CN104428674A - 前列腺癌和sar-cov的人血清生物标记物 - Google Patents

Abstract

抗-碳水化合物的抗体可通过以下方法检测：(a)使固定在基质上的低聚甘露糖-血清白蛋白缀合物的阵列与含有抗体的血清样品接触，接触条件为其中TM10抗体以至少微摩尔的亲和力结合所述缀合物的低聚甘露糖的条件；和(b)检测因而发生的所述样品的特定抗体与所述缀合物的低聚甘露糖的结合，作为所述抗碳水化合物的抗体的指示。

Description

前列腺癌和SAR-COV的人血清生物标记物

本发明是在国立卫生研究院授予的基金No.7U01CA128416-04的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年4月24日提交的美国申请No.61/637,674和于2013年2月1日提交的美国申请No.61/759,745的优先权，所述申请的公开内容以引用的形式全文纳入本文。

背景技术

前列腺癌(PCa)是男性中最常见的非上皮性恶性肿瘤。根据尸检研究，大量美国男性在他们30多岁的时候已经在他们的前列腺中患有癌症；该频率在男性70多岁的时候上升到约80％。尽管PCa有如此高的发病率，但在美国只有8％的男性在他们的一生中表现出影响他们生活质量的临床重大疾病[Stamey et al.1993]，并且在美国所有男性中只有3％死于PCa[Ries 1994]。没有其他人类癌症在非常高的恶性肿瘤的微观发病率和相对较低的死亡率之间具有如此巨大的差异。例如，乳腺癌——主要的女性恶性肿瘤——在5年内具有15％的死亡率[DeSantiset al.2011a；DeSantis et al.2011b]，同时，肺癌——总体上第三大常见的恶性肿瘤——在5年内具有超过86％的死亡率[Bach et al.2004]。

PCa的高发生率和相对较低的死亡率之间的这种显著差异已经促使本发明人提出以下疑问：1)是否存在实质上降低PCa的死亡率的宿主监视机制；2)是否能建立新的测定方法来检测PCa的高风险、高死亡率的状态以使得可以给予这些受试者有效的治疗以降低该疾病的死亡率；和3)是否存在在侵袭性癌症(aPCa)和其他临床无痛、非侵袭性癌症(iPCa)之间差异性表达的关键免疫学靶标。这类免疫原性要素的鉴定对于建立治疗和诊断策略来改善PCa患者的当前健康护理是重要的。

本发明人的小组已经研究了PCa的潜在免疫原性碳水化合物部分。通过对凝集素结合到组织微阵列上的模式进行评估，本发明人观察到PCa中很多聚糖标志物的异常表达[Wang et al.2011]。这些标志物是N-聚糖的前体、核心和内部序列，例如低聚甘露糖、三触角II型(Galβ1→4GlcNAc)链(Tri-II)或多价II型链(m-II)[Wang 2012]。这些标志物的常见免疫学特征在于它们通常被其它糖部分遮盖，并且它们属于一类通常“隐性的(cryptic)”的糖表位。重要的是，它们的组织表达或曝光量在PCa的不同Gleason分级和肿瘤转移中看起来明显不同[Lange et al.2012；Wang et al.2011]。这具有潜在的临床意义，因为Gleason分级是确定性手术治疗或放射治疗后PCa的复发的最有效预测指标(predictor)。

随后，本发明人在动物模型研究中发现基于肿瘤细胞的疫苗诱发了抗Man9-簇的抗体[Newsom-Davis et al.2009]。在这种情况下，Fas-配体转染的黑素瘤细胞被用于动物免疫接种。通过该免疫接种策略建立的单克隆抗体(mAb)TM10在流式细胞术分析中显示了独特的结合性质。TM10不与未转化的正常细胞的细胞表面结合但是强烈地结合许多小鼠和人肿瘤细胞系(包括来自黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌的那些)。有趣的是，本发明人的碳水化合物微阵列分析显示TM10识别由(Man9)n-匙孔血蓝蛋白(KLH)和[(Man9)4]n-KLH所呈递的寡甘露糖基表位[Newsom-Davis et al.2009]。最初构建了这些糖缀合物以显示由mAb 2G12识别的HIV-1中和表位[Ni et al.2006]，但是在该研究中发现它们呈递所述肿瘤相关的TM10-抗原。

通过使用碳水化合物微阵列，本发明人还研究了人免疫系统是否也识别这些肿瘤碳水化合物并引起(mount)抗体应答。本发明人分析了一组来自带有PCa的男性的血清(N＝17)，与来自带有良性前列腺增生(BPH)的男性的血清(N＝12)相比较。发现所述两个TM10-阳性的Man9-缀合物可高度有效地捕获来自这两个组的人血清IgG抗体。但是，在癌症组中捕获的抗体的水平显著高于在BPH组中检测的那些[Wang2012]。

总的来说，这些发现表明所述肿瘤相关的TM10抗原在体内具有免疫原性。这些靶标的异常表达或暴露可以在癌症受试者中引发特异的自身抗体反应。本发明人使用根治性前列腺切除术样本和血清的斯坦福同龄组(cohort)将本发明人的调查扩展至更大规模的血清学研究。如下面所总结的，本发明人建立了ELISA以便能够高度特异性检测人血清中的抗Man9-簇的抗体(包括IgG^Man9和M^Man9)。本发明人还证实抗Man9-簇的抗体广泛存在于人体循环中，并且证实这些自身抗体的水平在其癌症含有大体积的Gleason分级4和/或5的男性中显著地增加。

相关技术：

本发明的方面公开为Wang et al.2012,J Proteomics&Bioinformatics(5:090-095,DOI:10.4172/jpb.1000218)和Wang et al.2013,Drug Development Research[14(2):65-80,DOI:10.1002/ddr.21063]。斯坦福专利US7,981,625。

发明内容

本发明提供了用于检测抗碳水化合物的抗体的材料、系统和方法。在一个方面，所述方法包括以下步骤：(a)使在基质上的低聚甘露糖-血清白蛋白缀合物的阵列与含抗体的血清样品接触，基础条件为其中TM10抗体以至少微摩尔的亲和力结合所述缀合物的低聚甘露糖的条件；和(b)检测由此产生的所述样品的特定抗体与所述缀合物的低聚甘露糖的结合，作为所述抗碳水化合物的抗体的指示。在另一方面，所述组合物为包含有序的、固定的低聚甘露糖-血清白蛋白缀合物的阵列的微阵列、微孔板(microwell plate)或相关基质，其中所述缀合物的低聚甘露糖以至少微摩尔的亲和力结合TM10抗体。

在另一方面，本发明提供了用于通过检测抗碳水化合物的抗体如Ig^Man9和PSA来协同预测前列腺增生，特别是前列腺癌的临床结果的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使低聚甘露糖和前列腺特异性抗原

(PSA)与患者样品中的抗体接触，接触条件为其中所述抗体特异性结合所述抗原的条件；和(b)检测由此产生的所述抗体与所述抗原的特异性结合，其中所述抗体的特异性结合可协同预测前列腺增生的临床结果。

本发明包括具体的实施方案，及其所有的结合，其中：

-所述血清白蛋白是HAS或BSA；

-所述低聚甘露糖是man5或man9；

-所述缀合物具有结构(Man9GlcNAc2Asn)n-BSA或(Man5GlcNAc2Asn)n-BSA；

-所述阵列包含固定在所述基质的不同位置上的man5-和man9-血清白蛋白缀合物；

-所述阵列还包含固定在所述基质的不同位置上的ASOR、AGOR和/或OR

-所述方法从人血清抗体的未经筛选的库(unselected repertoire)中选择性检测TM10样抗Man9簇。

-所述样品来自患有前列腺发育异常的人并且所产生的结合的量指示前列腺增生的状态，如其中所述前列腺发育异常是侵袭性前列腺癌。

-所述基质是环氧树脂包被的载玻片且所述阵列是微阵列。

-所述基质是疏水性聚苯乙烯表面包被的塑料微孔板(microplate)(例如NUNC Polysorp)；

-所述缀合物是通过以下方式来固定：用溶于pH9.6的0.1M碳酸氢钠缓冲液溶液中的20μg/ml的Man9-BSA包被表面(例如，聚苯乙烯微孔板)并在37℃下孵育2小时；

-所述接触步骤包括用以1:500的稀释度溶于1％BSA、PBST中的所述血清样品包被所述缀合物并在4℃下孵育8-12小时。

例如，在具体实施方案的一种组合中：所述基质是疏水性聚苯乙烯表面包被的塑料微孔板；所述缀合物是通过以下方式来固定：用溶于pH9.6的0.1M碳酸氢钠缓冲液溶液的20μg/ml的Man9-BSA包被表面并在37℃下孵育2小时；并且所述接触步骤包括用以1:500稀释度溶于1％BSA、PBST中的所述血清样品包被所述缀合物并在4℃下孵育8-12小时。

本发明具体提供了所列举方面的所有组合，就如已努力将每一个组合单独提出。

具体实施方式

本发明提供了从人血清抗体的大库中选择性检测TM10样抗Man9簇，与用于检测人血清中的抗碳水化合物的抗体的现有技术方法相比，该检测具有显著提高的信号/背景比。本发明的方面包括：1)用于在前列腺癌中检测自身抗体的ASOR、AGOR和OR组(panel)；2)用于检测侵袭性PCa的Man₉-BSA(例如(Man9GlcNAc2Asn)n-BSA)和Man5-BSA组探针；3)用于检测TM10和TM10-样抗体的微阵列；和4)用于检测正常、BPH和PCa，且特别是侵袭性PCa中的TM10-样人血清自身抗体的ELISA方案。

除非另有说明，本公开内容不限于特定的过程、材料等，因为这些可以变化。本文使用的术语仅是为了描述具体实施方案，并且不意欲进行限制。除非上下文中另有明确说明，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代对象。

本发明涵盖所记载的具体和优选实施方案的所有组合。应理解，本文所述的实施例和实施方案仅仅是为了说明的目的，根据其的各种修改和变化将被建议给本领域技术人员，并且它们将被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请，包括其中的引用文献，都为了所有目的以引用的形式全文纳入本文。

实施例

实施例1.作为侵袭性前列腺癌的潜在血清生物标志物的抗低聚甘露糖的抗体

本研究将碳水化合物微阵列发现与作为侵袭性前列腺癌(PCa)的新血清生物标志物的抗低聚甘露糖的抗体的大规模血清学验证联系在一起。在实验上，建立了Man9-簇特异性的ELISA以实现在人血清中灵敏检测Man9抗体。使用该测定法对血清存储(bank)在斯坦福大学的患有PCa或良性前列腺增生(BPH)的男性的较大同龄组进行了表征。受试者包括患有100％的Gleason分级3癌症的患者(N＝84)、患有Gleason分级4和/或5癌症的患者(N＝204)和BPH对照(N＝135)。根治性前列腺切除术Gleason分级和生化(PSA)复发作为用于血清生物标记物评估的关键参数。发现IgG^Man9和IgM^Man9广泛存在于患有BPH的男性、以及患有癌症的男性的血清中。但是，这些抗体的反应性在具有最大体积的高分级癌症的受试者中显著增加。检测血清IgG^Man9和IgM^Man9显著预测了根除性前列腺切除术后PCa的临床结果。考虑到这些结果，本发明人公开了IgG^Man9和IgM^Man9是用于检测PCa的侵袭性进展的新的血清生物标志物，并且低聚甘露糖基抗原使用用于PCa亚分型(sub-typing)和靶向免疫治疗的有用靶标。

材料与方法

根治性前列腺切除术样本和血清的斯坦福同龄组。该同龄组包括已知其癌症全部由Gleason分级3(Gr3)组成的男性(N＝84)、其癌症含有1.0-100％的Gleason分级4和/或5(Gr4/5)癌症的男性(N＝204)、和被活检确认为PCa阴性的BPH对照(N＝135)。所述BPH同龄组选自已经过两轮系统性前列腺活检以排除存在癌症的男性。所述癌症同龄组选自这样的男性，即其已在斯坦福进行过根除性前列腺切除术，并且其前列腺被以每步3-mm的间隔进行切片并被定量表征了8个形态变量[Stamey et al.1993；Stamey et al.1999]。BPH、Gr3和Gr4/5的平均年龄分别为67.3(47-88)岁、61.35(37-75)岁和63.73(41-80)岁。Gr3的平均随访天数为2437.63(221-4884)并且Gr4/5的平均随访天数为2374.27(292-6174)，它们都具有定义为生化(PSA)复发的失败。

所使用的样本于1984和2006年间存储于斯坦福大学。在根除性前列腺切除术之前的手术前咨询过程中获得了血液并将其收集在带有二氧化硅凝块活化剂的试管中。离心后，收集血清并按等份试样储存在-80℃下直至进行分析。在患有BPH的男性为了BPH症状到斯坦福泌尿科(Stanford Department of Urology)就诊的过程中获得了他们的血清。所有的患者都经过了至少两次活检并被确认为癌症阴性。

碳水化合物的抗体和抗原。MAb TM10[Newsom-Davis et al.2009]由Thomas E Newsom-Davis博士惠赠，mAb 2G12由NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program惠赠。生物素化的抗人IgM的抗体、碱性磷酸酶(AP)缀合的抗人IgG和辣根过氧化物酶(HRP)-链霉亲和素缀合物购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。生物素化的伴刀豆凝集素A(Con A)购自EY Laboratories,Inc.(San Mateo,CA)。

表1.碳水化合物抗原和对照试剂

低聚甘露糖缀合物的合成和表征。根据所报道的方法[Wang et al.2004]制备了Man₉GlcNAc₂Asn和Man₅GlcNAc₂Asn。如之前所记载的[Ni et al.2006]，制备了(Man9)n-KLH和[(Man9)4]n-KLH。在以下过程中描述了糖缀合物、(Man₅)n-BSA和(Man₉)n-BSA的合成。

高效液相色谱(HPLC)。在40℃下，在带有Symmetry300^TM C₁₈柱(5.0μm，4.6×250mm)的Waters 626HPLC仪器上进行了分析型RP-HPLC。在10分钟内用含0.1％TFA的水以1mL/min的流速对所述Symmetry300柱进行洗脱(方法A)。在带有制备型Symmetry300^TMC₁₈柱(7.0m，19×250mm)的Waters 600HPLC仪器上进行了制备型HPLC。用含0.1％TFA的水以12mL/min的流速对这些柱子进行洗脱。

质谱(MS)。在Waters Micromass ZQ-4000单四极杆质谱仪上测量了所述ESI-MS谱

Man₉GlcNAc₂Asn-马来酰亚胺。将溶于含20％乙腈的磷酸盐缓冲液(50mM、3mL、pH7.4)的Man₉GlcNAc₂Asn(20mg)和N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯(BMPS)(26mg)的溶液在23℃下搅拌3小时。对所得残留物进行制备型HPLC纯化，得到产物Man₉GlcNAc₂Asn-马来酰亚胺(20mg，93％)。分析型HPLC(方法A):t_R＝5.7分钟；ESI-MS：计算的M＝2149；实测值1076.1[M+2H]²⁺。

Man₅GlcNAc₂Asn-马来酰亚胺。将溶于含20％乙腈的磷酸盐缓冲液(50mM、0.35mL、pH7.4)的Man₅GlcNAc₂Asn(3mg)和BMPS(6mg)的溶液在23℃下搅拌3小时。对所得残留物进行制备型HPLC纯化，得到产物Man₅GlcNAc₂Asn-马来酰亚胺(2.6mg，78％)。分析型HPLC(方法A):t_R＝5.5分钟；ESI-MS：计算的M＝1501；实测值751.2[M+2H]²⁺。

BSA-SH。将溶于磷酸盐缓冲液(50mM、2mL、pH7.2、含5mMEDTA)的BSA(40mg)和2-亚氨基硫烷(2-iminothiolane)(20mg)的混合物在23℃下震荡2小时。将所得残留物在Sephadex G-25柱上进行尺寸排阻色谱。用磷酸盐缓冲液(20mM、pH7.2)对所述柱进行洗脱。合并所得蛋白质级分并通过Bradford蛋白质测定(用于蛋白质定量)和使用Ellman试剂的游离巯基测定(用于游离巯基定量)进行定量。所得到的BSA-SH为41mg，含有32.6μM游离巯基基团。

(Man9)n-BSA。将溶于磷酸盐缓冲液(20mM、10mL、pH7.2、含5mM EDTA)的BSA-SH(41mg，含32.6μM游离巯基)和Man₉GlcNAc₂Asn-马来酰亚胺(10mg)的溶液在23℃下震荡3小时。将所得溶液冷冻干燥并将所得残留物在Sephadex G-25柱上进行尺寸排阻色谱。用磷酸盐缓冲液(10mM、pH6.6)对所述柱进行洗脱。合并所得蛋白质级分，得到Man₉GlcNAc₂-BSA(40mg)。通过蒽酮测定对所述碳水化合物组分进行定量(6.1mg碳水化合物，15％w/w的总Man₉GlcNAc₂-BSA)。

(Man5)n-BSA。将溶于磷酸盐缓冲液(20mM、1.5mL、pH7.2、含5mM EDTA)的BSA-SH(6mg，含4.8μM游离巯基)和Man5GlcNAc2Asn-马来酰亚胺(2.5mg)的溶液在23℃下震荡3小时。将所得残留物在Sephadex G-15柱上进行尺寸排阻色谱。用磷酸盐缓冲液(10mM、pH6.6)对所述柱进行洗脱。合并所得蛋白质级分，得到Man₅GlcNAc₂-BSA(6mg)。通过蒽酮测定对所述碳水化合物组分进行定量(1.15mg碳水化合物，19％w/w的总Man₅GlcNAc₂-BSA)。

碳水化合物微阵列。将不同复杂度的碳水化合物抗原溶解在PBS(糖蛋白缀合物)或盐水(多糖)中，并通过设计用于产生cDNA微阵列的高精度机器人(Cartesian Technologies’PIXSYS 5500C)将其点样到SuperEpoxy 2蛋白质载玻片上(ArrayIt Corporation,Sunnyvale,CA)。临使用前，将打印的微阵列载玻片在室温下在1XPBS中洗涤5分钟，并用1％BSA-PBS在室温下封闭30分钟。然后将它们在室温下用50μl抗体或凝集素孵育1小时，随后进行洗涤，并接着用滴定过的二抗或带有不同荧光标签(Cy5、PE、或FITC)的链霉亲和素缀合物在室温下孵育30分钟。将染色的载玻片漂洗5次并在室温下进行离心脱水，然后扫描荧光信号。使用ScanArray5000A微阵列扫描仪(PerkinElmer Life Science)扫描所述染色的微阵列。使用ScanArrayExpress软件(PerkinElmer Life Science)计算每个阵列斑点及其背景的荧光强度值。

抗原特异性的ELISA测定。采用了之前记载的用于检测抗-碳水化合物的抗体的方案[Wang et al.2002]，并进行了修改。简而言之，将(Man₉)n-BSA或(Man₅)n-BSA稀释在0.1M碳酸氢钠缓冲溶液(pH9.6)中，用于包被在ELISA微孔板上，随后使用1％BSA、PBST进行封闭。将人血清以1:500稀释度溶于1％BSA、PBST中用于进行ELISA。通过缀合的二抗的组合显示了所结合的抗-Man9-簇的抗体，所述组合包括山羊抗-人IgG-Fc特异性抗体的碱性磷酸酶(AP)缀合物和生物素化的山羊抗-人IgM-Fc特异性抗体，和随后的辣根过氧化物酶(AP)-链霉亲和素缀合物。

统计学分析。在以下分析中应用了SAS Institute’s JMP andJMP-Genomics软件(Cary,North Carolina)。

碳水化合物微阵列：使用JMP-Genomics对由ScanArray Express收集的微阵列数据集进行了进一步分析。

ELISA：进行了单因素方差分析(Oneway AVONA)以比较组间和/或亚组间所获得的ELISA结果。使用非参数统计检验(Wilcoxon迭和方法)计算比较组之间的差异显著性。使用拟合模型模式中的最小二乘拟合分析来估算血清标记物或标记物的组合在预测Gr4/5癌症的百分数或体积时的权重(weight)。使用正态逻辑拟合模型来研究作为用于PCa的差异诊断或用于该疾病的临床结果预后的分类指标(classifier)的血清标记物的性能。在关联和多元分析(Associations andMultivariate analyse)中使用REML(约束最大似然)法来估计血清标记物组合的性能。

结果

TM10-肿瘤抗原的设计和构建。构建了本发明人在之前的微阵列研究中使用的这两种新糖缀合物——(Man9)n-KLH和[(Man9)4]n-KLH——来研究针对HIV-1碳水化合物的免疫应答[Newsom-Davis et al.2009；Ni et al.2006；Wang et al.2011]。本发明人推断在免疫测定中，所述KLH载体会具有捕获不相关的抗-KLH的抗体的缺点，如果这种特异性存在于人血清中的话。因此，本发明人构建了其他新糖缀合物(Man9)n-BSA，以选择性地检测抗-Man9-簇的抗体。

为了确定(Man9)n-BSA是否保留肿瘤特异性的TM10-糖表位，本发明人在碳水化合物微阵列分析中对该化合物进行了表征。在用于将低聚甘露糖连接到蛋白质载体上的连接部分(linkage)上以及在Man9单元和相应的载体之间的摩尔比上，(Man9)n-BSA和(Man9)n-KLH是类似的。相比之下，为了模拟由HIV-1的gp120糖蛋白表达的高密度Man9-簇，通过引入确定的支架以显示四价低聚甘露糖簇来构建了[(Man9)4]n-KLH[Li and Wang 2004；Ni et al.2006]。通过与HIV-1中和mAb2G12结合确定了其HIV-1特异性的糖-表位的表达[Sanders et al.2002；Scanlan et al.2002；Trkola et al.1996；Wang and Herzenberg2011]。

如本发明人所预料的，这三个Man9-簇缀合物以相似方式与Con A发生反应，但是以不同方式与2G12反应。ConA检测带有C-3、C-4和C-5羟基的末端甘露糖[Goldstein et al.1965]。因此，Con A与这些缀合物的结合不依赖于Man9-簇构型。[(Man9)4]n-KLH被2G12高度性且选择性地结合，这反应了其HIV-1特异性的M9(2G12)糖-表位的表达。与[(Man9)4]n-KLH不同，(Man9)n-BSA和(Man9)n-KLH与抗肿瘤mAb TM10高度反应。因此，这种微阵列分析证明了所述新设计的糖缀合物——(Man9)n-BSA——很好地保留了TM10-反应性表位。考虑到(Man9)n-BSA和(Man9)n-KLH在蛋白质载体上是不同的，所述TM10-糖-表位明显由它们共同的Man9-簇组分呈递。由于这两个TM10-阳性缀合物仅少量与2G12反应，所述肿瘤相关的TM10-表位与所述HIV-1特异性的2G12-糖表位不同。

用于检测TM10-样抗体的高度特异性的ELISA的建立。本发明人还检测了(Man9)n-BSA是否适用于ELISA平台来支持特异性检测TM10-样抗-Man9簇的抗体。对于该研究，本发明人构建了额外的糖-缀合物——(Man5)n-BSA。(Man9)n-BSA和(Man5)n-BSA共有Man5GlcNAc2Asn部分和用于将它们连接到BSA分子上的连接部分。与在非还原性末端显示Manα1,2Man部分的Man9不同，Man5不表达末端的Manα1,2Man部分，但是其在其末端呈现了Manα1,3Man和Manα1,6Man部分。

本发明人在用(Man9)n-BSA和(Man5)n-BSA包被的微量滴定板上分别确定了CoA和TM10的ELISA结合曲线。将这些平板用系列稀释的糖缀合物包被并与恒定浓度的TM10或ConA反应。这样的测定法设计对于表位定位和碳水化合物-抗-碳水化合物相互作用的相对结合亲和力的测量是实用的。在该分析中，使用CoA来监测所述两个糖缀合物是否被定量固定在ELISA平板上以及它们的低聚甘露糖部分是否可用于特异性结合。本发明人的结果表明与(Man9)n-BSA和(Man5)n-BSA的CoA结合曲线在0.25-10.00μg/ml的抗原浓度范围内是接近线性的。两个缀合物看起来都稳定地固定在ELISA平板上，它们的末端甘露糖很容易地与Con A发生反应。本发明人的数据也显示了TM10高度地且选择性地与(Man9)n-BSA反应，但是其不与(Man5)n-BSA结合。其Man9结合曲线在1.0-20.00μg/ml的抗原浓度范围内是接近线性的。因此，尽管这两个缀合物都显示了Con A-表位，(Man9)n-BSA更好地保留了所述肿瘤特异性的TM10-糖-表位。

随后，本发明人研究了用于在人血清中测量抗-Man9-抗体的ELISA条件。本发明人测定了436份以1:500的恒定稀释度溶于1％BSAPBST中时所测量的血清的ELISA结果。在初步实验中确定了该条件以使抗-Man9信号(Ig^Man9)与所述测定背景(Ig^Bg)的比例最大化。ANOVA分析表明该测定检测出了相对于背景的高度显著水平的IgG^Man9(P<0.0001)和IgM^Man9(P<0.0001)。接收者操作特征(ROC)曲线分别产生了用于检测IgG^Man9和IgM^Man9的0.99709和0.97324的曲线下面积(AUC)。因此，该测定达到了从人血清抗体库中挑选出抗-Man9-簇的抗体所需的敏感度和特异性。

作为用于血清生物标记物评估的“黄金标准”的前列腺切除术Gr4/5癌症。本发明人接下来的目标是在前列腺切除术前的血清中测量抗-Man9-簇的抗体，所述前列腺切除术前的血清是从以下男性中获得的：在1984至2006年间在斯坦福大学通过手术治疗PCa的男性，和在同一时期在斯坦福泌尿科所见的带有BPH症状的男性。所述后者男性经过了至少两轮的超声引导的穿刺活检以排除PCa的存在。所述前者选自其前列腺已经经过了由一个病理学家进行的全面组织病理学检查[Stamey et al.1999]。将所述根除性前列腺切除术的样本以每步3-mm的间隔进行切片并定量了8个形态变量。将这些形态变量与临床数据关联后，Stamey和他的同事们[Stamey et al.1999]认识到Gr4/5癌症在肿瘤中的百分比是最重要的预后标记物，预测了生化失败(定义为在两次连续的测量中通过TOSOH测定得到的血清PSA≥0.07ng/ml)的风险。因此，本发明人进行了正态逻辑拟合分析以检验为选择用于该研究的同龄组是否也显示了这样的相关性。本发明人发现作为用于该模型分析的单独分类指标的总体积和Gr4/5百分比分别产生了用于预测生化复发的0.91165和0.91921的AUC值。因此，这两个参数在该同龄组中在预测前列腺切除术后失败或治愈方面是同等有效的。因此，该同龄组对于评估aPCa的血清标记物以及对于预测根除性前列腺切除术治疗PCa后的临床结果是高度有价值的。

在患有BPH或PCa的男性中检测TM10样抗Man9簇的自身抗体。使用所述Man9-簇ELISA来分析所述斯坦福同龄组，本发明人研究了TM10样抗体是否存在于人体循环中以及这些抗-肿瘤碳水化合物的抗体的滴度在患有BPH的男性、患有只含Gr3的癌症的男性以及其癌症中含有不同量的Gr4/5的男性之间是否不同。在一个实验中，本发明人在该同龄组中分析了423例受试者。这些包括患有Gr3癌症的患者(N＝84)、患有Gr4/5癌症的患者(N＝204)以及年龄相匹配的BPH对照(N＝135)。为了检验抗-Man9的抗体的检测是否预测了侵袭性PCa的存在情况，根据给定受试者中Gr4/5癌症的体积将患有Gr4/5癌症的男性亚分组成四分位数(quartile)。

在所有亚组中检测了IgM^Man9。如Wilcoxon非参数检验所测定的，IgM^Man9的水平在患有BPH的男性和患有Gr3癌症的男性之间没有显著差异。但是，在患有Gr4/5癌症的某些亚组中的IgM^Man9水平与所述BPH组和Gr3组显著不同。值得注意的是，具有最大总体积的Gr4/5癌症(≥3.99cc)的两个亚组表达的IgM^Man9水平高于BPH(BPH对比Gr4/53.99-7.0211cc以及BPH对比Gr4/57.03-40.67cc的p值分别为0.0012和0.0149)和Gr3(Gr3对比Gr4/53.99-7.0211cc以及Gr3对比Gr4/57.03-40.67cc的p值分别为0.0130和0.0835)。类似于所述IgM的情况，本发明人在所有亚组中检测了大量的IgG^Man9。在具有最大体积的Gr4/5癌症(≥7.03cc)的亚组中的IgG^Man9的水平显著高于在患有BPH(p＝0.0084)、Gr3癌症(P＝0.0064)的男性以及Gr4/5癌症的其他亚群(其与Gr4/5<0.91cc、Gr4/50.91-3.95cc和Gr4/53.99-7.0211cc配对时的P值分别为0.0140、0.0008和0.0526)中检测到的那些。

本发明人检验了Ig^Man9抗体是否与前列腺重量相关，前列腺重量是之前发现的与血清PSA水平强烈相关的参数[Stamey et al.2004]。为此目的，本发明人基于所述前列腺重量将所有癌症受试者亚分组成四分位数。IgM^Man9水平和IgG^Man9水平都没有显示与所述前列腺重量相关。本发明人还检验了抗体水平与其他癌症参数的相关性，例如非侵袭性Gr3癌症的体积。不同于与所述Gr3水平以及前列腺重量都是正相关的血清PSA值，血清IgM^Man9水平和IgG^Man9水平与这些参数都没有相关性。

在该同龄组中的大部分患者(N＝259，61.2％)都处在PSA“灰色地带”，PSA值<10.0ng/ml。在这些水平下，PSA不能高度特异地区分患有PCa的男性和患有BPH的男性或者以高可信度预测术后复发风险[Stamey et al.2004]。如这些数据的ANOVA分析所示的，在这种有挑战性的群体中再现了Ig^Man9标记(signatur)的性能。在具有较大体积的Gr4/5PCa的亚群中，IgM^Man9和IgG^Man9的水平都显著增加。逻辑回归分析表明了Ig^Man9在预测前列腺切除术后的男性临床结果上是非常重要的。IgM^Man9加上PSA和单独的PSA分别产生了0.72338和0.65221的AUC值。该结果表明了IgM^Man9和PSA在预测PCa的临床结果方面具有协同作用。

使用散点图矩阵来检验这些预测指标在检测较大体积的Gr4/5PCa和预测患者的临床结果中的相对值。对Log2-PSA、Log2-IgM^Man9和Log2-IgG^Man9的配对的视觉观察显示了在所述图的上部分和右边部分中的红点簇，所述红点簇和这些血清标记物的不断增加的值有关。

讨论

由mAb TM10和人血清IgM^Man9和IgG^Man9识别的N-聚糖隐性糖表位。本发明人已经通过423例受试者的大规模血清学研究证明了Ig^Man9存在于人体循环中。这个结果与以下事实形成显著对比：即通过HIV-1疫苗诱导抗-低聚甘露糖的抗体的广泛的、长达十年的搜寻都没有成功[Barouch 2008；Ni et al.2006；Wang 2006；Willyard 2010]。因此，本发明人想知道所述肿瘤-相关的低聚甘露糖基抗原在它们的结构特征上是否以及如何不同于2G12阳性的HIV-1碳水化合物。MabTM10和2G12已经作为关键试剂来检测由2G12识别的HIV-1碳水化合物和所述肿瘤-相关的TM10-碳水化合物之间的相似性和差异。

本发明人通过碳水化合物微阵列对TM10和2G12的结合特异性进行了表征，所述碳水化合物微阵列包含一组具有不同结构特征的甘露糖簇。这两个mAb在结合活性上不同于具有不同簇构型的低聚甘露糖基抗原。2G12特异性针对由模拟甘露寡糖抗原的HIV-1病毒粒子呈递的[(Man9)4]n-KLH所呈递的高密度Man9-簇；但是，TM10以相似方式与点样在同一阵列上的三种Man9缀合物进行反应，而没有选择性。在抗原特异性ELISA中，本发明人还证明了TM10与(Man9)n-BSA结合而不与(Man5)n-BSA结合。(Man9)n-BSA和(Man5)n-BSA在末端甘露糖基部分上存在不同。所述前者显示Man 1,2Man-部分；所述后者不表达末端Man 1,2Man-部分，但是在其末端提供了Man 1,3Man-部分和Man 1,6Man-部分。因此，TM10识别也会被2G12结合的末端Man 1,2Man-糖-表位。所述肿瘤-相关的TM10-抗原仅在其Man9-簇构型方面不同于HIV-1-特异性的2G12-抗原。

血清Ig^Man9的检测显著预测了侵袭性癌症的存在。使用斯坦福参照组，可以检验血清标记物是否与PCa严重程度的关键外科参数(如高％和大体积Gr4/5癌症的存在)相关，以及对这种标记物的检测是否预测了所述疾病的临床结果。为了解决这些问题，本发明人已经进一步进行了统计学分析来评估Ig^Man9在检测PCa患者中大体积和高％的Gr4/5癌症方面的效力。首先，本发明人进行了最小二乘拟合分析以针对预测大体积或高％Gr4/5来单独测试IgMMan9和IgGMan9。对于预测％Gr4/5，IgMMan9统计数据是P<0.0001、RSq 0.04和RMSE 33.614；IgGMan9的值是P＝0.0036、RSq 0.02、RMSE 33.95。当所述模型分析的目标是G4/5癌症的体积时，IgMMan9统计数据是P＝0.066、RSq 0.01、RMSE 5.1788；IgGMan9的值是P＝0.0008、RSq 0.03和RMSE 5.1318。因此，IgMMan9和IgGMan9显著地预测了G4/5癌症的％或体积。由RSq值所评估的每个参数的显著性程度因参数不同而变化。

接下来，本发明人检验了IgM^Man9和IgG^Man9在与PSA协同作用时是否提高了预测效果，所述PSA能够预测癌症体积或前列腺重量。本发明人观察到PSA加上Ig^Man9(IgM^Man9和IgG^Man9)在该同龄组中预测G4/5癌症的％或体积时具有高度显著性。对于检测％Gr4/5癌症，PSA和PSA加上Ig^Man9的RSquare(RSq)值分别为0.07和0.12。这意味着两个标记物的组合将影响的权重从通过单独PSA的7％增加到所有变量的12％。当计算Gr4/5的体积时，PSA和PSA加上Ig^Man9的RSq值分别是被加权为24％和28％的0.24和0.28。

Ig^Man9和PSA显示了在预测根除性前列腺术后的临床结果方面的协同作用。前列腺穿刺活检(PNBx)是另一种主要的临床检验，其目前被用于对新诊断的PCa患者进行风险分级。在美国，约90％的患者被诊断为T1c临床阶段，所述T1c临床阶段的特征在于具有升高的PSA，但是具有正常数字直肠检查，并且PNBx揭示了存在恶性肿瘤。大多数PCa是在低PSA(<10ng/ml)和无可触知前列腺团块(prostate mass)(cT1c)的情况下诊断出的。在这些情况下，所述PNBxGleason评分，即两个最突出的Gleason分级的总和，是用于赋予PCa或iPCa的临床决策的主要因素。但是，与根治性前列腺切除术Gleason评分相比，在PNBx中有很多欠分级(under-grading)和过分级的情况[D'Amico et al.1999；Grossfeld et al.2001；Isariyawongse et al.2008]。考虑到最近关于在杜克大学接受根治性前列腺切除术的2963例PCa的报道[Isariyawongse et al.2008]，所述诊断的Gleason总和与病理的Gleason总和之间的差异比例是相当高的。总的来说，诊断的Gleason总和中的55.8％不同于最终外科病理学中的那些，包括41.2％的病例中的欠分级诊断和12.8％的病例中的过分级。

可以理解的是，血清PSA水平和PNBx都没有正确揭示前列腺中癌症的体积或分级[King et al.2004；Noguchi et al.2001]。对受试者中Gr4/5PCa的体积或％的测量只有在根治性前列腺切除术之后才能实现。因此，尤其是在低PSA(＜10ng/ml)的人群中，鉴定作为大体积/高百分比的Gr4/5PCa(一类明确定义的侵袭性PCa)的预测指标的Ig^Man9具有重要意义。然而，当Gr4/5癌症的外科的％或体积用作临床状态的预测指标时，本文所计算的两种血清标记物的预后能力(prognosticpower)的总和(约72％)仍然显著低于由ROC曲线所评估的约91％精确度。PCa预后和差异诊断的更好性能可通过整合这些抗聚糖的抗体和其他血清标记物的诊断潜能来获得，所述抗体或血清标记物为例如针对PCa特异性蛋白的自身抗体[Massoner et al.2012]、O-糖肽[Wandallet al.2010]和由膳食的非人唾液酸Neu5Gc所引起的外来自身抗体[Padler-Karavani et al.2011]。

参考文献

Bach PB，Elkin EB，Pastorino U，Kattan MW，Mushlin AI，Begg CB，Parkin DM.2004.Benchmarking lung cancer mortality rates in current and former smokers.Chest126(6)：1742-9.

Barouch DH.2008.Challenges in the development of an HIV-1vaccine.Nature455(7213)：613-9.

D′Amico AV，Renshaw AA，Arsenault L，Schultz D，Richie JP.1999.Clinicalpredictors of upgrading to Gleason grade 4or 5disease at radical prostatectomy：potentialimplications for patient selection for radiation and androgen suppression therapy.Int J RadiatOncol Biol Phys 45(4)：841-6.

DeSantis C，Howlader N，Cronin KA，Jemal A.2011a.Breast cancer incidence ratesin U.S.women are no longer declining.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 20(5)：733-9.

DeSantis C，Siegel R，Bandi P，Jemal A.2011b.Breast cancer statistics，2011.CACancer J Clin 61(6)：409-18.

Goldstein I J，Hollerman CE，Smith EE.1965.Protein-Carbohydrate Interaction.Ii.Inhibition Studies on the Interaction of Concanavalin a with Polysaccharides.Biochemistry4：876-83.

Grossfeld GD，Chang J J，Broering JM，Li YP，Lubeck DP，Flanders SC，Carroll PR.2001.Under staging and under grading in a contemporary series of patients undergoingradical prostatectomy：results from the Cancer of the Prostate Strategic Urologic ResearchEndeavor database.J Urol 165(3)：851-6.

Isariyawongse BK，Sun L，Banez LL，Robertson C，Polascik TJ，Maloney K，Donatucci C，Albala D，Mouraviev V，Madden JF and others.2008.Significant discrepanciesbetween diagnostic and pathologic Gleason sums in prostate cancer：the predictive role of ageand prostate-specific antigen.Urology 72(4)：882-6.

King CR，McNeal JE，Gill H，Presti JC，Jr.2004.Extended prostate biopsy schemeimproves reliability of Gleason grading：implications for radiotherapy patients.Int J RadiatOncol Biol Phys 59(2)：386-91.

Lange T，Ullrich S，Mtiller I，Nentwich MF，Stuebke K，Feldhaus S，Knies C，Hellwinkel OJC，Vessella RL，Abramjuk C and others.2012.Human Prostate Cancer in aClinically Relevant Xenograft Mouse Model：Identification of β(1，6)-branchedOligosaccharides as a Marker of Tumor Progression.Clinical Cancer Res.PublishedOnlineFirst on January 18，2012；DOI：10.1158/1078-0432.CCR-11-2900.

Li H，Wang LX.2004.Design and synthesis of a template-assembled oligomannosecluster as an epitope mimic for human HIV-neutralizing antibody 2G 12.Org Biomol Chem2(4)：483-8.

Massoner P，Lueking A，Goehler H，Hopfner A，Kowald A，Kugler KG，AmersdorferP，Horninger W，Bartsch G，Schulz-Knappe P and others.2012.Serum-autoantibodies fordiscovery of prostate cancer specific biomarkers.Prostate 72(4)：427-36.

Newsom-Davis TE，Wang D，Steinman L，Chen PF，Wang LX，Simon AK，ScreatonGR.2009.Enhanced immune recognition of cryptic glycan markers in human tumors.CancerRes 69(5)：2018-25.

Ni J，Song H，Wang Y，Stamatos NM，Wang LX.2006.Toward a carbohydrate-basedHIV-1vaccine：synthesis and immunological studies of oligomannose-containingglycoconjugates.Bioconjug Chem 17(2)：493-500.

Noguchi M，Stamey TA，McNeal JE，Yemoto CM.2001.Relationship betweensystematic biopsies and histological features of 222radical prostatectomy specimens：lack ofprediction of tumor significance for men with nonpalpable prostate cancer.J Urol166(1)：104-9；discussion 109-10.

Padler-Karavani V，Hurtado-Ziola N，Pu M，Yu H，Huang S，Muthana S，ChokhawalaHA，Cao H，Secrest P，Friedmann-Morvinski D and others.2011.Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers andimmunotherapeutics in cancer.Cancer Res 71(9)：3352-63.

Ries LA.1994.Influence of extent of disease，histology，and demographic factors onlung cancer survival in the SEER population-based data.Semin Surg Oncol 10(1)：21-30.

Sanders RW，Venturi M，Schiffner L，Kalyanaraman R，Katinger H，Lloyd KO，Kwong PD，Moore JP.2002.The mannose-dependent epitope for neutralizing antibody 2G 12on human immunodeficiency virus type 1glycoprotein gp120.J Virol 76(14)：7293-305.

Scanlan CN，Pantophlet R，Wormald MR，Ollmann Saphire E，Stanfield R，WilsonIA，Katinger H，Dwek RA，Rudd PM，Burton DR.2002.The broadly neutralizing anti-humanimmunodcficiency virus type 1antibody 2G 12recognizes a cluster of alpha1--＞2mannoseresidues on the outer face of gp120.J Virol 76(14)：7306-21.

Stamey TA，Caldwell M，McNeal JE，Nolley R，Hemenez M，Downs J.2004.Theprostate specific antigen era in the United States is over for prostate cancer：what happened inthe last 20years？J Urol 172(4Pt 1)：1297-301.

Stamey TA，Freiha FS，McNeal JE，Redwine EA，Whittemore AS，Schmid HP.1993.Localized prostate cancer.Relationship of tumor volume to clinical significance for treatmentof prostate cancer.Cancer 71(3Suppl)：933-8.

Stamey TA，McNeal JE，Yemoto CM，Sigal BM，Johnstone IM.1999.Biologicaldeterminants of cancer progression in men with prostate cancer.Jama 281(15)：1395-400.

Trkola A，Purtscher M，Muster T，Ballaun C，Buchacher A，Sullivan N，Srinivasan K，Sodroski J，Moore JP，Katinger H.1996.Human monoclonal antibody 2G 12defines adistinctive neutralization epitope on the gp 120glycoprotein of human immunodeficiencyvirus type 1.J Virol 70(2)：1100-8.

Wandall HH，Blixt O，Tarp MA，Pedersen JW，Bennett EP，Mandel U，Ragupathi G，Livingston PO，Hollingsworth MA，Taylor-Papadimitriou J and others.2010.Cancerbiomarkers defined by autoantibody signatures to aberrant O-glycopeptide epitopes.CancerRes 70(4)：1306-13.

Wang D.2012.N-glycan cryptic antigens as active immunological targets in prostatecancer patients.Journal Proteomics Bioinform 5：090-095.

Wang D，Herzenberg LA.2011.Glycan markers and auto-antibody signatures inHIV-1and HIV-1-associated malignancies.Patent application No.20110177090，Files Jan19，2011.Assignee：The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University，PaloAlto，CA.

Wang D，Herzenberg LA，Peehl D，Herzenberg LA.2011.Prostate cancer glycanmarkers and auto-antibody signatures.U.S.Patent No.7，981，625.July 19，2011.Assigned toThe Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University，Palo Alto，CA(US).

Wang D，Liu S，Trummer B J，Deng C，Wang A.2002.Carbohydrate microarrays forthe recognition of cross-reactive molecular markers of microbes and host cells.NatBiotechnol 20(3)：275-81.

Wang LX.2006.Toward oligosaccharide-and glycopeptide-based HIV vaccines.Curr Opin Drug Discov Devel 9(2)：194-206.

Wang LX，Ni J，Singh S，Li H.2004.Binding of high-mannose-type oligosaccharidesand synthetic oligomannose clusters to human antibody 2G 12：implications for HIV-1vaccine design.Chem Biol 11(1)：127-34.

Willyard C.2010.Tiny steps towards an HIV vaccine.Nature 466(7304)：S8.

实施例2.在前列腺癌症患者中作为活性免疫学靶标的N-聚糖隐性抗原

尽管肿瘤相关的异常糖基化已经被识别了几十年，关于进化的肿瘤糖组(glycome)的宿主识别的信息仍然不清楚。这里本发明人报道了对很多肿瘤相关碳水化合物的在人体中血清抗体反应性和潜在免疫原性进行了碳水化合物微阵列分析。这些是N-聚糖的前体、核心和内部序列，它们通常被其它糖部分所遮盖并属于一般是“隐性的”一类糖抗原。但是，这些碳水化合物的病毒表达可引起宿主免疫应答。例如，HIV-1和SARS-CoV分别显示Man9簇以及三触角或多触角II型(Galβ1→4GlcNAc)链(Tri/m-II)；病毒中和抗体通常靶向这些糖部分。因此，本发明人想知道相应碳水化合物的前列腺肿瘤表达是否在体内引起了抗体应答。通过使用碳水化合物微阵列，本发明人分析了一组人血清，包括来自前列腺癌症患者的17个样品和来自患有良性前列腺增生(BPH)的男性的12个样品。本发明人观察到在患有BPH的男性、以及患有癌症的男性的血清中可很容易地检测到靶向所述Man9-或三-/m-II-自身抗原的IgG抗体。重要的是，这些抗体活性在前列腺癌症患者中选择性地增加。因此，人免疫系统主动识别这些N-聚糖隐性碳水化合物并产生靶向抗体。

缩写：OR：血清类粘蛋白；ASOR：脱唾液酸-血清类粘蛋白；AGOR：去半乳糖-血清类粘蛋白；Tri/m-II：三触角和多价II型链；Tri/m-Gn：三触角和多价GlcNAc核心；PHA-L：菜豆(Phaseolus vulgaris)-L凝集素；ISNA：西洋接骨木(Phaseolus vulgaris)I凝集素；GNA：雪花莲(Galanthus nivalis)凝集素；PCa：前列腺癌；BPH：良性前列腺增生。

引言

对肿瘤-相关的异常糖基化的识别因基于碳水化合物的癌症生物标志物的潜力而已引起了极大兴趣。对于前列腺癌(PCa)，已经鉴定并表征了很多肿瘤相关的异常碳水化合物，包括PSA的糖同种型(1-3)、硫酸化糖脂(4)、和血型抗原及其前体(5、6)。所述后者代表了一组不同的O-聚糖。这些包括，但不限于，T抗原(7、8)、Tn、唾液酸基和globo-H(9)；支链和直链II型骨架区域(I和i抗原)；双岩藻糖基化的Le^y或唾液酰-Le^x、血型H和Le^b的单唾液酸化合物或单岩藻糖基化合物(10)；基于I型骨架的唾液酰-Le^a(11)；以及与转移性PCa相关的唾液酸-Le^x(12)。

在碳水化合物研究人员正在探索肿瘤糖组的多样性时，其他研究者已经将他们的注意力转向肿瘤-相关的碳水化合物的免疫学特性。Wandall et al开发了O-糖肽微阵列来监测针对肿瘤抗原的人自身抗体应答，他们成功地使用了O-糖肽微阵列在来自乳腺、卵巢和前列腺的癌症患者的血清中检测针对衍生自MUC1的不同异常O-糖肽表位的癌症相关IgG自身抗体(13)。去年Blixt et al报道了与来自对照受试者的血清相比，来自癌症患者的血清中自身抗体的存在和水平明显更高，并且观察到与年龄的高度显著相关性。针对所述core3MUC1和STnMUC1糖组(分别为GlcNAcβ1-3GalNAc-MUC1和NeuAcα2,6GalNAc-MUC1)的自身抗体子集的高水平与降低的发病率和增加的转移时间显著相关。这些结果表明在早期乳腺癌中针对异常糖基化MUC1的自身抗体与较好的预后相关(14)。

Padler-Karavani et al(15)发现人类癌症可以代谢方式整合膳食非人唾液酸Neu5Gc。该单糖与人唾液酸N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)相差一个氧原子但其能够引起差异性抗体应答。通过使用新的唾液酸聚糖微阵列呈现多个Neu5Gc聚糖和对照Neu5Ac-聚糖，这些研究者发现针对Neu5Gcalpha2-6GalNAcα1-O-Ser/Thr(GcSTn)的抗体在患有癌的患者中比在患有其它疾病的患者中更显著。因此，认为这些外来自身抗体和外来自身抗原是用于在人类癌症中诊断、预后和治疗应用的潜在靶标。

本发明人的实验室已经研究出了在不同Gleason分级的PCa和转移性肿瘤之间差异表达的一类隐性聚糖标记物(16-18)。这些标记物包括高-甘露糖(Man9)簇；三触角II型或多价II型(Tri/m-II)链；和去半乳糖基衍生物、Tri-/m-Gn(GlcNAc)-糖表位。它们共有N-聚糖Man-核心但是在末端糖部分上不同。与通常被Neu5Ac加帽(cap)的完全糖基化的细胞N-聚糖不同，这些靶标将一般是“隐性的”内部序列暴露给免疫系统。但是，一些病毒病原体在其病毒颗粒表面上表达这些碳水化合物。例如，HIV-1包膜糖蛋白gp120被Man9簇重重包被(19，20)并且所述SARS-CoV的刺突蛋白表达Tri/m-II部分(21)。重要的是，病毒中和抗体通常靶向这些碳水化合物(19-23)。

未解决的问题之一是宿主免疫系统是否识别并响应于所述肿瘤表达的N-聚糖隐性碳水化合物。最近，Newsom-Davis和Wang et al报道了基于肿瘤细胞的疫苗激发了抗-Man9-簇的抗体(24)。在该实验中，将Fas-配体-转染的黑素瘤细胞用于动物免疫接种。流式细胞术分析表明，由这种免疫接种策略所建立的单克隆抗体(mAb)TM10显示了独特的结合性质。TM10不与未转化的正常细胞的细胞表面结合但是与很多小鼠和人肿瘤细胞系(包括来自黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌的那些)强烈结合。本发明人的碳水化合物微阵列分析显示，TM10识别由两个Man9簇——(Man9)n-匙孔血蓝蛋白(KLH)和[(Man9)4]n-KLH(24)——所呈递的低聚甘露糖基表位，构建了所述两个Man9簇以研究由人mAb2G12所识别的HIV-1中和表位(19，20)。

这些发现促进本发明人去研究人免疫系统是否识别并响应于这些肿瘤-相关的隐性糖抗原。在目前的研究中，本发明人使用碳水化合物微阵列表征了一组来自患有PCa的男性的血清和来自患有BPH的男性的血清。本发明人的理论是，如果这些肿瘤碳水化合物在体内具有免疫原性，则癌症患者可能产生针对相应靶标的抗体应答。通过碳水化合物微阵列检测PCa受试者中的这些抗体将提供证据来确定(pin down)所述特定的免疫学靶标。该研究的结果总结于该报告中。

材料与方法

血清样本、抗原和抗体

用于在本研究中进行分析的一组29份库存的人血清样本由Egenix,Inc.(Millbrook,NY)的Dr.Zeqi(Joe)Zhou惠赠。PCa(N＝17)或BPH(N＝12)的诊断是基于临床中的前列腺穿刺活检的结果。但是，没有获得该同龄组的外科Gleason分级信息。在本发明人进行所述分析前对所述样本并不清楚(bind)。

用于碳水化合物微阵列测定的Cy3-缀合的抗-人IgG购自Sigma(St.Louis,MO)。表2中列出了在本研究中所使用的碳水化合物抗原、糖缀合物和其他抗原制品。

碳水化合物微阵列

所使用的微阵列包含32种不同的抗原制品，包括16种潜在的自身抗原和16种常用的环境抗原。选择后者是因为它们通常在人体循环中检测显著的抗-碳水化合物的抗体并且能提供用于在给定的受试者中监测全抗体谱(global antibody profile)的对照探针。N-聚糖隐性糖部分的成员(包括Man-core、Tri-/m-Gn和Tri/m-II)是由一组点样的(spotted)碳水化合物抗原呈递。这些包括天然人糖蛋白OR、ASOR和AGOR以及两个合成的高-甘露糖簇——(Man9)n-KLH和[(Man9)4]n-KLH(25-28)。

对于微阵列打印，将多糖和糖蛋白溶解在盐水中，并将脂质制备为所述的脂质体(29-32)。通过为产生cDNA微阵列而设计的高精度机器人(Cartesian Technologies’PixSys 5500C)将抗原溶液和脂质体悬浮液点样到硝酸纤维素包被的FAST载玻片(Schleicher&Schuell)上。临使用前，将打印的微阵列载玻片在室温(RT)下在1XPBS中洗涤5分钟，并用1％BSA-PBS在室温下封闭30分钟。将它们在室温下用50μl血清(1:25)孵育1小时、洗涤、并接着用滴定过的与Cy3连接的二级抗-人IgG的抗体在室温下孵育30分钟。然后将染色的载玻片漂洗5次并在扫描前在室温下进行离心脱水。使用ScanArray5000A微阵列扫描仪(PerkinElmer Life Science)扫描所述染色的微阵列的荧光信号。使用ScanArray Express软件(PerkinElmer Life Science)计算每个阵列斑点及其背景的荧光强度值。

微阵列数据-处理和统计学分析。

使用来自SAS Institute(Cary,North Carolina)的JMP Genomics软件包对29次微阵列测定(包括来自17例PCa患者和12例BPH患者的血清)的碳水化合物阵列数据集进行标准化和统计学分析。将所得标准化的抗体反应性(IgG)确定为微阵列评分，所述微阵列评分是通过将它们的四分位距(interquartile range，IQR)设置为相同的来进行的归一化的log2转化(中值-背景)值。进行了单因素ANOVA以比较在组间和/或亚组间获得的结果。使用Student’s t检验计算比较组间的差异显著性。

结果

所述碳水化合物微阵列分析的第一步是表征所有受试者的全抗体谱。使用点样在同一碳水化合物微阵列上的一组不同抗原将这些图谱测定为相对的血清抗体反应性(IgG评分)。随后进行了统计学分析以鉴定在人体循环中检测显著水平的自身抗体的聚糖标记物以及捕获PCa相关的自身抗体标记的那些。

尽管来自所述BPH和PCa受试者的血清在它们的全抗体谱上显示出大体相似性，靶向Man9簇的抗体反应性在所述PCa血清中增强。本发明人还通过这种微阵列测定证明了对自身抗体的统计学显著检测。

本发明人确定了给定的自身抗原是否在人血清中检测抗体。进行了单因素分析来检查抗原对之间IgG评分的差异显著性。例如，本发明人分别检查了OR-AGOR对、OR-ASOR对和AGOR-ASOR对。OR、ASOR和AGOR在它们的蛋白质组分上是相同的，但是在它们表达的糖表位上是不同的。AGOR和ASOR分别显示了Tri/m-Gn和Tri/m-II；OR未表面-显示所述两个糖表位中的任何一个。因此，它们的成对比较足以显示所述碳水化合物-特异性结合信号。OR未检测到可测量的抗体。相比之下，其去唾液酸形式——ASOR(Tri/m-II)和去半乳糖形式——AGOR(Tri/m-Gn)捕获高度显著量的IgG抗体。

KLH、Man9(2G12)和Man9(TM10)共有KLH载体，但是在碳水化合物单元上不同。Man9(2G12)和Man9(TM10)以不同的簇构型显示Man9。通过将由这些缀合物捕获的抗体与所述KLH对照中的那些进行比较，确定了这两个Man9簇在PCa和BPH组中均检测高度显著量的IgG抗体。

为了鉴定PCa的潜在“标记”，本发明人研究了检测到的血清自身抗体是否在所述PCa和BPH组之间显著不同。为此目的，将在所述PCa组中检测到的自身抗体与在所述BPH组中检测到的那些进行比较。这两个Man9簇在PCa组中检测到显著升高水平的自身抗体。Man9(TM10)似乎比Man9(2G12)更有效地捕获血清IgG。AGOR和ASOR未在所述PCa组和BPH组之间检测到IgG的显著不同水平。但是，观察到IgGASOR评分在来自PCa患者的样品中的广泛分布，相当大比例的样品产生了增高水平的IgGASOR。

人血清抗体库是广泛且不同的(33)。如何使微阵列数据集标准化以使得可以定量地测量和有意义地比较不同受试者的抗体谱，是该研究的技术挑战。本发明人引入了相对抗体反应性(Relative AntibodyReactivity，RAR)的概念来对所述全抗体谱进行标准化。以这种方式，所比较的抗体谱不依赖于血清抗体浓度，所述血清抗体浓度通常受到临床上抽血时受试者的生理或病理状态影响。

本发明人的结果表明，抗原特异性抗体的全模式(global pattern)在BPH和PCa组中的所有受试者间是极其相似的。但是，自身抗体活性的尖峰(spike)出现在保守的全抗体谱的背景下。有趣的是，在PCa和BPH曲线图的相同抗原ID#位置上鉴定出多个尖峰。这些是抗原ID#10、#12和#26，它们分别是是Man9(2G12)、Man9(TM10)和心磷脂。基于这一发现，本发明人推断先前存在的自身抗体有助于增强抗体对肿瘤碳水化合物的应答。

在所述RAR-标准化的全抗体谱的背景下，本发明人进一步检验了在人体循环中对自身抗体的统计学上有意义的检测。本发明人的碳水化合物微阵列在来自BPH和PCa患者的血清中检测到显著水平的抗-ASOR(IgG^ASOR)抗体和抗-AGOR(IgG^AGOR)抗体。由于OR、ASOR、和AGOR具有相同的蛋白质组分，与它们相关的差异抗体活性反映了聚糖-结合特异性。OR的相应隐性部分被其他糖部分遮盖。因此，被ASOR捕获的IgG^ASOR主要是Tri/m-II特异性的；被AGOR检测到的IgG^AGOR检测反映了Tri/m-Gn的结合。

在人体循环中检测IgG^ASOR是特别有意义的，因为它们的靶向碳水化合物Tri-/m-II的特征在于具有β(1，6)-支链型II型链。通过PHA-L染色所确定的β(1，6)-支链型II型链的过表达已存在于多种人类癌症中(39)。该标记物的组织表达也在大多数的PCa中被确认(16，17)。本发明人还注意到所述PCa组中的大量IgG^ASOR点位于所述BPH组的95％置信上限线之上。这表明尽管PCa与BPH之间的组平均值无显著差异(P＝0.14306)，与BPH组相比，PCa患者的子集产生显著增高的IgG^ASOR水平。还在SARS-CoV中和抗体中发现了IgGASOR特异性(21)，提供了用于使用SARS-CoV中和抗体来杀死Tri-/m-II阳性肿瘤细胞的理论基础。

与它们共同的KLH载体分子所检测到的那些相比，所述两个Man9簇捕获到显著增加水平的IgG。[(Man9)4]n-KLH很好地保留了由2G12识别的HIV-1特异性Man9-糖-表位。(Man9)n-KLH与2G12反应较弱但是其具有与抗肿瘤mAbTM10的高度反应性。由于与Man9(TM10)相关的IgG评分显著高于Man9(2G12)的IgG评分，在人血清中检测到的IgG^Man9主要是TM10样抗Man9簇的抗体。与来自BPH组的血清相比，Man9(TM10)和Man9(2G12)都在来自PCa组的血清中检测到显著增加量的IgG抗体。在所述微阵列分析所检测的所有自身抗原中，所述Man9(TM10)轭合物在捕获血清IgG上是最有效的一个。在较高Gleason分级癌症中所述TM10-抗原的肿瘤细胞表面表达(24)和寡甘露糖的加强表达(16)的情况下，IgGMan9提供有用的血清生物标记物。

总之，在本研究中，本发明人已经发现了靶向Man9-或Tri-/m-II-糖-抗原的自身抗体在人血清中是很容易检测到的，并且这些抗体反应性在PCa受试者中选择性地增加。

参考文献

1.Prakash S，Robbins PW.Glycotyping of prostate specific antigen.Glycobiollgy.2000；10(2)：173-6

2.Peracaula R，Tabares G，Royle L，Harvey DJ，Dwek RA，Rudd PM，et al.Altered glycosylation pattern allows the distinction between prostate-specific antigen(PSA)from normal and tumor origins.Glycobiology.2003；13(6)：457-70.

3.Ohyama C，Hosono M，Nitta K，Oh-eda M，Yoshikawa K，Habuchi T，et al.Carbohydrate structure and differential binding of prostate specific antigen to Maackiaamurensis lectin between prostate cancer and benign prostate hypertrophy.Glycobiology.2004；14(8)：671-9.

4.Palma AS，Liu Y，Childs RA，Herbert C，Wang D，Chai W，et al.The humanepithelial carcinoma antigen recognized by monoclonal antibody AE3is expressed on asulfoglycolipid in addition to neoplastic mucins.Biochem Biophys Res Commun.2011；408(4)：548-52.

5.Abel PD，Marsh C，Henderson D，Leatherm A，Powell PH，Williams G.Detection of blood group antigens in frozen sections of prostatic epithelium.Br J Urol.1987；59(5)：430-5.

6.Satoh M，Fukushi Y，Kawamura S，Ohyama C，Saito S，Orikasa S，et al.Glycolipid expression in prostatic tissue and analysis of the antigen recognized byantiprostatic monoclonal antibody APG 1.Urol Int.1992；48(1)：20-4.

7.Moriyama H，Nakano H，Igawa M，Nihira H.T antigen expression in benignhyperplasia and adenocarcinoma of the prostate.Urol Int.1987；42(2)：120-3.

8.Ghazizadeh M，Kagawa S，Izumi K，Kurokawa K.Immunohistochemicallocalization of T antigen-like substance in benign hyperplasia and adenocarcinoma of theprostate.J Urol.1984；132(6)：1127-30.

9.Zhang S，Zhang HS，Reuter VE，Slovin SF，Scher HI，Livingston PO.Expression of potential target antigens for immunotherapy on primary and metastatic prostatecancers.Clin Cancer Res.1998；4(2)：295-302.

10.Chandrasekaran EV，Xue J，Xia J，Chawda R，Piskorz C，Locke RD，et al.Analysis of the specificity of sialyltransferases toward mucin core 2，globo，and relatedstructures，identification of the sialylation sequence and the effects of sulfate，fucose，methyl，and fluoro substituents of the carbohydrate chain in the biosynthesis of selectin and siglecligands，and novel sialylation by cloned alpha2，3(O)sialyltransferase.Biochemistry.2005；44(47)：15619-35.

11.Abel PD，Cornell C，Buamah PK，Williams G.Assessment of serum CA 19.9as a tumour marker in patients with carcinoma of the bladder and prostate.Br J Urol.1987；59(5)：427-9.

12.Jorgensen T，Berner A，Kaalhus O，Tveter K J，Danielsen HE，Bryne M.Up-regulation of the oligosaccharide sialyl LewisX：a new prognostic parameter in metastaticprostate cancer.Cancer Res.1995；55(9)：1817-9.

13.Wandall HH，Blixt O，Tarp MA，Pedersen JW，Bennett EP，Mandel U，et al.Cancer biomarkers defined by autoantibody signatures to aberrant O-glycopeptide epitopes.Cancer Res.2010；70(4)：1306-13.

14.Blixt O，Bueti D，Burford B，Allen D，Julien S，Hollingsworth M，et al.Autoantibodies to aberrantly glycosylated MUC1 in early stage breast cancer are associatedwith a better prognosis.Breast Cancer Res.2011；13(2)：R25.

15.Padler-Karavani V，Hurtado-Ziola N，Pu M，Yu H，Huang S，Muthana S，et al.Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkersand immunotherapeutics in cancer.Cancer Res.2011；71(9)：3352-63.

16.Wang D，Herzenberg LA，Peehl D，Herzenberg LA.Prostate cancer glycanmarkers and auto-antibody signatures.U.S.Patent No.7，981，625.July 19，2011.Assigned toThe Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University，Palo Alto，CA(US).2011.

17.Lange T，Ullrich S，Muller I，Nentwich MF，Stuebkc K，Feldhaus S，ct al.Human Prostate Cancer in a Clinically Relevant Xenograft Mouse Model：Identification ofbeta(1，6)-branched Oligosaccharides as a Marker of Tumor Progression.Clin Cancer Res.2012.

18.Handerson T，Pawelek JM.Beta 1，6-branched oligosaccharides and coarsevesicles：a common，pervasive phenotype in melanoma and other human cancers.CancerRes.2003；63(17)：5363-9.

19.Trkola A，Purtscher M，Muster T，Ballaun C，Buchacher A，Sullivan N，et al.Human monoclonal antibody 2G 12defines a distinctive neutralization epitope on the gp 120glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1.J Virol.1996；70(2)：1100-8.

20.Scanlan CN，Pantophlet R，Wormald MR，Olhnann Saphire E，Stanfield R，Wilson IA，et al.The broadly neutralizing anti-human immunodeficiency virus type 1antibody 2G 12recognizes a cluster of alpha 1--＞2mannose residues on the outer face ofgp 120.J Virol.2002；76(14)：7306-21.

21.Wang D，Lu J.Glycan arrays lead to the discovery of autoimmunogenicactivity of SARS-CoV.Physiol Genomics.2004；18(2)：245-8.

22.Wang D，Herzenberg LA.Glycan markers and auto-antibody signatures inHIV-1and HIV-1-associated malignancies.Patent application No.20110177090，Files Jan19，2011.Assignee：The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University，PaloAlto，CA.2011.

23.Sanders RW，Venturi M，Schiffner L，Kalyanaraman R，Katinger H，LloydKO，et al.The mannose-dependent epitope for neutralizing antibody 2G12 on humanimmunodeficiency virus type 1glycoprotein gp 120.J Virol.2002；76(14)：7293-305.

24.Newsom-Davis TE，Wang D，Steinman L，Chen PF，Wang LX，Simon AK，etal.Enhanced immune recognition of cryptic glycan markers in human tumors.Cancer Res.2009；69(5)：2018-25.

25.Wang LX，Ni J，Singh S，Li H.Binding of high-mannose-typeoligosaccharides and synthetic oligomannose clusters to human antibody 2G12：implicationsfor HIV-1vaccine design.Chem Biol.2004；11(1)：127-34.

26.Wang LX.Toward oligosaccharide-and glycopeptide-based HIV vaccines.Curr Opin Drug Discov Devel.2006；9(2)：194-206.

27.Ni J，Song H，Wang Y，Stamatos NM，Wang LX.Toward a carbohydrate-based HIV-1vaccine：synthesis and immunological studies of oligomannose-containingglycoconjugates.Bioconjug Chem.2006；17(2)：493-500.

28.Li H，Wang LX.Design and synthesis of a template-assembled oligomannosecluster as an epitope mimic for human HIV-neutralizing antibody 2G12.Org Biomol Chem.2004；2(4)：483-8.

29.Wang D，Herzenberg LA，Steinman L.A lipid-based microarray and methodsof use thereof.PCT International application No.PCT/US2006/011544，filed March 22，2006，claiming benefit of U.S.Provisional Application No.60/664，251，filed March 20，2005..2005.

30.Wang D，Liu S，Trummer BJ，Deng C，Wang A.Carbohydrate microarrays forthe recognition of cross-reactive molecular markers of microbes and host cells.NatBiotechnol.2002；20(3)：275-81.

31.Liu Y，Childs RA，Palma AS，Campanero-Rhodes MA，Stoll MS，Chai W，etal.Neoglycolipid-based oligosaccharide microarray system：preparation of NGLs and theirnoncovalent immobilization on nitrocellulose-coated glass slides for microarray analyses.Methods Mol Biol.2012；808：117-36.

32.Wang D.Carbohydrate antigen microarrays.Methods Mol Biol.2012；808：241-9.

33.Wang D，Kabat EA.Antibodies，Specificity.In：Encyclopedia of Immunology，Edn.Second(ed.Delves&Roitt).1998：148-54.

34.Wang D，Wells SM，Stall AM，Kabat EA.Reaction of germinal centers in theT-cell-independent response to the bacterial polysaccharide alpha(1--＞6)dextran.Proc NatlAcad Sci U S A.1994；91(7)：2502-6.

35.Wang D，Liao J，Mitra D，Akolkar PN，Gruezo F，Kabat EA.The repertoire ofantibodies to a single antigenic determinant.Mol Immunol.1991；28(12)：1387-97.

36.Seidl KJ，MacKenzie JD，Wang D，Kantor AB，Kabat EA，Herzenberg LA，etal.Recurrent identical rearrangement and repeated expression of identical heavy and lightchains in single anti-phosphatidylcholine B cells.Ann N Y Acad Sci.1997；815：484-8.

37.Seidl KJ，MacKenzie JD，Wang D，Kantor AB，Kabat EA，Herzenberg LA，etal.Frequent occurrence of identical heavy and light chain Ig rearrangements.Int Immunol.1997；9(5)：689-702.

38.Smith K，Garman L，Wrammert J，Zheng NY，Capra JD，Ahmed R，et al.Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.NatProtoc.2009；4(3)：372-84.

39.Lau KS，Dennis JW.N-Glycans in cancer progression.Glycobiology.2008；18(10)：750-60.

表2.用于前列腺癌症和BPH受试者的微阵列数据集

*在前列腺癌和BPH组之间具有显著性差异(t-检验，p<0.05)的结果用粗体突出显示。

Claims (15)

1.一种用于检测抗-碳水化合物的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使固定在基质上的低聚甘露糖-血清白蛋白缀合物的阵列与含抗体的血清样品接触，接触条件为其中TM10抗体以至少微摩尔的亲和力结合缀合物的低聚甘露糖的条件；

(b)检测因而发生的所述样品的特定抗体与所述缀合物的低聚甘露糖的结合，作为所述抗碳水化合物的抗体的指示。

2.权利要求1的方法，其中所述血清白蛋白是HSA或BSA。

3.权利要求1的方法，其中所述低聚甘露糖是man5或man9。

4.权利要求1的方法，其中所述缀合物具有结构(Man₉GlcNAc₂Asn)n-BSA或(Man₅GlcNAc₂Asn)n-BSA。

5.权利要求1的方法，其中所述阵列包含固定在所述基质的不同位置上的man5和man9-血清白蛋白缀合物

6.权利要求1的方法，其中所述阵列还包含固定在所述基质的不同位置上的ASOR、AGOR或OR。

7.权利要求1的方法，所述方法从人血清抗体的未经筛选的库中选择性检测TM10样抗-Man9簇。

8.权利要求1的方法，其中所述样品来自患有前列腺发育异常的人并且所产生的结合的量指示前列腺增生的状态。

9.权利要求1的方法，其中所述样品其中所述样品来自患有前列腺发育异常的人并且所产生的结合的量指示前列腺增生的状态，其中所述前列腺发育异常是侵袭性前列腺癌。

10.权利要求1的方法，其中所述基质是环氧树脂包被的载玻片且所述阵列是微阵列。

11.权利要求1的方法，其中所述基质是疏水性聚苯乙烯表面包被的塑料微孔板。

12.权利要求1的方法，其中所述缀合物是通过以下方式固定：用溶于pH9.6的0.1M碳酸氢钠缓冲液溶液中的20μg/ml的Man9-BSA包被表面并在37℃下孵育2小时。

13.权利要求1的方法，其中所述接触步骤包括用以1:500的稀释度溶于1％BSA、PBST中的血清样品包被所述缀合物并在4℃下孵育8-12小时。

14.权利要求1的方法，其中:

所述基质是疏水性聚苯乙烯表面包被的塑料微孔板；

所述缀合物是通过以下方式固定：用溶于pH9.6的0.1M碳酸氢钠缓冲液溶液中的20μg/ml的Man9-BSA包被表面并在37℃下孵育2小时；和

所述接触步骤包括用以1:500的稀释度溶于1％BSA、PBST中的血清样品包被所述缀合物并在4℃下孵育8-12小时。

15.一种用于检测抗-碳水化合物的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使低聚甘露糖和前列腺特异性抗原(PSA)与患者样品中的抗体接触，接触条件为其中所述抗体特异性结合所述抗原的条件；

(b)检测由此产生的所述抗体与所述抗原的特异性结合，其中所述抗体的特异性结合可协同预测前列腺增生的临床结果。