CN1547025A - 高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒,由携有特异性配基及酶的微载体或(携有特异性配基的微载体及与微载体具有特异性结合能力的酶标物),包被有特异性配基的免疫反应固相介质及检测试剂组成;本发明中的特异性配基与被检测标本中的目标物具有特异性结合能力;本试剂盒可一次快速检测同一生物标本中多种抗原产生的每一类IgM、IgG、IgA及其亚类特异性免疫球蛋白,检测用抗原或抗体需要材料种类少,反应步骤简单,反应中平均每个微载体携有1000个以上的特异性配基分子,酶的参与量较常规法明显增加,提高了敏感度;检测特异性抗体时,克服了间接法中各类免疫球蛋白的竞争干扰问题;解决了不明病原体爆发传染病中的快速、高敏感度的抗原检测问题。
Description
技术领域 本发明涉及抗原及抗体高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒,尤其是关于微载体固化被检测物和酶的免疫分析试剂盒。
背景技术 目前,一般的酶联免疫分析检测用的酶标记物是配体分子与酶分子的偶联,在每个抗原与抗体特异性结合的免疫反应中,酶参与的量有限,敏感度低。
动物在疾病状态时,常要涉及数种抗原产生的特异性抗体的检测;
如同一个体数种特异性IgM的一次检测有利于病原体的早期快速鉴别诊断,常规检测一般用几个试剂盒,分别操作。方法有间接法和捕获法。间接法存在特异性抗体IgG、IgA、IgM间的竞争干扰,敏感度低;捕获法一般用特异性抗原和特异性抗体,需要试剂复杂,操作繁索,敏感度有待提高。同理,IgG和IgA(包括他们的亚类)在同一个体,一次检测数种同一类或亚类特异性抗体也存在相似不足。
爆发病原体不清的传染病,急需建立快速、敏感的诊断试剂盒。一般检测特异性抗原明确诊断有意义,但因短时间内建立双抗体夹心抗原诊断试剂盒,需要获得高效价免疫原性相异的双份血清,需要时间长,操作工序复杂,需要大量原材料等。用动物单份高效价特异性免疫血清制备快速、敏感度高的检测抗原酶联免疫分析试剂盒有待解决。
发明内容 为解决上述问题,本发明采用的技术方案为:与被检测标本中的目标物(特异性抗原或抗体)具有特异性结合能力的配基,它被固相化微载体上,它特异性捕获被检测标本中的目标物(特异性抗原或抗体),微载体上携有酶,或(用与微载体具有特异性结合能力的酶标记物温育),已捕获被检测标本中的目标物(特异性抗原或抗体)的微载体,它与免疫反应固相介质温育,该固相介质包被了可和被检测目标物(特异性抗原或抗体)具有结合能力的配基,微载体上捕获了被检测标本中的目标物(特异性抗原或抗体)与免疫反应固相介质上的配基特异性的结合,充分洗涤去未结合的微载体(微载体上未携有酶者,用与微载体具有特异性结合能力的酶标记物与上述免疫反应固相介质温育一定时间后,充分洗涤后,洗涤去未结合的酶标记物),以显色用的底物液显示结果。由本发明中可知,在微载体与免疫反应固相介质间特异性的结合中,每一个抗原与抗体免疫反应相结合的微载体上可携有大量酶,每个微载体可携有成千上万个酶分子,检测敏感度高于常规法显而易见。
在实际偶联中,配基分子、酶分子与微载体的数目比例均在10000∶1以上,偶联后,平均每个微载体上携有的配基分子、酶分子数目均在1000个以上。微载体的偶联前、后数目用光学显微镜或电子显微镜计数;小到光学显微镜分辨力以下时,用电子显微镜计数。偶联率可用酶联免疫分别测定配基被固相化后的微载体及其游离于液体中的配基,微载体上的配基偶联率达50%以上为可用。
高灵敏度酶联免疫分析试剂盒,由携有配基及酶的微载体或(由携有配基的微载体及与微载体具有特异性结合能力的酶标物),包被有配基的免疫反应固相介质和检测试剂组成,其中,配基具有与被检测标本中的目标物具有特异性结合能力。它的特征为:1、携有配基及酶的微载体,它与被检测标本中的目标物(特异性抗原或抗体)具有特异性的结合能力。2、包被了配基的免疫反应固相介质,它与被检测标本中的目标物(特异性抗原或抗体)具有特异性结合的能力。3、平均每个微载体上携有配基分子、酶分子均在1000个以上。4、微载体包括:动物红细胞(绵羊、家兔、火鸡、马、猴、鸽子以及人O型红细胞),表面有蛋白A的葡萄球菌,悬浮培养中的微载体,凝集实验中的乳胶颗粒,树脂微粒。5、免疫反应固相介质,它指免疫反应滴定孔板,硝酸纤维,硝酸纤维素膜,尼龙纤维,尼龙膜,玻璃纤维,玻璃珠,其他材料可包被纤维或珠等。6、其中微载体上无酶的试剂盒,应有足量与微载体具有特异性结合能力的酶标物,该酶标物与包被了配基的免疫反应固相介质无结合能力。7、免疫反应固相介质与微载体具有大小、形态、密度明显差异,利于免疫反应中未结合的微载体充分洗脱分离。8、微载体密度大于检测中用的试剂密度,利于微载体在检测试剂液体中自然沉降或离心分离。
检测试剂为常规试剂包括:阳性对照,阴性对照,显色用的底物液,终止液,标本稀释液,洗涤液,可能有(其中微载体上无酶的试剂盒,应有足量与微载体具有特异性结合能力的酶标物)。可以自己配制检测试剂或市场上购买它们。
微载体可由市场上购买,如人O型红细胞,表面有蛋白A的葡萄球菌,乳胶颗粒,可偶联蛋白配基的树脂微粒。人O型红细胞用戊二醛常规偶联蛋白配基方法简单;硝酸纤维包被,它可用常规吸附包被蛋白配基;购买的诊断用乳胶颗粒可吸附蛋白配基;蛋白配基常规偶联的树脂微粒。制备的微载体方法,它适用于酶及配基的偶联于微载体上;可将酶及配基同时按一定比例偶联;也可先偶联酶后,再偶联配基。
免疫反应固相介质包被配基方法为吸附法。免疫反应滴定孔板为常规方法包被配基。碱性磷酸盐包被液处理硝酸纤维,硝酸纤维素膜,尼龙纤维,尼龙膜易包被配基。碱性玻璃纤维、珠易包被配基。其他材料可包被纤维、珠等也可用物理或化学方法进行。
当用于检测一个标本中一类或其亚类免疫球蛋白的不同特异性抗体时,免疫反应固相介质包被配基方法为:免疫反应滴定孔板,不同抗原用直接或间接法分别包被于各个独立的滴定孔中;如硝酸纤维,硝酸纤维素膜,尼龙纤维,尼龙膜,玻璃纤维,玻璃珠,其他材料可包被纤维或珠等,它们按同样相似方法,将不同抗原用直接或间接法分别包被于各个独立的免疫反应区域;此后,封闭液进行封闭;包被的免疫反应固相介质分装备用。
其中,微载体与免疫反应固相介质包被配基可用直接法或间接法。间接法先包被与特异性配基具有结合能力的物质(特异性抗原或抗体,受体,葡萄球菌蛋白A),再包被特异性配基。直接法如前所述,即配基直接包被于微载体外表面。
微载体与免疫反应固相介质包被或偶联配基后,常规用封闭液处理,降低非特异性反应。方法及操作为本领域常规技术。
当爆发病原体不清的传染病时,用一份高效价免疫血清,经高倍稀释度后,分别包被微载体与免疫反应固相介质表面,(其中微载体携有配基及酶者,用配基包被微载体前先偶联酶),此后,用封闭液封闭,同时设阴性、阳性对照。由此组成的试剂盒,可检测相应的特异性抗原。它用于爆发病原体不清的早期、快速诊断。当用于病原体不清的特异性抗原检测时,高灵敏度酶联免疫检测试剂盒组成为:病原体不清的高效价免疫血清包被的微载体,病原体不清的高效价免疫血清包被的免疫反应固相介质,与微载体具有特异性结合能力的酶标物,阳性对照,阴性对照,标本稀释液,洗涤液,显色用的底物液,终止液(微载体上同时携有酶及配基的试剂盒,无与微载体具有特异性结合能力的酶标物)。其特征为:病原体不清的高效价免疫血清包被的微载体,病原体不清的高效价免疫血清包被的免疫反应固相介质。
当微载体上包被抗人IgM或μ链抗体时,用常规封闭液封闭处理,该微载体可特异性与标本中的IgM结合;同理,检测标本中的特异性IgG、IgA时,微载体上分别包被抗IgG或γ链、IgA或α链的抗体,捕获相应的IgG、IgA。高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒,它由包被有与被检测标本中的特异性抗体IgM(IgA、IgG及其亚类)具有特异性结合的能力的单一配基及酶的微载体(或包被有与被检测标本中的特异性抗体IgM、IgA、IgG及其亚类具有特异性结合能力的一种配基的微载体,与微载体具有特异性结合能力的酶标物),分别包被与被检测标本中的特异性抗体(IgM、IgA、IgG及其亚类)具有特异性结合的能力的数种抗原的免疫反应同相介质(免疫反应滴定孔板,硝酸纤维,硝酸纤维素膜,尼龙纤维,尼龙膜,玻璃纤维,玻璃珠,其他材料可包被纤维或珠等),数种检测阳性对照,数种检测阴性对照,显色用的底物液,终止液,标本稀释液,洗涤液构成;其特征为:
A、平均每个微载体携有1000个以上的配基仅与一类IgM(IgA、IgG或其亚类)的免疫球蛋白具有特异性结合能力,
B、免疫反应固相介质,它分别包被了,与被检测标本中的特异性抗体(IgM、IgA、IgG及其亚类)具有特异性结合的能力的数种抗原,各抗原均包被在独立进行免疫反应的空间内;可一次,同时检测同一生物标本中不同抗原产生的某一类或其亚类特异性免疫球蛋白。
本发明的微载体指具有包被配基性能各种符合检测要求的材料,如聚苯乙烯、尼龙、玻璃、硝酸纤维素、各种离子树脂、亲和层析材料、细胞悬浮培养用的微载体、动物细胞等,不仅限于列举的上述材料制备的各种微载体,只要有微载体连接的配基,这种连接用物理、化学或物理及化学方法连接均在保护范围内。
微载体的密度大于检测试剂用的液体密度,粒度在纤微镜可分辨范围内,便于计数,控制安排配基分子、酶分子与微载体间数目比例,使平均每个微载体上包被或偶联的配基分子、酶分子数目均在1000个以上。连接有配基和/或酶的微载体经显微镜鉴定分散好,无聚集者分装低温保存备用。
免疫反应固相介质,指常规免疫反应滴定板,硝酸纤维,硝酸纤维素膜,尼龙,尼龙纤维,玻璃珠,玻璃纤维,可包被配基的其他材料纤维、珠等;与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合能力的配基,它经常规方法包被于免疫反应固相介质,用封闭液处理,降低非特异性反应,封装,0℃以下保存,备用。经上述处理的免疫反应固相介质为包被有特异性配基的免疫反应介质,配基与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合能力。
与微载体具有特异性结合能力的酶标记物有二种,一种为微载体特异性亲和配体,包括特异性抗体及受体亲和配体的酶标记物;如以人O型红细胞为微载体时,人O型RH阳性红细胞的抗RH酶标记物,抗体可购买或自己按常规操作制备抗RH抗体及标记酶标记物;另一种为抗体酶标记物,它与微载体上人工偶联的配基具有特异性结合能力,该配基与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合能力;抗体酶标记物与包被了配基的免疫反应固相介质无结合能力。
本发明高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒由如下组成:
一、高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒,由包被有与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合的能力的配基的微载体,包被与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合的能力的配基的免疫反应固相介质,与微载体特异性结合的酶标物,阳性对照,阴性对照,显色用的底物液,终止液,标本稀释液,洗涤液构成;
二、高灵敏度酶联免疫分析测试盒,由包被有与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合的能力的配基及酶的微载体,包被与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合的能力的配基的免疫反应固相介质,与微载体特异性结合的酶标物,阳性对照,阴性对照,显色用的底物液,终止液,标本稀释液,洗涤液构成;
标本稀释液:含5%牛血清白蛋白的生理盐水。
洗涤液:0.85%氯化钠,0.05%TWEEN-20。
显色用的底物液:0.01M柠檬酸-磷酸盐缓冲液(PH5.0)配制邻苯二胺浓度为0.05%;用前加入30%双氧水,终浓度0.05%;配后应避光保存。
终止液:2M硫酸。
具体实施方式 一、高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒的制造:
1、原材料及试剂可由市场上购得,部分试剂也可自行配制;
2、配基、酶偶联微载体及配基包被免疫反应固相介质按本领域常规技术操作进行;
3、检测试剂可购买或配制;
4、每个试剂盒中,已包被(偶联)的微载体、已包被(偶联)的免疫反应固相介质及各种试剂用量经棋盘滴定结果确定;
5、试剂盒各组成部分按需要比例分装,在符合GMP条件下,操作按制药标准进行,以上用的试剂及材料要达到国家法定标准。
二、高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒使用操作程序:
1、待检标本被稀释;
2、携有配基的微载体常温下与被稀释的待检标本温育60分钟;
3、离心或自然沉降分离微载体;洗涤微载体4次;
4、微载体与免疫反应固相介质温育60分钟;
5、洗涤微载体与免疫反应固相介质5次;(微载体无携酶者,用与微载体具有特异性结合能力的酶标物与免疫反应固相介质温育30分钟;洗涤微载体与免疫反应固相介质5次;)
6、显色用的底物液与免疫反应固相介质在37℃温育5-20分钟;2M硫酸终止反应;测OD值,P/N≥2.1判为阳性。
Claims (9)
1、高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒,由包被有与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合能力的配基的微载体,包被与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合能力的配基的免疫反应固相介质,与微载体具有特异性结合能力的酶标物,阳性对照,阴性对照,显色用的底物液,终止液,标本稀释液,洗涤液构成;其特征为:
A、平均每个微载体包被(或偶联)有1000个以上与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合的能力的配基分子;
B、免疫反应固相介质,它包被有与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合的能力的配基;
C、酶标物仅与微载体具有特异性结合的能力,与包被了配基的免疫反应固相介质无结合能力。
2、高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒,由包被有与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合的能力的配基及酶的微载体,包被与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合的能力的配基的免疫反应固相介质,阳性对照,阴性对照,显色用的底物液,终止液,标本稀释液,洗涤液构成;其特征为:
A、平均每个微载体上携有酶及配基分子均在1000个以上,该配基与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合的能力;
B、免疫反应固相介质,它包被有与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合的能力的配基。
3、如权利要求1,2所述高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒,其特征在于微载体可为动物红细胞(绵羊、家兔、火鸡、马、猴、鸽子以及人O型红细胞),表面有蛋白A的葡萄球菌,树脂微粒,细胞悬浮培养的微载体,凝集反应用乳胶颗粒;
4、如权利要求1,2所述高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒,其特征在于包被与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合能力的配基的免疫反应固相介质包括:免疫反应滴定孔板,硝酸纤维,硝酸纤维素膜,尼龙纤维,尼龙膜,玻璃纤维,玻璃珠,其他材料可包被纤维、珠等;
5、如权利要求1所述高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒,其特征为:
A、酶标物与微载体表面包被的配基具有特异性结合能力;
B、酶标物与微载体表面的配基具有特异性结合能力。
6、如权利要求2所述高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒,其特征在于微载体偶联的配基位于表面,与被检测标本中的特异性抗原或抗体具有特异性结合的能力的微载体上有酶联免疫需要的酶。
7、高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒,由包被有与被检测标本中的特异性抗体IgM(IgA、IgG及其亚类)具有特异性结合的能力的单一配基及酶的微载体(或包被有与被检测标本中的特异性抗体IgM、IgA、IgG及其亚类具有特异性结合能力的一种配基的微载体,与微载体具有特异性结合能力的酶标物),分别包被与被检测标本中的特异性抗体(IgM、IgA、IgG及其亚类)具有特异性结合的能力的数种抗原的免疫反应固相介质(免疫反应滴定孔板,硝酸纤维,硝酸纤维素膜,尼龙纤维,尼龙膜,玻璃纤维,玻璃珠,其他材料可包被纤维或珠等),数种检测阳性对照,数种检测阴性对照,显色用的底物液,终止液,标本稀释液,洗涤液构成;其特征为:
A、平均每个微载体携有1000个以上的配基仅与一类IgM(IgA、IgG或其亚类)的免疫球蛋白具有特异性结合能力;
B、免疫反应固相介质,它分别包被了,与被检测标本中的特异性抗体(IgM、IgA、IgG及其亚类)具有特异性结合的能力的数种抗原,各抗原均包被在独立进行免疫反应的空间内;可一次,同时检测同一生物标本中不同抗原产生的某一类或其亚类特异性免疫球蛋白。
8、高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒,它由病原体不清的高效价免疫血清包被的微载体,病原体不清的高效价免疫血清包被的免疫反应固相介质,与微载体具有特异性结合能力的酶标物,阳性对照,阴性对照,标本稀释液,洗涤液,显色用的底物液,终止液;(微载体上同时携有酶及配基的试剂盒,无与微载体具有特异性结合能力的酶标物)构成。其特征为:病原体不清的高效价免疫血清包被的微载体,病原体不清的高效价免疫血清包被的免疫反应固相介质。
9、如权利要求1,2,7,8所述高灵敏度酶联免疫分析检测试剂盒,其特征为:
A、微载体与免疫反应固相介质间的物理性质(形态、大小、密度)存在明显差异,以便于检测中未结合的微载体与免疫反应固相介质间可完全充分的分离;
B、微载体密度大于检测中用的试剂密度,利于微载体在检测试剂液体中自然沉降或离心分离。
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CN103364564A (zh) * | 2012-03-30 | 2013-10-23 | W·让·多兹 | 动物中的不耐性测试 |
CN101203756B (zh) * | 2005-05-27 | 2016-03-09 | 昂西免疫有限公司 | 改进的免疫测定方法 |
WO2018192036A1 (zh) * | 2017-04-20 | 2018-10-25 | 董方 | 一种用于酶联免疫吸附测定的固相载体及试剂盒 |
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- 2003-12-03 CN CNA2003101168938A patent/CN1547025A/zh active Pending
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