienen mayor especificidad y sensibilidad que los métodos de diagnóstico o detección basados en una única lectura y reducen la incidencia de determinaciones de falsos positivos y falsos
negativos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Medición de autoanticuerpos en suero usando una curva de titulación de antígeno. El suero del paciente con cáncer 17766(C) se une fuertemente al antígeno de ensayo con una curva sigmoidea característica (- \blacklozenge -) pero no se une al control negativo, VOL (- \blacksquare -). En comparación, el suero de un individuo normal, 18052(N) no se une al antígeno de ensayo (- \Delta -) o al control negativo (- < -).

Figura 2: Comparación de niveles de autoanticuerpos para p53 en individuos normales y pacientes con cáncer de mama primario (PBC) cuando se mide usando el ensayo de titulación de antígeno. Los niveles de autoanticuerpos se expresan como la DO_{650} debido a la unión del antígeno de ensayo (p53) menos a la debida a la unión al control negativo. El límite normal (- - - -) se calculó como la media más 2 desviaciones típicas de la población normal.

La Figura 3 muestra una comparación de niveles de autoanticuerpos para p53 y NY-ESO en individuos normales y pacientes con cáncer de pulmón cuando se miden usando el ensayo de titulación de antígeno. Los niveles de autoanticuerpos se expresan como la DO_{650} debido a la unión al antígeno de ensayo (p53 o NY-ESO) menos la debida a la unión al control negativo. Los límites normales (- - - -) se calcularon como la media más 2 desviaciones típicas de la población normal.

La Figura 4 muestra una curva de titulación para la detección de autoanticuerpos contra p53 y NY-ESO en una muestra de líquido de ascitis tomada de un paciente con cáncer de mama. Este paciente se ensayó pero se observó que no producía autoanticuerpos contra c-myc.

La Figura 5 muestra una curva de titulación para la detección de autoanticuerpos contra BRCA1, BRCA2 y HER2 en una muestra de suero de un paciente con cáncer de mama (carcinoma ductal in situ).

La Figura 6 muestra una curva de titulación para la detección de autoanticuerpos contra NY-ESO en una muestra de suero de un paciente con cáncer de pulmón. Este paciente se ensayó pero se observó que no producía autoanticuerpos contra p53 o c-myc.

La Figura 7 muestra una curva de titulación para la detección de autoanticuerpos contra NY-ESO y p53 en una muestra de suero de un paciente con cáncer de pulmón. Este paciente se ensayó pero se observó que no producía autoanticuerpos contra c-myc.

Las Figuras 8(a) y 8(b) ilustran los resultados de dos ensayos de titulación independientes para autoanticuerpos contra p53, c-myc y NY-ESO-1 en muestras de suero de un sujeto "normal" (es decir), un individuo sin indicios de cáncer.

Las Figuras 9(a) y 9(b) muestran los resultados de dos ensayos de titulación independientes realizados en muestras de suero de un único paciente con cáncer de mama invasivo usando una variedad de antígenos diferentes.

Las Figuras 10(a) y 10(b) ilustran los resultados de ensayos de titulación en los que muestras de suero de un sujeto humano clínicamente normal se ensayaron para la presencia de autoanticuerpos usando antígenos biotinilados BRCA2, HER2, c-myc y NY-ESO-1, BRCA1 no biotinilado y productos de expresión de control del vector "vacío" VOL, que codifica el marcador de biotina pero ningún antígeno adicional.

La Figura 11 ilustra los resultados de análisis de auto-anticuerpos de un paciente con cáncer de mama primario usando el ensayo de titulación de antígenos de la invención con respecto a los antígenos p53, c-myc y NY-ESO-1 y los productos de expresión de control del vector "vacío" VOL.

La Figura 12 ilustra los resultados de una repetición del ensayo mostrado en la Figura 11, pero con suero de un individuo normal.

La Figura 13 ilustra resultados adicionales obtenidos usando el ensayo de titulación de antígeno de la invención en un paciente con cáncer de mama primario pero que también muestra una respuesta de anticuerpo a biotina.

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La Figura 14 ilustra los resultados de comparación experimental en muestras normales entre un ensayo de detección de auto-anticuerpo cuando el antígeno se titula de acuerdo con la invención y un ensayo de detección de auto-anticuerpos en el que la cantidad de antígeno permanece constante pero se titula el suero.

La Figura 15 ilustra los resultados de una comparación experimental, en una muestra de un paciente con cáncer de mama primario, entre un ensayo de detección de auto-anticuerpos cuando el antígeno se titula de acuerdo con la invención y un ensayo de detección de auto-anticuerpos cuando la cantidad de antígeno permanece constante pero se titula el suero.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona en general un método de inmunoensayo para detectar un anticuerpo que sirve como un marcador biológico para una patología o susceptibilidad a enfermedad, caracterizado por que una muestra a ensayar para la presencia del anticuerpo se ensaya para la unión específica frente a diferentes cantidades de antígeno específico para el anticuerpo y una curva de titulación producida para unión de anticuerpo/antígeno frente a la cantidad de antígeno ensayado.

Las características generales de inmunoensayos, por ejemplo, ELISA, radioinmunoensayos y similares, se conocen bien por los especialistas en la técnica (véase, Immunoassay E. Diamandis y T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996). Los inmunoensayos para la detección de anticuerpos que tienen una especificidad inmunológica particular requieren generalmente el uso de un reactivo (antígeno) que muestra reactividad inmunológica específica con el anticuerpo en ensayo. Dependiendo del formato del ensayo, este antígeno se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. Una muestra a ensayar para la presencia del anticuerpo se pone en contacto con el antígeno y si están presentes anticuerpos con la especificidad inmunológica requerida en la muestra, reaccionarán inmunológicamente con el antígeno para formar complejos de anticuerpo-antígeno que después se pueden detectar o medir cuantita-
tivamente.

El método de la invención se caracteriza por que una muestra normalizada a ensayar para la presencia del anticuerpo se ensaya frente a una pluralidad de diferentes cantidades de antígeno (también denominadas en este documento una serie de titulación). La muestra se ensaya frente a al menos dos y preferiblemente al menos tres, cuatro, cinco, seis o siete cantidades diferentes del antígeno. Los ensayos típicos también pueden incluir un control negativo que no contiene ningún antígeno.

En este contexto, el término "antígeno" se refiere a una sustancia que comprende al menos un determinante antigénico o epítope capaz de interaccionar específicamente con el anticuerpo diana que se desea detectar o cualquier agente de captura que interaccione específicamente con la región variable o las regiones determinantes de complementariedad de dicho anticuerpo. El antígeno será típicamente una macromolécula biológica de origen natural o sintética tal como, por ejemplo, una proteína o un péptido, un polisacárido o un ácido nucleico y puede incluir anticuerpos o fragmentos de los mismos, tales como anticuerpos anti-idiotipo.

Los especialistas entenderán que en el método de la invención, la cantidad de determinantes antigénicos o epítopes disponibles para la unión al anticuerpo diana es importante para establecer una serie de titulación. En muchos formatos de ensayo, la cantidad de determinantes antigénicos o epítopes disponible para la unión está correlacionada directamente con la cantidad de moléculas de antígeno presente. Sin embargo, en otras realizaciones, tales como determinados sistemas de ensayo en fase sólida, la cantidad de determinantes antigénicos o epítopes expuestos puede no correlacionarse directamente con la cantidad de antígeno, sino que puede depender de otros factores, tales como unión a la superficie sólida. En estas realizaciones, se puede suponer que las referencias en este documento a "diferentes cantidades de antígeno" en una serie de titulación se refieren a diferentes cantidades del determinante antigénico o epítope.

La cantidad relativa o absoluta de unión específica entre anticuerpo y antígeno se determina para cada cantidad diferente de antígeno (determinante antigénico o epítope) usada y se usa para representar o calcular una curva de la cantidad (relativa o absoluta) de unión específica frente a la cantidad de antígeno para cada cantidad de antígeno ensayada. Se ilustran los resultados típicos, solamente a modo de ejemplo, en las Figuras adjuntas para detección de varios anticuerpos diferentes. La presencia en la muestra de ensayo de anticuerpo reactivo con el antígeno usado en el ensayo se determina basándose en la cantidad de unión específica observada a cada cantidad de antígeno y se indica generalmente por una curva generalmente con forma de S o sigmoidea. Las cantidades absolutas de unión específica entre anticuerpo y antígeno generalmente no son materiales, a menos que se desee producir una medición cuantitativa. Para una determinación simple de sí/no de la presencia o ausencia de anticuerpos es suficiente que solamente se produzca una curva con la forma correcta. Si no existe variación en la unión detectable a lo largo de las diferentes cantidades de antígeno ensayado, entonces esto se puede puntuar como una ausencia de una cantidad detectable del anticuerpo. En realizaciones preferidas de la invención, el método es no cuantitativo. Por tanto, puede dar una determinación de sí/no de presencia o ausencia de anticuerpo usando una relación proporcional adimensional que es independiente de la intensidad de señal.

Una medida de la cantidad de anticuerpo presente en una muestra particular, si se desea, se puede obtener de los resultados de los ensayos de titulación de antígeno.

El método de la invención es ventajoso para el uso en ensayos de diagnóstico, pronóstico, predictivos y/o de control en los que las cantidades absolutas de anticuerpo diana presente pueden variar de forma enorme de paciente a paciente. Los inventores han observado que si tales ensayos están basados en la detección de unión a anticuerpo usando una única cantidad/concentración de antígeno de ensayo, las muestras de paciente que contienen una cantidad de anticuerpo que están en el extremo inferior o superior del intervalo fisiológico normal de cantidad de anticuerpo a lo largo de la población se pueden omitir debido a limitaciones de la metodología de ensayo; las muestras con una cantidad baja de anticuerpo se pueden puntuar como resultados negativos falsos, mientras que aquellos con niveles muy altos de anticuerpo pueden estar fuera de la escala para la detección precisa dentro de la metodología de ensayo elegida.

El método de ensayo de titulación de la invención también es particularmente adecuado para la detección de anticuerpos/autoanticuerpos como marcadores biológicos de patología o susceptibilidad donde existe variación considerable de paciente a paciente en la especificidad y afinidad de los anticuerpos/autoanticuerpos para antígeno diana. Las respuestas de autoanticuerpos por su propia naturaleza pueden variar significativamente de paciente a paciente, teniendo lugar variación tanto en las cantidades absolutas de autoanticuerpo presente como en la especificidad/afinidad de los anticuerpos. El método de la invención puede tener en cuenta esta variación de paciente a paciente, permitiendo de este modo que se desarrolle un formato de ensayo convencional para cualquier anticuerpo/autoanticuerpo dado.

Las interacciones entre autoanticuerpos y sus antígenos diana tienen generalmente baja afinidad, pero la intensidad de la unión puede variar de paciente a paciente, como se ha resumido anteriormente. El método de la invención es particularmente adecuado para la detección de unión de baja afinidad, ya que un resultado positivo se puede inferir de la forma de la curva de titulación.

El método de la invención también proporciona una defensa contra variación de día a día en el rendimiento de inmunoensayos usados para la detección de autoanticuerpos/anticuerpos para propósitos de diagnóstico, pronóstico y/o control (patología o terapia). Se observa frecuentemente que puede haber una variación considerable de día a día en la intensidad de la señal cuando se realizan inmunoensayos para la detección de anticuerpos en muestras que comprenden líquidos corporales del paciente. Tal variación puede surgir, por ejemplo, debido a diferencias en el modo del que se obtuvieron y almacenaron las muestras antes del ensayo. Tales factores dificultan puntuar los resultados de ensayos clínicos con certeza, por ejemplo, basándose en un único valor umbral de unión de anticuerpo/antígeno. La presente invención minimiza los efectos de tal variación de día a día ya que un resultado positivo para la presencia de anticuerpo es claramente evidente a partir de la forma de la curva de titulación, independientemente de la intensidad de señal.

Otras ventajas adicionales más del método de la invención son que permite la dilución de la muestra del paciente, aunque todavía produce resultados uniformes y también que producirá generalmente el mismo resultado de exploración cualitativo (positivo/negativo) usando líquidos corporales de diferentes fuentes en un individuo (por ejemplo, sangre o suero frente a líquido de ascitis o efusión pleural), incluso aunque la concentración absoluta de anticuerpos puede ser diferente en los diferentes líquidos.

El método de la invención se puede realizar en cualquier formato adecuado que permite el contacto entre una muestra de la que se sospecha que contiene el anticuerpo y múltiples cantidades diferentes de un antígeno. De forma práctica, el contacto entre la muestra y diferentes cantidades del antígeno puede tener lugar en cámaras de reacción separadas pero paralelas tales como los pocillos de una placa de microtitulación. Se pueden aplicar como recubrimiento cantidades variables del antígeno sobre los pocillos de la placa de microtitulación preparando diluciones seriadas de una solución madre de antígeno a lo largo de los pocillos de la placa de microtitulación. La solución madre de antígeno puede tener concentración conocida o desconocida. Después se pueden añadir alícuotas de la muestra de ensayo a los pocillos de la placa, manteniéndose constante el volumen y la dilución de la muestra del ensayo en cada pocillo. Las cantidades absolutas de antígeno añadido a los pocillos de la placa de microtitulación pueden variar dependiendo de tales factores como la naturaleza del anticuerpo diana, la naturaleza de la muestra en ensayo, la dilución de la muestra de ensayo, etc., como se entenderá por los especialistas en la técnica. Generalmente, las cantidades de antígeno y la dilución de la muestra de ensayo se seleccionará para producir una variedad de intensidad de señal que entra dentro del intervalo de detección aceptable de la lectura elegida para la detección de la unión de anticuerpo/antígeno en el método. Las cantidades y las diluciones típicas para el ensayo de muestras de suero humano de las que se sospecha que contienen autoanticuerpos anti-marcador tumoral se proporcionan en los ejemplos adjuntos. De forma práctica, las cantidades ensayadas de antígeno pueden variar en el intervalo de 0,01 \mug/ml a 10 \mug/ml.

Como se ha mencionado anteriormente, también es posible construir una curva de titulación comenzando con una única solución madre de antígeno incluso aunque la concentración absoluta de antígeno en la solución madre sea desconocida. Suponiendo que se use la misma solución madre única y se diluya de forma seriada de la misma manera, es posible comparar los resultados de ensayos de titulación separados para este procesamiento de antígeno en muestras de ensayo de partida diferentes.

En una realización adicional, diferentes cantidades del antígeno (determinantes antigénicos o epítopos) se pueden inmovilizar en localizaciones o sitios de reacción separados sobre un soporte sólido. Después, todo el soporte se puede poner en contacto con la muestra de ensayo y la unión del anticuerpo al antígeno se puede detectar o medir por separado en cada una de las localizaciones o sitios de reacción separados. Los soportes sólidos adecuados también incluyen micromatrices, por ejemplo, matrices en las que los sitios o puntos separados sobre la matriz comprenden diferentes cantidades del antígeno. Se pueden preparar micromatrices inmovilizando diferentes cantidades de un antígeno particular en sitios de reacción discretos, que se pueden separar sobre la matriz. En otras realizaciones, la cantidad real de las moléculas de antígeno inmovilizado se puede mantener sustancialmente constante, pero el tamaño de los sitios o puntos sobre la matriz se puede variar para alterar la cantidad de epítopo de unión disponible, proporcionando una serie de titulación de sitios o puntos con cantidades diferentes de epítopo de unión disponible. En tales realizaciones, la concentración superficial bidimensional del epítopo o los epítopos de unión en el antígeno es importante para preparar la serie de titulación, más que la cantidad absoluta del antígeno. En la técnica se conocen generalmente técnicas para la preparación y lectura de datos de micromatrices de proteína/péptido.

A partir de la anterior discusión se entenderá que en todas las realizaciones de la invención se puede conseguir variación en la cantidad de antígeno cambiando la densidad de antígeno o epítope frente a la que se ensaya en la muestra o manteniendo la densidad de antígeno o epítope pero aumentando el área superficial sobre la que se inmoviliza el antígeno, o ambos.

Se pueden usar micromatrices para realizar ensayos múltiples para anticuerpos con diferente especificidad en una única muestra en paralelo. Esto se puede realizar usando matrices que comprenden múltiples conjuntos de diferentes antígenos, comprendiendo cada conjunto un antígeno particular a cantidades o concentraciones diferentes múltiples. La expresión "antígenos diferentes" incluye antígenos obtenidos de diferentes proteínas o polipéptidos (tales como antígenos obtenidos de proteínas no relacionadas codificadas por diferentes genes) y también antígenos que se obtienen de diferentes epítopos peptídicos de una única proteína o polipéptido. Una micromatriz dada puede incluir exclusivamente conjuntos de diferentes antígenos obtenidos de diferentes proteínas o polipéptidos, o exclusivamente conjuntos de diferentes antígenos obtenidos de diferentes epítopos peptídicos de una única proteína o polipéptido o una mezcla de ambos en cualquier proporción. Se debe señalar que cada conjunto de antígeno individual con cantidades o concentraciones diferentes en cualquier realización de la invención comprenderá generalmente solamente un antígeno y no mezclas de los mismos.

Como se usa en este documento, la expresión "líquido corporal", cuando se refiere al material a ensayar para la presencia de anticuerpos usando el método de la invención, incluye, entre otros, plasma, suero; sangre completa, orina, sudor, linfa, heces, líquido cefalorraquídeo, ascitis, efusión pleural, líquido seminal, esputo, aspirado de pezón, seroma post-quirúrgico o líquido de drenaje de heridas. Como se ha mencionado anteriormente, los métodos de la invención se realizan preferiblemente in vitro en una muestra de ensayo que comprende líquido corporal retirado del sujeto de ensayo. El tipo de líquido corporal usado puede variar dependiendo de la identidad del anticuerpo a ensayar y la situación clínica en la que se usa el ensayo. En general, se prefiere realizar los ensayos sobre muestras de suero o plasma. La muestra de ensayo puede incluir componentes adicionales además del líquido corporal, tales como, por ejemplo, diluyentes, conservantes, agentes estabilizantes, tampones, etc.

El término "antígeno" se usa en este documento en un sentido amplio para referirse a cualquier sustancia que muestre reactividad inmunológica específica con un anticuerpo diana a detectar. Los antígenos adecuados pueden incluir, pero sin limitación, proteínas de origen natural, proteínas o polipéptidos recombinantes o sintéticos, péptidos sintéticos, peptidomiméticos, etc., también polisacáridos y ácidos nucleicos. Específicamente, cuando "antígeno" se usa en este documento tiene por objeto incluir cualquier agente de captura, de origen humano, de origen mamífero u otro, susceptible a interacción inmunológica específica con las regiones variables o determinantes de complementariedad del antígeno a detectar. Por ejemplo, los anticuerpos anti-idiotípicos se pueden considerar un antígeno para este propósito, al igual que los antígenos generados por presentación en fagos.

Determinados antígenos pueden comprender o se pueden obtener de proteínas o polipéptidos aislados de fuentes naturales, que incluyen, pero sin limitación, proteínas o polipéptidos aislados de tejidos o líquidos corporales del paciente. En tales realizaciones, el antígeno puede comprender sustancialmente toda la proteína de origen natural, es decir, proteína sustancialmente en la forma en la que se aísla de la fuente natural, o puede comprender un fragmento de la proteína de origen natural. Para ser tan eficaz como un antígeno en el método de la invención, cualquiera de tales "fragmentos" tiene que conservar reactividad inmunológica con los anticuerpos para los que se usará para el ensayo. Los fragmentos adecuados se pueden preparar, por ejemplo, mediante escisión química o enzimática de la proteína aislada.

Dependiendo de la naturaleza precisa del ensayo en el que se usará, el antígeno puede comprender una proteína de origen natural, o un fragmento de la misma, unida a una o más moléculas adicionales que imparten alguna característica deseable no presente de forma natural en la proteína. Por ejemplo, la proteína o el fragmento se pueden conjugar con un marcador indicador, tal como, por ejemplo, un marcador fluorescente, marcador coloreado, marcador luminiscente, radiomarcador o metal pesado tal como oro coloidal. En otras realizaciones, la proteína o el fragmento se puede expresar como una proteína de fusión. A modo de ejemplo, las proteínas de fusión pueden incluir un péptido marcador en el extremo N o C para ayudar a la purificación del antígeno expresado de forma recombinante.

Dependiendo del formato del ensayo en el que se tiene que usar, el antígeno se puede inmovilizar sobre un soporte sólido tal como, por ejemplo, los pocillos de una placa de microtitulación, perlas de micromatriz o chips o perlas magnéticas. La inmovilización se puede realizar por adsorción no covalente o unión covalente.

Se puede usar cualquier medio de unión adecuado suponiendo que esto no afecte de forma adversa a la capacidad del antígeno de reaccionar inmunológicamente con el antígeno diana en un alcance significativo.

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La invención no se limita a ensayos en fase sólida, sino que también incluye ensayos que, completamente o en parte, se realizan en fase líquida, por ejemplo, ensayos con perlas en fase de solución.

En una realización, los antígenos se pueden marcar con un ligando que facilitaría la inmovilización, tal como biotina. Después, el antígeno se puede diluir hasta un intervalo de titulación adecuado y después se puede dejar reaccionar con autoanticuerpos en muestras del paciente en solución. Después, los inmunocomplejos resultantes se pueden inmovilizar sobre un soporte sólido por una interacción de ligando-receptor (por ejemplo, biotina-estreptavidina) y el resto del ensayo se puede realizar como se describe a continuación.

Para facilitar la producción de antígenos biotinilados para el uso en los métodos de ensayo de la invención, los ADNc que codifican un antígeno de longitud completa, una versión truncada del mismo o un fragmento antigénico del mismo se pueden expresar como una proteína de fusión marcada con un marcador de proteína o polipéptido al que se puede unir el co-factor biotina por una reacción enzimática. Los vectores para la producción de antígenos biotinilados recombinantes están disponibles en el mercado en varias fuentes.

Como se ilustra en los ejemplos adjuntos, una ventaja adicional del uso de la estrategia de curva de titulación con antígenos biotinilados es que el ensayo es capaz de distinguir entre la unión del componente biotina a anticuerpos anti-biotina y la unión verdadera del antígeno a su anticuerpo afín. Los inventores han observado que un número significativo de la población humana produce de forma natural anticuerpos anti-biotina que pueden conducir a la producción de resultados positivos falsos en ensayos basados en el uso de antígeno biotinilado.

Como se ha mencionado anteriormente, el "inmunoensayo" usado para detectar anticuerpos de acuerdo con la invención se puede basar en técnicas convencionales conocidas en la técnica, con la excepción de que se usan múltiples cantidades de antígeno para crear una curva de titulación. En una realización más preferida, el inmunoensayo puede ser un ELISA. Los ELISA generalmente se conocen bien en la técnica. En un ELISA "indirecto" típico, un antígeno que tiene especificidad por los anticuerpos en ensayo se inmoviliza sobre una superficie sólida (por ejemplo, los pocillos de una placa de ensayo de microtitulación convencional o la superficie de una microperla o una micromatriz) y una muestra que comprende líquido corporal a ensayar para la presencia de anticuerpos se pone en contacto con el antígeno inmovilizado. Cualquier anticuerpo con la especificidad deseada presente en la muestra se unirá al antígeno inmovilizado. Los complejos de anticuerpo/antígeno unidos se pueden detectar después usando cualquier método adecuado. En una realización preferida, se usa un anticuerpo secundario marcado anti-inmunoglobulina humana, que reconoce específicamente un epítopo común a una o más clases de inmunoglobulinas humanas, para detectar los complejos de anticuerpo/antígeno. Típicamente, el anticuerpo secundario será anti-IgG o anti-IgM. El anticuerpo secundario se marca habitualmente con un marcador detectable, típicamente un marcador de enzima tal como, por ejemplo, peroxidasa o fosfatasa alcalina, permitiendo la detección cuantitativa por la adición de un sustrato para la enzima que genera un producto detectable, por ejemplo, un producto coloreado, quimioluminiscente o fluorescente. Se pueden usar otros tipos de marcadores detectables conocidos en la técnica con un efecto equivalente.

La invención se refiere a un método para detectar anticuerpos que son marcadores biológicos de una patología o susceptibilidad a enfermedad. Este aspecto particular de la invención excluye preferiblemente ensayos diseñados para ensayar para anticuerpos producidos como resultado de una exposición a vacuna o protocolo de inmunización, diferente a vacunación con marcadores de cáncer. Por lo tanto, los ensayos de acuerdo con este aspecto de la invención preferiblemente no incluyen ensayos diseñados para ensayar para la presencia de anticuerpos anti-virales o anti-bacterianos después de vacunación/inmunización.

En determinadas realizaciones de la invención, el anticuerpo puede ser un autoanticuerpo. Como se ha indicado anteriormente, el término "Autoanticuerpo" se refiere a un anticuerpo de origen natural dirigido contra un antígeno que el sistema inmune de un individuo reconoce como extraño incluso aunque ese antígeno se ha originado en realidad en el individuo. Los autoanticuerpos incluyen anticuerpos dirigidos contra formas alteradas de proteínas de origen natural producidas por una célula enferma o durante un proceso patológico. La forma alterada de la proteína se origina en el individuo pero puede verse por el sistema inmune del individuo como "no propio" y, por tanto, provocar una respuesta inmune en ese individuo en forma de autoanticuerpos inmunológicamente específicos para la proteína alterada. Tales formas alteradas de una proteína pueden incluir, por ejemplo, mutantes que tengan una secuencia de aminoácidos alterada, opcionalmente acompañados de cambios en estructura secundaria, terciaria o cuaternaria, formas truncadas, variantes de corte y empalme, glicoformas alteradas, etc. En otras realizaciones, el autoanticuerpo se puede dirigir a una proteína que se sobreexpresa en una patología, por ejemplo, como resultado de amplificación génica o regulación de la transcripción anormal. La sobreexpresión de una proteína que no se encuentra de forma normal por células del sistema inmune en cantidades significativas puede desencadenar una respuesta inmune que conduce a producción de autoanticuerpos. En otras realizaciones adicionales, el autoanticuerpo se puede dirigir a una forma fetal de una proteína que se expresa en una patología. Si una proteína fetal que normalmente se expresa solamente en etapas tempranas del desarrollo antes de que el sistema inmune sea funcional se expresa en una patología, la forma fetal se puede reconocer por el sistema inmune como "extraña", desencadenando una respuesta inmune que conduce a producción de autoanticuerpos.

En una realización, el anticuerpo puede ser un autoanticuerpo específico para una proteína marcadora de tumor y más particularmente, un autoanticuerpo anti-tumor "asociado con cáncer".

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La expresión autoanticuerpo anti-tumor "asociado con cáncer" se refiere a un autoanticuerpo que se dirige contra un epítopo presente en formas de proteínas marcadoras de tumor que se expresan preferentemente en la patología del cáncer. La presencia de tales autoanticuerpos es característica de la patología del cáncer o de pre-disposición a cáncer en pacientes asintomáticos.

En aplicaciones preferidas, el método de la invención se usará para detectar la presencia de autoanticuerpos anti-tumor asociados con cáncer en sujetos o pacientes humanos y adoptará más preferiblemente la forma de un inmunoensayo in vitro, realizado en una muestra de ensayo que comprende una muestra de líquido corporal tomado del sujeto/paciente. La muestra de líquido corporal se puede diluir en un tampón adecuado o se puede tratar para almacenamiento a largo plazo o de otro modo antes del ensayo.

Los inmunoensayos in vitro no son invasivos y se pueden repetir tanto como se considere necesario para establecer un perfil de producción de autoanticuerpos en un paciente, antes de la aparición de enfermedad, como en la exploración de individuos "en riesgo" o a lo largo del desarrollo de la enfermedad (analizado más adelante adicionalmente en relación a aplicaciones preferidas del método).

En particular, pero no de forma limitante, las realizaciones de los métodos de la invención pueden comprender inmunoensayos para detectar (simultáneamente) dos o más tipos de autoanticuerpos, que tienen cada uno especificidad por diferentes epítopes en proteínas marcadoras de tumor iguales o relacionadas (por ejemplo, diferentes isoformas o variantes codificadas por un único gen) o por epítopos sobre diferentes proteínas marcadoras de tumor (queriendo decir proteínas codificadas por diferentes genes). Estos métodos implicarán típicamente el uso de un panel de dos o más conjuntos de antígenos, obteniéndose habitualmente cada conjunto de antígenos de una proteína marcadora de tumor diferente (queriendo decir diferente en este contexto proteínas que son los productos de diferentes genes) aunque, como se ha señalado anteriormente, un conjunto de antígenos podría implicar también diferentes epítopes sobre la misma proteína marcadora de tumor. Un conjunto de antígenos se refiere a un único antígeno a ensayar a diferentes cantidades/concentraciones en el método de la invención. Estos métodos, que se pueden denominar en lo sucesivo en este documento "ensayos de panel", utilizan un panel de dos o más conjuntos de antígenos para controlar la respuesta inmune global de un individuo a un tumor u otro cambio carcinógeno/neoplásico. Estos métodos, por tanto, detectan un "perfil" de la respuesta inmune en un individuo dado; indicando qué marcadores tumorales provocan una respuesta inmune que da como resultado producción de autoanticuerpos. El uso de un panel de dos o más antígenos para controlar la producción de autoanticuerpos frente a dos o más marcadores tumorales diferentes generalmente es más sensible que la detección de autoanticuerpos para marcadores únicos y proporciona una frecuencia mucho menor de resultados negativos falsos (véase el documento WO 99/58978 y el documento WO 2004/044590, cuyos contenidos se incorporan en este documento en su totalidad como referencia).

Por lo tanto, en una realización no limitante, la invención proporciona un método para detectar dos o más anticuerpos en una muestra de ensayo que comprende un líquido corporal de un sujeto mamífero en el que al menos uno de dichos anticuerpos es un marcador biológico de una patología o susceptibilidad a patología, comprendiendo el método:

(a): poner en contacto la muestra de ensayo con dos o más conjuntos de antígenos, donde cada uno de dichos conjuntos de antígenos es específico para uno de dichos anticuerpos a detectar en la muestra de ensayo y donde cada conjunto de antígenos comprende una pluralidad de diferentes cantidades de dicho antígeno,

(b): detectar la cantidad de unión específica entre dichos anticuerpos y dichos antígenos y

(c): representar o calcular una curva de la cantidad de dicha unión específica frente a la cantidad de antígeno para cada conjunto de antígenos usado en la etapa (a).

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En una realización, cada uno de dichos dos o más anticuerpos será un marcador biológico de una patología o susceptibilidad a enfermedad, sin embargo, pertenece al alcance de la invención combinar un ensayo de titulación para un antígeno de marcador de enfermedad con un ensayo de titulación para cualquier otro tipo de anticuerpo, que puede ser o no un marcador de enfermedad, en la misma muestra de ensayo.

De cualquier manera, la decisión de si los anticuerpos relevantes están presentes o no en la muestra de ensayo se basa en la cantidad de unión específica observada a cada una de las diferentes concentraciones de antígeno con respecto a cada antígeno diferente en el ensayo, en otras palabras, los valores colectivos para cada antígeno en vez de una lectura a una única concentración para cada antígeno. Por tanto, la determinación de presencia o ausencia de patología o susceptibilidad a enfermedad o anticuerpos para una sustancia extraña en una muestra de paciente basándose en la presencia de dos o más tipos de anticuerpo se puede basar en estos valores colectivos para cada antígeno. Preferiblemente, la decisión se realiza basándose en la representación de una curva generalmente con forma de S o sigmoidea con respecto a cualquiera o todos los antígenos presentes en el ensayo.

Para evitar dudas, los ensayos basados en el uso de un único tipo de antígeno para detectar anticuerpos se pueden denominar en este documento "ensayos de un solo marcador", mientras que los ensayos basados en el uso de un panel de dos o más antígenos se denominan "ensayos de panel".

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El método de la invención se puede adaptar para el uso en la detección de autoanticuerpos para esencialmente cualquier proteína marcadora de tumor para la que se puede preparar un antígeno adecuado, como un ensayo de un solo marcador o como un componente de un ensayo de panel. En particular, el método se puede adaptar para detectar/medir autoanticuerpos para la proteína de receptor de factor de crecimiento epidérmico EGFR (Downward et al (1984) Nature. 307: 521-527; Robertson et al. (2001 Archives of Pathology and Laboratory Medicine 126; 177-81), la glucoproteína MUC1 (Batra, S. K. et al. (1992) Int. J. Pancreatology. 12: 271-283) y las proteínas reguladoras de ciclo celular Myc/de transducción de señal (Blackwood, E. M. et al. (1994) Molecular Biology of the Cell 5: 597-609), p53 (Matlashewski, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 3257-3262; Wolf, D. et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 1887-1893) y ras (o Ras) (Capella, G. et al. (1991) Environ Health Perspectives. 93: 125-131) y también BRCAL (Scully, R. et al. (1997) PNAS 94: 5605-10), BRCA2 (Sharan, S. K. et al. (.1997) Nature. 386: 804-810), APC (Su, L. K. et al. (1993) Cancer Res. 53: 2728-2731; Munemitsu, S. et al. (1995) PNAS 92: 3046-50), CA125 (Nouwen, E. J. et al. (1990) Differentiation. 45: 192-8), PSA (Rosenberg, R. S. et al. (1998) Biochem Biophys Res Commun. 248: 935-939), antígeno carcinoembrionario CEA (Duffy, M. J. (2001) Clin Chem, Apr 47(4): 624-30), CA19.9 (Haga, Y. et al (1989) Clin Biochem (1989) Oct 22(5): 363-8), NY-ESO-1 (antígeno de cáncer/testículo; Chen, Y.-T. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 94: 1914-1918, 1997), PSMA (antígeno de membrana específico de próstata; Israeli, R. S. et al., Cancer Res. 53: 227-230,1993), PSCA (antígeno de células madre de próstata; Reiter, R. E. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 1735-1740, 1998) y EpCam (molécula de adhesión celular epitelial; Szala, S. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 3542-3546, 1990), HER2 (también conocido como c-erbB2 Coussens, L. et al., Science 230: 1132-1139, 1985), CAGE (Jager D, et al., Cancer Res. 1999 Dec 15; 59(24): 6197-204; Mashino K, et al., Br J Cancer. 2001 Sep 1; 85(5): 713-20), citoqueratinas (Moll R, et al., Cell. 1982 Nov; 31(1): 11-24; Braun S, et al., N Engl J Med. 2000; 342: 525-533), recoverina (Maeda A, et al., Cancer Res. 2000 Apr 1; 60(7): 1914-20), calicreinas (Kim H, et al., Br J Cancer 2001; 84: 643-650; Yousef GM, et al., Tumor Biol 2002; 23: 185-192); anexinas (Hudelist G, et al., Breast Cancer Res Treat. 2004 Aug; 86(3): 281-91), \alpha-fetoproteína (Stiller D, et al., Acta Histochem Supl. 1986; 33: 225-31), GRP78 (Block TM, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Jan 18; 102(3): 779-84; Hsu WM, et al., Int J Cancer. 2005 Mar 1; 113(6): 920-7), CA125 (Norum LF, et al., Tumour Biol. 2001 Jul-Aug; 22(4): 223-8; Perey L, et al., Br J Cancer. 1990 Oct; 62(4): 668-70; Devine PL, et al., Anticancer Res. 1992 May-Jun; 12 (3):709-17); mamoglobina, (Zehentner BK, et al., Clin Chem. 2004 Nov; 50(11): 2069-76; Zehentner BK, Carter D. Clin Biochem. 2004 Apr; 37(4): 249-57), raf (Callans LS. et al., Ann Surg Oncol. 1995 Jan; 2(1 ): 38-42; Pratt MA, et al., Mol Cell Biochem. 1998 Dec; 189(1-2): 119-25), gonadotropina coriónica humana beta b-HCG (Ayala AR, et al., Am J Reprod Immunol. 1983 Apr-May; 3(3): 149-51; Gregory JJ Jr, et al., Drugs. 1999 Apr; 57(4): 463-7) o antígeno 4-5 (Krause P, et al., J Immunol Methods. 2003 Dec; 283(1-2): 261-7). Sin embargo, la invención no tiene por objeto limitarse a la detección de autoanticuerpos para estos marcadores tumorales particulares.

Los métodos de ensayo de acuerdo con la invención basados en la detección de autoanticuerpos anti-marcador tumoral (en forma de ensayo de un solo marcador o de panel) se pueden emplear en una diversidad de situaciones clínicas diferentes. En particular, el método se puede usar en la detección o el diagnóstico de cáncer, para evaluar el pronóstico de un paciente al que se ha diagnosticado cáncer, para predecir la respuesta a terapia, para controlar el progreso de cáncer u otra enfermedad neoplásica en un paciente, para detectar cambio neoplásico temprano o carcinógeno temprano en un sujeto humano asintomático, para explorar una población de sujetos humanos asintomáticos para identificar aquellos sujetos que tienen un riesgo aumentado de desarrollar cáncer o para diagnosticar la presencia de cáncer, para predecir la respuesta de un paciente con cáncer a tratamiento anti-canceroso (por ejemplo, vacunación, terapias con factor anti-crecimiento o de transducción de señal, radioterapia, terapia endocrina, terapia con anticuerpos humanos, quimioterapia), para controlar la respuesta de un paciente con cáncer a tratamiento anti-canceroso (por ejemplo, vacunación, terapias con factor anti-crecimiento o de transducción de señal, radioterapia, terapia endocrina, terapia con anticuerpos humanos, quimioterapia), en la detección de enfermedad recurrente en un paciente al que se ha diagnosticado previamente que tiene cáncer que se ha sometido a tratamiento anti-canceroso para reducir la cantidad de cáncer presente o en la selección de una terapia anti-cancerosa (por ejemplo, vacuna, terapias con factor anti-crecimiento o de transducción de señal, radioterapia, terapia endocrina, tratamiento con anticuerpos humanos, quimioterapia) para el uso en un paciente particular.

Los inventores han observado generalmente que los niveles de autoanticuerpos asociados con cáncer muestran una correlación positiva con la patología (véase también el documento WO 99/58979, cuyos contenidos se incorporan en este documento como referencia). Por tanto, cuando el método de la invención se usa en aplicaciones clínicas, los niveles aumentados de autoanticuerpos anti-marcador tumoral, en comparación con controles adecuados, se toman generalmente como una indicación de la patología de cáncer.

Por ejemplo, cuando los inmunoensayos se usan en el diagnóstico de cáncer, la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con individuos de control "normales", se toma como una indicación de que el individuo tiene cáncer. Los individuos de control "normales" preferiblemente serán controles emparejados por edad que no tienen ningún diagnóstico de cáncer basándose en criterios clínicos, de formación de imágenes y/o bioquímicos.

Cuando se usan los inmunoensayos para predecir la respuesta de un paciente con cáncer a tratamiento anti-canceroso (por ejemplo, vacunación, terapias con factor anti-crecimiento o de transducción de señal, radioterapia, terapia endocrina, terapia con anticuerpos humanos, quimioterapia), la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con individuos de control "normales", se puede tomar como una indicación de si el individuo probablemente responderá o no al tratamiento anti-canceroso. Los individuos de control "normales" preferiblemente serán controles emparejados por edad que no tienen ningún diagnóstico de cáncer basándose en criterios clínicos, de formación de imágenes y/o bioquímicos. Para cada uno de los tratamientos que se han enumerado anteriormente, una relación entre el nivel de autoanticuerpos en comparación con controles y el éxito probable del tratamiento se puede establecer por observación del resultado de tal tratamiento en pacientes cuyo estado de autoanticuerpos se controla a lo largo del tratamiento. La relación que se ha establecido previamente se puede usar después para predecir la probabilidad de éxito para cada tratamiento en un paciente dado basándose en la evaluación del estado de autoanticuerpos.

Cuando los inmunoensayos se usan para controlar el progreso de cáncer u otra enfermedad neoplásica en un paciente, la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con un "control normal", se toma como una indicación de la presencia de cáncer en el paciente. El "control normal" pueden ser niveles de autoanticuerpos presentes en individuos de control, preferiblemente emparejados por edad, que no tienen ningún diagnóstico de cáncer basándose en criterios clínicos, de formación de imágenes y/o bioquímicos. Alternativamente, el "control normal" puede ser un nivel "basal" establecido para el paciente particular en ensayo. Por ejemplo, el nivel "basal" puede ser el nivel de autoanticuerpos presentes cuando se realizó el primer diagnóstico de cáncer o un diagnóstico de cáncer recurrente. Cualquier aumento por encima del nivel basal se tomaría como una indicación de que la cantidad de cáncer presente en el paciente ha aumentado, mientras que cualquier disminución por debajo del nivel basal se tomaría como una indicación de que la cantidad de cáncer presente en el paciente ha disminuido. El valor "basal" también puede ser, por ejemplo, el nivel antes de que se comience un nuevo tratamiento. Un cambio en el nivel de autoanticuerpos se tomaría como una indicación de la eficacia de la terapia. La dirección del "cambio" (es decir, aumento frente a disminución) que indica una respuesta positiva a tratamiento dependerá de la naturaleza precisa del tratamiento. Para cualquier tratamiento dado, la dirección del "cambio" en los niveles de autoanticuerpos que indica un resultado positivo se puede determinar de forma sencilla, por ejemplo, controlando los niveles de autoanticuerpos en comparación con otros indicadores clínicos o bioquímicos de respuesta al tratamiento.

Cuando los inmunoensayos se usan para explorar una población de sujetos humanos asintomáticos, esto puede hacerse para identificar aquellos sujetos que tienen un riesgo aumentado de desarrollar cáncer, los individuos que tienen un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con individuos de control "normales", se identifican como "en riesgo" de desarrollar cáncer. Los individuos de control "normales" preferiblemente serán controles emparejados por edad no identificados como que tienen ninguna predisposición a desarrollar cáncer o cualquier riesgo significativamente elevado de desarrollar cáncer. Una excepción a esto puede ser cuando la propia edad es un factor de riesgo importante.

Cuando los inmunoensayos se usan para explorar una población de sujetos humanos asintomáticos, esto puede hacerse para diagnosticar cáncer en aquellos sujetos que ya han desarrollado un cáncer, puntuándose individuos que tienen un nivel elevado de autoanticuerpos en comparación con individuos de control "normales" como que tienen cáncer o alguna forma de cambio neoplásico. Los individuos de control "normales" preferiblemente serán controles emparejados por edad no identificados como que tienen ninguna predisposición a desarrollar cáncer o cualquier riesgo significativamente elevado de desarrollar cáncer. Una excepción a esto puede ser cuando la propia edad es un factor de riesgo importante. Alternativamente, el "control normal" puede ser un nivel "basal" establecido para el paciente particular en ensayo. Por ejemplo, el nivel "basal" puede ser el nivel de autoanticuerpos presente cuando el paciente se ensayó por primera vez y se observó que tenía niveles no elevados por encima de una población "de control normal". Cualquier aumento después de esto frente a esta medición basal se tomaría como una indicación de la presencia de cáncer en ese individuo. Por tanto, el individuo, por un ensayo basal de este tipo, podría obtener su propio control para una medición futura de autoanticuerpos.

Cuando los inmunoensayos se usan para controlar la respuesta de un paciente con cáncer a tratamiento anti-canceroso (por ejemplo, vacunación, terapias con factor anti-crecimiento o transducción de señal, radioterapia, terapia endocrina, terapia con anticuerpos humanos, quimioterapia), la presencia de un nivel alterado de autoanticuerpos después del tratamiento se toma como una indicación de que el paciente ha respondido positivamente al tratamiento. Un nivel basal de autoanticuerpos tomado antes de que se comience el tratamiento se puede usar con propósitos de comparación para determinar si el tratamiento da como resultado un "aumento o disminución" de los niveles de autoanticuerpos. Un cambio en el nivel de autoanticuerpos se tomaría como una indicación de la eficacia de la terapia. La dirección del "cambio" (es decir, aumento frente a disminución) que indica una respuesta positiva al tratamiento dependerá de la naturaleza precisa del tratamiento. Para cualquier tratamiento dado, la dirección del "cambio" en los niveles de autoanticuerpos que indican un resultado positivo se puede determinar fácilmente, por ejemplo, controlando los niveles de autoanticuerpos en comparación con otros indicadores clínicos o bioquímicos de respuesta al tratamiento.

El método de la invención se puede usar para predecir y/o controlar la respuesta de un individuo a esencialmente cualquier tratamiento anti-canceroso conocido. Esto incluye, por ejemplo, terapia con anticuerpos humanos en la que los anticuerpos monoclonales o policlonales se infunden en el paciente, siendo un ejemplo específico no limitante el tratamiento con el anticuerpo anti-factor de crecimiento Herceptin^{TM} (Baselga, J., D. Tripathy et al., J Clin Oncol., 14(3), 737-744, 1996). La presencia de una respuesta de autoanticuerpos natural puede mejorar o inhibir la eficacia del tratamiento con anticuerpos terapéuticos infundidos de forma artificial. Mediante el uso del método de la invención es posible correlacionar la respuesta a cualquier tratamiento anti-canceroso, incluyendo terapia con anticuerpos, con niveles naturales de autoanticuerpos antes de y a lo largo del ciclo del tratamiento en cualquier paciente o grupos de pacientes. Después, este conocimiento se puede usar, a su vez, para predecir cómo responderán otros pacientes (o el mismo paciente en el caso de tratamiento repetido) al mismo tratamiento.

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Cuando los inmunoensayos se usan para detección de enfermedad recurrente, la presencia de un nivel aumentado de autoanticuerpos en el paciente, en comparación con un "control normal", se toma como una indicación de que la enfermedad ha recurrido. El "control normal" pueden ser niveles de autoanticuerpos presentes en individuos de control, preferiblemente emparejados por edad, que no tienen ningún diagnóstico de cáncer basado en criterios clínicos, de formación de imágenes y/o bioquímicos. Alternativamente, el "control normal" puede ser un nivel "basal" establecido para el paciente particular en ensayo. Por ejemplo, el nivel "basal" puede ser el nivel de autoanticuerpos presente durante un periodo de remisión de enfermedad basado en criterios clínicos, de formación de imágenes y/o bioquímicos.

El método de ensayo de la invención se puede aplicar en la detección de muchos tipos diferentes de cáncer, de los cuales son ejemplos cáncer de mama, de vejiga, colorrectal, de próstata, de pulmón, pancreático y ovárico. Los ensayos pueden complementar métodos existentes de exploración y supervivencia. Por ejemplo, en el caso de cáncer de mama primario se podrían usar inmunoensayos para autoanticuerpos para alertar a los médicos para que biopsien lesiones pequeñas en mamografías que radiográficamente no parecen sospechosos o para realizar formación de imágenes de mama o para repetir la formación de imágenes antes de lo planeado. En la clínica, se espera que los métodos de ensayo de la inyección sean más objetivos y reproducibles en comparación con técnicas de formación de imágenes actuales (es decir, mamografía y ultrasonidos), cuyo éxito puede depender del operario.

Los "ensayos de panel" se pueden adaptar teniendo en cuenta la aplicación clínica particular. Un panel de antígenos para la detección de autoanticuerpos para al menos p53 y c-erbB2 es particularmente útil para muchos tipos de cáncer y se puede complementar opcionalmente con otros marcadores que tienen una asociación conocida con el cáncer particular o un estadio del cáncer particular a detectar. Por ejemplo, para cáncer de mama, el panel puede incluir MUC 1 y/o c-myc y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA, mientras que en cáncer de vejiga, el panel puede incluir opcionalmente MUC1 y/o c-myc, para cáncer colorrectal, ras y/o APC, para cáncer de próstata, PSA y/o BRCA 1 y/o BRCA2 o para cáncer ovárico, BRCA1 y/o BRCA2 y/o CA125. Existen otras realizaciones preferidas en las que p53 o c-erbB2 no son necesariamente esenciales.

En el caso de cáncer de mama se podrían seleccionar paneles adecuados a partir de lo siguiente:

\quad: p53 y MUC 1 con c-erbB2 y/o c-myc y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o BRC1 opcional; p53 y c-myc con c-erbB2 y/o MUC1 y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o BRC1 opcional;

\quad: p53 y BRCA1 con c-erB2 y/o MUC 1 y/o c-myc y/o BRCA2 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o BRC1 opcional;

\quad: p53 y BRCA2 con c-erbB2 y/o MUC 1 y/o c-myc y/o BRCA1 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o BRC1 opcional; c-erbB2 y MUC 1 con p53 y/o c-myc y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o BRC1 opcional; c-erbB2 y c-myc con p53 y/o MUC1 y/o BRCA21 y/o BRCA2 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o BRC1 opcional;

\quad: c-erbB2 y BRCA1 con p53 y/o MUC 1 y/o c-myc y/o BRCA2 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o BRC1 opcional;

\quad: c-erbB2 y BRCA2 con p53 y/o MUC 1 y/o c-myc y/o BRCA1 y/o PSA opcional;

\quad: p53, c-myc, NY-ESO-1 y BRCA2.

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En el caso de cáncer colorrectal, los paneles adecuados se podrían seleccionar, por ejemplo, de lo siguiente:

\quad: p53 y ras con c-erbB2 y/o APC opcional;

\quad: p53 y APC con c-erbB2 y/o Ras opcional;

\quad: Ras y APC con p53 y/o c-erbB2 opcional. Tales paneles también pueden incluir CEA o CA19-9.

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En el caso de cáncer de próstata, los paneles adecuados se podrían seleccionar, por ejemplo, a partir de lo siguiente:

\quad: p53 y PSA con BRCA1 y/o BRCA2 y/o c-erbB2 opcional; c-erbB2 y PSA con p53 y/o BRCA1 y/o BRCA2 opcional; PSMA, PSCA y calicreínas.

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En el caso de cáncer ovárico, los paneles adecuados se podrían seleccionar, por ejemplo, a partir de lo siguiente:

\quad: p53 y CA125 con c-erbB2 y/o BRCA1 y/o BRCA2 opcional;

\quad: c-erbB2 y CA125 con p53 y/o BRCA1 y/o BRCA2 opcional;

\quad: HER2, anexinas, CAGE y 4-5.

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En el caso de cáncer de pulmón, los paneles adecuados se pueden seleccionar de:

\quad: p53 y NY-ESO-1, opcionalmente con marcadores adicionales;

\quad: HER2, anexinas, CAGE y 4-5.

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Cuando el método de la invención se usa para realizar un "ensayo de panel" basado en dos o más antígenos de marcador tumoral obtenidos de diferentes proteínas, al menos uno de los antígenos en el panel se tiene que ensayar en un ensayo de acuerdo con la invención basado en el ensayo de múltiples cantidades diferentes del antígeno para formar una curva de titulación. Preferiblemente, cada uno de los antígenos que forma el panel se ensaya de acuerdo con el ensayo de la invención y una curva de titulación se representa/calcula para cada antígeno individual en el panel.

La invención también considera que se puede usar un ensayo de titulación para la detección de al menos un anticuerpo anti-marcador tumoral en combinación con un ensayo diseñado para detectar al menos una proteína marcadora de tumor (que puede estar relacionada o no relacionada con el antígeno usado en el ensayo de titulación) en la misma muestra del paciente. Por tanto, se pueden realizar ensayos para autoanticuerpos anti-marcador tumoral y ensayos para proteínas marcadoras de tumor en paralelo en una única muestra del paciente.

En una realización adicional, el método de inmunoensayo de la invención se puede usar en la selección de una vacuna anti-cáncer para el uso en un paciente particular. En esta realización, una muestra de líquido corporal tomada del paciente se ensaya usando un panel de dos o más antígenos, correspondientes cada uno a una proteína marcadora de tumor diferente, para determinar la intensidad relativa de la respuesta inmune del paciente a cada una de las proteínas marcadoras de tumor diferentes. La "intensidad de la respuesta inmune" a una proteína o proteínas marcadoras de tumor dada se indica por la presencia y/o cantidad de autoanticuerpos asociados con cáncer específicos para esa proteína marcadora de tumor detectada usando el inmunoensayo; cuando se cuantifican autoanticuerpos, cuanto mayor sea el nivel de auto-anticuerpos asociados con cáncer, más intensa será la respuesta inmune. La proteína o las proteínas marcadoras de tumor que se han identificado como las que provocan la respuesta inmune más fuerte o respuestas fuertes en el paciente (es decir, el máximo nivel de autoanticuerpos) se selecciona o seleccionan después para formar la base de una vacuna anti-cáncer para el uso en el paciente.

La utilidad del método de la invención no se limita a la detección de autoanticuerpos anti-tumor, aunque el ensayo es particularmente útil para este propósito. El cáncer es solamente un ejemplo de una enfermedad en la que la detección de autoanticuerpos se puede usar como un marcador biológico para patología/susceptibilidad a enfermedad. Los inventores han mostrado que se obtienen sustanciales ventajas mediante el uso de una estrategia de titulación para detectar autoanticuerpos en muestras de un paciente. Por lo tanto, es razonable concluir que se obtendrán ventajas similares mediante el uso de la estrategia de titulación para detectar autoanticuerpos que sean marcadores biológicos para enfermedades diferentes al cáncer. Por lo tanto, el método se puede aplicar para la detección de cualquier autoanticuerpo que sirva como un marcador biológico para una patología o susceptibilidad a enfermedad, en cualquier enfermedad que se haya demostrado (o se pueda demostrar) que está asociada con producción de autoanticuerpos.

Otras aplicaciones del método de la invención incluyen, pero sin limitación, detección de autoanticuerpos que son marcadores biológicos de enfermedad autoinmune, tal como, por ejemplo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), cirrosis biliar primaria (PBC), tiroiditis autoinmune (por ejemplo, tiroiditis de Hashimoto), gastritis autoinmune (por ejemplo, anemia perniciosa), adrenalitis autoinmune (por ejemplo, enfermedad de Addison), hipoparatiroidismo autoinmune, diabetes autoinmune (por ejemplo, diabetes de Tipo 1) o miastenia grave y exploración de muestras del paciente para enfermedad renal o hepática que conduce a insuficiencia o fallo de cualquier órgano y para la exploración de las muestras de un paciente post-trasplante para detectar la presencia de anticuerpos dirigidos contra el tejido enfermo (que se ha dejado in situ post-trasplante) o frente al tejido trasplantado.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para detectar un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende un líquido corporal de un sujeto mamífero, en el que dicho anticuerpo se dirige a una sustancia extraña introducida en dicho sujeto mamífero, comprendiendo el método:

(a): poner en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antígeno específico para dicho anticuerpo,

(c): representar o calcular una curva de la cantidad de dicha unión específica frente a la cantidad de antígeno para cada cantidad de antígeno usado en la etapa (a).

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Preferiblemente, en esta realización de la invención, el método incluye como etapa (d) detectar la presencia de dicho anticuerpo basándose en la cantidad de unión específica entre dicho anticuerpo y dicho antígeno a cada concentración diferente de antígeno usada, en otras palabras, los valores colectivos observados para un antígeno particular. Preferiblemente, la presencia en la muestra de ensayo de anticuerpo reactivo con el antígeno usado en el ensayo se indica por una curva generalmente con forma de S o sigmoidea.

En este aspecto de la invención, se puede usar la metodología de titulación para evaluar la respuesta inmune de un sujeto mamífero, y preferiblemente un sujeto humano, a cualquier sustancia extraña introducida en dicho sujeto.

En una realización, la sustancia extraña puede ser un agente terapéutico, tal como, por ejemplo, un fármaco o profármaco, terapia con anticuerpos humanos con vacuna. El método de la invención se puede usar para evaluar si la administración de un agente terapéutico a un paciente desencadena una respuesta inmune que conduce a la producción de anticuerpos específicos para un epítope en el agente terapéutico, o un componente de un vehículo de suministro, excipiente, medio de soporte, etc., administrado con el agente terapéutico.

La naturaleza precisa del agente terapéutico no es limitante para la invención. En realizaciones no limitantes, el método de la invención se puede usar para evaluar la respuesta inmune a moléculas pequeñas sintéticas, sustancias de origen natural, agentes biológicos de origen natural o producidos sintéticamente o cualquier combinación de dos o más de lo anterior, opcionalmente en combinación con excipientes, medios de soporte o vehículos de suministro.

En una realización útil, el método de la invención se puede usar para evaluar la respuesta inmune a una porción no diana de un agente terapéutico o vacuna. Con porción "no diana" se quiere decir un componente parte del agente terapéutico o la vacuna administrada que, en el caso de un agente terapéutico, no contribuye directamente a la actividad terapéutica o, en el caso de una vacuna, no tiene por objeto provocar producción de anticuerpos en el hospedador. La porción no diana puede estar presente, por ejemplo, para facilitar la purificación del agente terapéutico o la vacuna o se puede diseñar para ayudar con el suministro, la captación o la dirección del agente terapéutico/vacuna. Los ejemplos de tales porciones "no diana" incluyen, pero sin limitación, enlazadores o marcadores unidos de forma común a polipéptidos expresados de forma recombinante, tales como marcadores de biotina, etiquetas de histidina, etc.

En otra realización de este aspecto de la invención, la sustancia extraída puede ser un agente infeccioso, tal como un hongo, una bacteria, un virus o un parásito.

La invención se comprenderá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos experimentales no limitantes:

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Ejemplo 1 Protocolo general para titulación de antígeno en un ensayo de autoanticuerpos

Se pueden preparar muestras de antígenos de marcador tumoral (biotinilados) mediante expresión recombinante, siguiendo métodos análogos a los descritos en el documento WO 99/58978.

En resumen, los ADNc que codificaban los antígenos de marcador de interés se clonaron en el vector pET21 (Invitrogen) que se ha modificado para codificar un marcador biotina y un marcador 6xhistidina para ayudar a la purificación de la proteína expresada. Los clones resultantes se cultivan en una célula hospedadora bacteriana adecuada (en cuerpos de inclusión), la bacteria se lisa y se desnaturaliza y los antígenos expresados se recuperan por columnas de afinidad de quelato de níquel (Hi-trap, disponible en el mercado en Amersham, siguiendo el protocolo del fabricante). Los antígenos expresados se renaturalizaron por diálisis en tampón apropiado y el rendimiento de la proteína expresada se evaluó por SDS-PAGE, transferencia de Western y ELISA y se cuantificó antes del almacena-
miento.

El control negativo VOL es un vector vacío (es decir, sin ADNc clonado) que todavía incluye las secuencias de marcador His y biotina).

Los números de acceso a GenBank para varios ADNc de marcador son los siguientes:

P53: B003596

c-myc: V00568

dominio extracelular de ECD6 (HER2): M11730

NY-ESO: NM_001327

BRCA2: U43746

BRCA1 delta 9-10: NM_007302

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1.: Se diluyeron antígenos y VOL (control negativo) hasta concentraciones apropiadas en tampón carbonato 0,1 M, después se diluyeron de forma seriada para formar un intervalo de titulación semilogarítmico (véase la tabla 1). Las diluciones de antígeno se dosificaron a 50 \mul/pocillo en las hileras de una placa de microtitulación Falcon de acuerdo con el diseño de placa usando una pipeta multicanal electrónica. Las placas se cubrieron y almacenaron a 4ºC durante 48 h.

2.: Las placas se lavaron una vez en PBS + tween 20 al 0,1% usando un lavador de plata automatizado, después se secaron por golpeteo sobre papel tisú.

3.: Las placas se bloquearon con un tampón de incubación de alto contenido de sales (HSB, PBS + NaCI 0,5 M + caseína al 0,1%) a 200 \mul/pocillo durante una hora o hasta que se requiera para el uso (se almacenan cubiertas a 4ºC).

4.: Las muestras de suero se descongelaron, se agitaron vorticialmente y diluyeron 1/100 en HSB a temperatura ambiente.

5.: Las placas se vaciaron y se secaron por golpeteo sobre papel tisú. Cada muestra de suero diluida se dosificó a 50 \mul/pocillo en todos los pocillos de la placa de microtitulación usando una pipeta multicanal electrónica. Los anticuerpos de control se diluyeron 1/1000 en HBS y se dosificaron en pocillos apropiados de la placa final. Las placas se cubrieron e incubaron durante 1,5 horas a temperatura ambiente con agitación.

6.: Etapa de lavado: Las placas se lavaron tres veces en PBS + tween 20 al 0,1% usando un lavador de placa automatizado, después se secaron por golpeteo sobre papel tisú.

7.: Se dosificó anti-Ig humana de conejo conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (Jackson, 1/10.000 en HSB) a 50 \mul/pocillo en todos los pocillos de la placa de microtitulación. Se dosificó anti-Ig de ratón de conejo conjugado con HRP (1/1000 en HSB) en pocillos de control que contenían anticuerpo anti-antígeno. Después, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora con agitación.

8.: Las placas se lavaron como en la etapa 6.

9.: Se añadió sustrato TMB pre-preparado a 50 \mul/pocillo y la placa se incubó en un banco de pruebas durante 10 min. Las placas se golpearon cuidadosamente para la mezcla.

10.: Se determinó la densidad óptica de los pocillos a 650 nm usando un protocolo de lector de placa convencional.

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TABLA 1 Diseños de placa convencional

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Ejemplo 2 Detección de autoanticuerpos en cáncer de mama primario

Se obtuvieron los siguientes datos de un estudio piloto para evaluar la sensibilidad y reproducibilidad de un panel de ensayos de anticuerpo de titulación en cáncer de mama primario (PBC). El estudio incluía suero de 17 mujeres sin indicios de cáncer y muestras de suero pre-quirúrgicas de 20 mujeres con cáncer de mama primario. Las muestras normales y con cáncer se emparejaron por edad. Se tuvieron que retirar una muestra normal y tres de cáncer del estudio debido a que mostraron indicios de respuestas de anticuerpos anti-biotina y, por lo tanto, no se podrían evaluar usando el ensayo en su presente formato. Se piensa que aproximadamente el 10% de la población desarrolla una respuesta inmune contra biotina.

El ensayo se realizó de acuerdo con el protocolo indicado en el ejemplo 1 usando los antígenos p53, c-myc, NY-ESO-1 y BRCA2.

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La figura 1 proporciona ejemplos de curvas obtenidas cuando se usó el ensayo de titulación de antígeno para medir autoanticuerpos para p53 en el suero. Se puede observar que el suero del paciente con cáncer 17766 (C) se une fuertemente al antígeno de ensayo (p53) con una curva sigmoidea característica pero no se une al control negativo, VOL. En comparación, el suero de un individuo normal, 18052(N) no da una curva de titulación para la unión al antígeno de ensayo o el control negativo.

Los niveles de autoanticuerpos se expresaron como la densidad óptica (650 nm) debido a la unión del antígeno de ensayo menos la debida a la unión al control negativo (VOL). El limite normal se calculó como el percentil 95 (media + 2 desviaciones típicas) del grupo normal. Esto se muestra como la línea discontinua en la Figura 2, en la que los niveles de autoanticuerpo anti-p53 en individuos normales se comparan con pacientes de cáncer. Se puede observar que el grupo con cáncer muestra generalmente mayores niveles de autoanticuerpos y también tiene una mayor proporción de individuos con niveles por encima del límite.

El panel consistía en cuatro antígenos; p53, c-myc, NY-ESO-1 y BRCA2. La sensibilidad de los ensayos individuales se da en la tabla 2 junto con la sensibilidad combinada del panel de cuatro antígenos en la detección de cáncer de mama primario (63%).

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TABLA 2 Sensibilidad del ensayo de autoanticuerpos de titulación de antígeno

Se midieron los autoanticuerpos contra cuatro antígenos diferentes y se calculó la sensibilidad combinada del panel. Se calcularon los niveles de límite como media + 2 desviaciones típicas del conjunto de muestra normal. Los individuos con respuestas de anticuerpo anti-biotina se excluyeron como no capaces de evaluación.

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Para evaluar si las mediciones obtenidas usando el ensayo de autoanticuerpo de titulación eran o no reproducibles, se realizaron ensayos en tres días separados y los resultados se muestran en la tabla 3. Se consideró que un ensayo era reproducible si concordaban los tres resultados. La reproducibilidad de las mediciones realizadas en suero normal fue del 94% (15/16) y del 88% (14/16) en muestras de cáncer de mama.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 3 Reproducibilidad del ensayo de titulación de antígeno para autoanticuerpos contra p53

Se realizaron ensayos en tres días separados (Procesamientos A, B y C) en muestras de suero de pacientes con cáncer de mama primario (PBC) o controles normales. Se calcularon los niveles límite en una base diaria como media + 2 desviaciones típicas del conjunto de muestra normal. AB indica individuos que mostraron indicios de una respuesta de anticuerpos anti-biotina y que no se pueden evaluar por el presente formato de ensayo. Se consideró que un ensayo era reproducible si los tres resultados concordaban. La reproducibilidad de los individuos normales fue del 94% (15/16) y los pacientes con PBC del 88% (14/16)

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Ejemplo 3 Detección de autoanticuerpos en cáncer de pulmón

El análisis de las respuestas de autoanticuerpos contra 2 antígenos (p53 y NY-ESO) en un estudio piloto de cáncer de pulmón (10 plasmas normales y 9 con cáncer de pulmón) mostraron una tasa de detección del 78% (Figura 3).

El ensayo se realizó de acuerdo con el protocolo general del ejemplo 1, excepto porque se usaron muestras de plasma en vez de suero.

Las muestras de paciente positivas mostraron curvas de titulación sigmoidea similares a las mostradas en la Figura 1. La Figura 3 muestra una comparación de niveles de autoanticuerpos contra p53 y NY-ESO en individuos normales y pacientes con cáncer de pulmón cuando se miden usando el ensayo de titulación de antígeno. Se calcularon los límites normales como la media más 2 desviaciones típicas de la población normal.

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Ejemplo 4 Curvas de titulación adicionales

Las siguientes curvas de titulación adicionales se generaron todas en ensayos basados en la metodología general que se ha descrito en el Ejemplo 1. Los resultados indican que la estrategia de curva de titulación se puede aplicar para la detección de una diversidad de diferentes antígenos, en diferentes tipos de líquidos corporales y en diferentes enfermedades (ilustradas por diferentes tipos de cáncer) y también ilustran la ventaja del método de la invención para distinguir entre resultados positivos "verdaderos" y "falsos".

La Figura 4 muestra una curva de titulación para la detección de autoanticuerpos contra p53 y NY-ESO en muestras de líquido de ascitis tomado de un paciente con cáncer de mama. Este paciente se ensayó, pero se observó que no producía autoanticuerpos contra c-myc.

Las Figuras 8(a) y 8(b) ilustran los resultados de dos ensayos de titulación independientes para autoanticuerpos contra p53, c-myc y NY-ESO-1 en muestras de suero de un sujeto "normal" (es decir, un individuo sin indicios de cáncer). En el ensayo mostrado en la Figura 8(a) se observa una línea plana con cantidades crecientes de antígeno, que indica que la muestra de suero no contiene autoanticuerpos contra ninguno de los antígenos ensayados. Cuando se ensayó una segunda alícuota de la misma muestra de suero del paciente nuevamente usando la misma metodología de ensayo, el ensayo falló produciendo los resultados anómalos que se muestran en la Figura 8(b). La ausencia de la curva de titulación característica con cantidades crecientes de antígeno indica que esto es un resultado anómalo, más que un positivo verdadero. Si se hubiera ensayado esta muestra en un ensayo de un solo punto usando una cantidad única, fija de antígeno, entonces podría haber aparecido como un resultado de "falso positivo". Por tanto, estos resultados ilustran la ventaja de la estrategia de la curva de titulación para distinguir entre resultados positivos verdaderos
y falsos.

Las Figuras 9(a) y 9(b) muestran los resultados de dos ensayos de titulación independientes realizados en muestras de suero de un único paciente con cáncer de mama invasivo que usa una variedad de diferentes antígenos. Este paciente particular muestra autoanticuerpos contra NY-ESO-1, HER2 y BRCA2. Para cada antígeno positivo, se indica un resultado de ensayo positivo por intensidad creciente de señal cuando la concentración de antígeno aumenta, es decir, una señal de titulación.

Las Figuras 10(a) y 10(b) ilustran la utilidad de la invención para distinguir entre respuestas anti-biotina y autoanticuerpos "verdaderos" contra un antígeno específico (es decir, un marcador tumoral). En estos ensayos se ensayaron muestras de suero de un sujeto humano clínicamente normal para la presencia de autoanticuerpos usando antígenos biotinilados BRCA2, HER2, c-myc y NY-ESO-1, BRCA1 no biotinilado y productos de expresión de control del vector "vacío" VOL, que codifica el marcador biotina pero ningún antígeno adicional. El individuo ensayado muestra una respuesta de titulación tanto a los antígenos biotinilados como al vector vacío VOL, que es, de hecho, biotina sola, pero ninguna respuesta al antígeno no biotinilado BRCA1, indicando que los resultados "positivos" con los marcadores biotinilados, de hecho, se deben a la presencia de anticuerpos anti-biotina en este individuo.

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Ejemplo 5 Análisis de la sensibilidad y especificidad de ensayos de titulación de antígeno en comparación con medición de un solo punto

Se realizaron mediciones de autoanticuerpos (AAb) en 100 mujeres con cáncer de mama primario (PBC) y 80 mujeres sin indicios de enfermedad maligna usando tanto el método de titulación como midiendo a una única concentración de antígeno (10 \mug/ml). Las tablas que muestran una comparación directa de los dos métodos se muestran a continuación:

TABLA 4 Comparación de la sensibilidad del ensayo de AAb de titulación con una medición a una única concentración de antígeno en PBC

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TABLA 5 Comparación de la especificidad del ensayo de AAb de titulación con una medición a una única concentración de antígeno en mujeres normales

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Se puede observar que mediante el uso de varios puntos en la curva de titulación de antígeno, se obtuvo tanto una mayor sensibilidad como especificidad en comparación con una medición de un solo punto.

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Ejemplo 6 Razones potenciales para mayor sensibilidad y especificidad con ensayo de titulación de antígeno

Sin quedar ligado por la teoría, el solicitante considera que hay varias razones para la mayor especificidad y sensibilidad observadas en un ensayo cuando se titula el antígeno.

(i): La Figura 11 muestra los resultados del análisis de AAb de suero de un paciente con cáncer de mama primario (PCB) usando los antígenos p53, c-myc y NY-ESO-1 a concentración variable. Estos resultados demuestran que en algunos casos la curva de titulación cae a altos niveles de antígeno (curva de NY-ESO-1). Esto es un fenómeno observado de forma común en inmunoquímica. Si se hubiera usado una medición de un solo punto a 10 \mug/ml, este paciente se habría clasificado como negativo con respecto a autoanticuerpos contra NY-ESO-1 cuando, de hecho, hay claramente una respuesta positiva.

(ii): La Figura 12 muestra el análisis de suero de un individuo normal, es decir, usando antígeno titulado p53, c-myc y NY-ESO-1. Esta figura demuestra un efecto que los solicitantes han observado en aproximadamente el 10% de los ensayos en los que el nivel basal de la medición del antígeno (en este caso, p53) se desplaza hasta un nivel por encima del del control negativo (VOL). Esto produce una lectura falsamente alta. Este tipo de resultado se puede identificar de forma sencilla con el ensayo de titulación, pero sería invisible en un conjunto de ensayos de un solo punto. Esto daría como resultado especificidad reducida debido a estos positivos falsos (véase la Tabla 5).

(iii): Como se analiza en el Ejemplo 4, los antígenos que se usan en el Ensayo de AAb de Titulación tienen un marcador biotina que se puede usar en la purificación de la proteína. Sin embargo, se conoce que aproximadamente el 10% de la población produce una respuesta de anticuerpos a biotina, que es una vitamina. La Figura 13 demuestra una respuesta anti-biotina en un paciente con PBC. Esta respuesta se puede identificar claramente usando la curva de titulación como una respuesta de anticuerpos fuerte contra el control negativo, VOL (que también está biotinilado). Estos individuos se tienen que considerar no evaluables con el ensayo en este formato. Sin embargo, si se hubiera usado un ensayo de un solo punto, los respondedores anti-biotina no se podrían distinguir de las respuestas verdaderas.

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Ejemplo 7 Demostración de sensibilidad aumentada de titulación de antígeno en comparación con titulación de suero

Las mediciones de AAb se realizaron de dos maneras en dos experimentos bastante separados. El primero fue usando el formato convencional en el que la placa se recubrió con antígeno en una titulación semilogarítmica de 10 \mug/ml hasta 0,01 \mug/ml. Después del bloqueo, se añadió suero a una dilución de 1 en 100. En el segundo, las placas se recubrieron con antígeno a una concentración de 3 \mug/ml y, después del bloqueo, se añadió suero en un intervalo de titulación semilogarítmico de una dilución de 1 en 10 hasta 1 en 10.000. Los métodos para el resto de los ensayos fueron idénticos. Se ensayaron dos combinaciones de sueros que se sabía que eran positivos para p53 y c-myc junto con 8 sueros de mujeres con PBC y 10 sueros de individuos normales. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 6.

TABLA 6 Sensibilidad de ensayos de AAb que implican titulación de antígeno en comparación con los que implican titulación de suero

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Se puede observar que el formato de ensayo que implica la titulación de antígeno es más sensible que el formato que implica la titulación de suero. Las muestras que eran fuertemente positivas se detectaron por ambos formatos, sin embargo, los positivos débiles en el ensayo de titulación de antígeno generalmente no se detectaron en el ensayo de titulación de suero.

La menor sensibilidad demostrada por el formato de titulación de suero se debe a la unión no específica inherente del suero a una alta concentración. Esto provoca un nivel de unión a las proteínas incluso en muestras normales (véase la Figura 14), que eleva el valor límite normal con reducción posterior en la sensibilidad. La especificidad también estaba reducida en el formato de titulación de suero (BRCA2 = 90%) en comparación con el formato de titulación de antígeno (BRCA2 = 100%).

La Figura 15 refleja los experimentos mostrados en la Figura 4, pero con suero de un paciente con cáncer de mama primario. Se observó que el paciente era positivo para auto-anticuerpos contra p53 y c-myc pero negativo para auto-anticuerpos contra BRCA2 cuando se usó el método de titulación de antígenos de la invención. Sin embargo, cuando se midieron auto-anticuerpos dentro de un intervalo de titulación de suero no se detectaron auto-anticuerpos (véase la Tabla 6). Esto se debe a la unión no específica mostrada por el suero a altas concentraciones (demostrado por el alto nivel de unión a la proteína de control negativo (VOL)) que enmascara señales debido a unión específica de auto-anticuerpo. La consecuencia es que con la dilución del suero, el ensayo podría indicar un paciente con cáncer de mama primario como negativo. Ya que sensibilidad = positivos verdaderos/positivos verdaderos + falsos negativos, esto tuvo el efecto de aumentar el denominador, y por lo tanto, disminuir la sensibilidad.

En resumen, los solicitantes han mostrado que los ensayos de Autoanticuerpos de Titulación de Antígeno son más sensibles y específicos que la medición de la reactividad de autoanticuerpos a una única concentración de antígeno. Esto es debido a que la titulación de antígeno proporciona la oportunidad de detectar tanto anticuerpos de baja abundancia, baja afinidad a altas concentraciones de antígeno como anticuerpos de alta abundancia que, de otro modo, se engancharían a una alta concentración de antígeno pero que se unen de forma máxima más hacia abajo en la curva de titulación. También permite la diferenciación de ensayos no evaluables de resultados verdaderos, lo que no es posible con medición de un solo punto. Se cree que un ensayo de AAb de titulación de antígeno es más sensible que la mera titulación de suero debido a que el alto nivel de unión no específica observada con suero a una alta concentración aumenta los niveles de límite normales, disminuyendo de este modo la sensibilidad.

Claims

1. Un método para detectar una patología o susceptibilidad a enfermedad en un sujeto mamífero que comprende detectar un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende un líquido corporal de dicho sujeto mamífero, en el que dicho anticuerpo es un autoanticuerpo que es un marcador biológico de una patología o susceptibilidad a enfermedad, comprendiendo el método:

(a): poner en contacto dicha muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antígeno específico para dicho anticuerpo,

(c): representar o calcular una curva de la cantidad de dicha unión específica frente a la cantidad de antígeno para cada cantidad de antígeno usado en la etapa (a) y

(d): determinar la presencia o ausencia de dicha patología o susceptibilidad a enfermedad basándose en la cantidad de unión especifica entre dicho anticuerpo y dicho antígeno a cada concentración diferente de antígeno usada, en el que la presencia o ausencia de dicha patología o susceptibilidad a enfermedad se determina explorando la representación de la etapa (c) para la presencia de una curva generalmente con forma de S o sigmoidea.

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2. El método de la reivindicación 1, en el que la presencia o ausencia de dicha patología o susceptibilidad a enfermedad se determina basándose en los valores colectivos de la cantidad de unión específica para todas las concentraciones de antígeno ensayadas.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es un autoanticuerpo específico para una proteína marcadora de tumor.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el antígeno es una proteína marcadora de tumor o un fragmento antigénico o epítopo de la misma.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la proteína marcadora de tumor es MUC1, MUC16, c-myc, EGRF, p53, ras, BRCA1, BRCA2, APC, HER2, PSA, CEA, CA19.9, NY-ESO-1, 4-5, CAGE, PSMA, PSCA, EpCam, una citoqueratina, recoverina, una calicreína, una anexina, AFP, GRP78, CA125, mamoglobina o raf.

6. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en el diagnóstico, pronóstico o control de cáncer.

7. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para explorar una población de sujetos humanos asintomáticos para identificar los sujetos que presentan riesgo aumentado de desarrollar cáncer, en el que las muestras a ensayar usando el método son muestras de líquido corporal tomado de los sujetos y en el que los sujetos que tienen un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con individuos de control normales, se identifican como en riesgo de desarrollar cáncer.

8. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para detectar un cambio neoplásico temprano o carcinógeno temprano en un sujeto humano asintomático, en el que la muestra a ensayar usando el método es una muestra de líquido corporal tomado del sujeto y en el que la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con individuos de control normales, se toma como una indicación de cambio neoplásico temprano o carcinógeno temprano en el sujeto.

9. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para explorar una población de sujetos humanos asintomáticos para identificar los sujetos que han desarrollado un cáncer, en el que las muestras a ensayar usando el método son muestras de líquido corporal tomado de los sujetos y en el que los sujetos que tienen un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con individuos de control normales, se diagnostican como que tienen un cáncer.

10. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para ensayar una población de sujetos humanos sintomáticos para identificar los sujetos que han desarrollado un cáncer, en el que las muestras a ensayar usando el método son muestras de líquido corporal tomado de los sujetos y en el que los sujetos que tienen un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con individuos de control normales, se diagnostican como que tienen un cáncer.

11. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para controlar el progreso de cáncer u otra enfermedad neoplásica en un paciente, en el que la muestra a ensayar usando el método es una muestra de líquido corporal tomado de un paciente humano y en el que la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con un control normal, se toma como una indicación de la presencia de cáncer en el paciente.

12. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en la detección de enfermedad recurrente en un paciente humano al que se ha diagnosticado previamente como que tiene cáncer, paciente que se ha sometido a tratamiento anti-canceroso para reducir la cantidad de cáncer presente, en el que la muestra a ensayar usando el método es una muestra de líquido corporal tomado del paciente, y en el que la presencia de un nivel aumentado de autoanticuerpos en el paciente, en comparación con un control normal, se toma como una indicación de que la enfermedad ha recurrido.

13. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para la evaluación de pronóstico de cáncer, en el que la muestra a ensayar usando el método es una muestra de líquido corporal tomado de un paciente humano y en el que la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con un control normal, se toma como una indicación del pronóstico del paciente por su cáncer.

14. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para predecir la respuesta a tratamiento anti-canceroso, en el que la muestra a ensayar usando el método es una muestra de líquido corporal tomado de un paciente humano y en el que la comparación del nivel de autoanticuerpos en dicho paciente con una relación establecida previamente entre niveles de autoanticuerpos y resultado probable del tratamiento se usa para proporcionar una indicación de si el paciente responderá a tal tratamiento anti-canceroso.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el tratamiento anti-canceroso es vacunación, terapia con factor anti-crecimiento o de transducción de señal, radioterapia, terapia endocrina, terapia con anticuerpos humanos o quimioterapia.

16. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para controlar la respuesta de un paciente con cáncer humano a tratamiento anti-canceroso, en el que la muestra a ensayar usando el método es una muestra de liquido corporal tomado del paciente y en el que un cambio en el nivel de autoanticuerpos después del tratamiento se toma como una indicación de si el paciente ha respondido o no al tratamiento.

17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el tratamiento es vacunación, terapia con factor anti-crecimiento o de transducción de señal, radioterapia, terapia endocrina, terapia con anticuerpos humanos o quimioterapia y un cambio en el nivel de autoanticuerpos después del tratamiento se toma como una indicación de que el paciente ha respondido positivamente al tratamiento.

18. Uso de las etapas del método (a) a (c) de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en la selección de un tratamiento anti-canceroso para el uso en un paciente humano particular, en el que el método se realiza usando un panel de dos o más antígenos que se corresponden cada uno a una proteína marcadora de tumor diferente para determinar la intensidad relativa de la respuesta inmune del paciente a cada una de las proteínas marcadoras de tumor diferentes, en el que la proteína o las proteínas marcadoras de tumor identificadas como las que provocan la respuesta inmune más fuerte o respuestas inmunes en el paciente se selecciona o seleccionan para formar la base de un tratamiento anti-canceroso para el uso en dicho paciente.

19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el tratamiento anti-canceroso es vacunación y la proteína o las proteínas marcadoras de tumor que se han identificado como las que provocan la respuesta inmune más fuerte o respuestas fuertes en el paciente se selecciona o seleccionan para formar la base de una vacuna anti-cáncer para el uso en dicho paciente.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un autoanticuerpo característico de o asociado con una enfermedad autoinmune.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), cirrosis biliar primaria (PBC), tiroiditis autoinmune, tiroiditis de Hashimoto, gastritis autoinmune, anemia perniciosa, adrenalitis autoinmune, enfermedad de Addison, hipoparatiroidismo autoinmune, diabetes autoinmune o miastenia grave.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un autoanticuerpo característico de o asociado con enfermedad renal o hepática que conduce a insuficiencia o fallo de cualquier órgano.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se dirige contra un epítopo presente en tejido trasplantado al sujeto mamífero.