CN102590530B

CN102590530B - Krt84自我免疫抗体作为诊断、检测类风湿性关节炎的诊断标记物的应用

Info

Publication number: CN102590530B
Application number: CN201210053557.2A
Authority: CN
Inventors: 常晓天; 孟红
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-03-02
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2032-03-02
Also published as: CN102590530A

Abstract

本发明公开了KRT84自我免疫抗体作为诊断、检测类风湿性关节炎的诊断标记物的应用。本发明通过实验研究(二维免疫印迹法、蛋白质组学技术和ELISA技术)发现，RA患者的血液中抗KRT84自身免疫抗体表达水平比正常人明显增高，因此，抗KRT84自我免疫抗体可以作为RA的诊断标记物。应用时，以ELISA技术、胶体金试纸等常见的抗原、抗体特异性结合的免疫化学方法均可以用于检测KRT84自我免疫抗体。

Description

KRT84自我免疫抗体作为诊断、检测类风湿性关节炎的诊断标记物的应用

技术领域

本发明涉及KRT84自我免疫抗体作为诊断、检测类风湿性关节炎的诊断标记物的应用。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种自身免疫性疾病。临床上通过检测自身免疫抗体存在和表达水平的方法为RA诊断提供依据。常用于RA检测的自我免疫抗体包括类风湿因子(rheumatoid factor，RF)、抗聚角蛋白微丝蛋白(anti filaggrinautoantibody，AFA)、抗角蛋白(anti keratin antibody，AKA)、抗细胞核周围因子(antiperinuclear factor，APF)和抗波型蛋白(anti vimentin)和抗环状瓜氨酸肽(anti cycliccitrullinated peptide antibody，anti-CCP)。但以上RA诊断标记物的知识产权全部属于西方发达国家，这些诊断试剂在中国医疗市场上价格昂贵，96人份的检测试剂盒价格在4000-6000元之间。

绝大多数RA自身免疫抗体的B细胞决定簇都是瓜氨酸残基。瓜氨酸是人体非自然氨基酸，由蛋白质中的精氨酸经肽基脱亚胺酶催化而成。虽然像聚丝蛋白、纤维蛋白和波型蛋白等瓜氨酸蛋白已经被证实是RA自身免疫抗体的瓜氨酸化蛋白抗原，但到目前为止，作为RA自身免疫抗原的瓜氨酸化蛋白还没有被系统地研究、筛查。我们应用二维免疫印迹(2-D westernblotting，2D WB)和蛋白质组学技术对RA瓜氨酸化自身免疫抗原进行系统性研究，计划发现更多的、新的RA瓜氨酸化蛋白抗原，并从中筛选出具有临床检测价值的、新的RA诊断标记物。

发明内容

针对上述现有技术，本发明筛选出了一种新的诊断、检测类风湿性关节炎的诊断标记物-KRT84自我免疫抗体。

本发明通过实验研究(二维免疫印迹法、蛋白质组学技术和ELISA技术)发现，RA患者的血液中抗KRT84自身免疫抗体表达水平比正常人明显增高，因此，抗KRT84自我免疫抗体可以作为RA的诊断标记物。应用时，以ELISA技术、胶体金试纸等常见的抗原、抗体特异性结合的免疫化学方法均可以用于检测KRT84自我免疫抗体。

附图说明

图1：用二维免疫印迹法筛选新型的自身免疫抗原设计原理图。

图2：RA滑膜蛋白的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱和二维western blotting；从RA滑膜组织中提取总蛋白进行二维聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行考马斯亮蓝染色(A，B)，将胶上的滑膜蛋白通过湿转法转移到PVDF膜上，用纯化的RA患者血清(C)或抗瓜氨酸抗体(D)进行免疫，最后运用基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪进行质谱鉴定蛋白点。

图3：滑膜组织中候选蛋白进行WB实验分析，A1AT(A)、TBB(B)和KRT84(C)在RA或OA患者的滑膜组织中表达，用抗GAPDH抗体免疫杂交作为标准内参，箭头标记出分子量大小。

图4：运用ELISA法检测RA患者的血液中自身免疫抗体抗A1AT(A)、TBB(B)和KRT84(C)的表达水平，在405nm检测OD值。以健康组样本作为对照，自身免疫抗体抗KRT84在RA血液中具有显著性高表达。

具体实施方式

下面结合实验对本发明作进一步的说明。

实验

一、设计原理

RA的组织病理学特征是关节滑膜炎症、增生，并在自我免疫抗原的刺激下由B细胞簇分泌大量自我免疫抗体。我们首先用双向凝胶电泳对RA滑膜总蛋白进行分离，然后将蛋白转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，随之分别用纯化的RA患者血清和抗瓜氨酸抗体作为探针进行杂交。瓜氨酸化抗体和RA患者血液中都识别的蛋白被认为是RA瓜氨酸化自我免疫抗原。最后用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪对RA瓜氨酸化自我免疫抗原进行分析鉴定，决定这些蛋白到底是哪些蛋白。对上述实验设计的解释见图1：做两套(每套两块A和B、C和D)相同的双向凝胶电泳图，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后分别用纯化的RA患者血清和抗瓜氨酸抗体对上述两套胶的其中一块分别进行免疫杂交。将二维western blotting结果与同套胶的另一块对比每套两块(A和B、C和D)，确定与免疫信号对应的蛋白点。将RA患者血清和抗瓜氨酸抗体都识别的那些蛋白点挖出，用通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪进行分析鉴定。被RA患者血清和抗瓜氨酸抗体免疫都识别的蛋白点被认为是RA瓜氨酸化蛋白自身免疫抗原。

二、发现过程和数据

本研究将RA滑膜组织中提取的总蛋白用2-D凝胶电泳分离，每张2-D电泳凝胶上呈现约300个蛋白质点(见图2)。通过比较二维电泳图谱和免疫印迹图谱，用RA患者血清或抗瓜氨酸抗体杂交获得的特异蛋白点从双向电泳图谱上取下来后进行质谱鉴定。用RA患者血清作为探针的2D WB结果与双向电泳图谱质谱鉴定比较，筛选出37个差异蛋白点。同时，用抗瓜氨酸抗体作为探针的2D WB结果与双向电泳图谱质谱鉴定比较，筛选出45个差异蛋白点。在这些蛋白点中，其中有12个蛋白点是RA患者血清和抗瓜氨酸抗体共同鉴定出相同的点。这些点分别是α1抗胰蛋白酶(Alpha-1-antitrypsin，A1AT)、动力蛋白重链3(dynein heavy chain3，DYH3)、纤维蛋白原Bβ链(fibrinogen beta chain，FIBB)、角蛋白84(keratin type IIcuticular Hb4，KRT84)、基膜聚醣(lumican，LUM)、微管蛋白β-2A链(tubulin beta-2Achain，TBB2A)、微管蛋白β-2B链(tubulin beta-2Bchain，TBB2B)、微管蛋白β-2C链(tubulinbeta-2Cchain，TBB2C)、微管蛋白β-3链(tubulin beta-3chain，TBB3)、微管蛋白β-4链(tubulinbeta-4chain，TBB4)、微管蛋白β-5链(tubulin beta-5chain，TBB5)和波型蛋白(vimentin，VIME)。见表1。实验结果重复3次。

表1获得特异蛋白点

对以上蛋白质组学研究结果用常规免疫印迹法(western blotting，WB)进行了验证。WB实验以骨关节炎(osteoarthritis，OA)作对照，用抗GAPDH抗体免疫杂交作为标准内参。发现：A1AT、KRT84和TBB在RA滑膜组织中有特异性高表达，见图3。DYH3和LUM在滑膜样本中均无表达。以上结果过证实RA滑膜中确实存在A1AT、TBB和KRT84瓜氨酸化蛋白。

FIBB和VIME蛋白作为自身免疫抗原已经被报道过。Skriner等用纯化的RA患者滑膜液进行二维凝胶电泳，用抗瓜氨酸抗体进行免疫杂交，飞行时间质谱分析鉴定发现瓜氨酸化的蛋白有FIBBα链片段、β链、β链前体和D片段。Takizawa等运用夹心ELISA法和免疫共沉淀后进行WB发现瓜氨酸化的FIBB在RA滑膜液中有高表达，而在OA滑膜液中没有表达。Sanmartí等以健康组为对照进行ELISA实验发现抗人工合成抗瓜氨酸化FIBB的多肽所产生的自身免疫抗体在RA中具有较高的特异性和敏感性。Tilleman等对RA滑膜提蛋白，进行二维电泳和质谱鉴定的方法，发现波型蛋白在RA滑膜中表达，并且发现抗瓜氨酸化VIME的自身免疫抗体与RA有显著相关性。Snir等对RA滑液和血清进行ELISA实验发现瓜氨酸化的VIBB和抗瓜氨酸化的一些蛋白抗体产品具有密切的关系。通过我们的2D WB，我们进一步确认了瓜氨酸化的FIBB和VIME是RA中的自我免疫抗原。以上其他报道也反过来证明了本实验方案的可行性和结果的可靠性。

为了验证RA患者血液是否存在抗KRT84自我免疫抗体，我们用酶联免疫方法(ELISA)方法检测了46位RA患者血液。实验以强直性脊柱炎(AS)患者血液和健康人血液为对照。对照组血液标本来自46名健康献血者，无一人患严重疾病或有严重疾病家族史。AS是一种以骶髂关节融合、炎症为主要组织病理学特征的关节疾病，与RA有相似之处，因而被选为对照。病例组和对照组均为山东地区汉族人群。所采集血样保存于含有3.8％枸橼酸钠的采血管中。具体方法如下：

①包被样品：用0.05M PH9.0碳酸盐包被缓冲液分别将KRT84合成蛋白(序列为：ESYITNLRRQLEVLVSDQARLQAERNHLQDVLEGFKKKYEEEVVCRANAE，与B SA偶联)分别稀释至蛋白质浓度为1μg/ml、1μg/ml和2.5μg/ml。在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

②加样：加一定稀释的人血清(1∶10)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

③加羊抗人IgG/IgM/IgA碱性磷酸酶标记的二抗(1∶3000)于各反应孔中0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

④加底物液显色：于各反应孔中加入PNPP底物溶液0.1ml，37℃观察变化，405nm测量结果。所测数据以x(--)±s表示，统计分析采用SPSS13.0软件，多组比较采用LSD检验，Kruskal-Walls检验；相关性分析采用Spearman等级相关。以P＜0.05为差异有统计学意义。

通过ELISA实验，与健康组样本的平均水平比较，抗KRT84自我免疫抗体在RA的血清中具有显著性高表达(p＝0.00025)，表达率为57％(26/46)。见图4。同样方法发现抗A1AT和抗TBB的自身免疫抗体在RA和健康血液中的平均水平没有发生显著性变化，显示RA血液中没有抗A1AT和TBB自我免疫抗体。

以上ELISA结果显示瓜氨酸化的角蛋白KRT84是RA滑膜中自身免疫抗原，它与I型角蛋白单体相互配对成异二聚体，是毛发和指甲的主要蛋白质。除此之外，毛发角蛋白还可在舌和胸腺中表达。角蛋白是细胞中间丝的主要组成部分。我们以前曾运用免疫组织化学法，用广谱型细胞角蛋白抗体进行免疫组化时发现，RA滑膜组织中的多种细胞中均有细胞角蛋白表达。双标记免疫荧光显示，位于滑膜组织表层细胞表达的细胞角蛋白均被瓜氨酸化。免疫共沉淀法也显示RA滑膜组织中的角蛋白被瓜氨酸化了(Chang X，Jian X and Yan X.Expression and Citrullination of Keratin in Synovial Tissue of Rheumatoid Arthritis.Rheumatology International 2009，29：1337-1342.)。Franch等运用间接荧光免疫检测法在佐剂性关节炎大鼠模型血清中检测到了抗细胞角蛋白自我免疫抗体和抗波型蛋白自我免疫抗体。这些结果表明瓜氨酸化角蛋白在RA滑膜组织中有表达，并被瓜氨酸化。瓜氨酸化角蛋白可能扰乱RA免疫系统的平衡，并作为自身免疫抗原参与了自身免疫应答。

以上研究表明，在RA患者的血液中抗KRT84自身免疫抗体表达水平比正常人明显增高，因此，抗KRT84自我免疫抗体可以作为RA的诊断标记物。实际应用时，以ELISA技术、胶体金试纸等常见的抗原、抗体特异性结合的免疫化学方法均可以用于检测KRT84自我免疫抗体。

Claims

1.抗KRT84自我免疫抗体在制备诊断、检测类风湿性关节炎的诊断试剂中的应用。

2.KRT84蛋白在制备诊断、检测类风湿性关节炎的检测物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述KRT84蛋白的氨基酸序列为：ESYITNLRRQLEVLVSDQARLQAERNHLQDVLEGFKKKYEEEVVCRANAE，如序列表1所示。