CN107064518A

CN107064518A - 确定胰腺癌存在的方法、阵列以及用途

Info

Publication number: CN107064518A
Application number: CN201710061429.5A
Authority: CN
Inventors: C.A.K.博雷贝克; L.B.C.温格伦
Original assignee: Immunovia AB
Current assignee: Immunovia AB
Priority date: 2011-03-04
Filing date: 2012-03-05
Publication date: 2017-08-18
Also published as: EP2681563A2; US9863960B2; KR20190101489A; GB201103726D0; CN103534594A; CA2828338A1; US20200088742A1; WO2012120288A3; US20140038844A1; MX363201B; US20210356478A1; JP2014508298A; WO2012120288A2; KR102014890B1; US20180136231A1; MX2013010127A; JP6161542B2; KR20140040118A

Abstract

本发明涉及在个体中确认胰腺癌存在的方法，该方法包括以下步骤或由以下步骤构成：(a)提供来自个体的待检测样品，以及(b)通过检测一种或多种生物标志物在检测样品中的表达来确定检测样品的生物标志物签名，所述一种或多种生物标志物选自表III中定义的组；其中，选自表III中定义的组的一种或多种生物标志物在检测样品中的表达是罹患胰腺癌的个体的指示。本发明还包括用于本发明方法的阵列和试剂盒部分。

Description

确定胰腺癌存在的方法、阵列以及用途

本申请是申请日为2012年3月5日，申请号为201280021793.4，发明名称为“确定胰腺癌存在的方法、阵列以及用途”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于诊断胰腺癌的方法，以及在该方法中使用的生物标志物和阵列。

背景技术

虽然花费了大量力气，但胰腺癌(PaC)仍然难以预测[1]。尽管PaC仅为第10大常见的癌症，但其在美国是癌症死亡的第4主要原因[2-4]。实际上，胰腺癌的5年存活率<5％，是所有恶性肿瘤中最低的[2-3]。但是，近期的数据已经显示这种现象可以通过早期检测来获得显著克服，早期检测是当癌症还主要在I期，如在早期PaC切除之后所显示的5年存活率为30-60％(≤20mm大小的肿瘤)和甚至>75％(≤10mm大小的肿瘤)的存活率[2-4]。

PaC的特征在于快速的肿瘤进展、早期转移、以及对于大部分传统治疗不敏感[1,5]。难以预测主要是由于缺乏有效的早期诊断方法以及在疾病的过程中较晚出现的疾病特异性临床症状。在确诊的时刻，肿瘤通常已经达到30-40mm大小并且全部患者中的大部分(52％)已经发生转移，26％患者为局部晚期癌症，仅7％的患者具有局限在胰腺的肿瘤[2,4]。此时，约15％的患者仍可进行手术，但他们的平均存活时间仅为20个月。

已经有大量非侵入性的方法用于PaC诊断，包括(内窥镜)超声波、计算机断层成像和/或内窥镜逆行胰胆管造影[1-2,6]。尽管功能强大，但这些方法不是PaC特异性的，并且不是针对在肿瘤仍较小且潜在可治愈时的早期诊断而设计的。使该情况变得更为复杂的是使用目前存在的诊断工具难以将PaC与良性状况(诸如慢性胰腺炎)区分[2]。因此，利用对于PaC特异性并且用于早期诊断PaC的生物标志物将具有无价的临床价值。

虽然花费了大量力气，但与PaC相关的分子指纹(特别是来自未经加工、未分离的血清和血浆)仍需要被破译[2,7-9]。在到目前为止已经被提及的大量单生物标志物(包括CRP、CA 242、GDF-15、结合珠蛋白、M2-丙酮酸激酶、血清淀粉样蛋白A、IGFBP-1)中，还没有任何一个被证明临床效果优于CA 19-9[2,8-10]。CA 19-9的使用仍然显著地受到发现的如下的事实所阻碍：i)在非-恶性状况(例如胰腺炎和急性胆管炎)以及其他肠胃癌(例如胃癌和大肠癌)中均有升高，ii)针对早期PaC缺乏敏感性，以及iii)在约10％的人群中是缺失的[2,8-10]。当筛查PaC时，CA 19-9仅获得了中等的灵敏性(范围为69％～98％)和特异性(46％～98％)[2,9-11]。

针对上述背景，本发明人在WO 2008/117067中开发了进行癌症的预后诊断的蛋白质组学方法，由此鉴定出用于检测胰腺癌和用于预测存活率的第一组血清生物标志物。

发明内容

受到近期研究(其中我们指出了亲和蛋白质组学[12-13]可以用作PaC血清生物标志物签名(biomarker signatures)的查明候选物(pin-point candidate)[14])的启发，我们还进一步解码了PaC的血清蛋白质组。

在本研究中，我们第一次预先验证了用于PaC诊断的复合血清生物标志物签名，其表明诊断信息可以从未加工血液样品中提取，并表现出高度的特异性和灵敏度。这提供了改善的PaC诊断以及从而提高了预测，带来了显著增加的临床价值，以及向相关的、复杂的疾病生物学射出了进一步的光芒。

由此，本发明的第一方面提供用于检测个体中胰腺癌存在的方法，该方法包括以下步骤或由以下步骤构成：

a)提供来自个体的待检测样品；

b)通过检测一种或多种生物标志物在检测样品中的表达来确定检测样品的生物标志物签名，该一种或多种生物标志物选自表III中定义的组；

其中，选自表III中定义的组的一种或多种生物标志物在检测样品中的表达是罹患胰腺癌的个体的指示。

“待检测样品”、“检测样品”或“对照样品”，适当地包括来自待检测个体或对照个体的组织，流体蛋白质组和/或表达性样品(expressome sample)。

“表达(expression)”表示基因产物诸如mRNA或蛋白质的水平或量。

检测和/或测定蛋白质和/或核酸的浓度的方法对于本领域技术人员而言是熟知的，参见例如Sambrook and Russell,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press。

“生物标志物”表示自然存在的生物分子或其组分或其片段，对其的测量可提供用于预测胰腺癌的信息。例如，生物标志物可以为自然存在的蛋白质或碳水化合物部分，或其抗原组分或其片段。

在一个实施方式中，该方法包括步骤(a)和(b)以及下述步骤，或由步骤(a)和(b)，以及下述步骤构成：

c)提供来自未患胰腺癌的个体的对照样品(即阴性对照)；

d)通过检测在步骤(b)中检测的一种或多种生物标志物在对照样品中的表达来确定对照样品的生物标志物签名；

其中，胰腺癌存在通过如下事件来鉴定，该事件为在步骤(b)中检测的一种或多种生物标志物在检测样品中的表达不同于步骤(d)中检测的一种或多种生物标志物在对照样品中的表达。

在另外的实施方式中，该方法包括步骤(a)、(b)、(c)和(d)，以及如下额外步骤，或者该方法由步骤(a)、(b)、(c)和(d)，以及如下额外步骤构成：

e)提供来自患胰腺癌的个体的对照样品(即阳性对照)；

f)通过检测在步骤(b)中检测的一种或多种生物标志物在对照样品中的表达来确定对照样品的生物标志物签名；

其中，胰腺癌存在通过如下事件来鉴定，该事件为在步骤(b)中检测的一种或多种生物标志物在检测样品中的表达相当于步骤(f)中检测的一种或多种生物标志物在对照样品中的表达。

“相当于在对照样品中的表达”包括，一种或多种生物标志物在待测样品中的表达与其在阳性对照样品中的表达相同或相似。优选一种或多种生物标志物在待测样品中的表达与其在阳性对照样品中的表达相同。

生物标志物的差异化表达(上调或下调)，或表达的缺乏可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方式来确定。差异化表达通过至少小于0.05的p值(p＝<0.05)来确定，例如至少<0.04、<0.03、<0.02、<0.01、<0.009、<0.005、<0.001、<0.0001、<0.00001或至少<0.000001。优选，使用支持向量机(SVM)来确定差异化表达。优选，SVM为如下所述的SVM。最优选，SVM是下述表V(A)所述的SVM。

本领域技术人员应当理解差异化表达可与单个生物标志物相关或与组合考虑的多个生物标志物(即作为生物标志物签名)相关。因此，p值可以与单个生物标志物关联或与一组生物标志物关联。实际上，当单独考虑时具有p值大于0.05差异化表达的蛋白质，在将它们的表达水平与一种或多种其他生物标志物结合考虑时，其作为根据本发明的生物标志物可仍然是有用的。

在一个实施方式中，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表IV(A)中列出的一种或多种生物标志物的表达，例如表IV(A)中列出的至少两个生物标志物的表达。

如在所附的实施例中所例证的，在血、血清或血浆检测样品中的特定蛋白质的表达可以是个体中胰腺癌的指示。例如，在单个检测样品中特定血清蛋白质的相对表达可以是个体中胰腺癌存在的指示。

优选地，个体为人类。但是，被检测的个体可以是任何哺乳动物，诸如驯养哺乳动物(优选具有农业或商业重要性的动物，包括马、猪、牛、羊、狗和猫)。

优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测白细胞介素-7(IL-7)和/或整合素α-10的表达，例如，检测白细胞介素-7的表达，检测整合素α-10的表达，或检测白细胞介素-7和整合素α-10的表达。最优选的，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表IV(A)中列出的每个生物标志物的表达。

在一个实施方式中，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表IV(B)中列出的1或多种生物标志物的表达，例如，检测表IV(B)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种生物标志物的表达。因此，步骤(b)优选包括以下检测或由以下检测构成：检测在表IV(B)中列出的全部生物标志物的表达。

在另外的实施方式中，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表IV(C)中列出的1或多种生物标志物的表达，例如，检测在表IV(C)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33种生物标志物的表达。优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表IV(C)中列出的全部生物标志物的表达。

优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表IV中定义的全部生物标志物在检测样品中的表达。

在一个实施方式中，该方法用于区分胰腺癌(PaC)和另外的疾病状态。

优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(A)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(A)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物在检测样品中的表达。优选地，步骤(b)还包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(B)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(B)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24种生物标志物在检测样品中的表达。还优选步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(C)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(C)中列出的至少2、3、4或5种生物标志物在检测样品中的表达。优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(D)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(D)中列出的至少2或3种生物标志物在检测样品中的表达。优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(F)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(F)中列出的至少2、3、4、5或6种生物标志物在检测样品中的表达。优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表V(A)、表V(B)、表V(C)、表V(D)和/或表V(F)中列出的全部生物标志物在检测样品中的表达。

“区分胰腺癌(PaC)和另外的疾病状态”包括区分PaC和任何其他状况，包括健康状态。

在一个实施方式中，其他疾病状态或状况为慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，ChP)、急性炎症性胰腺炎(acute inflammatory pancreatitis，AIP)和/或正常，例如其他疾病状态或状况可以是单独的慢性胰腺炎；单独的急性炎症性胰腺炎；慢性胰腺炎和急性炎症性胰腺炎；慢性胰腺炎和正常；急性炎症性胰腺炎和正常；或者慢性胰腺炎、急性炎症性胰腺炎和正常。

当涉及“正常”疾病状态时，我们包括未患慢性胰腺炎(ChP)或急性炎症性胰腺炎(AIP)的个体。优选未患任何胰腺疾病或病况的个体。最优选，个体为健康的个体，即他们未患任何疾病或病况的。

在另外的实施方案中，该方法用于区分胰腺癌和慢性胰腺炎(ChP)。优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(A)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(A)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物在检测样品中的表达。步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(C)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(C)中列出的至少2、3、4或5种生物标志物在检测样品中的表达。步骤(b)可包括以下检测或由以下检测构成：检测在表V(A)和/或表V(C)中列出的全部生物标志物在检测样品中的表达。

在另外的/可选的实施方式中，该方法用于区分胰腺癌和急性炎症性胰腺炎(AIP)，以及步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(A)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(A)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物在检测样品中的表达。优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(B)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(B)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24种生物标志物在检测样品中的表达。步骤(b)可包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(C)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(C)中列出的至少2、3、4或5种生物标志物在检测样品中的表达。优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(E)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达。优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(F)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(F)中列出的至少2、3、4、5或6种生物标志物在检测样品中的表达。优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(H)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(H)中列出的至少2或3种生物标志物在检测样品中的表达。因此，步骤(b)优选包括以下检测或由以下检测构成：检测表V(A)、表V(B)、表V(C)、表V(E)、表V(F)和/或表IV(H)中列出的全部生物标志物在检测样品中的表达。

在一个实施方式中，该方法用于区分胰腺癌和正常个体(N)。对于“正常”疾病状态的定义参见上文。优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(A)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(A)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物在检测样品中的表达。优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(B)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(B)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24种生物标志物在检测样品中的表达。优选地，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(D)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(D)中列出的至少2或3种生物标志物在检测样品中的表达。优选地，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(E)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达。还优选步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(G)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(G)中列出的至少2或3种生物标志物在检测样品中的表达。因此，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测表V(A)、表V(B)、表V(D)、表V(E)和/或表IV(G)中列出的全部生物标志物在检测样品中的表达。

在一个实施方式中，步骤(b)包括检测IL-3的表达或由检测IL-3的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测整合素α-10的表达或由检测整合素α-10的表达构成。在还另外的实施方式中，步骤(b)包括检测粘蛋白-1的表达或由检测粘蛋白-1的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测C1s的表达或由检测C1s的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测MCP-3的表达或由检测MCP-3的表达构成。在一个实施方式中，步骤(b)包括检测血管抑素结合蛋白(Angiomotin)的表达或由检测血管抑素结合蛋白的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测BTK的表达或由检测BTK的表达构成。在还另外的实施方式中，步骤(b)包括检测C1q的表达或由检测C1q的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测CD40配体的表达或由检测CD40配体的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测GM-CSF的表达或由检测GM-CSF的表达构成。在一个实施方式中，步骤(b)包括检测IgM的表达或由检测IgM的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测IL-11的表达或由检测IL-11的表达构成。在还另外的实施方式中，步骤(b)包括检测IL-16的表达或由检测IL-16的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测IL-1-ra的表达或由检测IL-1-ra的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测IL-1α的表达或由检测IL-1α的表达构成。在一个实施方式中，步骤(b)包括检测IL-1β的表达或由检测IL-1β的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测IL-2的表达或由检测IL-2的表达构成。在还另外的实施方式中，步骤(b)包括检测IL-7的表达或由检测IL-7的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测IL-9的表达或由检测IL-9的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测INF-γ的表达或由检测INF-γ的表达构成。在一个实施方式中，步骤(b)包括检测整合素α-11的表达或由检测整合素α-11的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测JAK3的表达或由检测JAK3的表达构成。在还另外的实施方式中，步骤(b)包括检测瘦素的表达或由检测瘦素的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测Lewis y的表达或由检测Lewis y的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测MCP-4的表达或由检测MCP-4的表达构成。在一个实施方式中，步骤(b)包括检测组织蛋白酶原(Procathepsin)W的表达或由检测组织蛋白酶原W的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测备解素(Properdin)的表达或由检测备解素的表达构成。在还另外的实施方式中，步骤(b)包括检测PSA的表达或由检测PSA的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测RANTES的表达或由检测RANTES的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测唾液酸路易斯抗原x(Sialyl Lewis x)的表达或由检测唾液酸路易斯抗原x的表达构成。在一个实施方式中，步骤(b)包括检测TM肽的表达或由检测TM肽的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测TNF-α的表达或由检测TNF-α的表达构成。在还另外的实施方式中，步骤(b)包括检测C4的表达或由检测C4的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测β-半乳糖苷酶的表达或由检测β-半乳糖苷酶的表达构成。

在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测IL-12的表达或由检测IL-12的表达构成。在一个实施方式中，步骤(b)包括检测TGF-β1的表达或由检测TGF-β1的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测VEGF的表达或由检测VEGF的表达构成。在还另外的实施方式中，步骤(b)包括检测IL-8的表达或由检测IL-8的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测C3的表达或由检测C3的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测IFN-γ的表达或由检测IFN-γ的表达构成。在一个实施方式中，步骤(b)包括检测IL-10的表达或由检测IL-10的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测IL-13的表达或由检测IL-13的表达构成。在还另外的实施方式中，步骤(b)包括检测IL-18的表达或由检测IL-18的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测IL-6的表达或由检测IL-6的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测Lewis x的表达或由检测Lewis x的表达构成。在一个实施方式中，步骤(b)包括检测嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)的表达或由检测嗜酸细胞活化趋化因子的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测C1酯酶抑制剂的表达或由检测C1酯酶抑制剂的表达构成。在还另外的实施方式中，步骤(b)包括检测MCP-1的表达或由检测MCP-1的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测TNF-β的表达或由检测TNF-β的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测GLP-1的表达或由检测GLP-1的表达构成。在一个实施方式中，步骤(b)包括检测IL-5的表达或由检测IL-5的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测IL-4的表达或由检测IL-4的表达构成。在还另外的实施方式中，步骤(b)包括检测B因子的表达或由检测B因子的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测C5的表达或由检测C5的表达构成。在另外的实施方式中，步骤(b)包括检测CD40的表达或由检测CD40的表达构成。

在一个实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-3的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测整合素α-10的表达。在还另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测粘蛋白-1的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测C1s的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测MCP-3的表达。在一个实施方式中，步骤(b)不包括检测血管抑素结合蛋白的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测BTK的表达。在还另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测C1q的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测CD40配体的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测GM-CSF的表达。在一个实施方式中，步骤(b)不包括检测IgM的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-11的表达。在还另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-16的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-1-ra的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-1α的表达。在一个实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-1β的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-2的表达。在还另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-7的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-9的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测INF-γ的表达。在一个实施方式中，步骤(b)不包括检测整合素α-11的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测JAK3的表达。在还另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测瘦素的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测Lewis y的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测MCP-4的表达。在一个实施方式中，步骤(b)不包括检测组织蛋白酶原W的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测备解素的表达。在还另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测PSA的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测RANTES的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测唾液酸路易斯抗原x的表达。在一个实施方式中，步骤(b)不包括检测TM肽的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测TNF-α的表达。在还另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测C4的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测β-半乳糖苷酶的表达。

在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-12的表达。在一个实施方式中，步骤(b)不包括检测TGF-β1的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测VEGF的表达。在还另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-8的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测C3的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测IFN-γ的表达。在一个实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-10的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-13的表达。在还另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-18的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-6的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测Lewis x的表达。在一个实施方式中，步骤(b)不包括检测嗜酸细胞活化趋化因子的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测C1酯酶抑制剂的表达。在还另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测MCP-1的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测TNF-β的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测GLP-1的表达。在一个实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-5的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测IL-4的表达。在还另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测B因子的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测C5的表达。在另外的实施方式中，步骤(b)不包括检测CD40的表达。

“TM肽”表示来源于10TM蛋白质的肽，针对该肽，下述SEQ ID NO:1所示的scFv抗体具有特异性(其中，CDR序列通过黑体且斜体字母表示)：

因此，可用该scFv或任何抗体或其抗原结合片段，其可以与该scFv竞争结合至10TM蛋白质。例如，该抗体或其抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO:1所示的相同的CDR。

本领域技术人员应当理解这样的抗体可以通过用于纯化目的的亲和标签(例如，在C-末端)来制备。例如可使用下述SEQ ID NO:2的亲和标签。

DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKAAAHHHHHH

[SEQ ID NO:2]

在一个实施方式中，胰腺癌存在通过下述事件来鉴定：下述物质在检测样品中的表达与阴性对照(一个或多个)相比被上调和/或相当于阳性对照(一个或多个)的表达，所述物质为：IL-3、整合素α-10、粘蛋白-1、C1s、GLP-1R、MCP-3、血管抑素结合蛋白、BTK、CD40配体、GM-CSF、IgM、IL-11、IL-16、IL-1-ra、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-7、IL-9、INF-γ、整合素α-11、JAK3、瘦素、Lewis y、MCP-4、组织蛋白酶原W、PSA、RANTES、唾液酸路易斯抗原x、TM肽、TNF-α、C4、β-半乳糖苷酶、IL-12、TGF-β1、VEGF、IL-8、C3、IFN-γ、IL-10、IL-13、IL-18、IL-6、Lewis x、嗜酸细胞活化趋化因子、C1酯酶抑制剂、MCP-1、TNF-β、GLP-1、IL-5、IL-4、B因子、C5和/或CD40。

在另外的实施方式中，胰腺癌存在通过下述事件来鉴定：C1q和/或备解素在检测样品中的表达与阴性对照(一个或多个)相比被下调和/或相当于阳性对照(一个或多个)的表达。

通常，诊断在具有至少为0.55的ROC AUC时进行，例如具有至少0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99的ROC AUC或1.00的ROC AUC。优选，诊断在具有至少0.85的ROC AUC时进行，以及最优选ROC AUC为1。

通常，使用支持向量机(SVM)，例如可购自http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html的那些(例如，e1071 1.5-24)来进行诊断。但是也可以使用任何其他合适的手段。

支持向量机(SVM)是用于分类和回归的一组相关的经监督的学习方法。给定一组训练实例，每一个被标记为属于两类中的一类，SVM训练算法构建了用于预测新的实例是否落入一类或另一类的模型。直观地，SVM模型是如空间中指出的实例的代表，被绘制成使得不同分类的实例被尽量宽的明显的间隙分开。然后，新的实例被绘制到相同的空间中并基于它们落入间隙的那一侧来预测其属于哪一类。

更正式的是，支持向量机在一定高度或无穷维空间构建超平面或一组超平面，其可被用于分类、回归或其他任务。直观地，良好的分离通过与任何类别的最近训练数据点具有最大距离(被称为功能边缘)来实现，因为通常边缘越大分类机的泛化错误约低。关于SVM的更多信息，可以参考例如Burges,1998,Data Mining and Knowledge Discovery,2:121–167。

在本发明的一个实施方式中，在使用来自已知疾病状态的个体(例如，已知个体具有胰腺癌，已知个体具有急性炎症性胰腺炎，已知个体具有慢性胰腺炎或已知个体是健康的)的生物标志物概貌进行本发明的方法之前，对SVM进行‘训练’。通过运行这样的训练样品，SVM能够学习什么样的生物标志物概貌与胰腺癌相关。一旦训练过程结束，然后SVM能够确认是否已检测的样品的生物标志物是来自具有胰腺癌的个体。

但是，通过在SVM中用必须的训练参数进行预编程可以省略该训练步骤。例如，可以根据使用在表V中详细描述的SVM算法，基于在表III或表IV中列出的任意或全部生物标志物的测定值，根据已知的SVM参数进行诊断。

本领域技术人员应当理解通过利用适当选择的数据(即，来自已知具有胰腺癌状态的个体的生物标志物的测定值)来训练SVM机，可以针对表III或表IV中列出的生物标志物的任何组合来确定适当的SVM参数。

优选地，本发明的方法具有至少60％的准确度，例如61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的准确度。

优选地，本发明的方法具有至少60％的灵敏度，例如61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的灵敏度。

优选地，本发明的方法具有至少60％的特异性，例如61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的特异性。

“准确度”表示方法的正确结果的比例，“灵敏度”表示被正确分类为阳性的所有PaC阳性样品的比例，以及“特异性”表示被正确分类为阴性的所有PaC阴性样品的比例。

在一个实施方式中，未患胰腺癌的个体未患胰腺癌(PaC)、慢性胰腺炎(ChP)或急性炎症性胰腺炎(AIP)。更优选地，健康个体未患任何胰腺疾病或病况。甚至更优选地，未患胰腺癌的个体未患任何疾病或病况。最优选的，未患胰腺癌的个体是健康个体。“健康个体”包括被本领域技术人员认为身体强壮以及没有身体疾病的个体。

但在另外的实施方式中，未患胰腺癌的个体是患慢性胰腺炎的。在仍另外的实施方式中，未患胰腺癌的个体是患急性炎症性胰腺炎的。

如上所述本发明的方法用于检测个体中胰腺癌存在。在一个实施方式中，胰腺癌选自下组：腺癌(adenocarcinoma)、腺鳞癌(adenosquamous carcinoma)、印戒细胞癌(signet ring cell carcinoma)、肝样癌(hepatoid carcinoma)、胶样癌(colloidcarcinoma)、未分化癌和伴有破骨细胞样巨细胞(osteoclast-like giant cells)的未分化癌。优选的胰腺癌是胰腺腺癌(pancreatic adenocarcinoma)。更优选的胰腺癌是胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma)，也已知为胰腺外分泌肿瘤(exocrinepancreatic cancer)。

在另外的实施方式中，使用能够与一种或多种生物标志物结合的第一结合试剂来进行步骤(b)、(d)和/或步骤(f)。本领域技术人员应当理解第一结合试剂可包括下述物质或由下述物质构成：针对蛋白质生物标志物中的一种具有特异性的单一种类或大量不同种类，每个对于不同的蛋白质生物标志物具有特异性。

合适的结合试剂(也被称为结合分子)可以选自如下所述的基于它们结合给定的基元(motif)的能力的库。

至少一种结合试剂，以及更通常地全部类型可包括下述物质或由下述物质构成：抗体或其抗原结合片段，或其变体。

抗体的制备和利用的方法在本领域中是已知的，例如参见Antibodies:ALaboratory Manual,1988,Harlow&Lane,Cold Spring Harbor Press,ISBN-13:978-0879693145,Using Antibodies:A Laboratory Manual,1998,Harlow&Lane,Cold SpringHarbor Press,ISBN-13:978-0879695446和Making and Using Antibodies:A PracticalHandbook,2006,Howard&Kaser,CRC Press,ISBN-13:978-0849335280(通过参考将其公开内容并入本文)。

因此，片段可以包括一个或多个重链可变区(V_H)或轻链可变区(V_L)。例如，术语抗体片段包括Fab-类分子(Better等人(1988)Science 240,1041)；Fv分子(Skerra等人(1988)Science 240,1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中V_H和V_L伴侣区域(partner domain)通过柔性的寡肽连接(Bird等人(1988)Science 242,423；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,5879)以及包括分离的V区域的单域抗体(dAbs)(Ward等人(1989)Nature 341,544)。

术语“抗体变体”包括任何合成抗体、重组抗体或抗体杂交物，例如但不限于：通过免疫球蛋白轻链和/或重链可变区和/或恒定区的噬菌体展示制备的单链抗体分子，或在本领域人员已知的免疫测定方法中能够与抗原结合的其他免疫相互作用分子。

可以在Winter&Milstein(1991)Nature 349,293-299中找到涉及包括它们的特异性结合位点的抗体片段合成技术的一般性综述。

分子库例如抗体库(Clackson等人，1991,Nature 352,624-628；Marks等人，1991,J Mol Biol 222(3):581-97)、肽库(Smith,1985,Science 228(4705):1315-7)、表达的cDNA库(Santi等人(2000)J Mol Biol 296(2):497-508)、除抗体结构之外的其他支架例如亲合体(affibody)的库(Gunneriusson等人，1999,Appl Environ Microbiol 65(9):4134-40)或适体(aptamer)库(Kenan等人，1999,Methods Mol Biol 118,217-31)可以用作从中选择用于本发明方法的对于给定的基础片段具有特异性的结合分子的源。

分子库可以在原核生物(Clackson等人，1991，同上；Marks等人，1991，同上)或真核生物细胞(Kieke等人，1999,Proc Natl Acad Sci USA,96(10):5651-6)中体内表达，或可以不涉及细胞体外表达(Hanes&Pluckthun,1997,Proc Natl Acad Sci USA 94(10):4937-42；He&Taussig,1997,Nucleic Acids Res 25(24):5132-4；Nemoto等人，1997,FEBSLet,414(2):405-8)。

在使用基于蛋白质的库的情况下，通常编码潜在结合分子库的基因被包装到病毒中并且在病毒的表面展示潜在结合分子(Clackson et al,1991，同上；Marks等人，1991，同上；Smith,1985，同上)。

目前最常见的这样的系统是丝状噬菌体在它们的表面展示抗体片段，被表达的抗体片段融合至噬菌体的次要衣壳蛋白(Clackson等人，1991，同上；Marks等人，1991，同上)。但是，还已经使用了利用其他病毒(EP 39578)、细菌(Gunneriusson等人，1999，同上；Daugherty等人，1998,Protein Eng 11(9):825-32；Daugherty等人，1999,Protein Eng 12(7):613-21)、以及酵母(Shusta等人，1999,J Mol Biol 292(5):949-56)展示的其他系统。

另外，还开发了利用多肽产物连接至其编码mRNA的展示系统，称为核糖体展示系统(Hanes&Pluckthun,1997，同上；He&Taussig,1997，同上；Nemoto等人，1997，同上)，或任选的将多肽产物连接至编码DNA(参见美国专利No.5,856,090和WO 98/37186)的展示系统。

当从库中选择了潜在结合分子时，通常使用具有给定的基元的一个或几个筛选肽(selector peptide)。可以使用提供结构、降低肽的灵活性的氨基酸残基或能够与结合分子相互作用的带电、极性的或疏水侧链用于设计筛选肽的基元。

例如：

(i)脯氨酸由于其侧链结合至α碳以及氮两者而稳定肽结构；

(ii)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸具有芳香侧链并且是非常疏水的，而亮氨酸和异亮氨酸具有脂肪侧链并且也是非常疏水的；

(iii)赖氨酸、精氨酸和组氨酸具有碱性侧链并且在中性pH下会带正电，而天冬氨酸和谷氨酸具有酸性侧链并且在中性pH下会带负电；

(iv)天冬酰胺和谷氨酰胺在中性pH时为中性的，但它们含有可以形成氢键的酰胺键；

(v)丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链含有羟基，其可以形成氢键。

通常，结合试剂的选择可以涉及利用阵列技术和系统来根据结合分子的类型分析结合点。

在一个实施方式中，第一结合试剂(一个或多个)被固定在表面上(例如，在多孔板或阵列上)。

抗体重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)参与抗原识别，这是由早期的蛋白酶消化实验首先认识到的事实。后来在啮齿类抗体的“人源化”工作中也得到确认。啮齿类来源的可变区可以融合至人类来源的恒定区域，使得得到的抗体保留对啮齿类亲本抗体的抗原特异性(Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851-6855)。

关于抗原特异性由多个可变区赋予且其独立于恒定区的事实是从多个涉及抗体片段的细菌表达的实验知晓的，这些实验都包括一个或多个可变区。这些分子包括Fab-类分子(Better等人，(1988)Science 240,1041)；Fv分子(Skerra等人(1988)Science 240,1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中通过柔性的寡肽连接V_H和V_L伴侣区域(Bird等人(1988)Science 242,423；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,5879)以及包括分离的V区域的单域抗体(dAbs)(Ward等人(1989)Nature 341,544)。可以在Winter&Milstein(1991)Nature 349,293-299中找到涉及保留它们的特异性结合位点的抗体片段的合成的技术的一般性综述。

“ScFv分子”是指如下分子，其中V_H和V_L伴侣区域通过柔性的寡肽连接。

使用抗体片段而非整个抗体的优点是数倍的。片段的较小尺寸可导致改善的药理性质，例如更好的固体组织渗透性。除去了整个抗体的效应功能，例如补体结合。Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段可以全部在大肠杆菌中表达并由大肠杆菌中分泌，从而使得容易进行所述片段的大量生产。

整个抗体以及F(ab')₂片段为“二价的”。“二价的”是指上述抗体和F(ab')₂片段具有两个抗原结合位点。相对地，Fab、Fv、ScFv和dAb片段是单价的，仅具有一个抗原结合位点。

抗体可以是单克隆或多克隆的。可以通过已知的技术来制备合适的单克隆抗体，例如在“Monoclonal Antibodies:A manual of techniques”,H Zola(CRC Press,1988)和“Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and applications”,J G R Hurrell(CRC Press,1982)中描述的那些，在此通过参考将它们并入本文。

在一个实施方式中，第一结合试剂被固定在表面上(例如在多孔板或阵列上)。

因此，第一结合试剂可以包括抗体或其抗原结合片段或由抗体或其抗原结合片段构成。优选抗体或其抗原结合片段是重组抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段可以选自下组：scFv、Fab、和免疫球蛋白分子的结合域。

优选地，第一结合试剂被固定在表面上。

可以用可检测部分标记检测样品中的一种或多种生物标志物。

“可检测部分(detectable moiety)”包括如下含义，该部分可以被检测以及可以确定该部分的相对量和/或位置(例如，在阵列上的位置)。

本领域技术人员熟知合适的可检测部分。

因此，该可检测部分可以是当暴露于特定的条件下时，可以被检测的荧光和/或发光和/或化学发光部分。例如，荧光部分可需要被暴露于在特定波长和强度的放射(例如光)下以引起荧光部分的激发，从而使得其发射出可以被检测的在特定波长的可检测的荧光。

另外的，可检测部分可以是酶，该酶能够将(优选检测不到的)基质变换成可视的和/或可检测的可检测产物。合适的酶的实例可以参考例如ELISA分析在下文中详细讨论。

另外的，可检测部分可以是用于成像的放射性原子。合适的放射性原子包括用于显像研究的^99mTc和¹²³I。其他容易的可检测部分包括，例如用于磁共振成像(MRI)的自旋标志物，诸如¹²³I again、¹³¹I、¹¹¹In、¹⁹F、¹³C、¹⁵N、¹⁷O、钆、锰或铁。显然，待检测的试剂(例如，在本文中描述的检测样品和/或对照样品中的一种或多种生物标志物和/或用于检测选择的蛋白质的抗体分子)必须具有足够的合适的原子同位素以使得可以容易地检测可检测部分。

可以按照已知的方式将放射-或其他标记组合到本发明的试剂(即，本发明方法的样品中存在的蛋白质和/或本发明的结合试剂)中。例如，如果结合部分(binding poiety)是多肽，其可以通过生物合成或可以通过使用合适的氨基酸前体(涉及，例如用氟-19代替氢)通过化学氨基酸合成来合成。可以例如通过半胱氨酸残基将标志，诸如^99mTc、¹²³I、¹⁸⁶Rh、¹⁸⁸Rh和¹¹¹In附着到结合部分中。可以通过赖氨酸附着钇-90。可以使用IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Comm.80,49-57)来结合¹²³I。参考文献(“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”,J-F Chatal,CRC Press,1989)详细地描述了其他方法。用于将其他可检测部分(诸如酶、荧光、发光、化学发光或放射性部分)偶联至蛋白质的方法是本领域所熟知的。

优选的，用可检测部分标记对照样品(一个或多个)中的一种或多种生物标志物。可检测部分可以选自下组：荧光部分；发光部分(luminescent moiety)；化学发光部分(chemiluminescent moiety)；放射性部分；酶部分。但是，优选可检测部分为生物素。

在另外的实施方式中，使用包括能够与一种或多种生物标志物结合的第二结合试剂的分析进行步骤(b)、(d)和/或步骤(f)，该第二结合试剂包括可检测部分。优选地，第二结合试剂包括或由以下物质构成：抗体或其抗原结合片段。优选地，抗体或其抗原结合片段为重组抗体或其抗原结合片段。最优选地，抗体或其抗原结合片段选自下组：scFv、Fab、以及免疫球蛋白分子的结合域。在一个实施方式中，可检测部分选自下组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分和酶部分。优选地，可检测部分为荧光部分(例如，AlexaFluor染料如Alexa647)。

在一个实施方式中，本发明第一方面的方法包括ELISA(酶联免疫吸附测定)或由ELISA构成。

用于检测血清或血浆蛋白质的优选的分析包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA)以及免疫酶分析(IEMA)，包括使用单克隆和/或多克隆抗体的三明治分析。David等人在美国专利No.4,376,110和No.4,486,530中描述了示例性的三明治分析，通过参考并入本文。在片(slide)上的细胞抗体染色可以用于在细胞学实验室诊断测试中已知的方法中，如本领域技术人员所述熟知的。

通常，该分析为ELISA(酶联免疫吸附测定)，其通常涉及使用产生有色的反应产物的酶，通常在固相分析中。酶诸如辣根过氧化物酶和磷酸酶已经被广泛使用。放大磷酸酶反应的方式是使用NADP作为基质产生NAD，其此时将作为用于第二酶系统的辅酶。来自大肠杆菌的焦磷酸酶提供了良好的偶联物(conjugate)，因为该酶不存在于组织中，其是稳定的并且提供良好的反应颜色。还可以使用基于酶诸如荧光素酶的化学-发光系统。

本领域技术人员熟知ELISA方法，例如参见The ELISA Guidebook(Methods inMolecular Biology),2000,Crowther,Humana Press,ISBN-13:978-0896037281(通过参考将其公开内容并入)。

通常使用与维生素生物素的结合，因为生物素可以通过其与酶连接的抗生素蛋白或链霉抗生物素蛋白(生物素以大的特异性和亲和性与其结合)的反应容易地被检测。

但是，备选地，使用阵列进行步骤(b)、(d)和/或步骤(f)。阵列本身是本领域所熟知的。通常它们是由具有分开的间距(即离散的)区域(“点”)的线性的或二维结构形成的，每个均具有有限的面积并形成在固体支撑体的表面上。阵列还可以是微珠结构的，其中每个微珠可以通过分子密码或颜色密码识别，或在连续流体中被识别。当样品通过一系列点(每个点从溶液中吸附分子类型)来顺序地进行分析。固体支撑物通常为玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支撑体可以为管、珠子、盘、硅芯片、微孔板、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、硝基纤维素膜、尼龙膜、其他多空膜、非多空膜(例如，塑料、聚合物、有机玻璃、硅等)、大量聚合物针(polymeric pin)、或大量微孔板、或适合用于固定蛋白质、多核苷酸和其他合适的分子和/或进行免疫分析的任何其他表面形式。结合方法是本领域所熟知的并且通常包括交联共价结合或物理吸附蛋白质分子、多核苷酸或等至固体支撑体。通过使用熟知的技术，例如接触式或非接触式印刷、掩膜或光刻，可以确定每个点的位置。其综述参见Jenkins,R.E.,Pennington,S.R.(2001,Proteomics,2,13-29)和Lal等人(2002,Drug Discov Today 15；7(18Suppl):S143-9)。

通常阵列为微阵列。“微阵列”是指如下含义：具有至少约100/cm²，优选至少约1000/cm²离散区域密度的区域的阵列。微阵列中的区域具有通常的维度，例如直径在约10～250μm的范围，并通过大致相同的距离与阵列中的其他区域分开。阵列还可以是宏阵列(macroarray)或纳米阵列。

一旦适合的结合分子(如上所述)被鉴定和分离出，本领域技术人员可以使用分子生物学领域中熟知的方法来制造阵列。

因此，阵列可以是基于珠的阵列或基于表面的阵列。优选地，阵列选自下组：宏阵列、微阵列和纳米阵列。

在一个实施方式中，根据本发明的第一方面的方法包括：

(i)利用生物素标记样品中存在的生物标志物；

(ii)使生物素-标记的蛋白质与阵列接触，该阵列包括固定在其表面上的离散区域的大量scFv，该scFv对于表III中的一种或多种蛋白质具有特异性；

(iii)使已固定的scFv与包括荧光染料的链霉抗生物素蛋白偶联物接触；以及

(iv)检测在阵列表面上的离散区域的染料存在，

其中阵列表面上的染料的出现是来自表IIII的生物标志物在样品中表达的指示。

在备选的实施方式中，步骤(b)、(d)和/或(f)包括检测编码一种或多种生物标志物的核酸分子的表达。优选核酸分子为cDNA分子或mRNA分子。最优选核酸分子为mRNA分子。

因此，在步骤(b)、(d)和/或(f)中检测一种或多种生物标志物的表达可使用选自下组的方法进行，该组由Southern杂交、Northern杂交、聚合酶链式反应(PCR)、反转录PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、纳米阵列、微阵列、宏阵列、放射自显影和原位杂交构成。优选地，使用DNA微阵列确定步骤(b)中一种或多种生物标志物(一个或多个)的表达。

在一个实施方式中，在步骤(b)、(d)和/或(f)中检测一种或多种生物标志物的表达通过使用一种或多种结合部分来进行，每个结合部分各自能够选择性地结合编码在表III中鉴定的一种生物标志物的核酸分子。

在另外的实施方式中，一种或多种结合部分各自包括核酸分子或各自由核酸分子分子构成。因此，一种或多种结合部分可各自包括下述物质或由下述物质构成：DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或PMO。但优选一种或多种结合分子各自包括DNA或由DNA构成。

优选地，一种或多种结合部分的长度为5～100个核苷酸。更优选地，一种或多种结合部分的长度为15～35个核苷酸。还更优选地，结合部分包括可检测部分。

在另外的实施方式中，可检测部分选自下组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分(例如放射性原子)；以及酶部分。优选地，可检测部分包括放射性原子或由放射性原子构成。放射性原子可选自下组：锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、铼-186、铼-188和钇-90。

但是，结合部分的可检测部分可以是荧光部分(例如，Alexa Fluor染料，例如Alexa647)。

在一个实施方式中，步骤(b)、(d)和/或(f)中提供的样品选自下组：未分级分离的血、血浆、血清、组织液、胰组织、胰汁、胆汁和尿液。优选地，步骤(b)、(d)和/或(f)中提供的样品选自下组：未分级分离的血、血浆和血清。更优选地，步骤(b)、(d)和/或(f)中提供的样品为血浆。在另外优选的实施方式中，步骤(b)、(d)和/或(f)中提供的样品为血清。

本发明的第二方面提供用于检测个体中胰腺癌存在的阵列，其包括如本发明第一方面所限定的一种或多种结合试剂。

阵列适合用在如上所述的本发明的方法中。

优选一种或多种结合试剂能够与表III中定义的所有蛋白质结合。

本发明的第三方面提供选自本发明第一方面定义的组的一种或多种生物标志物的用途，用作检测个体中胰腺癌存在的诊断标志物。优选地，表III中定义的所有蛋白质用作检测个体中胰腺癌存在的诊断标志物。

本发明的第四方面提供用于诊断胰腺癌存在的试剂盒，其包括：

A)一个或多个根据本发明第一方面的第一结合试剂或根据本发明第二方面的阵列；以及

B)用于进行根据本发明第一方面的方法的说明。

下面将参考下述表和图来描述体现本发明的某些方面的优选的、非限制性示例：

图1：PaC与N的分类

A)与PaC血清杂交的抗体微阵列的扫描图像。总共160个探针，包括位置标志物和对照，被印在八个20×8亚阵列/片中。B)PaC相比N的血清分析物差异化表达(p<0.05)。C)PaC相比N的基于全部抗体的ROC曲线，即，使用了未过滤的数据。D)使用基于全部抗体的SVM预测值进行的PaC相比N的分类(红点-PaC，蓝点-N)。在热图中示出了前20个差异化表达(p<0.02)的非冗余分析物的相对表达水平。红色-上调，绿色-下调，黑色-同等水平。(E)scFv抗体特异性的验证，示出了高度差异化表达(p＝0.005)的分析物IL-6的图形，用的是278种人蛋白质的阵列。(F)scFv抗体特异性的验证，示出了中等差异化表达(p＝0.005)的分析物IL-10的图形，用的是278种人蛋白质的阵列。

图2：用于PaC与N分类的生物标志物签名的预验证

(A)使用LOO程序结合向后消除策略进行的第一患者队列中PaC类相比于N类的生物标志物签名的缩图。观察的ROC AUC值针对于剩余的抗体数量作图。(C)由第一患者队列获得的精简的(condensed)18-分析物的非冗余生物标志物签名。(D)第一患者队列用作训练组，并且然后使用输出分类器(classifier)检测新的、独立的患者组，即第二患者队列。(E)用于PaC与N分类的生物标志物签名的预验证，由分离器在检测组上所获得的ROC曲线例示。

图3：候选血清生物标志物签名区分PaC和胰腺炎

(A)分别针对PaC与ChP、AIP或ChP+AIP+N的差异化表达(p<0.05)的血清分析物。(B)用于PaC、ChP、AIP或ChP+AIP+N分类的基于全部抗体的ROC曲线，即，使用了未过滤的数据。(D)使用10-plex细胞因子夹心抗体微阵列(MSD)对所选分析物进行抗体微阵列数据的验证。仅针对分析物IL-8示出了数据，其观察的信号的大部分大于MSD分析的检测下限。

图4：用于PaC诊断的候选血清生物标志物签名的预验证

(A)将由PaC、N、ChP和AIP构成的第一患者队列分成训练组(三分之二)和检测组(三分之一)。(B)使用向后消除策略针对训练组获得的精简的25个非冗余血清生物标志物签名。(C)用于PaC诊断的精简的25-分析物的生物标志物签名的预验证，由分离器在检测组上所得的ROC曲线所例示。(D)通过向后消除策略获得的精简的生物标志物签名的表现(实线)，由ROC AUC值表示，与i)1000个随机25-标志物签名(空心圆)、或ii)最低p-值(虚线)、或iii)最高差异倍数(点画线)得到的25-分析物签名相比。(E)当样品注释为正确(实线)或改变1000次(空心圆)时，比较检测组上针对精简的25-分析物生物标志物签名得到的ROCAUC值。

图5：抗体微阵列策略的纲要

图6：用于区分(A)胰腺癌、以及(B)正常、慢性胰腺炎和/或急性炎症性胰腺炎的ROC-AUC值

示出了多个标志物签名的ROC-AUC值，所述签名具有全部的表IV(A)(即核心)标志物和全部的表(B)(即优选的)标志物、以及具有增加数量的表(C)(即任选)标志物。从29个分析物签名，即核心标志物+优选标志物+15任选标志物，获得最佳ROC AUC值(0.90)。但是，所有标志物的组合具有显著的预测能力。

实施例

材料和方法

血清样品

在诊断时收集血清样品，即在开始任何治疗之前，从两个独立的患者队列收集并储存在-80℃。在第一队列中，筛查来自诊断患有腺癌(PaC)(n＝34)、慢性胰腺炎(ChP)(n＝16)、自身免疫性炎症性胰腺炎(AIP)(n＝23)、或健康个体(N)(n＝30)(无临床症状)103位患者的血清样品。表1描述了患者人口统计学。将该队列随机地分开并用作训练组和检测组。第二队列，由诊断患有PaC(n＝25)或N(n＝20)(针对患者人口统计学，参见[14])的45名患者构成，第二队列仅用作独立的检测组，使用近期收集的抗体微阵列数据[14]。样品队列的大小受在诊断时收集的能够良好表征的血清样品的限制。

抗体微阵列分析

使用在先内部优化的方案进行重组抗体微阵列分析[12-15](参见下述)。简要来说，使用靶标57个主要的免疫调节分析物的121个人重组单链Fv(scFv)抗体用作探针。通过使用i)严谨选择方案[16]，ii)每个目标分析物的多克隆(≤4)和iii)通过分子设计改编的scFv库微阵列(REF)来确定来源于scFv的噬菌体展示的特异性、亲和性(nM范围)和芯片上的功能[16]。使用非接触式分配器通过逐一分散抗体和对照(330pL/滴)来制备平面抗体微阵列(阵列大小；160x8,<0.5cm²)。单独筛选生物素化血清样品以及通过添加荧光标记的链霉抗生物素蛋白并使用共聚焦荧光扫描仪来可视化特异性结合的分析物。每个单独的阵列数据点代表四个重复样品的平均值。使用半全局归一算法来进行芯片至芯片的归一。根据之前的研究[12,15,17]，点-至-点再现性和阵列-至-阵列再现性的相关系数分别为0.99和0.94。分别使用234个人蛋白质阵列和10-plex细胞因子三明治抗体微阵列来验证选择的抗体的特异性和微阵列数据(表II)。另外，已经使用ELISA、蛋白质阵列、拦网/扣球实验(blocking/spiking experiment)和/或质谱验证了一些抗体的特异性(表II)。

微阵列数据分析

在R中进行数据分析(参见下述)。简要地说，使用支持向量机(SVM)将样品分为两个确定的组中的一个(例如，癌症vs.健康)，使用线性核估计并将制约成本设置为1。没有进行尝试来调节其以防止过度拟合的风险。使用留-出(leave-one-out(LOO))交叉验证程序对SVM进行训练和检测。在对照的两个中，该训练部分包括通过在训练组中选择展示最高识别力(discriminatory power)的抗体得到的抗体子面板。使用直接或交叉验证向后消除策略来进行抗体的选择。使用该方法，可以验证精简的候选生物标志物签名，并随后在独立的检测组上评估。

使用0阈值水平，由SVM决策值来计算灵敏度和特异性值。使用SVM决策值来构建受试者工作特征(receiver operating characteristics(ROC))曲线。计算曲线下面积(AUC)并用作预测性能的量度。另外，针对每个抗体计算Wilcoxon p-值和倍数变化(foldchange)。按照针对肿瘤标志物预后研究的推荐来报告候选生物标志物签[18]。

血清样品

在通知同意后，在诊断时即在开始治疗之前，从两组独立的患者队列上收集血清样品，并储存在-80℃。使用组织学来验证PC。患者队列1由来自患有胰腺导管腺癌(PaC)(n＝34)、慢性胰腺炎(hCP)(n＝16)、自身免疫性胰腺炎(AIP)(n＝23)或健康个体(对照；N)(n＝30)(无临床症状)的103个患者(Mannheim University Hospital,Germany)的血清样品组成。表1描述了患者人口统计学。将该队列随机地分开并用作训练组(样品的三分之二)和检测组(样品的三分之一)。患者队列2由诊断患有PaC(n＝25)或N(n＝20)的45名患者构成(Stockholm South General Hospital and Lund University Hospital,Sweden)(针对患者人口统计学，参见[39])，并如最近描述的适于使用抗体微阵列数据[39]。进行了功效分析(如下所述)以确定样品队列的大小是否足够提供统计功效>80％。针对患者队列1进行主要实验，患者队列用作在一个实验中用于验证的独立的数据组(参见图5)。

血清样品的标记

使用之前针对血清蛋白质组优化的标记步骤来标记血清样品[39-43]。简要来说，将未加工血清样品在冰上解冻并对30μL的等分样品进行离心(16 000x g，20分钟，4℃)。在PBS中将5μL上清液稀释45倍，得到的蛋白质浓度为约2mg/mL。在终浓度为0.6mM，在冰上利用硫-NHS-LC-生物素(Pierce,Rockford,IL,USA)标记样品2小时，并每20分钟轻柔悬混样品。使用3.5kDa MW截留透析单元(Thermo Scientific,Rockford,IL,USA)，在4℃，通过相对于PBS的透析除去游离的生物素72小时。将样品等分并在-20℃储存。

scFv的生产和纯化

从n-CoDeR库选择了总共121个靶标57个主要免疫调节生物分子的人重组单链Fv(scFv)抗体片段，并由BioInvent International AB,Lund,Sweden善意提供，或由Prof.Mats Ohlin(Lund University,Sweden)(针对粘蛋白-1的5个克隆)善意提供。通过使用i)严谨选择方案[43]，ii)每个目标分析物的多克隆(≤4)和iii)通过分子设计改编的scFv库微阵列[44,45]来确定来源于scFv的噬菌体展示的特异性、亲和性(nM范围)和芯片上的功能。在100mL大肠杆菌培养物中制备抗体片段并使用在Ni-NTA琼脂糖上的亲和性色谱(Qiagen,Hilden,Germany)从各自的表达上清液或细胞周质纯化。使用250mM咪唑洗脱结合分子，并针对PBS大规模地进行透析并在用于微阵列制造之前储存在4℃。通过在280nm处的吸光度来确定抗体浓度(平均500μg/mL，范围50～1840μg/mL)。

抗体微阵列的制备和处理

为了制备平面抗体微阵列，我们使用了经预先优化和验证的设置[39-43,46]。简要来说，使用非接触式打印机(BioChip Arrayer,PerkinElmer Life&AnalyticalSciences,Wellesley,MA,USA)，通过沉积约330pL-滴，使用piezo技术，将scFv布置到balck聚合物Maxisorb微阵列片(NUNC,Roskilde,Denmark)上。在每个位置滴下两滴，使得在第二滴分散之前第一滴干燥。平均地，在每个位置沉积5fmol抗体(范围1.5～25)。为了保证充分的统计性和解决任何局部缺陷，每个探针重复印刷8个重复样品。在每片上印刷了包括位置标志物和对照scFv的总共160个探针，排列在8个20x 8亚阵列中。为了在定量过程中辅助栅极调整(grid alignment)，在选定的位点放置一行Alexa647偶联的链霉抗生物素蛋白(Invitrogen,Carlsband,CA,USA)(10μg/mL)。在PBS中的5％(w/v)无脂奶粉(Semper AB,Sundbyberg,Sweden)中对该阵列进行阻断过夜。

在Protein Array Workstation(PerkinElmer Life&Analytical Sciences)中，根据先前的描述对微阵列片进行处理。简要来说，利用在PBS中的0.5％(v/v)Tween-20(PBS-T)，以60μL/min冲洗阵列4分钟，然后利用75μL生物素化血清样品(稀释的1:2，得到1:90的总血清稀释)温浴，该75μL生物素化血清样品在含1％(w/v)无脂奶粉和1％(v/v)Tween-20的PBS(PBS-MT)中，培养1小时，且每15秒钟进行搅拌。接下来，再次利用PBS-T冲洗并利用PBS-MT中的1μg/mL Alexa-647偶联的链霉抗生物素蛋白温浴1小时。最终，利用PBS-T冲洗阵列，并在氮气气流下干燥，并利用共聚焦微阵列扫描仪(PerkinElmer Life&Analytical Sciences)在10μm分辨率下扫描，使用PMT电流增益(PMT gain)和激光功率的四种不同的扫描仪设置。在ScanArray Express software v.4.0(PerkinElmer Life&Analytical Sciences)中，使用固定圈方法(fixed circle method)对每个点的强度进行定量。减去局部背景。为了补偿任何可能的局部缺陷，自动地除去两个最高和两个最低的重复样品，并且使用剩余的四个重复样品的平均值。对于抗体展示饱和的信号，来自较低的扫描仪设置的值被放大并代替使用。使用先前描述的半全局归一算法[39,40,42]来进行芯片至芯片的归一。首先，计算并排序全部样品中的每个探针的CV。然后，鉴定出在所有样品中展示最低CV-值的15％的探针并用于针对每个阵列计算芯片至芯片的归一因子。归一因子N_i利用公式N_i＝S_i/μ来计算，其中S_i是使用的抗体的信号强度之和，所有样品取平均，以及μ是S_i的样品平均值。在统计分析之前，重新计算强度取log2值。

抗体特异性的验证

使用278Human Protein Array G系列(Norcross,GA,USA)，根据制造商提供的说明书，对两个选定的scFvs(抗-IL-6(2)和抗-IL-10(1))的特异性进行测试。利用硫-NHS-LC-生物素(Pierce)标记scFv，2小时，在冰上，且生物素的量为3.5倍过量摩尔量。利用PBS透析72小时除去未结合的生物素。向每个阵列添加总共5μg抗体。使用1μg/mL Alexa647狗链的链霉抗生物素蛋白(Invitrogen)检测结合。向一个阵列中添加PBS作为阴性对照以检测链霉抗生物素蛋白的非特异性结合。对阵列进行扫描并减去由阴性对照阵列得到的信号。另外，使用良好定性的、标准化的血清样品，以及独立的方法，诸如质谱、ELISA、MSD和CBA以及扣球和拦网实验预先验证了几个抗体的特异性(表III)。

阵列数据的验证

进行了人Th1/Th2 10-plex MSD(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD,USA)分析以尝试确认抗体微阵列结果。在空间上不同的电极点中，MSD 96-孔板的每个孔均利用抗IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13和TNF-α的抗体进行了预功能化。分析了总计34个血清样品(未稀释的)，包括11个PaC、11个健康样品、9个ChP和3个AIP样品(AIP样品的数量较少是因为受到亚组中样品容量的限制)。根据制造商提供的说明书进行分析并且在MSD仪器中进行了基于电化学发光的读取。

微阵列数据分析

在R(http://www.r-project.org)中进行所有的统计和数据分析。简要地说，使用支持向量机(SVM)将样品分为两个确定的组中的一个(例如，癌症vs.健康)，使用线性核估计并将制约成本设置为1。没有进行尝试来调节其以防止过度拟合的风险。使用留-出(LOO)交叉验证程序对SVM进行训练和检测[42]。在对照的两个中，该训练部分包括通过在训练组中选择展示最高个人鉴别力的抗体得到的抗体子面板。使用直接或交叉验证向后消除策略来进行抗体的选择。使用该方法，可以验证精简的候选生物标志物签名，并随手在独立的检测组上评估。

使用0阈值水平，由SVM决策值来计算灵敏度和特异性值。使用SVM决策值来构建受试者工作特征(ROC)曲线。计算曲线下面积(AUC)并用作预测性能的量度。另外，针对每个抗体计算Wilcoxon p-值和倍数变化。按照针对肿瘤标志物预后研究的推荐来报告候选生物标志物签[47]。

生物标志物签名的鉴定

使用落后消除方案鉴定用于从健康个体中区分PaC的生物标志物签名。在该方法中，当时从数据集中排除一个样品。使用剩余的样品训练SVM，通过当时排除一个样品并且使用剩余的抗体进行分类。当所有的抗体已经被除去一次时，最少信息抗体被定义为当针对分类得到最小Kullback-Leibler(KL)错误时排除的抗体，并将其从数据集中消除。重复进行LOC步骤，直到仅剩下一个抗体，并记录通过其消除抗体的命令。通过排除新样品来重复步骤，该重复持续进行直到所有样品被除去一次。在每次排除样品时产生抗体被消除的命令列表。最终，当所有样品已经被除去一次，并且构建了合意列表，其中每个抗体被分配了基于其忍受消除步骤的时间的分数，针对进行的所有重复取平均。在整个过程中，使用每个除去的样品来检测针对每个抗体亚组的新长度的SVM模型构建，并返回根据性能的决策值。由此，收集了针对任何给定亚组长度的所有样品的决策值。相对于抗体的数量绘制相应的ROC区域，作为用于评估数据组能力和消除策略的手段。从合意列表中选择了18个分析物的精简签名，并且将来自25个PaC和20个N血清样品的抗体微阵列分析的独立数据组[39]用作检测组以对候选签名进行预验证。在检测组中，在SVM LOO交叉验证程序中使用了签名分析物，并在ROC曲线中示出了用于从N中区分PaC的签名的能力。

针对从N、ChP和AIP中区分PaC产生了第二候选生物标志物签名。首先，将数据随机分成训练组(样品的三分之二)和检测组(样品的三分之一)。使用了修改的(甚至是更严谨的)向后消除策略。代替当时除去一个样品，仅训练SVM一次，使用训练组中的全部样品。由此，由选择的25个分析物的精简组产生了一个消除列表并用于在训练组中构建SVM。在独立的检测组上施用模型并且产生了ROC曲线。另外，进行了统计功效分析以评估在R(根据Shapiro-Wilk检测所建议的假定决策值正常分布)中使用功能“power.t.test”在检测组中所需的患者的数量。在训练组中由SVM分析观察的决策值显示2.87的标准偏差，并且3.47的组间delta值(平均之间的差异)。将alpha水平(显著水平)设定为0.05。另外，通过分别比较选定的签名和1000个产生的相同长度的签名的性能以及比较选定的签名和通过选择最低p值和最高倍数变化的抗体产生的签名，对落后消除方案的有效性进行验证。最后，分类器的强度和数据组通过比较检测数据组的签名相对于随机数据的性能来检测，在检测数据组中生成1000个样品注释置换(permutation of the sample annotations)。

结果

PaC与健康对照的分类

为了鉴定与PaC相关的血清生物标志物签名，我们使用第一患者列队，进行了PaC(n＝34)与N(n＝30)的差异化血清蛋白质表达概貌描绘。抗体微阵列的代表性图像如图1A所示，说明获得了动态信号强度、足够的点形态学(spot morphology)以及低的非特异性背景结合。结果显示发现了33个非冗余蛋白质分析物(包括例如Th1和Th2细胞因子两者)有差异化表达(p<0.05)，其中除了补体蛋白C1q和备解素以外全部都在PaC中被上调了(图1B)。

为了研究是否PaC和N可以被区分，我们运行了SVM LOO交叉验证，基于所有的抗体，即，使用了未过滤数据。数据显示患者队列可以通过0.94的ROC AUC值来分类(图1C)。在图1D中，通过减少SVM决策值来对样品作图，并且在热图中示出了前20种最高水平差异化表达的分析物(p<0.02)的相对表达方式。通过使用0阈值(默认值)，分析显示可以以灵敏度和特异性为82％和87％区分PaC与N。

接下来，使用了一个278种人蛋白质的阵列用于验证所选抗体的特异性(图1E和1F)。为此，选择了抗较高水平差异化表达的分析物IL-6(p＝0.005)的scFv抗体，和抗中等水平差异化表达的分析物IL-10(p＝0.04)的scFv抗体。在两种情况中，蛋白质阵列分析显示scFv抗体片段特异性地结合至它们的靶标蛋白质。

预验证PaC类与N类的精简的生物标志物签名

为了检测从第一患者队列(n＝64)衍生的分类的强度，我们首先将分析物总数量压缩至对于所述分类贡献最多的18个非冗余生物标志物，方法是将我们的LOO程序与一种重复的向后消除策略组合。在该过程中，Kullback-Leibler偏差误差(divergences error)被最小化并且用于指导将所述抗体一个接一个地逐步去除。在每一轮之后，收集SVM决策值，并且计算相应的ROC曲线和AUC值。在图2A中，AUC值针对于剩余的抗体数量作图，显示甚至在仅包括少量的抗体时也能有高水平的且稳定的分类。18-分析物精简候选血清生物标志物签名(由诸如细胞因子、补体蛋白和酶等多种分析物组成)如图2B所示。接下来，我们将所述的18-分析物分类器应用在新的独立的检测组，即第二患者列队(n＝45)上(图2C)。结果显示该分类器能够利用0.95的ROC AUC值将患者分成PaC与N(图2D)，对应于灵敏度88％以及特异性85％。因此，该数据描绘出了用于PaC诊断的第一预验证的血清生物标志物签名。

区分PaC与胰腺炎的生物标志物签名

为了检测是否可以将癌症与胰腺的良性状态区分开，我们使用第一患者队列比较了PaC(n＝34)的血清蛋白质表达概貌与ChP(n＝16)或AIP(n＝23)的血清蛋白质表达概貌。在PaC与ChP的情况下，查明了15个非冗余的差异化表达(p<0.05)的血清分析物，其中除了两个(IL-4和IL-12)以外全部在PaC中被上调了(图3A)。基于未过滤数据，结果显示PaC与ChP可以利用0.86的ROC AUC值来区分(图3B)，对应于97％灵敏度和69％特异性。在PaC与AIP的比较中，发现了总共49个非冗余血清分析物被差异化表达，除了C1q和备解素以外，它们全部在PaC中被上调了(图3A)。同样，基于未过滤的数据，结果显示可以利用0.99的ROC值来区分PaC与AIP(图3B)，灵敏度和特异性分别为97％和91％。

为了更好地反映临床实际，我们随后用第一患者队列(n＝103)调查了是否能辨别PaC组与ChP+AIP+N多类型混合患者组之间的差异。结果显示47个非冗余血清蛋白质被差异化表达(p<0.05)(图3A)。这些分析物中大部分(47个中的45个)在PaC中被发现上调，包括广泛多种蛋白质。基于未过滤的数据，结果显示可以利用0.85的ROC AUC值来区分PaC与该多类型患者组。

在一个验证所述阵列数据的尝试中，使用了独立的10-plex细胞因子夹心抗体微阵列(MSD)(图3C)。但在10个目标血清分析物中仅一个(IL-8)在大部分样品中高于MSD分析的检测下限。同样地，通过MSD分析发现，在PaC相比于N、ChP、AIP及其混合的情况中，在除了PaC与AIP(p＝0.29)的所有情况中，IL-8的上调都被统计确认了(p<0.05)。

用于PaC诊断的提炼的生物标志物签名

为了检测整个第一患者队列(包括PaC、N、ChP和AIP(n＝103))的分类强度，我们将该队列分成训练组(三分之二)和检测组(三分之一)(图4A)。接下来，通过使用直接、重复的向后消除策略，解码了由在训练组中对分类贡献最多的25个非冗余分析物构成的精简的血清生物标志物签名。所述25-分析物的精简生物标志物签名由例如多种细胞因子和补体蛋白构成，在图4B中示出。接下来，我们将该25-分析物分类器用于独立的检测组(图4C)。数据显示可以利用0.88的ROC AUC值查明PaC，灵敏度和特异性分别为73％和75％。

为了进一步挑战所述分类器，我们从统计上分析了其识别力。首先，在训练组中产生了相同长度(25个抗体)的1000个随机签名，并用于检测组。结果显示在95％的例子中，针对这些随机签名的AUC值低于分类器生物标志物签名的AUC值(AUC＝0.88)(图4D)。另外，基于最低p-值(AUC＝0.77)或最高倍数改变(AUC＝0.78)所选出的相应25-分析物签名的AUC值明显低于分类器签名的AUC值。因此，所述数据进一步表明所述分类器的识别力，以及向后消除策略用于确定精简的、高效率签名的适用性。第二，将检测组样品的注释改变1000次以比较相同数量样品的特异性分类和随机分类。结果显示当使用正确的样品注释时AUC值明显地高于当使用随机注释时得到的AUC值(0.88比0.19-0.86，平均值0.5)，进一步证实了所述分类的能力。

讨论

在本研究中，我们应用了亲和性蛋白质组学来驾驭免疫系统对靶标PaC的诊断能力。我们根据了针对如下发现我们所采用的方法，该发现为：免疫系统对于由疾病引起的个体健康状况的改变非常敏感，能通过尤其是免疫调节性分析物的水平的波动来记录这些改变。为此，我们设计了我们的抗体微阵列，以主要靶定这些关键性的调节性血清分析物的类型。数据显示，展现高诊断能力的与PaC相关的候选生物标志物签名能够被解码(de-convoluted)。以相似的方式，近来该亲和蛋白质组学方法能够鉴定用于区分其他癌症迹象和健康对照的一些血清学生物标志物签名[14-15,17,19]，进一步显示了该平台的实力。

我们首次显示了血清储存的信息使得我们不仅能够具有高度确信度区分PaC与对照，以及PaC与胰腺炎的经明确确定的患者队列，还可以具有高度确信度地区分PaC与对照和胰腺炎患者的混合队列。后者的发现是特别关键的，因为在要筛选不同种类的患者组的临床设置中，候选标志物签名也应当表现良好。

高效率的PaC分类器的临床影响会较高，因为尚无有效的血清学识别器出现[2,7-9,20-21]。在等待黄金的分类器被建立的过程中，CA-19-9仍然是针对PaC诊断的最有效的分子标志物[2,8-10]。明显地，相比较于CA-19-9所一贯显示的灵敏度和特异性[2,9-11]，我们的数据显示了针对PaC诊断的显著高的中值灵敏度(88％)和特异性(85％)，显示了显著的增加临床价值。另外，我们最近还模拟了新的诊断可能性对成本、存活率和高危患者的生命质量的影响，显示了亲和性蛋白质组学具有成为筛选PaC的经济有效的工具的巨大前景(Bolin et al,ms in prep.)。

分类器将会发挥其最大优势，如果能够进行早期诊断，在当肿瘤仍然较小和可进行手术时[2,9]。

在寻找癌症生物标志物的过程中，系统性炎症作为潜在的干扰因子经常被提及[23]，因为癌症发展和炎症是关联的。在基于亲和性蛋白质组学的早期工作中，结果还经常显示普通疾病(炎症的)签名而不是癌症-特异的指纹被鉴定出来[24-26]。明显地，在本文中我们显示了可以高度确信地区分PaC和胰腺炎。另外，观察的签名(一个或多个)显示了显著的差异，即与在其他不同炎症病况文献[19,27](Carlsson et al.,ms in prep.)和其他癌症[14-15,17,19]中观察到的仅有少的重叠，进一步支持了破译了PaC-特异性签名的想法。

血清的免疫签名可以被认为是在检测时在患者中的免疫系统活性的快照。这些指纹特征将反映响应于癌症的直接的和间接的(系统的)影响的组合。关注细胞因子表达概貌，之前的报道已经显示胰腺癌细胞系表达的一组细胞因子被发现是过表达的，在本研究中也显示出，一组细胞因子包括例如IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18和TGF-β1[28]。还发现这些和其他细胞因子(例如VEGF和IL-7)中的一些在PaC肿瘤组织和/或血清/血浆中给过表达[29-33]，进一步支持了我们的观察。尽管细胞因子在免疫系统中发挥关键作用，在生物演化关系(biological context)中解释这些错综复杂的表达模式是需要的，因为这些分析物中的很多展现了多重功能，并且通过异常的细胞因子表达模式可以表征PaC[29]。尽管例如IFN-γ的表达可以示意试图的抗-肿瘤免疫响应[29]，PaC的免疫环境经常被发现在免疫抑制位点中，如抗-炎症细胞因子(例如TGF-β和IL-10)，以及潜在的非活性促炎性细胞因子(例如IL-12和IL-18)的附随表达所说明的[29]。细胞的免疫抑制是在多个患者中观察到的PaC的引人注目的生物特征[34]。尽管报道了Th2倾斜响应，但也观察到了本文所显示的Th1/Th平衡[29,31,35]。还发现了细胞因子表达模式反应其他参数，诸如存活率[14,29]。观察一些非细胞因子标志物，一些补体蛋白，例如C3(其已经被指出在针对肿瘤的免疫监测中发挥功能[36-37])，糖类抗原Lewis x之前也已经被发现与PaC相关[38]。

综上，我们陈述了临床需求并且显示免疫签名是用于破解针对PaC诊断的第一预验证的血清学生物标志物签名的有效工具。这是通过高效率的平台、经良好控制的样品以及严谨的生物信息学和验证手段来实现的。将会在随后的研究中验证预测签名的能力，其中将对独立的样品队列进行分析。最终，这些发现会为改善PaC诊断提供新的机会并且由此提高PaC的预测和临床管理。

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表I-第一患者队列的患者人口统计学

表II-通过抗体微阵列分析的血清生物标志物的总结

*通过蛋白质阵列确定抗体特异性。

**预先通过ELISA、蛋白质阵列、封闭/探查实验、和/或质谱验证了抗体特异性。

表III-胰腺癌诊断生物标志物

表IV-胰腺癌诊断性生物标志物

(A)核心生物标志物

生物标志物名称
	白细胞介素-7(IL-7)
整合素α-10

(A5)(B)优选生物标志物

生物标志物名称
	B-半乳糖苷酶
Bruton’s酪氨酸激酶(BTK)
	补体蛋白C1q(C1q)
补体蛋白C1s(C1s)
	B细胞受体μ链(IgM)
白细胞介素-9(IL-9)
	整合素α-11
Janus激酶3蛋白质酪氨酸激酶(JAK3)
	组织蛋白酶原W
备解素
	TM肽
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)

(C)任选额外的生物标志物

表VI–训练的SVM程序

使用e1071 1.5-24 SVM(由http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html获得)得到下述参数

(A)–使用向后消除策略的PaC vs全部(N+Chp+AIP)的精简的生物标志物名称的定义

表VI–续

(B)–使用修改的向后消除策略的PaC vs N的精简的生物标志物签名的定义

表VI–续

(C)–表5(A)中定义的签名的检测

表VI–续

(D)–PaC vs全部(N+ChP+AIP)的最终SVM模型

表VII-用于区分(A)胰腺癌、以及(B)正常、慢性胰腺炎和/或急性炎症性胰腺炎的ROC-AUC值

核心标记+8个优选标志物提供了最佳ROC-AUC值。

该签名对应于(红色标记的核心)：

IL-7+整合素α-10+BTK+C1q+IgM+IL-9+组织蛋白酶原W+备解素+TM肽+β-半乳糖苷酶

但是，所有标志物组合具有实质性的预测的能力。

本发明包括以下内容：

1.检测个体中胰腺癌存在的方法，该方法包括以下步骤或由以下步骤构成：

a)提供来自个体的待检测样品；

b)通过检测一种或多种生物标志物在检测样品中的表达来确定检测样品的生物标志物签名，所述一种或多种生物标志物选自表III中定义的组；

其中，选自表III中定义的组的一种或多种生物标志物在检测样品中的表达是罹患胰腺癌的个体的指示；以及

其中步骤(b)包括或由以下检测构成：检测在表IV(A)和/或表IV(B)中列出的一种或多种生物标志物的表达。

2.根据项1所述的方法，其还包括以下步骤或还进一步由以下步骤构成：

c)提供来自为患胰腺癌的个体的对照样品；

其中，胰腺癌存在通过如下事件来鉴定，该事件为所述一种或多种生物标志物在步骤(b)中检测的在检测样品中的表达不同于在步骤(d)中检测的在对照样品中的表达。

3.根据项1或2所述的方法，其还包括以下步骤或由以下步骤构成：

e)提供胰腺癌个体的对照样品；

其中，胰腺癌存在通过如下事件来鉴定，该事件为在步骤(b)中检测的一种或多种生物标志物在检测样品中的表达相当于步骤(f)中检测的所述一种或多种生物标志物在对照样品中的表达。

4.根据项1，2或3所述的方法，其中，步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表IV(A)中列出的一种或多种生物标志物，例如表IV(A)中列出的至少两个生物标志物的表达。

5.根据上述项中的任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测白细胞介素-7(IL-7)和/或整合素α-10的表达，例如，检测白细胞介素-7的表达，检测整合素α-10的表达，或检测白细胞介素-7和整合素α-10的表达。

6.根据上述项中的任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表IV(A)中列出的每个生物标志物的表达。

7.根据上述项中的任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表IV(B)中列出的1或多种生物标志物的表达，例如，检测表IV(B)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种生物标志物的表达。

8.根据上述项中的任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表IV(B)中列出的全部生物标志物的表达。

9.根据上述项中的任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表IV(C)中列出的1或多种生物标志物的表达，例如，检测在表IV(C)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33种生物标志物的表达。

10.根据上述项中的任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表IV(C)中列出的全部生物标志物的表达。

11.根据上述项中的任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表IV中定义的全部生物标志物在检测样品中的表达。

12.根据上述项中的任一项所述的方法，其中，该方法用于区分胰腺癌(PaC)和任何其他疾病状态或状况。

13.根据项12所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(A)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(A)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物在检测样品中的表达。

14.根据项12或13所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(B)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(B)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24种生物标志物在检测样品中的表达。

15.根据项12、13或14所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(C)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(C)中列出的至少2、3、4或5种生物标志物在检测样品中的表达。

16.根据项12～15中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(D)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(D)中列出的至少2或3种生物标志物在检测样品中的表达。

17.根据项12～16中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(F)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(F)中列出的至少2、3、4、5或6种生物标志物在检测样品中的表达。

18.根据项12～17中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表V(A)、表V(B)、表V(C)、表V(D)和/或表V(F)中列出的全部生物标志物在检测样品中的表达。

19.根据项12～18中任一项所述的方法，其中其他疾病状态或状况为慢性胰腺炎(ChP)、急性炎症性胰腺炎(AIP)和/或正常，例如其他疾病状态或状况可以是单独的慢性胰腺炎；单独的急性炎症性胰腺炎；慢性胰腺炎和急性炎症性胰腺炎；慢性胰腺炎和正常；急性炎症性胰腺炎和正常；或者慢性胰腺炎、急性炎症性胰腺炎和正常。

20.根据项1～11中任一项所述的方法，其中，该方法用于区分胰腺癌和慢性胰腺炎(ChP)。

21.根据项20所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(A)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(A)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物在检测样品中的表达。

22.根据项20或21所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(C)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(C)中列出的至少2、3、4或5种生物标志物在检测样品中的表达。

23.根据项20、21或22所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测在表V(A)和/或表V(C)中列出的全部生物标志物在检测样品中的表达。

24.根据项1～11中任一项所述的方法，其中该方法用于区分胰腺癌和急性炎症性胰腺炎(AIP)。

25.根据项24所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(A)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(A)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物在检测样品中的表达。

26.根据项24或25所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(B)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(B)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24种生物标志物在检测样品中的表达。

27.根据项24、25或26所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(C)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(C)中列出的至少2、3、4或5种生物标志物在检测样品中的表达。

28.根据项24～27中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(E)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达。

29.根据项24～28中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(F)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(F)中列出的至少2、3、4、5或6种生物标志物在检测样品中的表达。

30.根据项24～29中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(H)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(H)中列出的至少2或3种生物标志物在检测样品中的表达。

31.根据项24～30中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测表V(A)、表V(B)、表V(C)、表V(E)、表V(F)和/或表IV(H)中列出的全部生物标志物在检测样品中的表达。

32.根据项1～11中任一项所述的方法，其中该方法用于区分胰腺癌和正常个体(N)。

33.根据项32所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(A)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(A)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物在检测样品中的表达。

34.根据项32或33所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(B)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(B)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24种生物标志物在检测样品中的表达。

35.根据项32、33或34所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(D)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(D)中列出的至少2或3种生物标志物在检测样品中的表达。

36.根据项32～35中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(E)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达。

37.根据项32～36中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测来自表V(G)中列出的生物标志物中的1或多种生物标志物在检测样品中的表达，例如检测表V(G)中列出的至少2或3种生物标志物在检测样品中的表达。

38.根据项32～37中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以下检测或由以下检测构成：检测表V(A)、表V(B)、表V(D)、表V(E)和/或表IV(G)中列出的全部生物标志物在检测样品中的表达。

39.根据项2～38中任一项所述的方法，其中未患胰腺癌的个体未患胰腺癌(PaC)、慢性胰腺炎(ChP)或急性炎症性胰腺炎(AIP)。

40.根据项39所述的方法，其中未患胰腺癌的个体未患任何胰腺疾病或病况。

41.根据项39或40所述的方法，其中未患胰腺癌的个体未患任何疾病或病况。

42.根据项39、40或41所述的方法，其中未患胰腺癌的个体为健康的个体。

43.根据项2～38中任一项所述的方法，其中未患胰腺癌的个体患慢性胰腺炎。

44.根据项2～38中任一项所述的方法，其中未患胰腺癌的个体患急性炎症性胰腺炎。

45.根据上述项中的任一项所述的方法，其中胰腺癌选自下组：腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌和伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌。

46.根据上述项中的任一项所述的方法，其中胰腺癌为腺癌。

47.根据上述项中的任一项所述的方法，其中使用能够与所述一种或多种生物标志物结合的第一结合试剂来进行步骤(b)、(d)和/或步骤(f)。

48.根据项47所述的方法，其中第一结合试剂包括下述物质或由下述物质构成：抗体或其抗原结合片段。

49.根据项48所述的方法，其中抗体或其抗原结合片段是重组抗体或其抗原结合片段。

50.根据项48或49所述的方法，其中抗体或其抗原结合片段选自下组：scFv；Fab；免疫球蛋白分子的结合域。

51.根据项48～50中任一项所述的方法，其中第一结合试剂被固定在表面上。

52.根据项1～25中任一项所述的方法，其中用可检测部分标记检测样品中的所述一种或多种生物标志物。

53.根据项2～25中任一项所述的方法，其中用可检测部分标记(一种或多种)对照样品中的一种或多种生物标志物。

54.根据项52或53所述的方法，其中可检测部分选自下组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分；酶部分。

55.根据项52或53所述的方法，其中可检测部分是生物素。

56.根据项47～55中任一项所述的方法，其中使用包括能够与一种或多种生物标志物结合的第二结合试剂的分析进行步骤(b)、(d)和/或步骤(f)，该第二结合试剂包括可检测部分。

57.根据项56所述的方法，其中第二结合试剂包括或由以下物质构成：抗体或其抗原结合片段。

58.根据项57所述的方法，其中抗体或其抗原结合片段为重组抗体或其抗原结合片段。

59.根据项57或58所述的方法，其中抗体或其抗原结合片段选自下组：scFv；Fab；免疫球蛋白分子的结合域。

60.根据项56～59中任一项所述的方法，其中可检测部分选自下组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分；酶部分。

61.根据项60所述的方法，其中可检测部分为荧光部分，例如Alexa Fluor染料，如Alexa647。

62.根据上述项中的任一项所述的方法，其中该方法包括ELISA(酶联免疫吸附测定)或由ELISA构成。

63.根据上述项中的任一项所述的方法，其中使用阵列进行步骤(b)、(d)和/或步骤(f)。

64.根据项63所述的方法，其中阵列为基于珠的阵列。

65.根据项63所述的方法，其中阵列为基于表面的阵列。

66.根据项63～65中任一项所述的方法，其中阵列选自下组：宏阵列；微阵列；纳米阵列。

67.根据上述项中的任一项所述的方法，其中该方法包括：

(v)利用生物素标记样品中存在的生物标志物；

(vi)使生物素-标记的蛋白质与阵列接触，该阵列包括固定在其表面上的离散位置的多个scFv，所述scFv对于表III中的一种或多种蛋白质具有特异性；

(vii)使已固定的scFv与包括荧光染料的链霉抗生物素蛋白偶联物接触；以及

(viii)检测在阵列表面上的离散位置的染料的存在，

其中阵列表面上的染料的出现指示表IIII的生物标志物在样品中的表达。

68.根据上述项中任一项所述的方法，其中步骤(b)、(d)和/或(f)包括检测编码一种或多种生物标志物的核酸分子的表达。

69.根据项68所述的方法，其中核酸分子是cDNA分子或mRNA分子。

70.根据项68所述的方法，其中核酸分子是mRNA分子。

71.根据项68、69或70所述的方法，其中在步骤(b)、(d)和/或(f)中检测一种或多种生物标志物的表达使用选自下组的方法进行：Southern杂交、Northern杂交、聚合酶链式反应(PCR)、反转录PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、纳米阵列、微阵列、宏阵列、放射自显影和原位杂交。

72.根据项68～71中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中检测一种或多种生物标志物的表达通过使用DNA微阵列来确定。

73.根据项68～72中任一项所述的方法，其中在步骤(b)、(d)和/或(f)中检测一种或多种生物标志物的表达通过使用一种或多种结合部分来进行，每个结合部分各自能够选择性地结合编码表III中一种生物标志物的核酸分子。

74.根据项73所述的方法，其中一种或多种结合部分各自包括核酸分子或由核酸分子构成。

75.根据项74所述的方法，其中一种或多种结合部分各自包括下述物质或由下述物质构成：DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或PMO。

76.根据项74或75所述的方法，其中一种或多种结合部分各自包括DNA或由DNA构成。

77.根据项74～76中任一项所述的方法，其中一种或多种结合部分的长度为5～100个核苷酸。

78.根据项74～76中任一项所述的方法，其中一种或多种核酸分子的长度为15～35个核苷酸。

79.根据项74～78中任一项所述的方法，其中结合部分包括可检测部分。

80.根据项79所述的方法，其中可检测部分选自下组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分，例如放射性原子；或酶部分。

81.根据项80所述的方法，其中可检测部分包括放射性原子或由放射性原子构成。

82.根据项81所述的方法，其中放射性原子选自下组：锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、铼-186、铼-188和钇-90。

83.根据项80所述的方法，其中结合部分的可检测部分为荧光部分。

84.根据上述项中的任一项所述的方法，其中步骤(b)、(d)和/或(f)中提供的样品选自下组：未分级分离的血、血浆、血清、组织液、胰组织、胰汁、胆汁和尿液。

85.根据项84所述的方法，其中步骤(b)、(d)和/或(f)中提供的样品选自下组：未分级分离的血、血浆和血清。

86.根据项84或85所述的方法，其中步骤(b)、(d)和/或(f)中提供的样品是血浆。

87.一种用于检测个体中胰腺癌存在的阵列，其包括如项47～61中任一项所限定的一种或多种结合试剂。

88.根据项87所述的阵列，其中一种或多种结合试剂能够与表III中定义的所有蛋白质结合。

89.选自表III中定义的组的一种或多种生物标志物用作检测个体中胰腺癌存在的诊断标志物的用途。

90.根据项89所述的用途，其中表III中定义的所有蛋白质都用作检测个体中胰腺癌存在的诊断标志物。

91.用于诊断胰腺癌存在的试剂盒，其包括：

C)一个或多个如项47～55中任一项所定义的第一结合试剂或根据项63～66或项87或88的阵列；

D)用于进行如项1～67或68～86中任一项所述的方法的说明。

92.根据项91所述的试剂盒，其还包括如项56～61中任一项所定义的第二结合试剂。

93.基本上如本文所述的用于检测个体中胰腺癌存在的方法或用途。

94.基本上如本文所述的用于检测个体中胰腺癌存在的阵列或试剂盒。

序列表

<110> 伊缪诺维亚公司(Immunovia AB)

<120> 确定胰腺癌存在的方法、阵列以及用途

<140> PCT/GB2012/050483

<141> 2012-03-05

<150> GB1103726.4

<151> 2011-03-04

<160> 2

<170> SeqWin99

<210> 1

<211> 242

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Gly Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

130 135 140

Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn

145 150 155 160

Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

165 170 175

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro

180 185 190

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

195 200 205

Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp

210 215 220

Asp Asp Ser Leu Ser Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Gly

<210> 2

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6-His亲和标签

<400> 2

Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr

1 5 10 15

Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ala Ala His His His His His His

20 25 30

Claims

a)提供来自个体的待检测样品；

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括测量选自下组的一种或多种生物标志物在检测样品中的表达：备解素、补体-1酯酶抑制剂、补体蛋白C3、补体蛋白C4、补体蛋白C5、白细胞介素-13、白细胞介素-4、白细胞介素-6、干扰素-γ、lewis X、唾液酸路易斯抗原X和血管内皮生长因子。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括测量备解素在检测样品中的表达。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括测量备解素、补体-1酯酶抑制剂、补体蛋白C3、补体蛋白C4、补体蛋白C5、白细胞介素-13、白细胞介素-4、白细胞介素-6、干扰素-γ、lewis X、唾液酸路易斯抗原X和血管内皮生长因子在检测样品中的表达。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述胰腺癌是腺癌。

6.根据上述权利要求中的任一项所述的方法，其中使用能够与所述一种或多种生物标志物结合抗体或其抗原结合片段来进行步骤(b)。

7.根据上述权利要求中的任一项所述的方法，其中使用阵列进行步骤(b)。

8.用于检测个体中胰腺癌存在的阵列，其包括如权利要求6所限定的一种或多种结合试剂。

9.一种或多种生物标志物结合剂在制备用于检测个体中胰腺癌存在的试剂盒中的用途，其中所述一种或多种生物标志物选自下组：备解素、补体-1酯酶抑制剂、补体蛋白C3、补体蛋白C4、补体蛋白C5、白细胞介素-13、白细胞介素-4、白细胞介素-6、干扰素-γ、lewisX、唾液酸路易斯抗原X和血管内皮生长因子。

10.根据权利要求9所述的用途，其包括以下步骤：

(a)提供来自个体的待检测样品；

(b)通过检测两种或更多种生物标志物在检测样品中的表达来确定检测样品的生物标志物签名，该一种或多种生物标志物选自：备解素、补体-1酯酶抑制剂、补体蛋白C3、补体蛋白C4、补体蛋白C5、白细胞介素-13、白细胞介素-4、白细胞介素-6、干扰素-γ、lewis X、唾液酸路易斯抗原X和血管内皮生长因子，

其中步骤(b)中测量的两种或更多种生物标志物在检测样品中的表达是罹患胰腺癌的个体的指示。

11.根据权利要求10所述的用途，其中步骤(b)包括测量备解素、补体-1酯酶抑制剂、补体蛋白C3、补体蛋白C4、补体蛋白C5、白细胞介素-13、白细胞介素-4、白细胞介素-6、干扰素-γ、lewis X、唾液酸路易斯抗原X和血管内皮生长因子在检测样品中的表达。

12.用于诊断胰腺癌存在的试剂盒，其包括：

A)一个或多个如权利要求6所定义的第一结合试剂；

D)用于进行如权利要求1所定义的方法的说明。